一、M蛋白阳性患者2007例的体液免疫特征分析（论文文献综述）
王倩云[1]（2021）在《AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步探索》文中认为本论文分为两个部分组成,主要讨论了AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步研究。第一部分:本研究主要利用肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）感染其易感细胞人横纹肌瘤细胞（Rhabdomyoma,RD）和人神经母细胞瘤（Neuroblastoma cells,SK-N-SH）,利用荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和蛋白免疫印记（Western-Blot,WB）,酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测EV71感染两种细胞系后黑色素瘤缺乏因子2（Absent in melanoma 2,AIM2）炎症小体及其下游基因的表达,通过流式细胞术检测EV71感染引起细胞焦亡情况。将纯化后的EV71通过颅内注射方式免疫出生24h C57野生型（Wild type,WT）及AIM2基因敲除鼠(AIM2 Gene knockout,AIM2-/-),对其感染后引起的临床症状进行评分,取感染后7d小鼠脑组织进行固定,脱蜡至水,HE染色观察EV71感染引起的炎症反应并通过免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry,IHC）检测EV71及AIM2的表达情况,qRT-PCR检测脑组织中VP1,Caspase1和IL-1β的表达水平。分离培养鉴定小鼠原代神经元细胞,观察EV71感染小鼠原代神经元细胞引起的形态学变化,EV71感染WT和AIM2-/-小鼠原代神经元细胞48h上清病毒滴度测定,qRT-PCR检测AIM2,Caspase1及IL-1β的表达,流式细胞术检测细胞焦亡情况。实验结果显示EV71感染RD、SK-N-SH细胞及小鼠原代神经元细胞可以激活AIM2炎症小体及其下游基因的表达。通过建立EV71感染小鼠原代神经元细胞模型,发现在感染AIM2-/-小鼠原代神经元细胞上清中检测到较高的病毒滴度,说明在原代神经元细胞中AIM2对EV71的复制同样具有抑制作用。EV71感染AIM2-/-鼠后脑组织较野生鼠观察到严重的炎性浸润和空泡形成,且VP1表达较野生型鼠也较高,表明AIM2可以抑制EV71病毒在脑中的复制。这些结果为宿主如何抵抗病毒感染,病毒免疫逃逸机制及抗病毒药物设计提供理论依据。第二部分:本研究构建了两种重组杆状病毒,其中一个是将人源的SARS-CoV-2的S基因克隆至p10启动子下游,利用Bac to Bac真核表达系统表达S蛋白并展示在病毒表面,另外一个是用哺乳动物启动子元件CMV启动子取代杆状病毒原有的p10和Polh启动子,将人源的SARS-CoV-2的S蛋白克隆至CMV启动子下游,利用杆状病毒有效转导进入哺乳动物细胞的特性将S基因带入哺乳动物细胞并在CMV启动子作用下表达外源S蛋白。采用皮下加腹腔注射重组病毒的方式,每两周免疫一次,共四次免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫10天后用ELISA检测血清中S蛋白特异性抗体生成情况;分离脾细胞后流式细胞技术检测IFN-γ和IL-4确定特异性细胞免疫应答类型;最后利用SARS-CoV-2假病毒检测小鼠血清中的中和抗体的效价。实验结果显示,两种方式构建的重组杆状病毒与野生杆状病毒及PBS组比较均可引起特异性细胞免疫和体液免疫应答,并且具有显着性差异。重组杆状病毒免疫小鼠后血清中S蛋白特异性抗体水平较高。假病毒系统检测免疫后小鼠体内产生的中和抗体水平,结果显示两种方式构建的重组杆状病毒抗体有明显的的提高。这些结果表明表达S蛋白的重组杆状病毒可以作为潜在的活病毒疫苗载体。
徐双,路瑾,赵磊,裴林,贾玫,荣嵘[2]（2020）在《血清蛋白电泳识别M蛋白的规则制定及其在健康人群M蛋白筛查中的应用》文中研究说明目的建立血清蛋白电泳识别M蛋白的规则并进行验证。探讨该规则在健康人群中筛查M蛋白的价值。方法参照相关文献,依据M蛋白在血清蛋白电泳中出现的区域制定M蛋白的识别规则。对312例随机临床血清样本进行血清蛋白电泳,依据制定的M蛋白识别规则筛查M蛋白,并通过免疫固定电泳进行验证。收集1 170名健康体检者的血清样本及236例除血液科、肾内科、风湿免疫科、骨肿瘤科、肝病科和老年科外的患者血清样本,分别进行血清蛋白电泳,筛查M蛋白,采用免疫固定电泳对可疑样本进行确证并分型。结果 312例临床样本采用血清蛋白电泳筛选出28例可疑样本（含有M峰或可疑M峰）,其中16例（5.12%）经免疫固定电泳确认为M蛋白阳性;血清蛋白电泳漏检1例,漏检率为0.32%。1 170例健康体检者中M蛋白阳性率为2.14%（25/1 170）,男性阳性率（2.64%）高于女性（1.82%）。25例M蛋白阳性的健康体检者中,IgG型M蛋白阳性率最高（60%）,其次为IgM型（24%）。236例除血液科、肾内科、风湿免疫科、骨肿瘤科、肝病科、老年科外的患者样本中有10例M蛋白血症,阳性率为4.24%。结论制定的M蛋白识别规则在血清蛋白电泳识别M蛋白中有较大的价值,值得推广应用。
戴诗雨[3]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中认为病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。
纪立凯[4]（2020）在《猪丁型冠状病毒N蛋白抑制猪RLR信号通路的分子机制研究》文中研究表明冠状病毒（Cornavirus,CoV）在自然界中具有广泛的感染宿主,给人类和动物健康造成严重威胁。CoV属于套式病毒目（Nidovirales）,冠状病毒科（Coronaviridae）,冠状病毒亚科（Coronavirinae）,主要分为甲型、乙型、丙型和丁型冠状病毒属。猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新发现的冠状病毒,其基因组为单股正链RNA,大小约25 kb,可编码4种结构蛋白:刺突蛋白（spike,S）、小包膜蛋白（small membrane,E）、膜蛋白（membrane,M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid,N）,分别参与病毒入侵、病毒组装和宿主先天免疫调控的过程。先天性免疫是动物抵御病毒入侵的第一道防线,而PDCoV可抑制猪的先天性免疫。2014年以来PDCoV在世界范围内大规模猪群中暴发,导致大量仔猪因水样腹泻而脱水死亡。鉴于PDCoV感染导致免疫抑制的分子机制尚不清楚,且迄今尚无防控该病毒的安全高效疫苗。因此,本文以PDCoV为对象,聚焦该病毒编码的N蛋白,解析其在病毒感染中拮抗宿主先天性免疫的分子机制及其在VLP（virus-like particle,VLP）组装中的作用,为深入揭示PDCoV致病机理、研制VLP疫苗提供理论依据。主要研究内容与结果如下:本文对上海及周边地区腹泻猪的粪便及小肠内容物样本进行PDCoV核酸检测,对阳性样本利用猪肾细胞系LLC-PK1分离病毒,成功获得一株PDCoV上海毒株,命名为PDCoV-CHSH-2016。通过全基因组测序及序列分析发现,基因组全长25,412bp,与参考毒株（HKU-44）相比,上海毒株的ORF1a和S基因分别存在6个和3个碱基序列的缺失。基于全基因组和S基因的进化分析显示,上海毒株与中国其它地区的分离株属于同一进化分支,提示本文的研究结果对于国内其它PDCoV毒株的研究具有普遍参考价值。病毒的细胞嗜性研究结果显示,PDCoV能感染猪源细胞（LLC-PK1、PK-15、IPEC-J2、3D4/21）、鸡源细胞DF-1和人源细胞HEK-293T,提示PDCoV具有适应感染多物种细胞的潜力潜力。为了阐明PDCoV拮抗猪先天性免疫的机制,本文成功构建了猪IFN-α（porcine IFN-α,p IFN-α）和p IFN-β的双荧光素酶报告基因系统,基于该系统分析发现,PDCoV感染LLC-PK1细胞能显着抑制水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）诱导p IFN-α和p IFN-β的表达。通过对PDCoV结构蛋白研究发现,PDCoV N蛋白能够显着抑制poly（I:C）及VSV诱导的p IFN-β启动子活性,而M和E蛋白对其影响不显着。进一步研究发现,PDCoV N蛋白在PK-15细胞中过表达时,不仅能够显着抑制poly（I:C）诱导的猪IFNB1、OAS1和ISG15m RNA的转录,而且能够恢复VSV-GFP病毒在poly（I:C）预处理的PK-15细胞中的复制能力。表明PDCoV N蛋白是一种重要的抑制p IFN-β产生的拮抗蛋白。为了进一步揭示PDCoV N蛋白拮抗p IFN-β产生的信号通路激活机制,通过共表达PDCoV N蛋白和猪RLR（RIG-I-like receptor）信号通路中的关键信号分子,利用双荧光素酶报告基因检测发现,N蛋白能够显着抑制猪RIG-I、RIG-IN（RIG-I的激活突变体）、MDA5、MAVS、TBK1和IRF3诱导的p IFN-β产生,表明N蛋白具有抑制猪RLR信号通路激活的功能。为了阐明其分子机制,本文利用Co-IP和激光共聚焦技术筛选PDCoV N蛋白的潜在互作蛋白,结果显示PDCoV N蛋白与猪RIG-I具有明显的共沉淀现象,且在PK15细胞中呈现明确的共定位特征,表明猪RIG-I是N蛋白的重要互作蛋白。通过构建删减突变体进行Co-IP试验,确定了PDCoV N蛋白的N端区域（1-268aa）是结合猪RIG-I的关键区域。同时发现,N蛋白仅与猪RIG-I识别ds RNA的关键结构域HEL和CTD结合,而该结构域是猪RIG-I识别病毒ds RNA和早期泛素化修饰激活的关键区域。为此,本文进一步探究了PDCoV N蛋白对猪RIG-I功能的影响。体外ds RNA结合试验表明,猪RIG-I和PDCoV N蛋白均能够结合poly（I:C）-breads,且PDCoV N蛋白能显着抑制猪RIG-I与ploy（I:C）-breads的结合,且存在剂量依赖效应。此外,PDCoV N蛋白与猪RIG-I的互作能够显着抑制猪RIG-I K63多聚泛素化修饰激活。深入研究发现,猪Riplet是促进猪RIG-I激活的关键E3泛素连接酶,但由于PDCoV N蛋白与猪Riplet拥有相同的结合猪RIG-I的结构域,通过竞争结合,干扰了猪Riplet对猪RIG-I的泛素化修饰激活。这一发现揭示了PDCoV N蛋白抑制猪RLR上游信号通路早期激活的新机制。为了深入探究PDCoV N蛋白抑制猪RLR下游信号通路激活的机制,经LC-MS/MS、Co-IP以及激光共聚焦分析发现,猪IRF7（po IRF7）是PDCoV N蛋白的另一个重要互作蛋白。虽然IRF7是各物种保守的功能蛋白,但Co-IP、双荧光素酶报告基因以及q RT-PCR的结果表明,PDCoV N蛋白可与po IRF7发生特异性相互作用,并抑制po IRF7诱导的I型IFN产生,但不与人源或鸡源IRF7相互,也不影响它们的功能。进一步研究发现,PDCoV N蛋白通过促进po IRF7发生K6、K11和K29连接的多聚泛素化修饰,诱导po IRF7经泛素-蛋白酶体途径降解。通过点突变发现,po IRF7第359位赖氨酸是PDCoV N蛋白诱导po IRF7发生多聚泛素化修饰并导致其降解的关键位点。尽管该位点在人源和鸡源IRF7中保守,但PDCoV N蛋白不能促进这两种动物的IRF7降解,表明PDCoV N蛋白对猪IRF7的降解作用具有物种特异性。PDCoV结构蛋白具有潜在组装形成VLP的能力,而N蛋白具有显着抑制猪I型IFN的表达的作用,若N蛋白参与VLP的组装,可能会影响VLP作为疫苗的免疫效果。因此,本文进一步探究了PDCoV N蛋白在病毒VLP组装中的作用,利用昆虫杆状病毒系统,成功构建可分别独立表达PDCoV结构蛋白（S/M/E/N）的重组杆状病毒:r Bacmid-PDCoV-S、r Bacmid-PDCoV-N和r Bacmid-PDCoV-E/M。利用免疫斑点试验和电镜观察发现,r Bacmid-PDCoV-S、r Bacmid-PDCoV-N和r Bacmid-PDCoV-E/M共感染Sf9细胞后能组装形成PDCoV VLP（S/M/E/N）。而r Bacmid-PDCoV-S和r Bacmid-PDCoV-E/M共感染Sf9细胞后,同样也能组装形成PDCoV VLP（S/M/E）,且两者形态和大小均与PDCoV一致。基于小鼠免疫和病毒中和试验表明,制备的VLP（S/M/E/N）和VLP（S/M/E）均具有较好抗原性,免疫小鼠的血清具有中和病毒在LLC-PK1细胞中复制的能力,且两者差异不显着,表明PDCoV VLP的组装可以不依赖N蛋白,从而可以规避VLP应用中因N蛋白导致免疫抑制对动物产生的风险。综上所述,本文以分离、鉴定的PDCoV-CHSH-2016为研究对象,解析了病毒的基因组特征,明确了病毒具有感染多物种细胞的能力,首次揭示了PDCoV依赖其N蛋白干扰猪RLR信号通路中RIG-I的激活,并通过N蛋白诱导胞质中猪IRF7经泛素-蛋白酶体途径降解,进而抑制猪RLR信号通路诱导I型IFN产生的分子机制。此外,PDCoV结构蛋白（S/M/E）可不依赖N蛋白,通过自组装形成具有良好抗原性的VLP。研究结果将为深入解析PDCoV的致病机制、研制安全高效VLP疫苗提供理论依据。
刘爱平,刘瑞来,刘琴,方京冲,胡尧,张弢[5]（2019）在《单克隆免疫球蛋白检测在浆细胞病中的临床意义》文中指出目的分析M蛋白阳性患者疾病谱的构成,比较不同疾病之间血清免疫学特征的差异。方法选取M蛋白阳性住院患者211例,分析病种分布并比较不同疾病免疫球蛋白（Ig）及轻链检测结果的差异。结果在M蛋白阳性患者中,发病率居前3位的依次为多发性骨髓瘤（MM）（53.0%）、意义未明丙种球蛋白血症（MGUS）（25.6%）、POEMS综合征（7.6%）。MM患者M蛋白对应的Ig和轻链检测结果均高于MGUS和POEMS综合征患者（P<0.05）,非对应的Ig和轻链检测结果均低于MGUS和POEMS综合征患者（P<0.05）,而MGUS患者与POEMS综合征患者之间不同类型的Ig和轻链检测结果差异均无统计学意义（P>0.05）。结论M蛋白阳性患者中不同类型的M蛋白对应的疾病谱不同,且不同疾病之间Ig和轻链水平存在差异。
李玉玮[6]（2019）在《多发性骨髓瘤伴肾损害患者的临床特点及危险因素分析》文中进行了进一步梳理目的:多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma,MM）是一种单克隆浆细胞异常增殖的血液系统的恶性肿瘤,除血液系统损害外,肾损害（Renal Impariment,RI）是其重要特点之一。如果合并有肾脏损害,则严重影响患者的预后及生存。本文通过对苏州大学附属第一医院收治的初诊多发性骨髓瘤病例进行临床特点的回顾性分析及对MM发生肾损害的危险因素进行相关性分析,提高对初诊时MM伴肾损害的发病特点的认识,增强临床医生对于MM伴肾损害的综合诊治水平,改善MM患者的预后。方法:收集苏州大学附属第一医院自2016年1月1日起至2018年9月1日期间收治的,经由临床、实验室检查如免疫球蛋白定量、蛋白电泳、骨髓穿刺及活检、细胞染色体检测等项目确诊的MM患者的一般资料、临床特征、实验室检查结果,分组比较MM合并肾损害和无肾损害的患者的临床特点、实验室检查结果的差异,并分析肾功能与其临床分型、各临床分期及免疫性指标的相关性。结果:1、共收集初治的MM患者255例,其中MM伴肾损害患者65例,初诊年龄为59.7±9.1岁,51-65岁患者分布最多,临床症状多样,其中以乏力、腰背痛症状多见。2、65例肾损害患者中有28例为肾功能轻度损害,15例为肾功能中度损害,22例为肾功能重度损害,有92.3%的患者合并贫血。3、与肾功能正常组患者相比MM伴肾损害患者组的年龄、ISS分期、R-ISS分期、临床表现（乏力、骨痛症状）、血红蛋白、血小板计数、血尿素氮、血尿酸、血钙、乳酸脱氢酶、血、尿β2-微球蛋白含量、血λ游离轻链定量、尿蛋白、24h尿蛋白定量、骨髓浆细胞比例均有显着差异（P<0.05）。4、与肾功能正常组患者相比MM伴肾损害患者的性别、临床分型、DS分期、血白蛋白水平、血球蛋白水平、血管内皮生长因子水平、M蛋白定量、血κ游离轻链蛋白定量、尿λ、κ游离轻链蛋白定量、有无骨损、流式细胞学检查（CD19、CD117、CD38、CD56、CD45、CD138、CD137L、CD81 等）、荧光原位杂交（1q21、13q14、Rb1、P53等）、染色体检测及体液免疫中如IgG、IgM、IgA等免疫球蛋白含量则无显着性差异（P>0.05）。5、单因素回归分析显示:MM患者的年龄、血红蛋白、血小板、血尿素氮、血钙、血尿酸、乳酸脱氢酶、血β2微球蛋白、24h尿蛋白定量水平及骨髓形态浆细胞比例与MM患者肾损害的发生呈负相关,而ISS分期、R-ISS分期与MM肾损害的发生呈正相关。6、多因素Logistic回归分析显示:血尿素氮可能是降低MM患者发生肾损害的保护因素。7、经过治疗后有53例初诊MM伴肾损害患者出院时复查了血肌酐,这部分患者初诊时的血肌酐平均水平为321.23±213.64μmol/L,治疗后复查的血肌酐水平为225.76±162.53 μmol/L,有44例患者的肾功能有不同程度的恢复,其中有20例患者的肾功能恢复到了正常水平[GFR>60 ml/（min·1.73 m2）]。结论:1、MM肾损害好发于中老年男性患者,临床症状多样,以乏力、腰背痛症状起病为主,MM患者就诊时间晚,大部分就诊时已处于临床分期晚期。2、ISS分期及R-ISS分期对MM肾损害的相关性优于DS分期,更能反映MM肾损害的病情。3、与肾功能正常组患者相比MM伴肾损害患者的年龄、ISS分期、R-ISS分期、临床表现（乏力、骨痛等症状）、血红蛋白、血小板计数、血尿素氮、血尿酸、血钙、乳酸脱氢酶、血、尿β2-微球蛋白含量、血λ游离轻链定量、尿蛋白、24h尿蛋白定量、骨髓浆细胞比例均有显着性差异（P<0.05）。4、MM患者的年龄、血红蛋白、血小板计数、血尿素氮、血钙、血尿酸、乳酸脱氢酶、血β2微球蛋白、24h尿蛋白定量水平及骨髓形态浆细胞比例与MM患者肾损害的发生呈负相关,而ISS分期、R-ISS分期与MM肾损害的发生呈正相关。5、血尿素氮的升高可能对于MM患者发生肾损害有一定的预测作用。6、MM的早期诊断和干预治疗对于初诊伴肾损害患者的肾功能的恢复有重要意义。
刘杰[7]（2019）在《狂犬病病毒M和L蛋白单克隆抗体的制备及应用》文中指出狂犬病病毒（RabiesVirus,RABV）是导致温血动物狂犬病的病原体,并且发病动物致死率几乎为100%,对公共卫生造成严重威胁。狂犬病病毒包含五个结构蛋白,其中基质蛋白（M）对于病毒的组装和出芽必不可少的,大蛋白（L）对病毒基因组的转录和复制起到重要调控作用。抗原表位的鉴定不仅有助于了解蛋白的免疫学基础,还对研发相关疫苗,建立针对不同特异性表位的病毒诊断方法有重要的指导作用。双抗体夹心ELISA法常用于RABV定量检测中,因此开发新的RABV 双抗体夹心ELISA法对于狂犬病病毒的临床诊断很有意义。本研究利用狂犬病病毒重组M蛋白制备了五株狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体:3B9、4A1、2B11、2C1和4B11;利用狂犬病病毒重组L蛋白制备了三株狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体:3F3、4D10和5A3。进一步,我们鉴定了 M蛋白的一个线性表位25PPYDDD30,并且利用本实验中制备的M蛋白的单克隆抗体建立了基于M蛋白的RABV 双抗体夹心ELISA检测方法。这不仅为RABV临床诊断提供了有力的工具,同时也为M蛋白相关功能的深入研究奠定了基础。具体研究内容如下:1.狂犬病病毒M蛋白的原核表达与鉴定采用PCR方法以实验室保存的狂犬病病毒CVS-11毒株的反转录产物为模板扩增M基因,并将其克隆至pET-28a（+）表达载体中,命名为pET-28a-M,随后将pET-28a-M转化到E.coli BL-21（DE3）感受态细胞中,实现M蛋白的原核表达,结果显示重组M蛋白的大小约为27kDa,并且M蛋白主要以包涵体的形式存在。western blotting结果显示,重组M蛋白能够与His蛋白单抗反应。试验结果表明,我们成功利用大肠杆菌原核表达系统表达了狂犬病病CVS-11的M蛋白。2.狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以纯化后His-M蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,将血清效价最高小鼠的脾细胞与的骨髓瘤细胞（SP2/0）在PEG2000的作用下进行融合,以间接ELISA和IFA进行杂交瘤的筛选,阳性克隆亚克隆3-5次。最终制备了 5株M蛋白单克隆抗体命名为:3B9、4A1、2B11、2C1和4B11。单抗亚型分析结果显示,3B9、4A1和4B11单抗亚型均为IgG2bκ,2B11亚型为IgG2aκ,2C1亚型为IgAκ。制备的单抗腹水效价为105-108。五株单克隆抗体与狂犬病病毒CVS-11毒株在免疫印迹（westernblotting,WB）和间接免疫荧光试验（IFA）上反应良好。进一步研究发现,这五株单抗能在间接免疫荧光试验和免疫印迹识别广东茂名野毒株但是不与弱毒株HEP-Flury反应,提示这五株单抗识别的抗原表位在不同狂犬病病毒株可能存在差异。本研究获得的单克隆抗体,为狂犬病病毒的检测和抗原表位分析的研究奠定了基础。3.狂犬病病毒M蛋白B细胞表位的精细鉴定利用在线预测软件预测了 M蛋白的5个可能抗原表位,将这5个截短蛋白克隆至pET-32a（+）载体后,利用原核表达系统实现这五个重组截短的蛋白的表达。利用western blotting方法,确定五株单抗识别的B细胞表位范围为23SAPPYDDDLW32,再逐步截短23SAPPYDDDLW32克隆到pGEX4T-1的原核表达载体上,表达出的GST标签的截短体蛋白结合western blotting方法,最终将M蛋白的精细表位定位到25PPYDDD30。将该片段克隆到pCMV-Flag真核表达载体上,转染细胞后进行IFA试验,最终确定五株单抗识别M蛋白的精细表位为25PPYDDD30。进一步的,我们比对不同进化分枝狂犬病病毒表位氨基酸序列后发现,25PPDGDD30只存在分枝三中的HEP-Flury及变体Flury毒株,而Y27D突变在三个进化分枝毒株中广泛存在。此外,表位序列中D28G突变消除了 5株单抗对M蛋白的反应性。M蛋白25PPYDDD30表位的鉴定丰富了 RABVM蛋白的表位图谱,并为M蛋白相关功能的研究奠定了基础。4.狂犬病病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立以纯化的狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体4A1和3B9分作为捕获抗体和检测抗体,建立检测狂犬病病毒的单克隆抗体夹心ELISA方法。优化的试验反应条件为:单克隆抗体4A1的包被浓度为2μg/mL,4℃过夜作为包被条件,10%小牛血清37℃封闭,酶标单克隆抗体的稀释度为1:4000,酶标单抗反应时间为1h时,体系最优。特异性试验表明,该夹心ELISA方法与犬细小病毒和犬流感病毒无交叉反应;敏感性试验显示,该方法检测病毒量的最低限为102 TCID 50/mL;重复性试验表明,夹心ELISA检测方法批内、批间变异系数均小于小于5%。本实验建立的单克隆抗体夹心ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,具有狂犬病病毒的临床诊断以及检测的应用前景。5.狂犬病病毒L蛋白单克隆抗体的制备采用PCR方法以实验室保存的狂犬病病毒CVS-11毒株的反转录产物为模板扩增L基因,将L蛋白基因克隆至pET-32a（+）表达载体中,命名为pET-32a-L,将pET-32a-L转化到E.coli BL-21（DE3）感受态细胞后实现L蛋白的原核表达,重组His-L蛋白的大小约为57kDa。以纯化后His-L蛋白三次免疫BALB/c小鼠,将血清效价最高小鼠的脾细胞与的骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,以间接ELISA和IFA进行杂交瘤的筛选,对阳性克隆继续亚克隆三次,每次亚克隆检测2-3次。最终获得了 3株针对L蛋白单抗命名为:3F3、4D10和5A3。3株单克隆抗体与狂犬病病毒CVS-11毒株的间接免疫荧光试验和蛋白印迹实验具有良好反应性。
尹丹[8]（2019）在《鸭坦布苏病毒流行株prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗体依赖性感染增强作用的初步验证》文中提出鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒（Tembusu Virus,TMUV）引起的一种新发传染性疾病。该病自2010年起持续危害我国水禽养殖业,造成了严重经济损失。2017年11月,山东临沂地区一前期接种过鸭坦布苏病毒弱毒疫苗的种鸭群发生以产蛋下降为主要特征的疾病。通过采集脑、肝脏等组织制备组织悬液,无菌处理后在10日龄鸭胚上盲传四代,经鉴定,本试验获得了一株鸭坦布苏病毒,随后进行了动物回归试验。所收获毒液对易感雏鸭进行了致病性试验。结果显示,该分离株可致胚体出血、侏儒化,攻毒死亡雏鸭剖检可见肺脏、脑膜出血水肿,腺胃出血,脾脏肿大、表面有出血点等病变,与临床病例表现一致。对该毒株NS1基因和prM基因进行遗传进化分析,结果表明该分离株位于中国基因II型分支上,且与该分支上的其他参考株同源性较高,氨基酸同源性最高可达99.4%,核苷酸的同源性最高达99.8%。综上所述,本研究成功从免疫鸭群中分离到一株有致病性的鸭坦布苏病毒病野毒株。从分离到的鸭坦布苏病毒中扩增出prM基因,成功构建了pET-32a-prM原核表达载体,将其转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,并对表达出的鸭坦布苏病毒prM蛋白进行纯化。利用纯化的prM蛋白作为抗原免疫3月龄新西兰白兔,获取相应的多克隆抗体。通过间接ELISA试验检测抗体效价为1:51200,Western-blot结果显示,该多克隆抗体能与pET-32a-prM重组蛋白发生特异性结合,证明其具有良好的反应性,间接免疫荧光试验结果表明制备的prM蛋白多克隆抗体可以特异性的识别TMUV感染细胞中的相应蛋白。将纯化的prM重组蛋白作为抗原免疫68周龄BALB/c小鼠,经过细胞融合和间接ELISA筛选,最终得到3株能稳定分泌prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过抗体亚类试剂盒测定所获得的单抗均为IgG1亚型。利用间接ELISA方法进行效价测定,三株单抗的细胞上清效价均在1:26以上,诱导产生腹水的效价均大于1:25600。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,三株单抗均可与prM蛋白发生特异性反应。该鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备为后续研究其ADE作用机制提供了必要基础。黄病毒属病毒被认为普遍存在抗体依赖性感染增强作用（Antibody-dependent enhancement,ADE）,TMUV作为黄病毒属成员之一,其ADE的作用机制一直未能明确,而prM蛋白诱导产生的抗体被认为与黄病毒的ADE作用密切相关。本试验利用不同稀释度的抗体与鸭坦布苏病毒结合形成抗体病毒混合物后感染HEK-293细胞,通过荧光定量PCR检测鸭坦布苏病毒在细胞内的增殖情况。结果显示稀释度为1:800的抗体与鸭坦布苏病毒结合共同感染的HEK-293细胞病毒载量最高,感染效果显着增强,表明抗体依赖性感染增强作用的强度与抗体的浓度有一定关系。本研究利用制备的prM蛋白单克隆抗体通过体外试验初步探索了鸭坦布苏病毒的抗体依赖性感染增强作用,为后续研究ADE的作用机制、研发减弱特异性prM抗体的新型TMUV疫苗打下了一定基础。
孙雨航[9]（2018）在《黄曲霉毒素B1对猪流感病毒复制的促进及甘露寡糖的干预作用与机理研究》文中提出猪流感病毒（SIV）是一种正黏病毒科,流感病毒属,有囊膜、分节段的单股负链RNA病毒,是引起流感的主要病原之一。影响流感病毒感染的主要因素包括病毒、宿主和传播途径。越来越多的调查发现,不同地区或者同一地区不同猪场/猪群对同一SIV的易感性和感染程度存在很大差异,使人们认识到外界环境和宿主营养条件对抵抗SIV感染的重要性。黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前最常见的一种霉菌毒素,广泛存在于发霉的玉米、小麦和花生等农作物中,具有影响宿主免疫和降低生长性能等作用。所以,在本研究中我们提出AFB1可能促进SIV复制,并深入探讨其作用机理。考虑到猪在SIV传播中的重要地位以及AFB1的广泛暴露,找到一种能够防止猪群免受AFB1暴露和SIV侵害的营养物质变得尤为重要。α-甘露寡糖又称为甘露低聚糖,是从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质,可通过物理吸附或直接结合霉菌毒素,消除毒素对机体的有害影响,同时具有增强免疫、促生长及抗病毒等生物学功能。所以,本研究通过体内、体外添加α-MOS来研究其对AFB1促进SIV复制的干预作用及其作用机理。一、AFB1对SIV复制的影响研究本试验中,我们首先检测不同浓度AFB1对猪肺泡巨噬细胞（PAMs）、犬肾细胞（MDCK）和人非小细胞性肺癌肺泡上皮细胞（A549）活性的影响,筛选出对细胞活性无显着影响的AFB1浓度用于后续试验,以排除AFB1诱导的细胞毒性对SIV复制的影响。同时,根据以往文献和国内外关于无毒性AFB1的报道,选择对小鼠相对“安全”的AFB1剂量用于体内试验。接下来,我们以传代PAMs、MDCK和A549以及小鼠为模型,通过体外、体内感染H1N1型SIV,来检测AFB1对SIV复制的影响。细胞试验结果显示:0.01-0.05 μg/ml AFB1能够显着增加H1N1型SIV滴度,增加SIV M mRNA和NP蛋白在PAMs、MDCK和A549上的表达水平。这些结果共同表明低浓度AFB1能够促进H1N1型SIV在体外复制。体内试验结果同样显示:10-40 μg/kg AFB1显着增加H1N1型SIV复制,包括增加病毒M mRNA和NP蛋白在小鼠肺脏的表达水平,同时还能够降低小鼠增重,增加肺指数,加剧肺组织病理损伤。这些结果表明低水平AFBi污染能够促进SIV在小鼠体内感染,并加重病毒感染程度。综上所述,我们的试验结果表明低水平AFB1能够促进H1N1型SIV在体内、体外复制,并加重病毒感染程度。二、AFB1促进SIV复制的TLRs通路研究为了进一步研究AFB1促进SIV复制的机制,我们在体外、体内建立H1N1型SIV感染的传代PAMs和小鼠模型。通过小RNA干扰Toll样受体4（TLR4）、注射TLR4特异性抑制剂（TAK242）和TLR4基因敲除（TLR4 KO）等方法去除TLR4的影响,来比较TLR4干扰/基因缺失前后AFB1促进SIV复制的变化情况。首先,我们使用荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组化等技术检测AFB1促进SIV复制过程中,TLR4及其下游因子表达情况。结果显示:野生型小鼠脾脏和PAMs中TLR4表达水平显着增加,TLR4-NFκB通路上调,同时TNF-α表达和血清TNF-α浓度显着增加。体外siTLR4转染试验结果显示:与阴性转染对照相比,TLR4干扰后SIV滴度、病毒M mRNA和NP表达水平显着降低;这说明siTLR4阻碍AFB1对SIV复制的促进作用。此外,在本研究中我们还使用NFκB抑制剂（BAY11-7082）进一步研究AFB1促进SIV复制的机制。结果显示:BAY11-7082显着降低由AFB1促进的病毒滴度的增加,病毒mRNA表达水平的增加以及TNF-α mRNA表达水平的增加,并且与空白对照组无显着差异,表明NFκB的抑制阻碍了 AFB 1促进SIV在PAMs上复制及其所致炎性反应。体内试验结果显示:与注射对照组和野生型小鼠相比,TAK242注射组小鼠和TLR4敲除组小鼠增重和肺指数无显着变化,但是肺脏中病毒M mRNA和NP表达水平以及肺组织损伤显着降低;体内结果进一步说明TLR4抑制/基因缺失阻碍了AFB1对SIV的复制及其所致肺组织损伤的促进作用。综上所述,我们的试验结果表明AFB1可能通过上调TLR4-NFκB从而促进SIV复制及其所致炎症和肺组织损伤,或者至少在TLR4存在的情况下AFB1才会发挥此作用,即TLR4的存在会营造AFB1促进SIV复制及其所致炎症和肺组织损伤的环境。三、AFB1促进SIV复制的巨噬细胞极化机理研究本试验以小鼠和传代PAMs为模型,通过体内、体外感染H1N1型SIV进一步研究是否高浓度、长时间AFB1暴露更为促进SIV复制,并从巨噬细胞极化角度阐明其作用机制。体内试验结果显示:低剂量AFB1显着增加流感病毒M mRNA、NP、M1和M2蛋白在小鼠肺脏表达,同时还能够显着降低小鼠增重,增加肺指数,加剧小鼠肺和脾组织损伤。此外,低剂量AFB1暴露还增加了 SIV感染15天小鼠血清TNF-α含量、脾指数和肺支气管灌洗液中CD206 阳性巨噬细胞数,降低胸腺指数和肺支气管灌洗液中CD80 阳性巨噬细胞数;与此相一致地,在SIV感染18-21天小鼠血清TNF-α含量回到基本水平,随后血清IL-10含量显着升高。细胞试验结果显示:低浓度AFB1同样增加病毒滴度,病毒MmRNA、NP蛋白表达以及NP阳性细胞数;体外流式细胞术和扫描电镜形态学观察结果还显示低浓度AFB1促进SIV感染的PAMs在SIV感染后8 h向促炎性巨噬细胞表型（M1型巨噬细胞）极化,24-48 h向抑炎性巨噬表型（M2型巨噬细胞）极化;最后,通过体外添加脂多糖（LPS）刺激,我们发现LPS能够逆转PAMs向M1型巨噬细胞极化,同时完全抵消由AFB1促进的SIV复制。综上所述,体内、体外试验结果共同表明低水平AFB1可以促进H1N1型SIV在体内、体外复制,同时调节体内和体外肺泡巨噬细胞从M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化,而添加脂多糖逆转M2极化可能有利于消除由AFB1促进的SIV复制。四、甘露寡糖干预AFB1促进SIV复制的作用研究本试验以小鼠和传代PAMs为模型,通过体内、体外感染H1N1型SIV,以及AFB1和α-MOS暴露,来检测α-MOS对AFB1促进的SIV复制的影响。体外试验结果显示:α-MOS阻碍AFB1促进SIV复制,降低SIV滴度、病毒M mRNA和NP表达水平。体内试验结果同样显示:α-MOS显着降低AFB1增加的病毒M mRNA和NP蛋白在小鼠肺脏表达,同时还能够缓解AFB1降低的小鼠增重、增加的肺指数,以及增加的肺和脾组织损伤。综上所述,我们的试验结果表明α-MOS能够阻碍AFB1促进H1N1型SIV复制,同时缓解AFB1暴露加剧的SIV感染程度。五、甘露寡糖干预AFB1促进SIV复制的作用机理研究本试验以小鼠和传代PAMs为模型,通过体内、体外感染H1N1型SIV,以及AFB1和α-MOS暴露,进一步探索α-MOS干预AFB1促进SIV复制及组织损伤的作用机理。体内和体外试验结果共同表明:α-MOS能够从mRNA和蛋白水平降低小鼠的脾脏和肺脏以及PAMs中TLR4、NF-κB和TNF-α的表达。我们通过体外DNA转染进行TLR4过表达,来进一步探讨α-MOS是否是通过抑制TLR4基因表达来削弱AFB1促进的SIV复制及炎性反应。结果显示:在细胞进行TLR4 DNA转染后,α-MOS的保护性作用被显着逆转。因此,我们得出结论,α-MOS可以通过抑制TLR4信号通路来保护PAMs免受AFB1促进的SIV感染及其所致免疫损伤。体外添加TNF-α试验结果表明:增加不同浓度TNF-α后病毒滴度、M mRNA和NP表达水平并没有显着变化。为了进一步证实TLR4在α-MOS削弱AFB1促进SIV感染及其炎性损伤中的作用,本研究使用TLR4KO和野生型（WT）小鼠进行试验。结果显示:与饲喂基础日粮的WT小鼠相比,饲喂500 mg/kg α-MOS的WT小鼠肺脏中SIV M mRNA和NP的表达水平降低;相反,与饲喂基础日粮的TLR4 KO小鼠相比,饲喂500 mg/kg α-MOS的TLR4 KO小鼠肺脏中SIV M mRNA和NP的表达水平无显着差异。这些结果表明,α-MOS以TLR4依赖性方式阻断AFB1促进的SIV感染。与此相似地,α-MOS也以TLR4依赖性方式增加小鼠体重,并降低肺指数。HE染色结果显示:与饲喂基础日粮的WT小鼠相比,饲喂500 mg/kg α-MOS的WT小鼠的肺和脾损伤减轻。相比之下,TLR4 KO废除了α-MOS的保护性作用。总之,我们的数据表明α-MOS以TLR4依赖性方式减轻AFB1促进的SIV感染及其所致组织损伤。综上所述,这些结果共同表明α-MOS能够下调TLR4-NFκB通路,降低TNF-α表达,但是α-MOS可能通过TLR4依赖性而非TNF-α依赖性方式降低TLR4-NFκB通路从而缓解AFB1促进的H1N1型SIV复制及其所致组织损伤。
许汪[10]（2018）在《PRRSV-1 VLPs的构建及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理本研究结合当前猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）致病机制、疾病防控及病毒基因功能研究进展,以欧洲型PRRSV（RRSV-1）的ORF5编码蛋白为主要免疫原,利用Bac-to-Bac?杆状病毒-昆虫细胞表达系统,采用4种不同的蛋白表达策略,包装制备由GP5和M蛋白组成的欧洲型PRRSV病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）,并通过鼻腔黏膜免疫途径分析其免疫原性。首先以本实验室保存的欧洲型PRRSV LV株基因组为模板,通过RT-PCR方法获得PRRSV-1 GP5和M基因,利用生物信息学及相应软件分别对两种基因的遗传进化关系及其编码蛋白结构进行分析;同时从猪肺巨噬细胞中扩增获得猪IFN-λ1基因,并将其与PRRSV M基因融合,信号肽和跨膜区分析显示,IFN-λ1的融合可能不影响M蛋白表达。进而将GP5、M或pIFN-λ1基因分别克隆到杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA/C或pFastBac Dual中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10?Bac大肠杆菌感受态细胞;使用蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-GP5、rB-M、rB-pIFNλ1、rB-M-pIFNλ1或rBD-GP5-M;采用阳离子转染方法将重组杆粒转染至SF9细胞,拯救重组杆状病毒。重组杆状病毒扩大培养至第二代,采用酶联免疫斑点实验法测定重组杆状病毒滴度,同时利用Western Blot、间接免疫荧光等方法检测GP5和M蛋白的表达情况;然后设置病毒感染不同时间点检测GP5和M蛋白的表达情况,以确定病毒样颗粒的最佳收获时间;使用无血清表达系统大量制备PRRSV VLPs,收集细胞培养上清,采用蔗糖垫超速离心、蔗糖密度梯度离心策略进行纯化,Western blot鉴定GP5和M均存在后,利用透射电镜观察所收集的VLPs的形态;最后以小鼠为试验动物,通过鼻腔免疫策略及免疫后体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫指标的检测,分析VLPs的免疫原性,同时添加A5佐剂,并对VLPs-A5复合物的免疫原性进行了评价。结果显示,GP5和M蛋白共表达策略,即利用pFastBac Dual载体,构建重组杆粒rBD-GP5-M,包装并拯救同时携带PRRSV-1 GP5和M蛋白基因的重组杆状病毒rBDV-GP5-M,感染无血清悬浮培养的SF9细胞可以成功包装出具有PRRSV相似形态结构的VLPs。将纯化的VLPs作为免疫原,通过鼻腔免疫途径免疫小鼠,整个试验过程中小鼠的体重呈现稳定上升趋势,免疫过程没有引起小鼠过于强烈的应激反应;单独使用VLPs和VLPs+A5均能通过鼻腔免疫途径诱导小鼠局部sIgA分泌量增加,及全身性具有中和作用的IgG抗体水平升高;免疫应答类型是以B细胞免疫应答为主的体液免疫;A5递送系统能够让VLPs缓慢释放,使得机体的抗体水平保持在持续上升的状态,提供长期的免疫保护,表明PRRSV-1 VLPs具有开发成安全有效的新型黏膜疫苗的潜能,A5递送系统可增强粘膜免疫应答水平。
二、M蛋白阳性患者2007例的体液免疫特征分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、M蛋白阳性患者2007例的体液免疫特征分析（论文提纲范文）
（1）AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步探索（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 AIM2 炎症小体在EV71 引起脑炎发病机制的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞培养 |
| 2.1.2 细胞与病毒 |
| 2.1.3 Western-blot相关试剂 |
| 2.1.4 荧光定量PCR相关试剂 |
| 2.1.5 ELISA相关试剂 |
| 2.1.6 流式检测相关试剂 |
| 2.1.7 荧光定量引物 |
| 2.1.8 细胞免疫荧光相关试剂 |
| 2.1.9 实验动物 |
| 2.2 实验试剂配制 |
| 2.3 实验器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞的复苏、传代与冻存 |
| 2.4.2 病毒扩增、超离浓缩 |
| 2.4.3 TCID_(50)检测 |
| 2.4.4 Trizol法提RNA |
| 2.4.5 RNA逆转录反应 |
| 2.4.6 荧光定量聚合酶链式反应 |
| 2.4.7 Western-blot检测目的蛋白表达 |
| 2.4.8 ELISA检测上清中细胞因子 |
| 2.4.9 流式检测细胞凋亡 |
| 2.4.10 实验动物 |
| 2.4.11 原代神经元细胞分离培养 |
| 2.4.12 细胞免疫荧光 |
| 2.4.13 细胞免疫荧光共聚焦 |
| 2.4.14 HE染色 |
| 2.4.15 免疫组织化学染色 |
| 2.4.16 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 EV71 感染引起RD、SK-N-SH细胞中AIM2 炎症小体的表达增加 |
| 3.2 EV71 感染引起RD、SK-N-SH细胞中AIM2 通路下游基因的表达增加 |
| 3.3 EV71 感染引起RD、SK-N-SH细胞焦亡 |
| 3.4 小鼠原代神经元细胞分离鉴定 |
| 3.5 EV71 感染小鼠原代神经元细胞模型建立 |
| 3.6 AIM2 抑制EV71 在小鼠原代神经元细胞中的复制 |
| 3.7 AIM2 对EV71 感染引起小鼠脑炎有保护性作用 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 杆状病毒作为SARS-CoV-2 活病毒疫苗载体的初步探索 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 细胞及病毒 |
| 2.2 主要试剂与器材 |
| 2.3 主要培养基配置 |
| 2.4 引物设计与合成 |
| 2.5 转移载体pFast Bac Dual的改造 |
| 2.6 双酶切鉴定重组质粒 |
| 2.7 重组杆状病毒的构建 |
| 2.8 重组杆状病毒转导BHK细胞 |
| 2.9 Western blot检测重组杆状病毒转导BHK细胞S蛋白表达 |
| 2.10 实验动物 |
| 2.11 ELISA检测特异性IgG |
| 2.12 脾淋巴细胞分离培养 |
| 2.13 流式细胞术检测INF-γ和IL-4 因子 |
| 2.14 中和实验 |
| 2.15 数据分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 构建重组杆状病毒vAc-S-CMV、vAc-S |
| 3.2 检测vAc-S-CMV、vAc-S重组杆状病毒的表达 |
| 3.3 S蛋白引起的体液免疫应答 |
| 3.4 重组病毒引起的细胞免疫 |
| 3.5 中和效应检测 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 SARS-CoV-2 研究进展 |
| 前言 |
| 1.SARS-CoV-2 病原体的确定 |
| 2.SARS-CoV-2 生物学特征 |
| 3.SARS-CoV-2 基因组结构 |
| 4.SARS-CoV-2 结构蛋白 |
| 4.1 S蛋白 |
| 4.2 N蛋白 |
| 4.3 M蛋白 |
| 4.4 E蛋白 |
| 5.SARS-CoV-2 免疫学研究 |
| 6.SARS-CoV-2 疫苗的研究现状 |
| 6.1 SARS-CoV-2 灭活疫苗 |
| 6.2 SARS-CoV-2 减毒活病毒疫苗 |
| 6.3 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗 |
| 6.4 SARS-CoV-2 活病毒载体疫苗 |
| 6.5 SARS-CoV-2 DNA疫苗 |
| 6.6 SARS-CoV-2 RNA疫苗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
（2）血清蛋白电泳识别M蛋白的规则制定及其在健康人群M蛋白筛查中的应用（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 血清蛋白电泳 |
| 1.3.2 免疫固定电泳 |
| 1.3.3 结果判读 |
| 2 结果 |
| 2.1 血清蛋白电泳与免疫固定电泳的符合率 |
| 2.2 健康体检人群中M蛋白的阳性率及不同性别之间的比较 |
| 2.3 健康体检人群M蛋白类型分布 |
| 2.4 临床样本M蛋白阳性率统计 |
| 3 讨论 |
（3）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 病毒样颗粒疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 病毒样颗粒疫苗的简介 |
| 1.1.2 病毒样颗粒疫苗的表达系统 |
| 1.1.3 病毒样颗粒疫苗发展面临的挑战和解决方案 |
| 1.2 寨卡病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 寨卡病毒的流行病学 |
| 1.2.2 寨卡病毒的分类 |
| 1.2.3 寨卡病毒结构和基因组结构 |
| 1.2.4 寨卡病毒的生命周期 |
| 1.2.5 寨卡病毒E蛋白的结构和功能研究 |
| 1.2.6 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3 脊髓灰质炎病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 脊髓灰质炎的流行现状 |
| 1.3.2 脊髓灰质炎病毒的生物学 |
| 1.3.3 脊髓灰质炎疫苗的研究进展 |
| 1.4 克里米亚刚果出血热病毒的研究进展 |
| 1.4.1 CCHFV的生物学 |
| 1.4.2 CCHFV的临床流行病学 |
| 1.4.3 CCHF的预防 |
| 1.4.4 CCHFV疫苗的研究进展 |
| 1.4.5 CCHFV单克隆抗体的研究进展 |
| 1.5 本论文的研究内容和意义 |
| 第2章 寨卡病毒样颗粒的构建和免疫原性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒与菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 抗体与抗体制备 |
| 2.1.4 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.1.5 ZIKV病毒蛋白的表达和鉴定 |
| 2.1.6 ZIKV病毒样颗粒和病毒粒子的纯化与检测 |
| 2.1.7 ZIKV VLPs的免疫原性评价 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组杆状病毒v Ac-Zpr ME的构建 |
| 2.2.2 ZIKV pr M和 E蛋白形成VLPs |
| 2.2.3 ZIKV VLPs的免疫原性研究 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于杆状病毒表达的VLP诱导合胞体现象的抗黄病毒药物筛选方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 抗体与抗体纯化 |
| 3.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.5 质粒的构建及转染实验 |
| 3.1.6 序列比对和进化分析 |
| 3.1.7 免疫荧光分析 |
| 3.1.8 ZIKV滴度测定(空斑实验) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导Sf9细胞形成合胞体 |
| 3.2.2 黄病毒E蛋白在Sf9细胞中的细胞定位研究 |
| 3.2.3 ZIKV prME和E蛋白形成VLPs |
| 3.2.4 基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体现象的抗病毒筛选 |
| 3.2.5 AMS通过影响病毒入侵抑制黄病毒感染 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 脊髓灰质炎病毒样颗粒的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 抗体与抗体制备 |
| 4.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 PVⅡP1多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 4.2.2 重组杆状病毒的构建 |
| 4.2.3 PVⅡVP0,VP1和VP3 蛋白形成VLPs |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 克里米亚刚果出血热病毒样颗粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞、病毒与质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 抗体 |
| 5.1.4 重组杆状病毒的构建 |
| 5.1.5 病毒样颗粒的纯化和鉴定 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 重组杆状病毒v Ac-Gn Gc NP和 v Ac-Gn Gc的构建 |
| 5.2.2 CCHFV VLPs的纯化和鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 菌株、质粒与细胞系 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc胞外区的诱导表达 |
| 6.1.4 单克隆抗体制备的流程 |
| 6.1.5 小鼠血清和杂交瘤细胞上清识别能力的检测 |
| 6.1.6 单克隆抗体线性识别位点的鉴定 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 小鼠血清的检测 |
| 6.2.2 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体的筛选 |
| 6.2.3 CCHFV膜蛋白Gn/Gc单克隆抗体识别表位的鉴定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 CCHFV膜蛋白Gn/Gc宿主相互作用组的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞、病毒、菌株与质粒 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 抗体 |
| 7.1.4 细胞转染 |
| 7.1.5 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP) |
| 7.1.6 非标定量质谱分析 |
| 7.1.7 生物信息学分析 |
| 7.1.8 免疫荧光和共聚焦实验 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 诱饵蛋白Gn/Gc及其宿主互作蛋白的SDS-PAGE和 Western blot分析 |
| 7.2.2 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的非标定量质谱分析 |
| 7.2.3 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 7.2.4 膜蛋白Gn/Gc宿主互作蛋白的相互作用网络分析 |
| 7.2.5 间接免疫荧光验证质谱结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 线粒体 |
| 7.3.2 内质网 |
| 7.3.3 细胞骨架 |
| 7.3.4 外泌体和囊泡 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）猪丁型冠状病毒N蛋白抑制猪RLR信号通路的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 冠状病毒简介 |
| 1.1.1 冠状病毒的分类 |
| 1.1.2 冠状病毒的危害 |
| 1.1.3 冠状病毒的基因组结构与复制 |
| 1.2 猪丁型冠状病毒研究进展 |
| 1.2.1 PDCoV的发现及流行特征 |
| 1.2.2 PDCoV基因组结构及遗传多样性 |
| 1.2.3 PDCoV防控概述 |
| 1.3 先天免疫系统概述 |
| 1.3.1 模式识别受体 |
| 1.3.2 RIG-I样受体及其信号通路 |
| 1.3.3 TLRs信号通路 |
| 1.3.4 NLRs信号通路 |
| 1.3.5 DNA受体信号通路 |
| 1.3.6 IFN信号通路 |
| 1.4 冠状病毒调控宿主先天免疫应答 |
| 1.4.1 病毒逃逸宿主先天免疫应答的机制 |
| 1.4.2 冠状病毒非结构蛋白干扰先天免疫应答的机制 |
| 1.4.3 冠状病毒结构蛋白干扰宿主先天免疫应答 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 PDCoV上海毒株的分离与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.0 细胞、毒株、菌株及临床腹泻样品 |
| 2.2.1 主要试剂及抗体 |
| 2.2.2 主要试剂及缓冲液的配制 |
| 2.2.3 主要仪器及设备 |
| 2.2.4 细胞、病毒总RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.5 PDCoV结构蛋白原核表达质粒的构建 |
| 2.2.6 PDCoV分离及培养 |
| 2.2.7 PDCoV细胞嗜性试验 |
| 2.2.8 PDCoV病毒滴度测定 |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR检测试验 |
| 2.2.10 Western blot检测PDCoV复制水平 |
| 2.2.11 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.12 PDCoV病毒颗粒的透射电镜观察 |
| 2.2.13 PDCoV结构蛋白免疫小鼠及ELISA试验 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 PDCoV上海毒株的分离 |
| 2.3.2 PDCoV上海毒株的全基因组测序及分析 |
| 2.3.3 PDCoV上海毒株的进化树构建及分析 |
| 2.3.4 PDCoV上海毒株的变异及重组分析 |
| 2.3.5 PDCoV结构蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.3.6 PDCoV细胞嗜性的探究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PDCoV分离株存在地区差异性 |
| 2.4.2 PDCoV具有感染多物种细胞的潜力 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 PDCoV N蛋白抑制猪RIG-I激活的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 细胞、毒株及菌株 |
| 3.2.2 主要试剂及抗体 |
| 3.2.3 主要仪器及设备 |
| 3.2.4 主要生物学分析软件 |
| 3.2.5 PCR引物设计及载体构建 |
| 3.2.6 PDCoV、VSV-GFP培养 |
| 3.2.7 细胞转染 |
| 3.2.8 VSV-GFP感染恢复试验 |
| 3.2.9 q RT-PCR检测猪基因转录水平 |
| 3.2.10 Western blot及 Co-IP试验 |
| 3.2.11 激光共聚焦检测 |
| 3.2.12 RNA结合实验 |
| 3.2.13 统计学方法 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.3.1 PDCoV感染抑制猪I型干扰素的表达 |
| 3.3.2 PDCoV结构蛋白对猪IFN-β和 NF-κB启动子活性的影响 |
| 3.3.3 PDCoV M/E/N蛋白对猪RLR信号通路激活的影响 |
| 3.3.4 PDCoV N蛋白互作蛋白的筛选 |
| 3.3.5 PDCoV N蛋白N端区域是结合猪RIG-I的关键区域 |
| 3.3.6 PDCoV N蛋白影响猪RIG-I与 ds RNA的结合 |
| 3.3.7 PDCoV N蛋白抑制猪RIG-I的泛素化修饰 |
| 3.3.8 PDCoV N蛋白不与猪TRIM25和Riplet相互作用 |
| 3.3.9 PDCoV N蛋白抑制猪 Riplet诱导的猪 RIG-I K63 连接的多聚泛素化 |
| 3.3.10 PDCoV N蛋白与猪 Riplet竞争性结合猪 RIG-I |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PDCoV N蛋白物种特异性降解猪IRF7 的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、毒株及菌株 |
| 4.2.2 主要仪器及设备 |
| 4.2.3 主要生物学分析软件 |
| 4.2.4 主要试剂及缓冲液的配制 |
| 4.2.5 PCR引物设计及载体构建 |
| 4.2.6 点突变的引物设计及载体构建 |
| 4.2.7 细胞转染试验 |
| 4.2.8 qRT-PCR检测试验 |
| 4.2.9 细胞病毒感染试验 |
| 4.2.10 Western blot及 Co-IP实验 |
| 4.2.11 激光共聚焦试验 |
| 4.2.12 统计学方法 |
| 4.3 试验结果与分析 |
| 4.3.1 PDCoV N蛋白与poIRF7 相互作用 |
| 4.3.2 PDCoV N蛋白与IRF7 相互作用具有物种特异性 |
| 4.3.3 PDCoV N蛋白抑制poIRF7 诱导的猪I型干扰素的表达 |
| 4.3.4 PDCoV N蛋白表达促进poIRF7 的降解 |
| 4.3.5 PDCoV N蛋白促进猪IRF7 的泛素化修饰 |
| 4.3.6 猪IRF7 K359 位是PDCoV N蛋白影响的关键位点 |
| 4.3.7 筛选调控猪IRF7 泛素化降解的E3 泛素化连接酶 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 PDCoV结构蛋白组装VLP的策略 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞、毒株和菌株 |
| 5.2.2 PCR引物设计及载体构建 |
| 5.2.3 主要仪器及设备 |
| 5.2.4 PCR引物设计及重组载体构建 |
| 5.2.5 重组杆状质粒的提取 |
| 5.2.6 重组杆状病毒质粒的细胞转染试验 |
| 5.2.7 重组杆状病毒的复制 |
| 5.2.8 Western blot及免疫斑点试验 |
| 5.2.9 间接免疫荧光 |
| 5.2.10 PDCoV病毒样颗粒的透射电镜观察 |
| 5.2.11 PDCoV VLP免疫小鼠及ELISA试验 |
| 5.2.12 荧光抗体病毒中和试验 |
| 5.3 试验结果与分析 |
| 5.3.1 重组杆状病毒质粒的构建 |
| 5.3.2 重组杆状病毒的制备 |
| 5.3.3 PDCoV VLP的组装 |
| 5.3.4 PDCoV VLP免疫小鼠诱导产生特异性抗体 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 全文讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得的主要学术成果 |
（5）单克隆免疫球蛋白检测在浆细胞病中的临床意义（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 相关疾病的诊断标准 |
| 1.3 仪器和试剂 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 M蛋白阳性患者的性别构成和疾病谱的分析 |
| 2.2 MM、POEMS综合症和MGUS患者IgG、IgA、IgM及κ、λ轻链检测结果的差异 |
| 3 讨论 |
（6）多发性骨髓瘤伴肾损害患者的临床特点及危险因素分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 1. 研究对象 |
| 2. 病例资料搜集 |
| 结果 |
| 1. 临床资料 |
| 2. 实验室检查 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 对本课题的进一步设想 |
| 综述 多发性骨髓瘤肾损害的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（7）狂犬病病毒M和L蛋白单克隆抗体的制备及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 RABV概述 |
| 2 RABV病原特性 |
| 3 RABV基因组结构及编码的蛋白 |
| 3.1 RABV基因组的结构 |
| 3.2 狂犬病病毒的复制和转录 |
| 3.3 编码的病毒蛋白及其功能 |
| 4 RABV的检测 |
| 4.1 病原学检查 |
| 4.2 荧光抗体病毒中和实验检测方法(FAVNT) |
| 4.3 直接免疫荧光检测(FAT) |
| 4.4 酶联免疫实验(Enzyme-Linked Immunoassay) |
| 4.5 核酸检测 |
| 4.6 狂犬病的快速酶免疫诊断(RREID) |
| 4.7 直接快速免疫组化法 |
| 5 单克隆抗体技术 |
| 5.1 单克隆抗体技术概述 |
| 5.2 单克隆抗体对RABV抗原表位研究 |
| 5.3 单克隆抗体在RABV分型研究 |
| 5.4 单克隆抗体在RABV治疗研究 |
| 5.5 M蛋白单克隆抗体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 狂犬病病毒M蛋白的原核表达与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 M基因的扩增与克隆 |
| 2.2 his-M蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.3 his-M蛋白的抗原性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 狂犬病病毒M蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 免疫动物 |
| 1.3 间接ELISA法检测小鼠抗体效价 |
| 1.4 细胞融合 |
| 1.5 杂交瘤细胞的建立 |
| 1.6 腹水制备 |
| 1.7 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 免疫小鼠血清中抗体水平检测 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 RABV M蛋白抗原表位的精细鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒与试剂 |
| 1.2 M蛋白基因截短体引物设计及合成 |
| 1.3 截短体原核表达载体的构建 |
| 1.4 目的蛋白的表达与分析 |
| 1.5 Western blotting鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 1.6 IFA鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 1.7 不同分枝RABV M蛋白表位序列氨基酸的比对 |
| 1.8 氨基酸突变对表位抗原性的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 M蛋白截短 |
| 2.2 截短体蛋白的表达 |
| 2.3 western blotting鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 2.4 IFA鉴定M蛋白的B细胞表位 |
| 2.5 基于M蛋白的RABV进化树 |
| 2.6 M蛋白氨基酸比对 |
| 2.7 M蛋白氨基酸突变 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 狂犬病病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒与试剂 |
| 1.2 单克隆抗体的纯化 |
| 1.3 单抗的辣根过氧化物酶(HRP)标记 |
| 1.4 双抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单抗纯化 |
| 2.2 双抗体夹心ELISA检测方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 狂犬病病毒L蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 抗原的制各 |
| 1.3 免疫动物 |
| 1.4 间接ELISA法检测小鼠抗体效价 |
| 1.5 细胞融合 |
| 1.6 杂交瘤细胞的建立 |
| 1.7 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 L基因的扩增与克隆 |
| 2.2 his-L蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.3 免疫小鼠血清中抗体水平检测 |
| 2.4 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录：常用试剂的配制 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果目录 |
（8）鸭坦布苏病毒流行株prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗体依赖性感染增强作用的初步验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.1 鸭坦布苏病毒病的病原学 |
| 1.1.1 鸭坦布苏病毒的形态结构及分类 |
| 1.1.2 鸭坦布苏病毒的理化特性 |
| 1.1.3 鸭坦布苏病毒的培养特性 |
| 1.1.4 鸭坦布苏病毒基因组的分子生物学特征 |
| 1.2 多克隆抗体与单克隆抗体研究现状 |
| 1.2.1 多克隆抗体 |
| 1.2.2 单克隆抗体 |
| 1.3 抗体依赖性感染增强作用研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、载体、细胞及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸭坦布苏病毒流行株的分离与鉴定 |
| 2.2.2 重组prM蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.2.3 重组prM蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.4 重组prM蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.5 鸭坦布苏病毒ADE作用的初步验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.1.1 病鸭的临床症状及剖检变化 |
| 3.1.2 感染鸭胚胚体病理变化 |
| 3.1.3 病毒尿囊液PCR检测 |
| 3.1.4 重组质粒菌液PCR检测 |
| 3.1.5 病毒NS1 基因与prM基因序列分析 |
| 3.1.6 病毒分离株半数致死量的测定 |
| 3.1.7 动物回归试验 |
| 3.2 重组prM蛋白的原核表达与鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒pET-32a-prM的构建和双酶切验证 |
| 3.2.2 诱导温度的优化 |
| 3.2.3 诱导时间的优化 |
| 3.2.4 IPTG浓度的优化 |
| 3.2.5 重组prM蛋白纯化 |
| 3.2.6 重组prM蛋白浓度的测定 |
| 3.2.7 重组prM蛋白的Western-blot鉴定 |
| 3.3 重组prM蛋白多克隆抗体的鉴定 |
| 3.3.1 多克隆抗体效价的测定 |
| 3.3.2 多克隆抗体与prM重组蛋白反应性检测 |
| 3.3.3 间接免疫荧光检测 |
| 3.4 重组prM蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.4.1 免疫小鼠血清抗体效价 |
| 3.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.4.3 单克隆抗体的亚类鉴定与效价测定 |
| 3.4.4 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.4.5 单克隆抗体与prM重组蛋白反应性检测 |
| 3.4.6 间接免疫荧光检测 |
| 3.4.7 腹水的纯化 |
| 3.5 鸭坦布苏病毒ADE作用的初步验证 |
| 3.5.1 病毒毒力(TCID50)的测定 |
| 3.5.2 实时荧光定量PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭坦布苏病毒的分离鉴定 |
| 4.2 重组prM蛋白的原核表达 |
| 4.3 鸭坦布苏病毒重组prM蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 4.4 鸭坦布苏病毒重组prM蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 4.5 鸭坦布苏病毒抗体依赖性感染增强作用的初步验证 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）黄曲霉毒素B1对猪流感病毒复制的促进及甘露寡糖的干预作用与机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 黄曲霉毒素B_1的研究进展 |
| 1. 霉菌毒素概述 |
| 2. 黄曲霉毒素B_1(AFB_1)概述 |
| 2.1 AFB_1的来源 |
| 2.2 AFB_1的分布 |
| 2.3 AFB_1的作用机制 |
| 2.4 AFB_1在动物体内的代谢和影响因素 |
| 3. AFB_1的危害 |
| 3.1 AFB_1对机体的危害 |
| 3.2 AFB_1对经济的危害 |
| 4. AFB_1的防治 |
| 4.1 AFB_1的人为管控 |
| 4.2 AFB_1的化学防治 |
| 4.3 AFB_1的生物防治 |
| 4.4 AFB_1的其他防治方法 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪流感病毒的研究进展 |
| 1. 流感病毒概述 |
| 2. 猪流感病毒(SIV)概述 |
| 2.1 SIV的易感动物 |
| 2.2 SIV感染的症状 |
| 2.3 影响SIV感染的因素 |
| 3. SIV感染的防治策略 |
| 3.1 SIV感染的预防策略 |
| 3.2 SIV感染的治疗策略 |
| 参考文献 |
| 第三章 甘露寡糖的研究进展 |
| 1. 甘露寡糖概述 |
| 2. 酵母来源甘露寡糖(A-MOS)概述 |
| 2.1 α-MOS的来源和制备 |
| 2.2 α-MOS的应用 |
| 2.3 α-MOS的作用机制 |
| 3. A-MOS对机体的影响 |
| 3.1 α-MOS对仔猪生产性能的影响 |
| 3.2 α-MOS对肠道形态和微生物的影响 |
| 3.3 α-MOS对免疫功能的影响 |
| 3.4 α-MOS对霉菌毒素毒性的影响 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 黄曲霉毒素B_1对猪流感病毒复制的影响研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 工作溶液的配置 |
| 1.5 细胞的传代培养 |
| 1.6 病毒培养和扩增 |
| 1.7 细胞活力测定 |
| 1.8 细胞乳酸脱氢酶检测 |
| 1.9 细胞凋亡测定 |
| 1.10 病毒滴度检测 |
| 1.11 动物试验设计 |
| 1.12 HE染色试验 |
| 1.13 荧光定量PCR检测 |
| 1.14 免疫印迹试验 |
| 1.15 数据统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 不同浓度AFB_1对MDCK、A549和PAMs活性的影响 |
| 2.2 AFB_1促进SIV在MDCK、A549和PAMs上复制 |
| 2.3 AFB_1加剧SIV在小鼠肺脏中感染 |
| 2.4 AFB_1加剧SIV感染所致肺组织损伤 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 黄曲霉毒素B_1促进猪流感病毒复制的TLRS通路研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 工作溶液的配置 |
| 1.5 细胞的传代培养 |
| 1.6 病毒培养和扩增 |
| 1.7 荧光定量PCR检测 |
| 1.8 免疫印迹试验 |
| 1.9 小RNA干扰 |
| 1.10 动物试验设计 |
| 1.11 HE染色试验 |
| 1.12 免疫组化染色 |
| 1.13 数据统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 AFB_1上调SIV感染的PAMs上的TLR4-NFκB-TNFα表达 |
| 2.2 TLR4干扰和NFκB抑制剂阻碍AFB_1促进SIV在PAMs上复制 |
| 2.3 AFB_1上调SIV感染小鼠脾脏中的TLR4-NFκB-TNFα表达 |
| 2.4 TLR4敲除和抑制剂削弱AFB_1促进的SIV感染及其所致炎症和肺组织损伤 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 黄曲霉毒素B_1促进猪流感病毒复制的巨噬细胞极化机制研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 工作溶液的配置 |
| 1.5 细胞的传代培养 |
| 1.6 病毒培养和扩增 |
| 1.7 动物试验设计 |
| 1.8 小鼠肺支气管灌洗 |
| 1.9 HE染色试验 |
| 1.10 荧光定量PCR检测 |
| 1.11 免疫印迹试验 |
| 1.12 MTT法测定细胞增殖活性 |
| 1.13 流式测定细胞凋亡情况 |
| 1.14 病毒滴度检测 |
| 1.15 免疫荧光 |
| 1.16 试剂盒检测NO、TNF-α和IL-10 |
| 1.17 扫描电镜观察细胞极化 |
| 1.18 流式细胞术鉴定巨噬细胞极化 |
| 1.19 数据统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 低剂量AFB_1加剧SIV感染所致肺组织损伤 |
| 2.2 低剂量AFB_1促进SIV在小鼠肺脏中复制 |
| 2.3 低剂量AFB_1加剧SIV感染所致炎症和脾组织损伤 |
| 2.4 低剂量AFB_1促进SIV感染的小鼠肺泡巨噬细胞向M2极化 |
| 2.5 不同浓度AFB_1和LPS对PAMs活性的影响 |
| 2.6 低浓度AFB_1促进SIV在PAMs上复制 |
| 2.7 低浓度AFB_1促进SIV感染的PAMs向M2型极化 |
| 2.8 LPS刺激逆转M2极化从而降低AFB_1促进的SIV复制 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 甘露寡糖对黄曲霉毒素B_1促进猪流感病毒复制的干预作用研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 工作溶液的配置 |
| 1.5 细胞和病毒培养 |
| 1.6 动物试验设计 |
| 1.7 HE染色试验 |
| 1.8 MTT法测定细胞增殖活性 |
| 1.9 中性红法测定细胞吞噬作用 |
| 1.10 DAPI染色测定细胞活性 |
| 1.11 病毒滴度检测 |
| 1.12 免疫荧光试验 |
| 1.13 荧光定量PCR检测 |
| 1.14 免疫印迹试验 |
| 1.15 数据统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 不同浓度α-MOS对PAMs活性的影响 |
| 2.2 α-MOS阻碍AFB_1促进SIV在PAMs上复制 |
| 2.3 α-MOS削弱AFB_1促进SIV在小鼠肺脏中复制 |
| 2.4 α-MOS缓解AFB_1促进SIV复制所致小鼠肺和脾组织损伤 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 甘露寡糖干预黄曲霉毒素B_1促进猪流感病毒复制的机理研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 工作溶液的配置 |
| 1.5 细胞和病毒培养 |
| 1.6 动物试验设计 |
| 1.7 病毒滴度检测 |
| 1.8 免疫荧光试验 |
| 1.9 免疫组化染色 |
| 1.10 荧光定量PCR检测 |
| 1.11 免疫印迹试验 |
| 1.12 试剂盒检测TNF-α |
| 1.13 数据统计分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 α-MOS阻碍AFB_1上调TLR4-NFκB通路在SIV感染的PAMs上表达 |
| 2.2 TLR4过表达逆转α-MOS对AFB_1促进的SIV感染及其炎性反应的抑制性作用 |
| 2.3 TNF-α体外添加对AFB_1促进的SIV复制无显着影响 |
| 2.4 α-MOS降低AFB_1上调TLR4-NFκB通路在SIV感染的小鼠脾脏和肺脏中表达 |
| 2.5 α-MOS以TLR4依赖性方式减轻AFB_1促进的SIV感染和组织损伤 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（10）PRRSV-1 VLPs的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 前言 第一篇 文献综述 |
| 第一章 病毒样颗粒研究现状 |
| 1.1 VLPS的结构多样性 |
| 1.2 VLPS的功能多样性 |
| 1.3 计算机模拟在VLPS设计中的应用 |
| 1.4 VLPS包装系统 |
| 1.5 杆状病毒-昆虫细胞表达系统的应用概述 |
| 1.6 VLPS疫苗 |
| 第二章 PRRSV生物学特征与免疫现状 |
| 2.1 PRRSV的基本特性 |
| 2.2 PRRSV的复制与增殖 |
| 2.3 PRRSV感染机体后的免疫应答 |
| 2.4 PRRSV-1的流行现状 |
| 2.5 PRRSV疫苗现状 第二篇 研究内容 |
| 第一章 PRRSV-1GP5、M基因与PIFN-Λ1扩增及生物信息学分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 PRRSV病毒样颗粒的构建与表达鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PRRSVVLPS黏膜免疫原性分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 结论 参考文献 附录 作者简介 致谢 |
四、M蛋白阳性患者2007例的体液免疫特征分析（论文参考文献）
- [1]AIM2炎症小体在EV71引起脑炎发病机制的研究及杆状病毒作为SARS-CoV-2活病毒疫苗载体的初步探索[D]. 王倩云. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]血清蛋白电泳识别M蛋白的规则制定及其在健康人群M蛋白筛查中的应用[J]. 徐双,路瑾,赵磊,裴林,贾玫,荣嵘. 检验医学, 2020(07)
- [3]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [4]猪丁型冠状病毒N蛋白抑制猪RLR信号通路的分子机制研究[D]. 纪立凯. 上海交通大学, 2020
- [5]单克隆免疫球蛋白检测在浆细胞病中的临床意义[J]. 刘爱平,刘瑞来,刘琴,方京冲,胡尧,张弢. 检验医学, 2019(08)
- [6]多发性骨髓瘤伴肾损害患者的临床特点及危险因素分析[D]. 李玉玮. 苏州大学, 2019(04)
- [7]狂犬病病毒M和L蛋白单克隆抗体的制备及应用[D]. 刘杰. 南京农业大学, 2019(08)
- [8]鸭坦布苏病毒流行株prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗体依赖性感染增强作用的初步验证[D]. 尹丹. 山东农业大学, 2019(01)
- [9]黄曲霉毒素B1对猪流感病毒复制的促进及甘露寡糖的干预作用与机理研究[D]. 孙雨航. 南京农业大学, 2018(02)
- [10]PRRSV-1 VLPs的构建及免疫原性研究[D]. 许汪. 吉林农业大学, 2018(02)