一、杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析（论文文献综述）
乔郭洁[1]（2020）在《SEMA3C错义突变在肝癌发生发展中的作用和机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:神经轴突导向因子Semaphorin3C（信号素SEMA3C）在多种肿瘤中都有表达,但是它在不同类型肿瘤细胞中对于细胞的增殖侵袭转移等功能的影响结果不同,因为SEMA3C突变在肝癌发生过程中的研究还未有先例,而且SEMA3C在肿瘤中异常表达的作用机制也尚未被阐明。所以本研究主要探讨SEMA3C突变在肝癌生长、侵袭转移中的作用机制,并分析抑制剂凡德他尼（Vandetanib）对SEMA3C表达异常的作用效果。方法:1、采用外显子组测序方法对40例肝癌病人的肿瘤标本进行测序。2、构建SEMA3C野生型WT和突变型MT的真核表达载体。3、研究过表达SEMA3C的野生型和突变型rs1527482 G>A对肝癌细胞的迁移能力,克隆形成能力,增殖能力,并对此分子机制进行分析。生长因子受体酪氨酸激酶（RTK）途径激活是介导肿瘤生长、生存和治疗抵抗的关键机制。同源配体在这些RTK途径的自分泌或旁分泌刺激中起着关键作用。本文展示了SEMA3C通过自身受体丛蛋白PLXND1和PLXNB1以一种与配体无关的方式驱动包括EGFR、VEGFR2和MET在内的多个RTK的激活。4、研究过表达SEMA3C的野生型和突变型对裸鼠皮下成瘤能力的影响,以及EGFR抑制剂凡德他尼（Vandetanib）对皮下瘤的疗效,SEMA3C抑制是治疗晚期肝癌的新策略。结果:1、在40例肝癌病人的外显子组测序结果中发现,在20例高转移潜能病例组中SEMA3C突变rs1527482 G>A有8例,在20例低转移潜能组病例中SEMA3C突变rs1527482 G>A有1例。2、在肝癌细胞系PLC/PRF/5和Hu H-7中,SEMA3C突变型（MT）稳转株的侵袭迁移能力,克隆形成能力,增殖能力均比野生型（WT）和空载体对照组（NC）增强,但NC,WT,MT三者之间的细胞凋亡水平无明显差异。3、在肝癌细胞系PLC/PRF/5的裸鼠皮下瘤模型中,非喂药组中SEMA3C突变型（MT）的肿瘤质量与体积比野生型（WT）和空载体对照组（NC）大很多,凡德他尼（Vandetanib）用药组中,NC,WT,MT三组皮下瘤均明显减小,从减小幅度上来看,MT减小的更多。结论:本研究表明,SEMA3C对肝癌的发生发展具有重要作用。综上所述,在肝癌中高表达SEMA3C或者表达rs1527482 G>A突变的SEMA3C可以作为诊断肝癌的候选标志物;同时,它在肝癌中表现为促癌基因的特点和功能,将为阐明SEMA3C表达异常与肝癌发生发展机制的关系奠定理论基础,并为肝癌的临床治疗和诊断提供了新的靶点和方向。
李祖俐[2]（2020）在《高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析》文中指出目的:肝癌是全球第六常见的癌症,也是排名第四的癌症死亡原因。中国肝癌每年新发病例和死亡病例占全球50%以上,大多数肝癌初次诊断时已经伴随远处转移。由于肝癌异质性的存在,肝癌在化疗、靶向治疗、免疫治疗等治疗容易产生耐药,探究肝癌异质性显得格外重要。方法:对来自同一患者具有不同转移潜能的肝癌细胞系（MHCC97-L、MHCC97-H、HCC97LM3）进行了全外显子测序。在Oncotator中注释了测序数据,并找到非沉默类型突变基因。为了探究三株细胞进化关系,用Mega X软件构建了基于基因组单核苷酸多态性（SNP）的进化树。根据三株细胞突变位点和基因绘制维恩图并计算了异质性。在Excel中统计三株细胞的碱基改变情况、已知肝癌驱动基因和10个经典致癌信号通路上的基因突变情况。为了进一步探究三株细胞的不同,通过分析突变位点找到三株细胞的主干差异突变基因和各自特有的基因,利用STRING构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络找到hub突变基因,在c Bio Portal数据库中查询hub基因的突变与肝癌总生存期（OS）的关系。由于基因突变会影响基因表达,在ULCAN数据库探究了关键基因在肝癌中的表达及其对肝癌病人预后影响。挑选感兴趣的突变基因,根据突变位点设计引物后用PCR进行验证。结果:三株细胞的突变基因维恩图显示,三株细胞共有4691个突变基因,MHCC97-L特有突变基因243个,MHCC97-H特有突变基因315个,HCC97LM3特有突变基因289个。三株细胞的平均异质性突变率（三株细胞非共有的突变数占的百分比）为16.55%（范围15.38%～18.17%）。基于SNP的进化树显示,MHCC97-H和HCC97LM3在进化关系更近。三株细胞株在7个肝癌驱动基因（ARID1A、CDKN1A、P53、KEAP1、APOB、XPO1、HIST1H1E）和10个经典致癌信号通路基因（如ALK、RET、EGFR、ROS1、KRAS、HRAS、APC等）中存在非沉默突变。在c Bio Portal数据库中,部分从主干差异突变和特有突变中筛选的hub基因突变（SDC1、ITGB4、ITGA4、BPTF、COL4A1、MYOD1、AR、EFTUD2）与肝癌患者更短生存期相关。在ULCAN数据库中,部分关键基因（CDC27、RELA、EIF4E、POXO3、EZH2、POLR2G、WDTC1、DLG、EPRS、EFTUD2）不仅在肝癌组织中高表达,还与肝癌病人更短生存期相关。在MHCC97-H和HCC97LM3细胞中发现了肝癌驱动基因KEAP1的一个新的纯合移码缺失突变（1334del C,p.P445fs）,这导致了KEAP1蛋白的c末端（Nrf2结合区）缺失。结论:WES数据表明,来自同一患者的肿瘤活检标本的HCC细胞系通过在小鼠体内的重复选择获得了不同的转移潜能,它们在基因组水平上具有遗传关系。肝癌驱动基因中和经典致癌通路上的突变基因,以及从主干突变和特有突变中筛选出来的hub基因,在肝癌的发生发展中可能发挥着重要的作用。
樊潇霄[3]（2020）在《肝癌和癌栓的全基因组甲基化分析及差异基因的相关临床特征研究》文中研究说明背景和目的:原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一类我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤,给我国人民健康造成了极大负担。门静脉癌栓（PVTT）是肝癌中一种常见的转移形式之一,给肝癌治疗带来极大的困难。DNA甲基化异常是肿瘤发生发展的关键机制之一,因其稳定且可以伴随疾病发展或治疗而变化,是一个潜在的理想生物标志物。本研究通过全DNA甲基化分析对门静脉癌栓特征进行分析,探索门静脉癌栓中可能存在的关键分子事件,并重点分析了DNAH17和ADRA1A两个基因在肝细胞肝癌中甲基化改变情况。实验方法:利用Infinium Human Methylation450芯片（病人数=11）对邻近正常组织（ANT）、HCC组织和PVTTs进行全基因组DNA甲基化分析。通过MTS实验和凋亡实验,以评估地西他滨（DAC）和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（rh-TRAIL）对肝癌细胞系抑制的协同作用。在对DNAH17的研究中,主要使用Sequenom Epi TYPER法评估了163个HCC样本及其配对正常组织中DNAH17的甲基化水平,并利用Taq Man拷贝数试剂盒分析来评估DNAH17在样本中的拷贝数状态。同时结合免疫组化、q PCR等验证该基因该肝癌中的表达差异。对ADRA1A的研究中,同样使用了Sequenom Epi TYPER对分析了160个HCC患者中该基因的甲基化水平。通过构建稳转细胞系、免疫组化、转录组测序等方法,探索该基因在肝脏中潜在作用机制。实验结果:1、HCC组织和PVTTs的整体平均甲基化水平明显低于ANT（P<0.01）。在HCC组织和配对的PVTTs之间共鉴定532个差异基因中864个差异甲基化Cp G位点（平均甲基化差异>10%,P<0.005）。基于PVTT组织中高甲基化基因的KEGG通路分析显着富集于肌动蛋白细胞骨架调控通路（P=4.48 E-5）。23个基因的甲基化水平在HCC和PVTT中呈梯度变化,其中17个基因的甲基化水平梯度升高（例如,PAK1、NDRG2、SLC9A3R2、ZC3H3）和6个基因梯度降低（ADORA2A、KIAA1143、NAPEPLD、PARVG、TNFRSF10A、TSTD1）。TNFRSF10A是TRAIL的关键细胞表面受体之一,可被rh-TRAIL激活。MTS实验和细胞凋亡实验表明,DAC和rh-TRAIL联合使用可协同抑制SK-Hep-1和Huh7细胞系的增殖以及诱导凋亡。2、与ANT相比,肝癌组织的DNAH17平均甲基化水平显着降低（扩增子1:58.7%vs.84.5%（癌vs.癌旁）,P<0.0001;扩增子2:69.9%vs.84.5%（癌vs.癌旁）,P=0.0060）。RNA-seq和免疫组化均显示肿瘤组织中DNAH17表达增加（P<0.05）。DNMT抑制剂处理肝癌细胞可发现DNAH17表达上调。DNAH17基因扩增常和低甲基化状态并存。还发现低甲基化状态与男性患者、较高的AFP值、高龄、存在完整包膜、存在肿瘤坏死、肝硬化、肝癌癌栓等临床特征相关（P<0.05）。ROC曲线分析显示,DNAH17的甲基化水平可以有效预测肝癌包膜（AUC=0.695）和肝癌癌栓（AUC=0.806）的存在。3、ADRA1A m RNA水平和蛋白水平在肝癌组织中的表达水平明显降低。与ANT相比,160例肝癌患者的肿瘤组织中ADRA1A启动子区域的平均甲基化水平显着升高（25.2%:17.0%,P<0.0001）。地西他滨作用肝癌细胞系,可以增加肝癌细胞系中ADRA1A的表达。此外,肝癌样本中ADRA1A基因的高甲基化水平与酒精摄入（P=0.0097）和甲胎蛋白（P=0.0411）存在明显相关性。ROC曲线分析显示,ADRA1A的平均甲基化水平可以区分HCC组织与癌旁非癌组织（AUC=0.700,P<0.0001）。通过构建ADRA1A稳定敲减的肝癌细胞系的转录组测序结果显示,主要富集途径为癌通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和代谢通路（P<0.01）。结论:我们的研究表明,DNA甲基化通过调节转移相关的途径在PVTT的形成中发挥重要作用。DAC与rh-TRAIL联合应用可能是一种有前景的HCC治疗策略。DNAH17的异常甲基化与肝癌的多种临床病理特点有关,可能是肝癌患者肿瘤血栓形成的一个有潜在应用价值的生物标志物。ADRA1A基因异常高甲基化可能参与HCC的发生,同样有可能作为HCC诊断的生物标志物。
王佳佳[4]（2020）在《de Winter综合征及复发性肝癌克隆起源的早期诊断》文中研究说明目的:早期诊断是一些疾病诊治的关键,具有重要临床意义。早期诊断方式主要有两种:通过医学设备进行诊断和对生物学特异性的标志物开展检测。对de Winter综合征和复发性肝癌（Recurrent hepatocellular carcinoma,RHCC）克隆起源开展早期诊断能有效帮助医生实施临床决策。特征心电图（electrocardiogram,ECG）是目前de Winter综合征进行早期诊断主要手段,而复发性肝癌克隆起源的早期诊断目前缺乏理想的分子标志物。de Winter综合征是一种极其罕见但致命的急性前壁心肌梗死,多发生于年轻男性患者。de Winter综合征进展凶险,易误诊或漏诊而错过最佳治疗时间。肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是我国致死率居于第三的恶性肿瘤,具有高复发和预后差的特点。目前认为,肝癌复发有两种机制:一、由原发性肝癌（Primary hepatocellular carcinoma,PHCC）转移而来,即肝内转移（Intrahepatic metastasis,IM）;二、为新发生的原发肿瘤,即多中心发生（Multicentric occurrence,MO）。临床上,这两种不同起源的复发性肝癌的治疗方案不同,预后具有显着差异。肝癌复发瘤起源的的早期鉴定有利于选择正确的治疗方案并改善预后。本研究首先报告了一例分叉病变de Winter综合征,并评估一项改良的拘禁球囊技术（Modified jailed-balloon technique,M-JBT）对de Winter综合征的长期治疗效果。同时,本研究对9名肝癌患者原发肿瘤和复发肿瘤开展全外显子测序（Whole exome sequencing,WES）,筛选与复发瘤克隆起源相关的突变。方法:1.对一名急性胸痛患者开展心电图检测,疑似de Winter综合征心电图模式。在经皮冠状动脉治疗术（Percutaneous coronary intervention,PCI）中同时实施拘禁球囊技术,分别在刚实施手术后,以及手术后2个月,8个月的时间进行冠状动脉造影（Coronary angiography,CAG）,检测患者恢复情况。2.收集9名患者的原发、复发瘤及其匹配的正常癌旁组织,共32个样品,进行全外显子测序。开展编码区SNV分布、已知驱动基因、突变频谱、突变特征、肝癌系统发育等分析,判断复发性肝癌的克隆起源。用卡方检验分析原发瘤和复发瘤突变频谱比率的差异,显着检验采用双边检验（P<0.05）。结果:1.使用改良的拘禁球囊技术在经皮冠状动脉治疗术中无侧支（Side branch,SB）损伤,术后de Winter综合征心电图模式消失。冠状动脉主支（Main branch,MB）与侧支血流量分别在术后2个月与8个月时恢复至TIMI 3级。2.肝癌数据采用过滤癌旁数据集（A集）和未过滤癌旁数据集（B集）分别进行分析。在A、B集中,P1、P2、P3、P4、P5、P6、P8、P9八名患者的原发与复发瘤之间发现共有SNV突变,P7未发现共有SNV突变。3.驱动基因分析发现,P7患者原发与复发瘤间无共有已知驱动基因突变（A、B集）。在A集中,P1患者原发与复发瘤间的共有突变位于已知肝癌驱动突变基因TMEM170A上,P2、P3、P4、P5、P6、P8、P9患者的原发与复发瘤间的共有突变不在已知的肝癌驱动突变基因上。在B集中,P1、P3、P5、P8、P9患者患者原发与复发瘤间的共有突变位于已知肝癌驱动突变基因GXYLT1（P1）、TMEM170A（P1）、MUC17（P3）、LRP1B（P5）、PI3KCA（P5）、USP25（P8）、DSE（P9）上,P2、P4、P6患者原发与复发瘤间的共有突变不位于已知的肝癌驱动突变基因上。4.在A、B集中,P7患者的原发与复发瘤之间的突变图谱存在显着差异（P=0.0005）,P1、P2、P3、P5、P6、P8、P9患者的原发与复发瘤之间的突变图谱未发现显着差异。P4患者的原发与复发瘤之间的突变图谱在A集中未发现显着性差异,但在B集中存在显着性差异（P=0.044）。在A集中,P7患者原发与复发瘤间未检测到共有突变信号,在B集中,P7患者原发与复发瘤之间存在共有突变信号1和3。P1、P2、P3、P4、P5、P6、P8、P9患者原发与复发瘤间至少存在共有突变信号3（A、B集）。5.在A集,系统进化分析结果显示,P4的原发与复发瘤不聚类在一起,而P1、P2、P3、P5、P6、P7、P8、P9患者的原发与复发瘤均聚类在一起。在B集,系统进化分析结果显示,P2、P4的原发与复发瘤不聚类在一起,而P1、P2、P3、P5、P6、P7、P8、P9患者的原发与复发瘤均聚类在一起。结论:1.建议对胸痛患者开展早期特征心电图检测可以防止漏诊de Winter综合症,对于有分叉病变的de Winter综合征患者建议在经皮冠状动脉治疗术支架置入期间使用安全有效的的改良拘禁球囊技术。2.基于WES的分析结果表明,P2、P4、P7三位患者的复发肿瘤属于多中心起源,其他患者的复发肿瘤属于肝内转移。
王奕婷[5]（2020）在《异常活化的Hh-FOXM1-TPX2信号轴促进肝癌细胞恶性增殖的分子机制》文中研究指明背景与目的:原发性肝癌是全球范围最常见且最难治疗的恶性肿瘤之一,其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）占85%90%以上。肝癌起病隐匿,早期诊断较难,且增殖迅速,对常规放化疗治疗手段不敏感,术后很快出现复发转移,而具体的机制尚不明确。因此,深入研究肝癌发生、发展、耐药、复发等表型背后的分子机制,寻找关键性分子靶点,有助于实现肝癌患者的早期筛查、早期诊断、精准医疗,具有重大转化意义,是肝癌基础研究领域亟待解决的核心科学问题。目前认为,肿瘤的恶性增殖,主要归因为一系列异常的基因表达和调控网络。异常激活的Hedgehog（Hh）信号通路在肝癌的恶性增殖过程中起着重要作用,Hh信号活化后,转录因子GLI2与靶基因启动子区域的GBS（GLI binding site,GLI结合位点）序列5’-GACCACCCA-3’结合,激活下游Hh靶基因的转录和表达。目前的研究发现,许多Hh靶基因与细胞增殖和细胞周期调控相关,如FOXM1、N-Myc、Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin E等,从而介导了Hh信号对有丝分裂和细胞增殖的调控作用。然而,细胞周期的调控机制十分精细且复杂,Hh信号通路影响肝癌细胞增殖的具体分子机制需要更深入的探索。肿瘤的基本特征之一是细胞周期调控机制的紊乱,进而导致肿瘤细胞的失控性增殖。微管相关蛋白TPX2在肿瘤细胞恶性增殖和细胞周期运转过程中起着重要作用,而前期的基因表达谱提示TPX2可能是Hh信号通路的下游靶基因。因此,我们提出了如下科学假设:肝癌细胞中异常活化的Hh信号激活TPX2的表达,TPX2的异常表达导致肝癌细胞恶性增殖,从而参与了Hh信号通路对肿瘤细胞增殖的调控作用。本研究综合使用生物信息学、分子细胞生物学、动物实验、临床队列研究等多学科方法,在分子层面、细胞层面、体内实验等阐明Hh信号通路调控TPX2的分子机制,并证明Hh-TPX2信号轴在调控肝癌细胞恶性增殖过程中的重要作用。本研究有助于明确肝癌恶性增殖的分子机制,为肝癌的分子诊断和个体化诊疗提供新的诊断指标和治疗靶点。材料与方法:1、肝癌细胞的基因芯片表达谱及二代测序数据分析、验证（1）使用Smo抑制剂Cyclopamine和GLI抑制剂GANT61处理肝癌细胞HCC-LM3（或使用GANT61处理肝癌细胞Huh7和HepG2）,通过基因微阵列（microarray）和二代测序（next generation sequence）,分析差异基因表达谱,寻找Hh信号通路下游靶基因。再与GeneCards公共数据库中的细胞周期、有丝分裂相关的基因集进行交集,筛选出可能介导Hh信号通路调控细胞周期、有丝分裂的靶基因;（2）为验证基因微阵列和二代测序数据,在Hh信号通路异常激活的肝癌细胞Hep3B中,使用Cyclopamine和GANT61抑制Hh信号后,检测TPX2的表达水平,并将已知的Hh下游靶基因PTCH1和FOXM1作为阳性对照;（3）为进一步验证候选基因TPX2是否受Hh信号通路调控,在Hep3B细胞中干扰GLI2表达,或在Huh7中使用N-Shh条件培养基处理或者过表达激活型GLI2（GLI2A）,分别检测TPX2的mRNA水平和蛋白水平。2、探索TPX2介导Hh通路对肝癌细胞恶性增殖的促进功能（1）构建过表达和干扰TPX2的肝癌慢病毒稳定细胞株;（2）为明确TPX2是否受到经典Hh信号通路的调控并帮助行使促进肝癌细胞恶性增殖的功能,在过表达TPX2的肝癌稳定细胞株中,加入GANT61处理,或者在干扰TPX2的肝癌慢病毒稳定细胞株中,加入新鲜制备的N-Shh条件培养基,通过EdU实验、软琼脂集落形成、平板克隆形成实验、细胞生长曲线实验等细胞功能实验,验证TPX2是否参与介导Hh通路对肝癌细胞恶性增殖的促进作用。3、阐明FOXM1调控TPX2的分子机制研究（1）利用生物信息学工具分析TPX2上游启动子区域可能的转录因子结合位点;（2）验证预测结果,检测FOXM1是否调控TPX2的表达。在肝癌细胞中,过表达或者干扰FOXM1表达后,检测TPX2的mRNA和蛋白表达水平,初步验证FOXM1与TPX2之间的表达调控关联;在动物实验中,利用裸鼠皮下移植瘤,干扰FOXM1的表达后,使用western blot和免疫组化技术检测FOXM1与TPX2的表达,进一步在体内验证FOXM1与TPX2之间的表达调控关系;（3）使用双荧光素酶报告基因系统和染色质免疫共沉淀验证TPX2是否为FOXM1的直接靶基因。4、Hh-FOXM1信号轴通过调控TPX2表达促进肝癌细胞恶性增殖（1）在干扰FOXM1的肝癌细胞中,使用N-Shh条件培养基刺激,用western blot检测TPX2的蛋白水平;（2）在过表达FOXM1的肝癌细胞中,加GANT61抑制GLIs活性,用western blot检测TPX2的蛋白水平;（3）在过表达GLI2A的肝癌细胞中,干扰FOXM1表达后,用western blot检测TPX2的蛋白水平;（4）验证Hh-FOXM1信号轴通过调控TPX2表达促进肝癌细胞恶性增殖:在过表达FOXM1的基础上干扰TPX2表达后,通过一系列体外细胞功能实验,如EdU、平板克隆形成实验、细胞计数及细胞周期检测等方法探究FOXM1-TPX2信号轴对肝癌细胞恶性增殖的作用。5、临床队列研究验证（1）通过western blot及免疫组织化学染色分析FOXM1和TPX2在人肝癌组织及对应正常组织中的蛋白表达情况;（2）采用“德国半定量系统”评分方法对免疫组织化学结果进行评分统计,采用卡方检验分别分析FOXM1或TPX2的表达量与肝癌患者各个临床病理特征的相关性;采用Pearson秩相关系数分析FOXM1和TPX2表达量的相关性;绘制Kaplan-Meier生存曲线、采用Log rank检验分析FOXM1和TPX2的表达水平对肝癌患者生存预后的影响;（3）在公共数据库中,验证FOXM1、TPX2表达水平与肝癌患者预后的关系。结果:1、TPX2是Hedgehog信号通路的下游靶基因（1）使用Cyclopamine和GANT61抑制Hh信号通路后,采用寡核苷酸表达谱芯片分析,有202个基因的表达出现共同下调（DiffScore<-50）;使用GANT61抑制Hh信号通路后,通过二代测序技术,找到1711个表达下调基因;分别将其与622个细胞周期、有丝分裂相关的基因进行交集,获得目标基因,其中TPX2属于微管招募蛋白,与细胞有丝分裂、细胞周期进展有关;（2）分别使用Cyclopamine、GANT61处理或者干扰GLI2的表达以抑制Hh信号后,Hep3B细胞中的TPX2 mRNA和蛋白表达水平都显着下降;使用N-Shh条件培养基处理或者过表达GLI2A激活Hh信号后,Huh7细胞中的TPX2mRNA和蛋白表达均显着增加。2、Hh信号通路通过调控TPX2表达促进肝癌细胞恶性增殖（1）过表达TPX2后,HepG2细胞增殖能力增强;干扰TPX2后,Huh7细胞增殖能力被明显抑制;（2）干扰TPX2表达,能阻断N-Shh条件培养基促进肝癌细胞增殖能力的作用;（3）过表达TPX2可以挽救GLIs抑制剂GANT61对Hh信号通路的抑制效果。3、转录因子FOXM1转录调控TPX2的表达（1）生物信息在线分析结果提示,FOXM1可能是TPX2的候选转录因子之一;在TPX2启动子区域并未找到转录因子GLI2潜在结合位点,但是,却发现转录因子FOXM1的多个潜在结合位点;（2）初步证实FOXM1与TPX2之间存在调控关系:过表达或者干扰FOXM1后,TPX2的mRNA和蛋白表达水平随之显着增加或明显下降;在体内实验中,干扰FOXM1表达后,TPX2表达也下调;（3）双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,FOXM1能直接激活TPX2编码区上游调控序列的启动子活性。通过进一步的质粒分段和结合位点突变实验,找到3个可能发挥关键功能的结合位点FBS-9、FBS-10、FBS-11;染色质免疫共沉淀直接证实FBS-11是FOXM1最关键的结合位点。4、Hh-FOXM1信号轴调控TPX2的表达并促进肝癌细胞恶性增殖（1）为明确N-Shh是否通过FOXM1调控TPX2的表达,在N-Shh存在的培养条件下,干扰FOXM1的表达,western bolt检测TPX2蛋白的表达,发现TPX2蛋白表达减少;（2）为进一步验证TPX2在Hh-FOXM1信号轴的下游,在过表达FOXM1的肝癌慢病毒稳定细胞株中,同时加入GANT61处理,阻断Hh信号转录因子GLI的转录活性,发现FOXM1的过表达可以回复GANT61阻断Hh信号后引起的TPX2表达抑制;（3）在过表达GLI2A的Huh7细胞中,干扰下游FOXM1表达,检测TPX2的蛋白表达,发现过表达GLI2A后,TPX2表达增加;但是在过表达GLI2A的基础上干扰FOXM1,TPX2表达会受到抑制,进一步验证了Hh-GLI2-FOXM1-TPX2信号轴的存在;（4）证明FOXM1通过调控TPX2的表达促进肝癌细胞增殖:与对照组Lv-Control+sh-Control相比,干扰TPX2表达后,肝癌细胞EdU阳性细胞百分比明显下降,克隆形成能力、细胞生长能力及软琼脂成球能力都显着减弱,而过表达FOXM1组增殖能力明显增强;在过表达FOXM1的基础上阻断下游TPX2的表达,与过表达FOXM1组相比,EdU阳性细胞百分比有所减少,增殖能力、克隆形成能力、细胞生长能力及成球能力都受到明显抑制;（5）细胞周期结果显示,与对照组（Lv-Control+sh-Control）相比,过表达FOXM1组（Lv-FOXM1+sh-Control）分布在S期的细胞比例更多;而在此基础上干扰TPX2表达后,FOXM1促进细胞周期进展的作用被明显抑制,具体表现为,S期细胞减少,并出现G2/M期阻滞和多倍体细胞的形成。5、FOXM1、TPX2在肝癌组织中异常高表达,与肝癌患者较差的临床预后相关（1）Western blot与免疫组织化学染色结果均显示:FOXM1与TPX2在肝癌组织中的表达量明显高于对应的正常组织;分析公共数据库的已有数据也验证了这一结果;（2）在肝癌组织和肝癌细胞系中验证FOXM1与TPX2的表达呈正相关;分析公共数据库中已有数据也验证了这一结果;（3）FOXM1或者TPX2高表达,与较大的肿瘤直径、较差的肿瘤病理分级及较高的TNM分期相关;（4）FOXM1、TPX2高表达的肝癌患者,总生存期及无病生存期相对缩短。结论:1、抑制Hh信号通路可显着抑制TPX2的表达,TPX2是Hh信号通路的下游靶基因。2、Hh信号通路通过调控下游效应分子TPX2的表达促进肝癌细胞增殖。3、TPX2是转录因子FOXM1的直接靶基因;FOXM1直接正向转录调控TPX2。4、Hh-FOXM1信号轴介导的肝癌细胞增殖依赖于TPX2的表达。5、FOXM1和TPX2在肝癌组织中异常高表达,二者表达呈正相关趋势,且与肝癌患者不良预后相关。提示FOXM1、TPX2可作为肝细胞癌的潜在预后标志物及治疗靶点。
杨国华[6]（2018）在《TET2/E-cadherin/β-catenin调控环路在肝癌演进中的作用研究》文中研究指明肝癌死亡率高居我国癌症相关死亡率的第2位。生长速度过快、易出现转移、化疗效果差、治疗后易复发是导致肝癌死亡率高居不下的主要原因。其发病机制目前仍不十分清楚。明确肝癌迅速进展的原因,深入研究其发病分子机制,筛选和鉴定能够用于肝癌诊断、预后判断及治疗的新靶点有着深远的临床意义。大量研究表明,表观遗传学在肝癌进展中发挥重要作用。本研究中我们发现TET2在肝癌细胞中高表达,且与E-cadherin表达模式呈负相关。TET家族可以催化5mC发生连续氧化反应,羟化形成5hmC,后者经过系列变化可转化为胞嘧啶,实现DNA去甲基化。TET家族在多种肿瘤组织特别是血液恶性肿瘤中表达缺失,发挥抑癌基因的作用。在本研究中我们发现TET2在肝癌细胞中高表达,且与E-cadherin表达呈负相关,提示TET2对E-cadherin存在非去甲基化依赖的调控方式。本研究拟对TET2在肝癌中表达上调的原因及其促进肝癌进展的分子机制进行研究。我们首先利用免疫组化对TET2在肝癌组织中的表达模式进行了研究,发现TET2在肝癌组织中表达上调,TET2高表达者具有肝癌肿块大、存在肝内、外转移以及存在脉管侵犯密切相关,TET2高表达者预后不良。进一步我们利用功能获得和功能缺失实验在体内外研究了 TET2对肝癌细胞生物学行为的影响。结果显示TET2具有促进肝癌细胞增殖和侵袭转移的作用。进一步的分子机制研究中,我们采用ChIP-qPCR方法证实抑制TET2的表达或使用去乙酰化酶抑制剂（MS-275）处理肝癌细胞可以显着增加E-cadherin启动子区H3K9位点和H4K16位点的乙酰化水平,过表达TET2则可显着降低上述两个位点的乙酰化水平,进一步免疫共沉淀检测发现TET2可以与HDAC1相互结合形成复合物,揭示肝癌细胞中TET2可以通过招募HDAC1与之形成复合物,引起E-cadherin启动子区组蛋白去乙酰化,通过非甲基化途径发挥抑制E-cadherin表达的作用。进一步研究发现肝癌细胞中β-catenin转录活性与TET2的表达水平呈正相关,而与E-cadherin表达水平呈负相关,利用TCF/LEF活性报告实验,发现在肝癌细胞中,TET2高表达可显着增加β-catenin的转录活性,随之激活Wnt通路,发挥促进肝癌进展的作用。同时,我们对肝癌细胞中TET2表达上调的机制进行了研究。首先利用在线数据库JASPAR进行生物信息学预测,结果显示TET2上游具有3个TCF4潜在的结合位点,ChIP-qPCR实验证实TET2上游预测的A位点和C位点可以直接与TCF4/β-catenin结合,抑制β-catenin的表达,则TET2启动子区与TCF4/β-catenin的结合显着降低。进一步利用启动子荧光素酶报告基因实验证实,在下调β-catenin胞内水平后,TET2上游TCF4/β-catenin结合位点野生型载体转染的肝癌细胞中,荧光素酶活性显着下降,而转染结合位点突变型载体的细胞中,荧光素酶活性无明显变化,提示TET2启动子区域预测的A位点和C位点可以直接与β-catenin/TCF4转录因子结合并具有转录活性。肝癌细胞中β-catenin活性增加可引起TET2的转录激活,从而引起TET2的表达上调,形成TET2/E-cadherin/β-catenin正反馈环路,促进肝癌的进展。
章健,来维洁,周秀梅,王毅刚[7]（2017）在《靶向肝癌干细胞的肿瘤治疗进展》文中研究说明肝癌是最常见的五大癌症之一,也是患者死亡的重要癌症类型之一。传统方法对治疗早期肝癌取得了一定的进展,但是癌症的复发、转移和耐药仍未得到根本解决,而这些现象可通过癌症干细胞（cancer stem cells,CSCs）理论进行解释。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）,目前认为其可能部分起源于肝癌干细胞。与肝癌干细胞有关的Wnt/β-catenin、TGF-β、Notch和Hedgehog等信号通路和Ep CAM、Lin28和mi R-181等分子,在体内外调节肝癌干细胞活性,并可用以设计预防或治疗癌症的分子靶点。然而,肝癌和肝癌干细胞涉及一个复杂的发生和调节机制,存在相互干扰和冗余的信号通路,因此针对单个分子或途径的治疗效果有限。该文综述了肝癌干细胞与肝癌发生的进展及其相关的信号通路与关键分子,与针对肝癌干细胞治疗的新策略。
常巍[8]（2016）在《8q24区域的LncRNA基因多态性与广东顺德人群原发性肝癌的遗传关联性研究》文中研究说明背景原发性肝癌（Primary hepatic carcinoma,PHC）,是最常见的恶性肿瘤之一,现在全球发病率接近62.6万/年,死亡率接近60万/年,发病率居于全球恶性肿瘤的第五位,癌症的死因顺位位居第三位;而全球肝癌新发病例的一半以上在我国,据统计每年肝癌新发病例约30万,在癌症发病中居于第二位,癌症的死因顺位位居第二位;中国肝癌发病率以东南沿海最高,同全国相比,广东省肝癌死亡率高出全国平均水平50%,与全球相比,是全球平均水平的3～4倍。广东的3次大规模死因调查均提示,顺德地区居民恶性肿瘤死因顺位居于第一位即为肝癌。而肝癌起病隐匿,好发于中老年男性,男女之比为2:1-5:1,且病程短,疾病进展迅速,80%患者就诊时已处于癌症中晚期,失去了治疗的最佳时期,因而治疗效果不佳,病死率高,五年生存率仅在5%左右,严重影响我国居民的生命与健康。因此,在该地寻找和建立有效的预防和筛查方法,降低肝癌的发病率和死亡率,已成为当地最主要的公共卫生问题。目前可以确定的是,肝癌的发生是一个十分复杂的过程,是多个环境和遗传因素、多个基因参与和突变的结果,有多种风险因素参与肝细胞肝癌的致病起始,促癌作用和病情进展。目前已经证实乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染、血吸虫病、肝硬化、酗酒及摄入大量的黄曲霉素等是导致肝癌发生的重要原因,在我国,大部分肝癌患者有HBV感染史。但有相关的研究也表明,病人机体对HBV病毒的免疫能力存在着很大的个体差异,也就是说患者感染HBV病毒后,病情进展以及恶化程度取决于病人自身抗病毒的免疫中相关易感基因的多态性。而目前研究广东地区肝癌相关的易感基因多态性的相关分析数据非常少。在过去的数十年,对于人类基因与肿瘤发生关系的调查研究基本上都集中在结构基因及其相关的表达调控序列上,然而最近几年的研究表明人类基因的非编码序列对肿瘤生物学行为有至关重要的作用。曾被视为转录“噪声”的长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）近年来被证实在染色质重塑、组蛋白修饰、转录干扰、原癌基因活化等多个生物学进程中发挥关键调控作用,且相对于编码蛋白的基因,LncRNA在肿瘤中是非常精确且特异性表达的,这个特点让其成为新的肿瘤标记物非常有希望。于是LncRNA成为近年来肝癌等恶性肿瘤的病因学研究中的一个全新热点。已有研究证实许多LncRNA的异常表达与肝癌的发生、转移、预后或诊断密切相关。最近的研究发现,一些LncRNAs在MYC位点附近转录,且从多层面参与MYC的调控。8q24之前被认为是缺少蛋白编码基因的“基因沙漠”,位于8q24染色体区域的MYC原癌基因其上游区域的IncRNA被GWAS鉴定出很多独立的癌症可能位点,被认为是多种癌症（前列腺,卵巢和结肠癌）的高危险区域。而位于这个区域的CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1基因已被证实和多种癌症的发病有关,且有的已作为某种特殊癌症非常有效的生物标记物。但是涉及这个个基因与肝癌的报道很少,仅有个别文献涉及CCAT1在肝癌中有高表达,且之前的研究的人群样本量较少,SNP位点不够全面,统计效能有限。综上所述,在广州顺德展开流行病学调查研究来阐明诱发肝癌的危险因素,采用基于单核苷酸多态性和单体型的研究策略,扩大样本量、应用病例对照及队列研究设计等分析性研究方法,深入开展LncRNA遗传多态性与恶性肿瘤易感性的研究,将有助于个体和群体罹患肝癌的风险的预测,而且对于阐明肝癌发生及发展机制有极为重要的意义,最终有助于提高肝癌的早预防、早诊断和早治疗的水平。为此我们开展此项研究。拟将人群流行病学、分子生物学、生物信息学和统计学方法有机结合,选择8q24区域的CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、中的潜在功能性变异位点,深入开展LncRNA遗传多态性与肝癌易感性的研究,揭示对肝癌有重要影响的基因-基因、基因-环境交互模式,将有助于肝癌的病因学深入研究,以期为肝癌预测预警体系的构建提供遗传标志物,最终将有助于提高肝癌的早期预防、早期诊断和早期治疗的水平,对控制肝癌的流行、减轻肝癌的疾病负担有极为重要现实意义。目的筛选和预测位于8q24染色体上的CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR15个LncRNA中的可疑位点,研究其候选基因SNP与原发性肝癌的易感性;同时揭示候选基因对原发性肝癌有重要影响的基因-基因、基因-环境交互模式,为进一步深入开展肝癌遗传易感机制研究提供科研依据。方法（1）按照病例对照研究策略,选取广东顺德人群中的619例肝癌病例和619例对照,进行流行病学问卷调查收集肝癌的环境及遗传因素信息,采用单因素logistic回归筛选其危险因素信息;（2）用Haploview软件以R2>0.8,MAF>0.05的标准,参考大量文献,结合生物信息学技术,运用SNP功能预测数据库筛选和预测CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1中的潜在功能性遗传变异位点;（3）采用硅胶膜吸附法进行研究对象血液的DNA提取,由博淼生物科技（北京）有限公司采用中通量MassArray分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术系统Sequenom进行SNP基因分型,计算其基因型及等位基因频率的分布,分析候选基因潜在功能区域的单核苷酸多态性;（4）对病例组及对照组SNPs进行Hardy-Weinberg平衡检验,采用卡方检验、logistic回归、单倍体分析等方法分析候选基因SNP与原发性肝癌易感性的相关性;（5）基于流行病学调查结果及SNP与肝癌易感性结果,采用条件logistic回归模型、叉生分析、多因子降维法（MDR）方法探索候选基因CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1对原发性肝癌有重要影响的基因-基因、基因-环境交互模式。结果1、研究对象共计1238例,病例组619人,对照组619人。男女比例为6.5:1,男性平均年龄为60±12岁,女性平均年龄为57±16岁。其中,肝癌患者平均首诊年为55±12岁,以50～70岁为主,占57.19%,72.05%患者有乙肝感染史,68.5%患者有慢性肝炎史,43.13%患者有肝硬化史,11.47者有肝吸虫感染史,68.98%患者吸烟,57.19%患者饮酒,24.88%患者食用生鱼,58.48%患者曾经饮用沟塘水,25.52%患者有乙肝家族史,14.54%有肝癌家族史,19.22%患者有肿瘤家族史。2、单因素条件Logistic回归分析得:乙型肝炎病毒感染、肝吸虫感染、吸烟、饮酒、有无进食鱼生史、是否饮用沟塘水、肝癌家族史、肿瘤家族史8个因素可能是原发性肝癌发病相关的危险因素。（P<0.05）,其OR值和95%置信区间分别为:18.88（13.53-25.61）、3.15（1.46-4.77）、1.56（1.37-2.23）、1.62（1.22-2.06）、1.48（1.12-1.85）、1.68（1.34-2.16）、3.81（2.27-5.95）、1.76（1.23-1.97）。3、对选定23个候选基因采用Mass ARRAY技术分型,经HWE遗传平衡定律分析得:CCAT1 基因的 rs10087719、PVT1基因的 rs4733813、rs77290463差异有统计学意义（P<0.05）外,其余位点差异均无统计学意义（P>0.05）。对符合HWE遗传平衡定律的20个SNP位点的基因型和等位基因频率在病例组和对照组的分布采用x2检验进行分析得:CCAT1中的rs6989575、PVT1中的rs13257657和rs13281615的基因型和等位基因频率分布在两组间差异具有统计学意义（χ2=11.5172,P=0.041,χ2=6.262,P=0.044,χ2=24.654,P=0.000）,其他各SNP的基因型和等位基因频率分布均无统计学差异（P>0.05）。4、对20个SNP位点用条件logistic回归模型进行基因型关联分析,结果提示:rs13257657、rs13281615、rs6989575三个位点的基因型与肝癌发生风险有统计学关联（P<0.05,OR值均>1）,提示这三个基因可能为肝癌的危险因素,经调整年龄、性别、乙肝病毒感染史、乙肝家族史等因素后,三个SNPs基因型与原发性肝癌发病的风险仍具有统计学关联（P<0.05,OR值均>1）。进一步的显性模型、隐性模型和加性模型的分析提示:rs13281615、rs6989575在显性模型有统计学意义（P<0.05,OR值>1）,rs1 3257657在显性模型、隐性模型和加性模型有统计意义（P<0.05,OR值>1）,而其他SNPs基因型与原发性肝癌发病风险均没有统计学关联（P>0.05）。对20个SNP位点的单倍体分析没有提示病例和对照组间有统计意义的单体型（P>0.05）。5、利用叉生分析表对每个基因的SNP位点进行交互作用分析,基于条件logistic回归模型,采用相乘和相加交互作用模型,并进而得出相应结论。结果显示:PVT1基因的rs13281615位点与CCAT1基因的rs77628730位点存在相乘和相交交互作用（P<0.05）,CCAT1基因的rs6989575位点与CASC8基因的rs1562430位点存在相乘交互作用（P<0.05）,其他各基因之间的交互作用模型均无统计学意义（P>0.05）。6、对 CCAT1 上的 rs6989575、rs77628730、rs7816475,CCAT2上的 rs10808556,PVT1 上的 rs13281615、rs13257657、CASC8 上的 rs1562430,PRNCR1上的rs13252298共8个基因与饮酒史、曾饮用沟塘水、乙肝病毒感染、肝吸虫感染史、肝癌家族史、肿瘤家族史、吸烟、食用生鱼共8环境因素分别进行基因-环境交互分析,结果提示:CCAT1基因中的rs7816475遗传变异与饮用沟塘水,乙肝病毒感染间存在交互作用（P=0.020,P=0.032）,携带rs7816475 GG基因型的饮用沟塘水阳性者肝癌发病风险增加,OR值为1.513（95%CI=1.052-2.176）;携带rs7816475 GG基因型、AA+AG基因型的乙肝病毒感染史阳性者肝癌发病风险显着增加,OR 值分别为 22.288（95%CI=14.155-35.095）;29.163（95%CI=15.503-54.858）;CCAT2基因中的rs10808556遗传变异与肝癌家族史存在相乘交互作用（P=0.047）,携带rs10808556TT基因型、CC+TC基因型的肝癌家族史阳性者肝癌发病风险增加,OR值分别为2.981（95%CI=1.792-4.960）、8.616（95%CI=3.013-24.635）;PVT1基因中的rs13281615遗传变异与饮酒史、乙肝病毒感染史同时存在相乘和相加交互作用（P<0.05）,携带rs13281615 GG基因型、AA+AG基因型的饮酒史阳性者肝癌发病风险增加,OR值为2.625（95%CI=1.884-3.658）、1.548（95%CI=1.154-2.078）,携带 rs13281615 GG 基因型、AA+AG基因型的乙肝病毒感染史阳性者肝癌发病风险显着增加,OR值分别为26.637（95%CI=16.906-41.969）、17.032（95%CI=11.512-25.199）;PRNCR1基因中的rs13252298遗传变异与饮酒史存在相乘交互作用（P=0.048）,携带rs13252298 GG+AG基因型的饮酒史阳性者肝癌发病风险增加,OR值为1.416（95%CI=1.047-1.916）。7、对 CCAT1上的 rs6989575、rs77628730、rs7816475,CCAT2上的rs10808556,PVT1上的 rs13281615、rs13257657,CASC8上的 rs1562430,PRNCR1上的rs13252298共8个基因进行分析,MDR结果得:最佳的2因子模式是CCAT1基因中的rs6989575和CASC8基因中的rs1562430多态,预测准确率最高,TA（Testing accutracy）预测准确率=59.25%,CVC达到10/10,但经1000次置换检验该模型无统计学意义（P>0.05）。8、对CCAT1上的rs6989575、rs77628730、rs7816475,CCAT2上的rs6983267,PVI1上的 rs13281615、rs13257657、CASC8 上的 rs1562430,PRNCR1上的rs1016343共8个基因与饮酒史、曾饮用沟塘水、乙肝病毒感染、肝吸虫感染史、肝癌家族史、肿瘤家族史共5环境因素进行分析,MDR结果得:三因子的最佳模型为PVT1基因的rs13281615多态与乙肝病毒感染、饮酒史,且该三因子模型的预测准确性最高,TA=78.92%。CVC达到8/10,经1000次置换检验该模型具有统计学意义（P<0.001）。结论1、广州顺德地区的肝癌发病以中老年男性高发,肝癌相关危险因素为:乙型肝炎病毒感染、肝吸虫感染、吸烟、饮酒、有无进食鱼生史、是否饮用沟塘水、肝癌家族史、肿瘤家族史。2、PVT1基因中的rs13257657位点、rs13281615位点、CCAT1基因中的rs6989575位点可能与肝癌发生风险有关联,但需进一步验证。3、本研究中未发现多基因间存在有意义的基因-基因交互模型。4、PVT1基因的rs13281615多态与乙肝病毒感染、饮酒史可能存在基因—环境交互作用,但仍需在今后的研究中进一步扩大规模,选择在其他地区及种族人群进行研究。
李军[9]（2009）在《新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究》文中提出原发性肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,目前尚无根治方法。自杀基因疗法,又名基因介导的酶-前药疗法,能特异性提高药物在肿瘤中的浓度,并具备独特的旁观者效应,是肿瘤基因治疗的重要方法之一。本研究将木薯来源的linamarase（lis）引入肝癌基因治疗中,利用其水解前体药物linamarin（lin）,并产生毒性代谢产物HCN的特性,从而实现对肝癌细胞的杀伤。通过建立lis稳转肝癌细胞系,发现其本身对细胞生长,细胞周期等特性并无影响。此外单独使用前体药物lin也未发现细胞毒性,从而提示了该策略的安全性。为提高目的基因的表达及针对肝癌的靶向性,我们以ViraPower?病毒载体系统为基础,分别构建CMV及AFP启动子转录的lis腺病毒载体。体外实验表明,含CMV启动子的腺病毒联合lin具备针对多种肿瘤细胞的强大抑制效应及旁观者效应。而含AFP启动子的病毒仅具备对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,从而体现了其针对肝癌的特异性和靶向性。动物实验提示lis能特异性表达于肝癌组织中,联合使用lin后能显着抑制肿瘤生长并延长动物存活时间。结果表明,lis/lin系统是一种潜在的肝癌基因治疗策略,值得进一步深入研究。目的:1.构建稳定转染lis基因的肝癌细胞系,实现lis酶在真核细胞中的活性表达,观察它对肿瘤细胞的体内、体外生物学特性的影响。初步了解lis基因及lin对肝癌细胞的作用;2.运用ViraPower?腺病毒载体系统,构建CMV启动子转录下的lis重组腺病毒载体,观察该病毒载体的感染效率及目的基因表达情况。应用重组病毒联合前体药物lin进行多种肿瘤细胞系的体内、体外治疗,探讨腺病毒载体介导的lis/lin系统的抑瘤效果及作用机理;3.克隆AFP启动子,检测其靶向转录活性。构建AFP启动子转录的lis重组腺病毒,通过体外实验及裸鼠荷瘤实验来检验该病毒前药体系针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,实现lis/lin系统治疗原发性肝癌转录水平上的靶向调控。方法:1.PCR法从木薯cDNA中克隆并扩增lis cDNA,将该基因亚克隆至pcDNA3.1+质粒中,构建重组真核表达载体。脂质体转染及药物筛选相结合,构建稳定转染lis肝癌细胞系HepG2/lis。观察稳转细胞形态学变化,生长曲线,流氏细胞周期,裸鼠体内成瘤曲线等,并进行肿瘤细胞内lis酶活性分析。用不同浓度的lin培养HepG2细胞,观察lin本身对HepG2细胞生长的影响及细胞毒性;2.将lis cDNA亚克隆于ViraPower?腺病毒载体系统的入门克隆pENTRTM2B中,利用特异性LR反应将入门克隆中的lis导入腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST中（含CMV启动子） ,获得重组病毒骨架载体pAd/CMV/lis。线性化骨架载体并转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-CMV-lis。扩增并纯化重组腺病毒,TCID50法测定它的滴度。利用含报告基因的腺病毒Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞,摸索病毒的最佳感染复数。通过联合Ad-CMV-lis及前药lin进行多种肿瘤细胞系的体外及体内抑瘤实验,观查该系统的抑瘤活性及旁观者效应。用DNA片段化检测、Annexin-V/PI流式细胞分析、瘤组织病理学及TUNEL染色进一步探索lis/lin系统的抑瘤机理。3.RT-PCR法从HepG2（AFP+）细胞基因组中克隆并扩增AFP启动子,亚克隆入pEGFP-1质粒中,利用报告基因EGFP检测其特异性转录活性。用AFP启动子替换pcDNA3.1+质粒中的CMV启动子,然后将lis cDNA插入该质粒多克隆位点中,实现AFP启动子与lis的串联。通过构建病毒入门载体及LR反应,将AFP-lis序列定向克隆于pAd/PL-DEST腺病毒骨架载体中（不含启动子）,获得骨架载体pAd/AFP/lis。将其转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-AFP-lis。重组病毒经扩增、纯化后,联合lin进行体内、体外抑瘤实验,验证该体系对AFP阳性肿瘤细胞的特异性及靶向性杀伤。结果:1.成功构建lis稳转肝癌细胞系HepG2/lis。发现它与空质粒转染组及空白对照细胞相比,在细胞形态,生长曲线,细胞周期分布,体内成瘤生长曲线等方面差异不显着（P>0.05）。HepG2/lis细胞给予lin后,能产生代谢产物HCN,并随lin浓度的增加而增多,提示lis酶在真核细胞中能以活性方式表达。此外单独使用lin对细胞生长并无抑制作用。2.成功构建重组腺病毒Ad-CMV-lis。联合应用lin后能在体内、体外有效抑制多种肿瘤细胞的生长,抑瘤作用与lin呈明显的时间、剂量依赖效应。肿瘤细胞治疗后经DNA片段化检测未发现典型的凋亡DNA ladder, Annexin-V/PI流式细胞分析提示经治疗后凋亡及坏死细胞均增高,但以坏死细胞增高为主。瘤组织病理学观察发现Ad-CMV-lis/lin治疗组中出现大量的坏死区,并发现较多的TUNEL阳性染色细胞。3.克隆并重组了276bp的AFP启动子。EGFP报告基因分析提示,该启动子具备AFP阳性肝癌细胞的特异性转录活性。成功构建AFP启动子转录下的重组腺病毒Ad-AFP-lis,实现了lis在AFP阳性肝癌细胞系中的高效特异性表达。体外及动物治疗实验均证明,该病毒联合lin治疗,能特异性抑制AFP阳性肝癌细胞系的生长,并延长动物存活时间,而对AFP阴性肝癌细胞系无杀伤效果。结论:1.植物来源的lis cDNA能稳定表达于真核细胞中,并能正确包装出类似大小,具备β-葡萄糖苷酶活性的lis蛋白。lis cDNA在细胞中的稳定整合对细胞形态、生长特性、细胞周期、成瘤性等生物学特点并无明显影响。而前体药物lin对细胞也具有低毒性,因此lis/lin系统是一种安全的自杀基因治疗策略。2.通过重组腺病毒载体,发现腺病毒具有靶细胞感染率及目的基因表达水平高,包装使用方便,病毒滴度高,不整合到宿主基因组中等优点,因此能作为lis/lin自杀基因治疗的高效表达载体。3.重组腺病毒Ad-CMV-lis在体内、体外均表现出对多种肿瘤细胞系的抑制作用,提示lis/lin自杀基因系统具备较广的治疗适用范围。由于不同肿瘤的生物学特点不同,因此该系统在其他肿瘤中的应用潜能有待于进一步研究。4. 276bp的AFP启动子能调控lis/lin系统在肝癌中的靶向性转录,实现针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤。然而由于原发性肝癌中有少部分呈AFP阴性表达,因此改造现有的AFP启动子,提高其针对AFP阴性的肝癌细胞的转录水平,是值得深入研究的问题。
杜芝燕,王妍,陈惠华,徐元基,徐丁尧,蔺会云,刘刚,谭晓刚,陆应麟[10]（2006）在《一种改进的重组腺病毒载体的包装和克隆纯化方法》文中研究表明目的:重组腺病毒载体是目前使用最多的病毒载体之一。常用的AdEasyTM包装系统在制备条件复制型腺病毒时易混有野生型腺病毒或可复制型腺病毒（RCA）,在HEK293细胞中包装出的重组腺病毒必须经过2～3轮噬斑的筛选,费时费力。本实验拟对常规包装方法进行改进。方法:将腺病毒载体质粒转染至HEK293细胞过程中的液体培养基更换为琼脂糖凝胶的混合培养液,因为凝胶形成的阻碍,包装出的病毒不能通过细胞-培养液-细胞的方式进行扩散,只能依靠细胞-细胞的方式来扩展而形成病灶（噬斑）;然后随机挑选单个噬斑进行PCR鉴定,筛选出特异的目标病毒。结果:采用常规方法在HEK293细胞中初包装出的腺病毒,同源重组产生的RCA已被检测到。采用改进方法制备的重组腺病毒,能排除背景病毒的干扰,使重组腺病毒载体的包装和克隆纯化一步完成;利用此病毒初步在体外实现了对人肝癌细胞的特异性杀伤。结论:改进的方法是一种高效、简便、快捷地包装并纯化重组溶瘤腺病毒的方法,采用该方法包装的重组溶瘤腺病毒能满足实验的需要。
二、杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析（论文提纲范文）
（1）SEMA3C错义突变在肝癌发生发展中的作用和机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1.肝癌 |
| 2.SEMA3C与肿瘤 |
| 2.1 SEMA3C蛋白简介 |
| 2.2 SEMA3C在发育中的功能 |
| 2.3 SEMA3C在癌症和癌干细胞中的作用 |
| 2.4 SEMA3C受体在癌变中的作用 |
| 2.5 针对SEMA3C及其受体的治疗策略 |
| 第一章 SEMA3C在肝癌患者中的突变情况以及过表达载体和稳转株的构建 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 组织样本和细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 SEMA3C在肝癌临床组织样本中突变情况 |
| 2.2 SEMA3C在不同肝癌细胞系中的表达情况 |
| 2.3 SEMA3C过表达稳转株的构建 |
| 3.讨论 |
| 第二章 过表达SEMA3C对肝癌细胞体外功能的影响 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验样本细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 过表达SEMA3C对肝癌细胞增殖的影响 |
| 2.2 过表达SEMA3C对肝癌细胞克隆形成的影响 |
| 2.3 过表达SEMA3C对肝癌细胞迁移的影响 |
| 2.4 过表达SEMA3C对肝癌细胞凋亡的影响 |
| 3.讨论 |
| 第三章 SEMA3C影响RTK通路 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验样本细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 过表达SEMA3C激活RTK通路 |
| 2.2 SEMA3C的6个受体的敲低稳转株的构建 |
| 2.3 SEMA3C通过受体PLXND1和PLXNB1 激活RTK通路 |
| 3.讨论 |
| 第四章 Vandetanib通过RTK抑制肝癌生长 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验动物和细胞株 |
| 1.2 主要实验仪器、试剂与材料 |
| 1.3 主要实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.研究结果 |
| 2.1 肝癌细胞对Vandetanib的 IC50值 |
| 2.2 Vandetanib对肝癌细胞RTK通路的影响 |
| 2.3 Vandetanib抑制肝癌皮下瘤的生长 |
| 2.4 Vandetanib通过抑制RTK通路蛋白抑制肝癌体内生长 |
| 2.5 Vandetanib的安全性评价 |
| 3.讨论 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 潜在的应用价值 |
| 文献综述 SEMA3C在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 DNA提取 |
| 1.3 DNA样本评估及全外显子测序 |
| 1.4 Oncotator注释突变体 |
| 1.5 三株细胞的进化树以及突变基因分布 |
| 1.6 功能富集分析 |
| 1.7 蛋白质网络互作分析 |
| 1.8 HUB基因突变与HCC病人预后关联分析 |
| 1.9 HCC中 HUB基因的表达与病人预后关联分析 |
| 1.10 三株细胞的差异蛋白质中的基因突变分析 |
| 1.11 突变基因KEAP1 分析及PCR验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 根据WES分析三株细胞的突变情况 |
| 2.2 肿瘤驱动突变基因和致癌信号通路上的突变情况 |
| 2.3 三株细胞的共有突变基因分析 |
| 2.4 三株细胞的特有突变基因分析 |
| 2.5 HCC中 HUB基因的表达与病人预后关联分析 |
| 2.6 三株细胞差异蛋白质中的基因突变分析 |
| 2.7 突变KEAP1 基因分析和PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肝癌的主要驱动基因与肿瘤 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参与的课题项目 |
（3）肝癌和癌栓的全基因组甲基化分析及差异基因的相关临床特征研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 绪论 |
| 第一部分 肝细胞肝癌组织及门静脉癌栓(PVTT)组织的DNA甲基化组学分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 患者一般临床病例学资料 |
| 3.2 肝细胞肝癌原发灶和门静脉癌栓的全甲基化组特征 |
| 3.3 差异甲基化基因特征分析 |
| 3.4 癌旁组织到肝癌原发灶组织再到门静脉癌栓组织甲基化发生梯度改变的基因 |
| 3.5 关键梯度变化基因分析 |
| 3.6 甲基化转移酶抑制剂地西他滨(DAC)和重组人肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(rh-TRAIL)在体外实验中能够协同作用于肝癌细胞系抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二部分 候选基因(DNAH17 以及ADRA1A)在肝癌中的甲基化特征分析及、肝癌临床病理学特征相关性分析及机制研究 |
| 1 引言 |
| 1.1 DNAH17基因 |
| 1.2 ADRA1A基因 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 DNAH17基因甲基化与肝癌临床特征相关性分析 |
| 3.2 ADRA1A基因甲基化与肝癌临床特征相关性分析及潜在机制探索 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DNAH17甲基化水平研究讨论 |
| 4.2 ADRA1A甲基化水平研究讨论 |
| 5 本章小结 |
| 5.1 在HCC中检测到DNAH17基因的低甲基化状态 |
| 5.2 笔者观察到 ADRA1A 在 HCC 中的低表达和高甲基化 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞肝癌中 E-cadherin 蛋白基因组及表观修饰调控机制 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间科研成果 |
（4）de Winter综合征及复发性肝癌克隆起源的早期诊断（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究意义 |
| 研究现状与成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、M-JBT治疗de Winter综合征 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 治疗对象 |
| 1.1.2 治疗方法和过程 |
| 1.1.3 药物辅助 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 术后效果 |
| 1.2.2 长期疗效 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 疾病认识误区 |
| 1.3.2 快速识别与及时治疗 |
| 1.3.3 改进技术的优势 |
| 二、复发性肝癌的克隆起源鉴定 |
| 2.1 对象与方法 |
| 2.1.1 临床样本 |
| 2.1.2 DNA提取与全外显子测序 |
| 2.1.3 检测SNVs |
| 2.1.4 已知肝癌驱动基因分析 |
| 2.1.5 突变频谱和突变特征分析 |
| 2.1.6 肝癌系统进化分析 |
| 2.1.7 复发性肝癌早期标志物 |
| 2.1.8 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 原发肝癌与复发肝癌编码区非同义SNVs分布 |
| 2.2.2 已知肝癌驱动基因分析 |
| 2.2.3 突变频谱与突变信号分析 |
| 2.2.4 系统进化分析 |
| 2.2.5 复发性肝癌早期标志物 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全外显子测序SNVs分布 |
| 2.3.2 已知驱动基因 |
| 2.3.3 突变频谱分析 |
| 2.3.4 突变信号分析 |
| 2.3.5 APOBEC富集分析 |
| 2.3.6 系统进化分析 |
| 2.3.7 复发性肝癌早期标志物 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 肝癌的克隆起源、异质性与早期复发标记物研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）异常活化的Hh-FOXM1-TPX2信号轴促进肝癌细胞恶性增殖的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 TPX2是Hedgehog信号通路的下游靶基因 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系、菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 转化、扩增并提取质粒 |
| 2.2.3 PEI法进行细胞转染,制备N-Shh条件培养基 |
| 2.2.4 构建慢病毒稳定细胞株 |
| 2.2.5 TRIzol法抽提细胞总RNA |
| 2.2.6 逆转录合成cDNA |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 细胞总蛋白提取 |
| 2.2.9 BCA法蛋白定量 |
| 2.2.10 Western blot实验 |
| 2.2.11 高通量检测技术分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 寻找与增殖相关的Hh通路靶基因 |
| 2.3.2 Hh信号通路影响肝癌细胞中TPX2 的表达 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 Hh信号通路通过调控TPX2 表达促进肝癌细胞增殖 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 干扰质粒构建 |
| 3.2.3 构建慢病毒稳定细胞株 |
| 3.2.4 Real-Time PCR |
| 3.2.5 Western blot |
| 3.2.6 EdU增殖检测实验 |
| 3.2.7 细胞生长曲线测定 |
| 3.2.8 细胞克隆形成实验 |
| 3.2.9 软琼脂集落形成实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 构建TPX2 过表达和敲除慢病毒稳定细胞系 |
| 3.3.2 干扰TPX2 表达,抑制N-Shh促进肝癌细胞增殖的能力 |
| 3.3.3 过表达TPX2 可恢复GANT61 对肝癌细胞增殖的抑制 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 Hh信号通路调控TPX2 表达的分子机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及菌株 |
| 4.1.2 动物实验 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养及菌株 |
| 4.2.2 质粒构建 |
| 4.2.3 使用Lipofectamine2000 脂质体进行细胞转染 |
| 4.2.4 双荧光素酶报告基因实验(Dual-Luciferase reporter assay) |
| 4.2.5 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, Ch IP) |
| 4.2.6 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 生物信息学预测TPX2 启动子区域的转录因子 |
| 4.3.2 FOXM1与TPX2 表达具有相关性 |
| 4.3.3 FOXM1 在转录水平调控 TPX2 |
| 4.3.4 TPX2 是转录因子FOXM1 的直接靶基因 |
| 4.3.5 体内实验验证FOXM1 调控TPX2 的表达 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 Hh-FOXM1 信号轴调控TPX2 的表达并促进肝癌细胞恶性增殖 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 构建过表达FOXM1+干扰TPX2 的肝癌慢病毒稳定细胞系 |
| 5.2.2 体外细胞功能实验 |
| 5.2.3 细胞周期分析实验 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 验证慢病毒稳定细胞系 |
| 5.3.2 FOXM1 通过调控TPX2 的表达促进肝癌细胞的体外增殖 |
| 5.3.3 肝癌细胞中存在Hh-FOXM1-TPX2 信号轴 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 FOXM1和TPX2 在肝癌组织中异常高表达并显着影响患者预后 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 肝癌临床组织标本及临床资料收集 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 实验仪器 |
| 6.1.4 相关溶液的配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 标本的取材与处理 |
| 6.2.2 制作石蜡切片 |
| 6.2.3 提取组织总蛋白 |
| 6.2.4 BCA蛋白定量 |
| 6.2.5 Western blot检测蛋白表达 |
| 6.2.6 H&E染色 |
| 6.2.7 免疫组化染色步骤 |
| 6.2.8 免疫组化染色评分 |
| 6.2.9 统计学方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 一般资料 |
| 6.3.2 FOXM1和TPX2 在肝癌组织中异常高表达 |
| 6.3.3 FOXM1和TPX2 表达正相关 |
| 6.3.4 FOXM1和TPX2 的表达与肝癌患者多组临床病理特征相关 |
| 6.3.5 FOXM1、TPX2 异常高表达,提示肝癌患者不良预后 |
| 6.4 结论 |
| 第7章 研究讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）TET2/E-cadherin/β-catenin调控环路在肝癌演进中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 肝癌患者及正常肝组织标本 |
| 2.1.3 实验所用细胞株 |
| 2.1.4 实验所用质粒 |
| 2.1.5 实验用引物 |
| 2.1.5.1 qRT-PCR所用引物 |
| 2.1.5.2 CHIP-QPCR所用引物 |
| 2.1.6 主要试剂 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.1.8 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 TET2在肝癌细胞及肝癌组织中的表达模式研究 |
| 3.2 体内和体外实验证实TET2高表达具有促进肝癌细胞增殖和侵袭转移的能力 |
| 3.2.1 体内、体外实验证实TET2高表达具有促进肝癌细胞增殖的作用 |
| 3.2.2 体外实验证实TET2高表达具有促进肝癌细胞增殖的作用 |
| 3.3 TET2招募HDAC1形成复合物作用于E-CADHERIN抑制其转录活性,引起β-CATENIN信号通路持续活化 |
| 3.3.1 TET2具有抑制E-CADHERIN表达的功能 |
| 3.3.2 TET2通过招募HDAC1介导E-CADHERIN启动子区去乙酰化抑制其转录 |
| 3.3.3 肝癌细胞中TET2抑制E-CADHERIN的表达,激活β-CATENIN的转录活性 |
| 3.4 肝癌细胞中，β-catenin信号持续活化在转录水平上调TET2的表达 |
| 3.4.1 生物信息学预测TET2启动子区具有TCF4结合位点，β-catenin可以在转录水平调控TET2的表达 |
| 3.4.2 β-CATENIN/TCF4复合物可直接与TET2启动子区相结合在转录层面调控其表达 |
| 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 肝癌严重威胁人类健康，复杂的发病机制是制约有效治疗方案开发的瓶颈 |
| 4.2 甲基化修饰与肿瘤发生密切相关，作为去甲基化重要酶类的TET2,在肝癌中具有不同的作用机制 |
| 4.3 TET2经由组蛋白乙酰化水平降低介导E-cadherin下调，维持β-catenin持续活化 |
| 4.4 β-catenin/TCF4复合物作为转录因子靶向调控TET2表达，形成正反馈环路，促进肝癌进展 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
（8）8q24区域的LncRNA基因多态性与广东顺德人群原发性肝癌的遗传关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 肝癌现状 |
| 2 LNCRNA概述 |
| 3 生物信息学概况 |
| 4 立题依据 |
| 5 技术路线图 |
| 第二章 广州顺德原发性肝癌的流行病学调查 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 第三章 CCAT1、CCAT2、PVT1、CASC8、PRNCR1与肝癌易感性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 基因-基因、基因-环境交互作用探讨 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 结论 |
| 小结 |
| 论文创新点问题与展望 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. 原发性肝癌基因治疗现状 |
| 2. 原发性肝癌自杀基因治疗现状 |
| 3. 新型自杀基因linamarase/linamarin系统研究现状 |
| 正文 |
| 实验一 linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 真核表达载体pcDNA-lis的构建和鉴定 |
| 2.2 稳定转染肝癌细胞系HepG2/lis的建立 |
| 2.3 稳转细胞HepG2/lis的鉴定 |
| 2.4 稳转细胞lis酶活性检测 |
| 2.5 HepG2/lis细胞生物学特性分析 |
| 2.6 lin的细胞毒性分析 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 lis cDNA的克隆及真核表达载体构建 |
| 3.2 稳定转染细胞系的鉴定 |
| 3.3 稳定转染细胞lis酶活性鉴定 |
| 3.4 稳转细胞形态学观察 |
| 3.5 生长曲线及细胞周期分析 |
| 3.6 稳转细胞系体内成瘤活性 |
| 3.7 lin对HepG2 的细胞毒性分析 |
| 4 讨论 |
| 实验二 重组腺病毒介导lis/lin自杀基因系统对多种肿瘤细胞系的体内外杀伤 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系及动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 构建基于ViraPower?载体系统的重组腺病毒 |
| 2.2 重组腺病毒体外杀伤实验 |
| 2.3 重组腺病毒体外旁观者效应 |
| 2.4 lis/lin系统抑制肿瘤作用机理 |
| 2.5 重组腺病毒体内抑瘤实验 |
| 2.6 肿瘤组织病理学检查 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2 重组腺病毒感染MOI的确定 |
| 3.3 重组腺病毒感染后lis的表达 |
| 3.4 重组腺病毒体外杀伤及旁观者效应 |
| 3.5 lis/lin系统杀伤机理 |
| 3.6 重组腺病毒体内抑瘤实验 |
| 3.7 移植瘤组织学检查 |
| 4 讨论 |
| 实验三 AFP启动子调控lis/lin重组腺病毒系统靶向治疗原发性肝癌 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株及动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 AFP启动子的克隆、重组及鉴定 |
| 2.2 AFP启动子与lis cDNA的连接重组 |
| 2.3 含AFP启动子的lis重组腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.4 重组腺病毒体外杀伤实验 |
| 2.5 重组腺病毒体外旁观者效应 |
| 2.6 重组腺病毒体内实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AFP启动子的克隆、重组及鉴定 |
| 3.2 AFP启动子转录活性鉴定 |
| 3.3 构建AFP启动子引导的lis重组质粒 |
| 3.4 重组腺病毒 Ad-AFP-lis 的构建、扩增及纯化 |
| 3.5 重组腺病毒体外感染及目的基因表达测定 |
| 3.6 重组腺病毒体外抑瘤实验 |
| 3.7 重组腺病毒体内实验 |
| 3.8 肿瘤组织病理及免疫组化分析 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）一种改进的重组腺病毒载体的包装和克隆纯化方法（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 重组溶瘤腺病毒AdhafE1△55的包装 |
| 1.2.1 常规方法包装AdhafE1△55 |
| 1.2.2 改进的方法包装AdhafE1△55 |
| 1.3 重组溶瘤腺病毒AdhafE1△55的PCR鉴定 |
| 1.3.1 常规方法包装的AdhafE1△55的PCR鉴定 |
| 1.3.2 改进的方法包装的AdhafE1△55的PCR鉴定 |
| 1.4 野生型腺病毒或RCA检测 |
| 1.5 重组腺病毒AdhafE1△55的放大及滴度检测 |
| 1.6 重组腺病毒AdhafE1△55对人肝癌细胞的特异性杀伤实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 2种包装方法的比较 |
| 2.2 重组溶瘤腺病毒AdhafE1△55特异杂合启动子HREAF引物PCR结果分析 |
| 2.3 野生型腺病毒或RCA检测分析 |
| 2.4 重组腺病毒AdhafE1△55的滴度检测 |
| 2.5 MTT法测定细胞杀伤效率 |
| 3 讨论 |
四、杂合启动子HREAF的构建及其肝癌特异性分析（论文参考文献）
- [1]SEMA3C错义突变在肝癌发生发展中的作用和机制的研究[D]. 乔郭洁. 海南大学, 2020(04)
- [2]高、低转移肝癌细胞系外显子测序及进化分析[D]. 李祖俐. 重庆医科大学, 2020(02)
- [3]肝癌和癌栓的全基因组甲基化分析及差异基因的相关临床特征研究[D]. 樊潇霄. 浙江大学, 2020(01)
- [4]de Winter综合征及复发性肝癌克隆起源的早期诊断[D]. 王佳佳. 天津医科大学, 2020(06)
- [5]异常活化的Hh-FOXM1-TPX2信号轴促进肝癌细胞恶性增殖的分子机制[D]. 王奕婷. 南昌大学, 2020(08)
- [6]TET2/E-cadherin/β-catenin调控环路在肝癌演进中的作用研究[D]. 杨国华. 南方医科大学, 2018(01)
- [7]靶向肝癌干细胞的肿瘤治疗进展[J]. 章健,来维洁,周秀梅,王毅刚. 中国细胞生物学学报, 2017(01)
- [8]8q24区域的LncRNA基因多态性与广东顺德人群原发性肝癌的遗传关联性研究[D]. 常巍. 南方医科大学, 2016(04)
- [9]新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究[D]. 李军. 第四军医大学, 2009(12)
- [10]一种改进的重组腺病毒载体的包装和克隆纯化方法[J]. 杜芝燕,王妍,陈惠华,徐元基,徐丁尧,蔺会云,刘刚,谭晓刚,陆应麟. 生物技术通讯, 2006(04)