一、重组人蛋白C的研究进展（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中研究说明近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
胡艳晶[2]（2021）在《应用大黄治疗脓毒症性凝血病的回顾性研究》文中进行了进一步梳理目的:通过单中心回顾性分析应用大黄治疗的脓毒症性凝血病（sepsis‐induced coagulopathy,SIC）患者和未应用大黄治疗的脓毒症性凝血病患者的病例,进行对照研究,探讨大黄对脓毒症性凝血病患者的治疗作用。方法:本研究收集2018年1月至2019年12月解放军联勤保障部队第908医院重症医学科收治的238例脓毒症患者,严格按照纳入标准（符合SIC诊断标准的脓毒症患者,即脓毒症患者根据SIC评分系统评分,总得分≥4分）和排除标准（年龄<18岁,临床数据缺失,存在的先天凝血功能障碍、慢性肝肾功能不全,长期口服抗凝药物）,经整理后,最终共40例脓毒症性凝血病患者纳入本研究。收集这40例脓毒症性凝血病患者的临床资料包括年龄、性别、SOFA评分、DIC评分、SIC评分、急性生理与慢性健康评估Ⅱ（APACHEⅡ）评分、感染部位（包括肺及呼吸系统,腹部及消化系统,泌尿系统和其他）、收缩压（systolic blood pressure,SBP）、90d预后、ICU住院时间和患者用药前、用药后第1天、第3天、第5天、第7天的白细胞计数（White Blood Cell Count,WBC）、血小板计数（Platelet Count,PLT）、C反应蛋白（C Reaction Protein,CRP）、血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time,PT）、活化部分凝血活酶原时间（Activated Partial Thromboplastin Time,APTT）,纤维蛋白原（Fibrinogen,FIB）、凝血酶时间（Thrombin Time,TT）、血浆纤维蛋白降解产物（Fibrin Degradation Products,FDP）、D-二聚体（D-dimer,DD）、血栓弹力图（Thrombelastogram,TEG）指标,按照是否接受大黄治疗将脓毒症性凝血病患者分为大黄治疗组（n=20）和对照组（n=20）,并应用SPSS22.0对选取的这40例脓毒症性凝血病患者的年龄、性别、SOFA评分、DIC评分、SIC评分、APACHEⅡ评分、收缩压、90d预后、ICU住院时间和患者用药前、用药后第1天、用药后第3天、用药后第5天、用药后第7天的WBC、PLT、CRP、PT、APTT、FIB、TT、FDP、DD和TEG指标等进行统计学分析。结果:大黄治疗组和对照组的脓毒症性凝血病患者的90d生存率无明显差异（P>0.05）。两组患者的年龄、SOFA评分、DIC评分、SIC评分、APACHEⅡ评分、感染部位、收缩压、90d预后、ICU住院时间均无明显差异（P>0.05）。用药前,大黄治疗组和对照组的WBC、PLT、CRP、PT、APTT、FIB、TT、FDP、DD和TEG指标均无统计学差异（P>0.05）。用药后第1d,大黄治疗组和对照组的WBC、PLT、CRP、PT、APTT、FIB、TT、FDP、DD和TEG指标也均无统计学差异（P>0.05）。用药后第3 d,大黄治疗组患者的FIB水平[（2.92±0.99）g/L]和血栓弹力图检测的MA值（TEG-MA）[（57.8±6.0）mm]显着高于对照组患者的FIB水平[（2.14±1.01）g/L]和TEG-MA值[（49.3±9.2）mm]（P<0.05）,其他指标均无统计学意义（P>0.05）。用药后第5 d,大黄治疗组患者的TEG-MA值[（59.5±9.0）mm]显着高于对照组患者第5 d的TEG-MA值[（46.9±16.4）mm]（P<0.05）,其他指标均无统计学意义（P>0.05）。用药后第7d,大黄治疗组和对照组的凝血指标、弹力图指标、感染指标和血小板计数均无统计学差异（P>0.05）。广义估计方程（generalized estimating equation,GEE）是对纵向数据按时间顺序对个体重复测量的一种高级统计学方法。本研究应用GEE综合分析显示在时间和治疗方式的交互影响下大黄治疗组的PT[14.8（12.9-17.9）s]、APTT[34.4（30.1-41.6）s]、TT[15.9（14.4-17.2）s]、FDP[13.7（8.1-26.9）μg/m L]、DD[4.6（2.5-7.8）μg/m L]、R[7.7（6.5-10.3）min]、K[2.3（1.8-3.8）min]、Angle[58.9（48.6-66.1）°]、WBC[11.1（7.8-15.9）×109/L]、PLT[90.0（64.8-182.8）×109/L]、CRP[90.7（43.3-150.3）ng/d L]与对照组的PT[15.7（13.8-17.7）s]、APTT[35（31.3-42.4）s]、TT[17（15.1-18.5）s]、FDP[11.5（6.8-23.9）μg/m L]、DD[3.9（2.4-7.2）μg/m L]、R[8.0（6.2-9.8）min]、K[2.7（1.8-4.5）min]、Angle[54.6（44.8-63.9）°]、WBC[10.2（6.9-15.6）×109/L]、PLT[90.5（48.0-137.3）×109/L]、CRP[83.4（53.8-126.9）ng/d L]相比均无统计学差异（P>0.05）。而大黄治疗组的FIB水平[（2.76±0.93）g/L]和TEG-MA值[（56.45±9.99）mm]明显高于对照组的FIB[（2.29±0.89）g/L]和TEG-MA值[（50.15±12.89）mm]（P<0.05）。结论:大黄可以改善脓毒症性凝血病患者纤维蛋白原水平和血小板功能,但不影响脓毒症性凝血病患者的90d生存率。
程振兴[3]（2020）在《循环组蛋白与急重症时多器官功能障碍综合征发病机制相关性的研究》文中研究指明背景:多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）是指机体受到休克、创伤、感染、烧伤等严重打击后,短时间内同时发生两个或两个以上器官或系统功能障碍或衰竭、不能维持自身的生理功能,从而影响机体内环境稳定的临床综合征。依受损器官数量差异,MODS患者病死率维持在30%-100%之间。MODS的特征是多个脏器同时、而非依次发生功能障碍,MODS的介质至今仍未明确。凝血激活、微循环衰竭、缺氧以及细菌毒素都被认为是MODS的潜在介质,但其真正作用尚未得以充分证明。正常情况下,位于细胞核内的组蛋白（histones）是DNA包装、基因调控过程所必需的结构性蛋白质;在多种原因导致的细胞损伤过程中,细胞核内的染色质分解后将组蛋白释放到细胞外形成胞外组蛋白（extracellular histones）。若机体在短时间内发生广泛性组织损伤或细胞死亡,随即产生的大量胞外组蛋白进入血液循环即为循环组蛋白（circulating histones）。目的:胞外组蛋白会损伤单器官。本研究将阐述循环组蛋白是否以第二次打击的方式介导创伤、急性胰腺炎、脓毒症等原发性急重症时MODS的发生与发展,与此同时我们还对急重症模型小鼠的高浓度循环组蛋白的来源进行初步探讨。方法:总体来说,我们主要通过将临床研究、体外实验以及建立创伤、急性胰腺炎和脓毒症等急重症动物模型相结合的方式阐明循环组蛋白在临床常见急重症时MODS发生与发展中的作用;通过体内、外实验对脓毒症模型小鼠高水平循环组蛋白的来源进行初步探讨。1.循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义采用蛋白质免疫印迹法（western blotting,WB）检测最终纳入的420名重症监护病房（intensive care unit,ICU）急重症患者入院时血浆组蛋白状况并通过一定方法换算出各自相应的血浆组蛋白浓度;检测纳入病人的肝、肾功能、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、氧合指数等多脏器功能指标,及时采集病人入院时的序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment,SOFA）评分、入院后48h-72h的MODS发生情况以及住院后28天内的病死情况等临床数据,统计分析循环组蛋白浓度与急重症患者上述各项临床数据之间的关系。另外采集10名健康献血者的血液以分离血浆或血清用于相关的体外实验。2.胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用首先,分别使用添加不同剂量小牛胸腺组蛋白后的健康人血清、含不同浓度组蛋白的急重症患者血清处理人源性内皮细胞系EA.hy926,选择抗组蛋白单链抗体（anti-histone single chain variable fragment,ahsc Fv）、非抗凝肝素（non-anticoagulant heparin,Heparin）作为胞外组蛋白拮抗剂;然后,使用含高浓度循环组蛋白的急重症患者血清处理以下不同器官来源细胞以进一步观察循环组蛋白对组织细胞的非特异性毒性作用:小鼠心肌细胞（HL-1）、原代人肺支气管-肺泡上皮细胞（HSAEp C）、人永生化肝细胞（THLE-3）及原代人肾皮质上皮细胞（HRCE）。采用流式细胞术检测上述处理后各种细胞的PI阳性率（细胞死亡率）,以判断胞外组蛋白的细胞毒性作用。3.循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用选择野生型C57BL/6j以建立各类急重症的小鼠模型。采用重物自由落体撞击并控制撞击次数法建立轻、中、重三种不同损伤程度的小鼠肢体闭合性创伤模型;通过腹腔注射4次、12次雨蛙素以及胆总管逆行注射胆酸盐法（taurocholate,TCL）诱导轻、中、重三种不同胰腺损伤程度的小鼠急性胰腺炎模型;选择在结扎75%长度的盲肠后制造两个或四个肠内容物溢出穿刺孔的方式建立小鼠次重度、重度盲肠结扎后穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）模型;以静脉注射ahsc Fv或肌肉注射Heparin干预以上各模型小鼠,评价抗组蛋白治疗能否减轻这些小鼠的多脏器功能损伤。以WB法检测急重症模型小鼠的血浆组蛋白浓度,通过检测血浆ALT、BUN、cTnT来反映各模型小鼠肝、肾功能及心肌损伤情况,通过显微镜下肺组织（H&E染色）损伤评分法评估各模型小鼠肺损伤情况;经H&E染色、抗激活型Caspase-3免疫组化的方法观察各模型小鼠心、肝、肺、肾、肠、胸腺、脾脏等多脏器组织病理学特点;统计分析上述急重症模型小鼠循环组蛋白水平与多器官损伤之间的相关性,评价抗组蛋白治疗对重度CLP模型小鼠建模后72h生存率的影响。4.急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨为判断胸腺、脾脏对小鼠脓毒症时循环组蛋白来源的贡献,除常规使用WT C57BL/6j小鼠建模外,我们还要用到WT BALB/c小鼠及缺乏胸腺的BALB/c nude小鼠,同时需在以上小鼠完成脾脏切除术后再进行诱发脓毒症的相应处理。由于在脾脏切除术后继续对实验小鼠进行CLP操作会造成额外的损伤,进而可能影响脓毒症的自然发病过程;革兰氏阴性杆菌感染依然在细菌性脓毒症的病因中占有重要地位,而定量细菌腹腔注射法建立小动物脓毒症模型具有操作简便、效果明显且稳定的特点,我们故在此通过腹腔注射大肠杆菌K-12的方式对脾脏切除后的C57BL/6j小鼠诱发脓毒症。由于缺乏胸腺的BALB/c nude小鼠自身具有免疫缺陷性,这些小鼠的经细菌性腹膜炎（CLP术或腹腔注射大肠杆菌）导致脓毒症的病程可能不利于揭示循环组蛋白水平的变化特点,在此情况下使用造模成分明确且效果可靠、即腹腔注射LPS成为诱导BALB/c nude小鼠发生脓毒症的首选替代方法。将凋亡标记蛋白Annexin-V与荧光素m-Cherry联合形成Annexin-V/m-Cherry耦合物,因此在近红外激发光下m-Cherry的荧光强度标志着凋亡信号的强弱。通过近红外成像技术比较脓毒症模型小鼠在静脉注射m-Cherry/Annexin-V后多脏器的荧光强度;腹腔注射大肠杆菌K-12后的C57BL/6j小鼠在不同时间点接受皮下注射泛Caspases抑制剂Z-VAD-FMK;向健康的C57BL/6j小鼠尾静脉注射小牛胸腺组蛋白以探讨高浓度的循环组蛋白是否会引起脾细胞发生过度凋亡;经H&E染色、抗激活型Caspase-3免疫组化的方法观察各种方式处理后小鼠的多脏器组织病理学特点;比较野生型BALB/c、BALB/c nude及脾脏切除后的BALB/c nude小鼠在接受腹腔注射LPS后40h左右的生存率。目前人们普遍认为细胞坏死而并非细胞凋亡过程能够释放组蛋白到细胞外。糖皮质激素不仅是引发淋巴细胞凋亡的典型信号,也是临床通过诱发凋亡治疗骨髓瘤、白血病等恶性血液肿瘤的常用化疗药物。为明确细胞在发生凋亡过程中是否会直接释放组蛋白到细胞外,我们在体外实验中先采用水溶性糖皮质激素处理人B淋巴细胞系Daudi细胞、人T淋巴细胞系Jurkat细胞,然后经流式细胞术检测两种细胞的凋亡情况,通过WB法检测并比较细胞培养上清中组蛋白H3的含量变化情况。结果:1.循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义总体看来,所有纳入ICU的急重症病人入院时循环组蛋白浓度[24.7（8.0,46.7）μg/ml]明显高于健康献血者[1.3（0,2.1）μg/ml]。按病因对纳入病人分类后可见,重度创伤、重症胰腺炎、脓毒症患者入院时循环组蛋白水平较其他病种患者的显着升高,但这三种疾病患者之间循环组蛋白浓度差异无统计学意义。Spearman秩相关性检验表明,纳入病人入院时循环组蛋白水平与肝功能[ALT（rs=0.545;P<0.0001）]、肾功能[BUN（rs=0.496;P<0.0001）]、呼吸功能[Pa O2/Fi O2（rs=-0.360;P=0.015）]损伤以及心肌损伤标志物[c Tn T(rs=0.607;P<0.01]升高之间均存在正相关性;入院伴发MODS或住院28天内死亡病人的入院时循环组蛋白浓度明显偏高{[30.1（7.3,63.2）μg/ml vs.10.8（4.3,30.1）μg/ml;P<0.0001]、[32.7（14.4,66.9）μg/ml vs.20.1（6.7,40.5）μg/ml;P<0.0001]}。另外,纳入病人入院时循环组蛋白浓度不仅能预测入院后48h-72h之间MODS发生情况,还有助于推断病人住院后28天病死率。2.胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用健康人血清在加入外源性组蛋白后会对人内皮细胞系EA.Hy926产生剂量依赖性的毒性作用,当用组蛋白浓度≥30ug/ml的病人血清处理EA.hy926细胞后,其存活率也显着降低;与此相反,用胞外组蛋白拮抗剂ahsc Fv或Heparin处理均可显着降低胞外组蛋白对EA.Hy926内皮细胞的毒性作用。用含50μg/ml小牛胸腺组蛋白的健康人血清或组蛋白含量也超过50μg/ml的急重症病人血清处理不同器官来源的细胞（小鼠心肌细胞、人肝细胞、人肾皮质上皮细胞和人支气管-肺泡上皮细胞）后,这些细胞的存活率均明显下降。3.循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用循环组蛋白的浓度—时间曲线表明,中度创伤、次重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的循环组蛋白浓度峰值时间分别为建模后8h、16h、16h;各类疾病模型小鼠在各达峰时间的循环组蛋白浓度随病情加重而升高。经相关性分析后发现,各类疾病模型小鼠的循环组蛋白浓度与受损的肝功能（ALT）、肾功能（BUN）及升高的肌钙蛋白I（cTnT）、肺组织损伤评分得分（lung injury score,LIS）均呈正相关;ahsc Fv、Heparin抗组蛋白治疗能显着改善重度创伤、重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的ALT、BUN、cTnT、LIS等受损脏器功能指标;其中,无论在建模前还是建模后开始抗组蛋白治疗,重度CLP模型小鼠的72h存活率均得以显着改善。多脏器组织切片抗激活型Caspase-3免疫组化检测发现,重度创伤、重度CLP及TCL胰腺炎模型小鼠的胸腺与脾脏存在细胞过度凋亡现象。4.急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨经腹腔注射适量大肠杆菌K-12能成功诱导野生型C57BL/6j小鼠发生脓毒症,同时细菌注射后10h循环组蛋白浓度达到较高水平（322.8±100.6μg/ml）,此后其值持续升高,峰值时间约在注射细菌后16h左右（478.2±166.4μg/ml）,且在24h仍处于高水平（424.8±154.1μg/ml）。多脏器近红外成像结果表明,从腹腔注射细菌后4h开始,C57BL/6j小鼠胸腺与脾脏的凋亡信号已明显升高,其中胸腺的凋亡信号一直持续升高到注射细菌后24h,脾脏凋亡信号高峰时间是细菌注射后8h;脏器组织切片H&E染色与抗激活型Caspase-3免疫组化染色结果显示,腹腔注射大肠杆菌后24h左右C57BL/6j小鼠的胸腺与脾脏淋巴细胞数大幅减少,两者均存在大面积细胞凋亡现象,而心、肝、肾等重要器官均未见明显的实质细胞凋亡;统计学分析发现,脓毒症模型小鼠的脾脏凋亡细胞数目与循环组蛋白浓度升高呈正相关（r=0.78;P<0.001）。将一定剂量的小牛胸腺组蛋白经尾静脉注射到C57BL/6j小鼠体内,循环组蛋白升高水平与小鼠发生严重脓毒症时相似,但免疫组化检查结果并未显示脾脏淋巴细胞凋亡增加,据此推断模型小鼠脾脏与胸腺细胞凋亡是循环组蛋白的来源,而不是循环组蛋白作用结果。皮下注射泛Caspases抑制剂Z-VAD-FMK能阻断细胞凋亡,循环组蛋白浓度也相应降低,提示细胞凋亡促进了循环组蛋白浓度的升高。我们还发现,脾脏切除后的C57BL/6j小鼠再经腹腔注射大肠杆菌K-12诱发脓毒症时,其循环组蛋白水平较未切除脾脏组显着降低（137.4.57±31.2μg/ml vs.53.8±21.8μg/ml;P<0.001）;与WT BALB/c nude小鼠比较（84.57±13.51μg/ml）,胸腺缺失（BALB/c nude小鼠）（33.49±7.59μg/ml）或胸腺缺失联合脾脏切除（BALB/c nude小鼠+脾脏切除术）（13.47±3.27μg/ml）能有效降低经腹腔注射LPS诱发脓毒症时的循环组蛋白水平并显着改善建模后实验小鼠的40h存活率。体外培养的Daudi细胞（B淋巴细胞系）、Jurkat细胞（T淋巴细胞系）均随氢化可的松剂量依赖的、不同程度的细胞凋亡（Annexin V+）,蛋白质免疫印迹法也证实未经糖皮质激素处理的淋巴细胞上清未见明显的组蛋白H3条带,而糖皮质激素处理的两种淋巴细胞上清液存在氢化可的松剂量依赖的、浓度高低不等的组蛋白H3。结论:1.重度创伤、重症胰腺炎及脓毒症等急重症患者入院时的高水平循环组蛋白与MODS进展及不良预后密切相关。2.添加外源性组蛋白后的健康人血清或含高水平循环组蛋白的急重症患者血清均对多器官来源的细胞产生由组蛋白介导的、非细胞特异性的毒性作用;抗组蛋白处理能有效抑制这种细胞毒性效应。3.在实验小鼠发生重度创伤、TCL胰腺炎（重症胰腺炎）、重度CLP（重度脓毒症）等多种原发性急重症后,循环组蛋白通过直接作用、以第二次打击的方式同时损伤多个脏器从而参与介导了MODS的发生与发展;抗组蛋白治疗有效改善以上急重症模型小鼠的MODS,显着提高重度脓毒症模型小鼠的存活率。4.胸腺与脾脏是脓毒症模型小鼠高水平循环组蛋白的重要来源,具体机制主要涉及脓毒症时胸腺与脾脏细胞的过度凋亡。
廖钰秋[4]（2020）在《马铃薯StMAPKK1互作蛋白筛选及其互作蛋白基因功能解析》文中认为促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联反应是植物生长发育、激素及胁迫的响应信号通路中重要信号网络之一。MAPKKs是其主要成员之一,在该级联反应中位于通路中间、对信号传递起着收集和发散的关键作用的激酶。本实验室前期工作中,对马铃薯（Solanum tuberosum L.）StMAPKKs家族基因进行了鉴定,共鉴定出5个StMAPKKs基因,不同胁迫处理下马铃薯StMAPKKs基因荧光定量PCR结果发现,在干旱胁迫下该基因家族中StMAPKK1基因表达量升高最为显着。所以,本研究旨在对鲜有报道的StMAPKK1基因的调控功能及信号通路上的互作蛋白进行挖掘和解析,以期为深入研究马铃薯抗逆应答反应中的MAPK、MAPKK及MAPKKK信号传导级联系统的分子机理和代谢网络奠定基础。为此,本研究用生物信息学方法对StMAPKK1基因进行了序列和功能分析;使用同源重组方法构建了酵母（Saccharomyces cerevisiae）双杂交系统诱饵载体pGBKT7-StMAPKK1、亚细胞定位表达载体pCEGFP-StMAPKK1以及双分子荧光互补表达载体pSPYCE-StMAPKK1和pSPYNE-StMAPKK1;利用酵母双杂交技术从马铃薯‘紫花白’酵母双杂交cDNA文库经过大量筛选,获得了与马铃薯StMAPKK1相互作用的蛋白质;对筛选出的马铃薯StMAPKK1互作蛋白基因进行了生物信息学基因序列分析及基因功能注释。取得了以下主要研究结果:1.采用生物信息学分析发现,马铃薯StMAPKK1是等电点为5.47的稳定蛋白质和亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,含有丝氨酸和苏氨酸为主的蛋白磷酸化位点,含有Protein kinase domain（PF00069）结构域。StMAPKK1基因定位于细胞质中,含有涉及植物激素ABA、GA3和乙烯响应相关、植物逆境胁迫干旱响应、厌氧诱导和损伤应答相关以及光响应相关的顺式作用元件。StMAPKK1基因在组织中表达存在特异性,在生物胁迫BABA和晚疫病病菌处理下,以及非生物胁迫ABA、BAP和水分胁迫处理下基因表达量显着变化。STRING v11.0中共预测出5种StMAPKK1互作蛋白,包括2种StMAPKKK蛋白,1种StMAPK蛋白,1个真核翻译起始因子3的B亚基蛋白以及1个未被鉴定的蛋白质。2.克隆了马铃薯StMAPKK1基因,采用同源重组方法构建了StMAPKK1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-StMAPKK1,并将该诱饵载体转入酵母Y187中,进行检测证明该诱饵载体对酵母菌株无毒性和无自激活活性,可用于进一步酵母双杂交实验。3.采用酵母双杂交方法,使StMAPKK1诱饵蛋白与马铃薯cDNA文库杂交,杂交液共涂布于50个四缺QDO培养基上培养,挑选出直径较大的、呈白色或浅粉色的单菌落406个,通过初步X-α-Gal染色初步鉴定筛选,其中210个菌落在48 h内生长并显蓝色,视其为阳性克隆,阳性率为51.72%。对阳性克隆进行PCR电泳检测和测序,合并重复、冗余测序结果,最终筛选出5种与StMAPKK1互作的蛋白质阳性克隆,分别命名为C1-C5。5种阳性克隆均通过小规模杂交验证互作真实性。4.对StMAPKK1互作蛋白阳性克隆进行测序和Blast比对分析,鉴定得到的5个StMAPKK1互作蛋白基因C1-C5分别为:水解酶（水解O-糖基化合物）、RING-H2亚家族RHE蛋白、氰酸酯酶、ARF GTPase活化因子以及一个含有C2结构域的蛋白。通过生物信息学分析发现,StMAPKK1互作蛋白均为亲水性蛋白,且均含有数量不等的蛋白磷酸化位点。除C2基因可能定位于叶绿体类囊体膜或细胞核之外,其它StMAPKK1互作蛋白基因均定位于在细胞质中。StMAPKK1互作蛋白基因均含有植物生长发育相关、激素和胁迫响应相关顺式作用元件,并在组织表达及生物胁迫和非生物胁迫响应中具有特异性。5.构建了亚细胞定位表达载体pCEGFP-StMAPKK1可以用于后续StMAPKK1基因的亚细胞定位研究;构建了双分子荧光互补表达载体pSPYCE-StMAPKK1和pSPYNE-StMAPKK1,将用于StMAPKK1与其5个互作蛋白双分子荧光互补实验,对上述5对蛋白互作关系进行进一步验证。
程延良[5]（2020）在《左西孟旦与重组人利钠肽治疗急性心衰的疗效及成本分析》文中研究说明研究背景:心力衰竭简称心衰,是一组复杂临床综合征,它是由于多种原因导致心脏结构和（或）功能的异常改变,使心室收缩和（或）舒张功能发生障碍而引起的,是各种心血管疾病的严重表现或者晚期阶段。近年来的流行病学调查显示,我国35岁以上成人心衰患病率已达1.3%,估计心衰患者已达1370万人。随着我国人口老龄化的不断加剧,冠心病、高血压、糖尿病、肥胖等慢性疾病人数的不断增多,我国心衰患者将呈持续增多的趋势。根据China-HF研究,我国心衰患者中位住院天数为10天,住院期间死亡率高达4.1%。再住院率高、住院时间长、死亡率高已成为心衰的显着特点,心衰是目前心血管病学领域尚未攻克的堡垒,而住院期间治疗心衰所需的高额费用,更是给家庭和社会带来了沉重的负担。针对急性心衰的药物治疗,我们目前主要依靠利尿、扩血管、强心这“三驾马车”,左西孟旦是一种钙增敏剂,是一种新型的正性肌力药物,它与心肌肌钙蛋白C相结合,增加心肌收缩力,且对心脏舒张无影响,同时还能扩张血管;重组人利钠肽作为扩血管药物的代表药物,主要通过扩张静脉与动脉进而降低心脏的前后负荷,且具有一定的排钠利尿作用;二者均可明显改善急性心衰患者的血流动力学和呼吸困难等相关症状,一系列临床研究分别从不同角度证明了其治疗效果与安全性,二者对急性心衰的治疗作用已毋庸置疑,均已作为推荐药物写入各国心衰指南,且目前临床上广泛应用。在急性心衰的治疗中,我们经常会结合患者病情选择不同的治疗方案来帮助患者度过急性期,比如在利尿剂的基础上,选择二者中某一种药物单独应用或者两种药物联合应用治疗;但由于这两种药物价格相对较高,对心衰患者的治疗费用有一定影响,同时不同的治疗方案对治疗效果也会产生不同的影响,不同的治疗方案之间成本与效果到底有何关系,目前研究尚少。这就需要我们在有限的医疗资源内,利用药物经济学中的成本-效果分析方法,对不同的药物治疗方案所获得的收益及成本之间进行比较,选择出相对最优的结果,从而为临床医师的决策提供信息。基于以上情况,本研究利用心衰患者住院期间的相关信息,探讨左西孟旦与重组人利钠肽治疗急性心衰的疗效及成本分析。研究目的:1.探讨左西孟旦与重组人利钠肽对急性心衰疗效的影响。2.左西孟旦与重组人利钠肽治疗急性心衰的成本-效果分析。研究方法:选取2018年1月1日至2018年12月31日于山东大学齐鲁医院心内科住院且诊断为急性心力衰竭的患者进行回顾性病例调查分析,根据纳入及排除标准,共筛选出147例患者。统计患者的一般资料包括年龄、性别、身高、体重、吸烟史、饮酒史、疾病史等,入院及出院时静息血压和静息心率,入院心衰诱因、心衰症状及体征,心脏彩超（主要为LVEF和LVEDD）,化验资料包括NT-proBNP、血常规、肝肾功、血糖、血脂、电解质、甲功、D-Di等,以及治疗药物、住院天数及住院费用等资料并记录到电子档案,建立数据库。根据是否应用左西孟旦及重组人利钠肽,将其分为3组:左西孟旦组:对患者采取常规治疗+左西孟旦治疗;重组人利钠肽组:对患者采取常规治疗+重组人利钠肽治疗;联合治疗组:对患者采取常规治疗+左西孟旦联合重组人利钠肽治疗。根据疗效判定标准将治疗效果分为显效、有效和无效,总有效率为（显效+有效）/总人数x100%,利用住院总费用及总有效率计算并分析不同组的成本-效果比值及组间的增量成本-效果比值。使用SPSS25.0统计分析软件对数据进行分析,计量资料需进行正态性检验,对符合正态分布的计量资料,采用均数±标准差（x±s）的形式表示,组间比较方法采用单因素方差分析,组内比较方法采用配对样本T检验;对不符合正态分布的计量资料,采用四分位数M（Q1,Q3）的形式表示,组间比较方法采用非参数检验,组内比较方法采用Wilcoxon符号秩检验;等级资料采用例数或百分比（%）表示,组间比较方法采用非参数检验中的Ridit分析;计数资料采用例数或百分比（%）表示,组间比较方法采用卡方检验。所有检验以P<0.05为差异有统计学意义。结果:（1）一般临床资料比较:三组患者在年龄、性别比例、身高、吸烟史、饮酒史、入院NT-proBNP、血红蛋白（HGB）、血白蛋白（ALB）、肝功能（ALT、AST）、肾功能（Cr、BUN）、血脂（LDL-c）、血钾（K+）、有无心衰诱因、主要心衰病因、入院心功能分级（NYHA分级）、心衰合并症等资料方面进行比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。（2）LVEF、LVEDD 比较:在LVEF方面,左西孟旦组与重组人利钠肽组、联合治疗组分别进行比较,差异均无统计学意义（P>0.05）;而重组人利钠肽组与联合治疗组相比,重组人利钠肽组的LVEF值明显高于联合治疗组,差异具有明显统计学意义（P<0.05）。在LVEDD方面,左西孟旦组、重组人利钠肽组与联合治疗组三组患者相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。（3）住院期间药物使用情况:在纳入本研究的147名患者中,住院期间RAAS抑制剂总使用率为84.4%,β受体阻滞剂总使用率为93.9%,醛固酮受体拮抗剂总使用率为94.6%,静脉利尿药物总使用率为97.3%,三组患者在以上药物的使用情况上相比,差异均无统计学意义（P>0.05）。（4）入院与出院的心率比较:重组人利钠肽组及联合治疗组患者的出院心率均明显慢于入院心率,差异具有明显统计学意义（P<0.001）;而左西孟旦组患者的出院心率与入院心率相比,差异无统计学意义（P>0.05）。（5）入院与出院的血压比较:三组患者在出院时收缩压及舒张压均较入院时明显降低,差异具有明显统计学意义（P<0.001）。（6）入院与出院的体重比较:联合治疗组患者在出院时体重较入院时明显减轻,差异具有统计学意义（P<0.05）;而左西孟旦组及重组人利钠肽组患者的出院体重与入院时相比,差异无统计学意义（P>0.05）。（7）入院与出院的NT-proBNP比较:左西孟旦组、重组人利钠肽组与联合治疗组三组患者在出院前最后1次所测NT-proBNP较入院时均明显降低,差异均具有明显统计学意义（P<0.001）。（8）NT-proBNP降幅比较:以NT-proBNP下降幅度大于50%、30%-50%、小于30%甚至上升为等级对NT-proBNP降幅进行Ridit分析,提示左西孟旦组在NT-proBNP降幅上表现最优,联合治疗组表现次之,重组人利钠肽组表现最差,但三组患者相比差异无统计学意义（P>0.05）。（9）住院天数比较:左西孟旦组、重组人利钠肽组与联合治疗组三组患者中位住院天数分别为10天、11天、12天,三组相比差异无统计学意义（P>0.05）。（10）治疗效果比较:以显效、有效、无效对三组进行Ridit分析,提示左西孟旦组治疗效果相对最好,联合治疗组次之,重组人利钠肽组相对最差,但三组差异无统计学意义（P>0.05）。而在总有效率方面,左西孟旦组治疗总有效率为81.3%,重组人利钠肽组治疗总有效率为67.4%,联合治疗组治疗总有效率为72.5%,三组差异无明显统计学意义（P>0.05）（11）住院总费用比较:左西孟旦组住院总费用明显低于重组人利钠肽组及联合治疗组,差异具有明显统计学意义（P<0.05）;而联合治疗组住院总费用则明显高于左西孟旦组及重组人利钠肽组,差异具有明显统计学意义（P<0.05）。（12）平均每日住院费用比较:左西孟旦组平均每日住院费用明显低于重组人利钠肽组及联合治疗组,差异具有明显统计学意义（P<0.05）;而重组人利钠肽组与联合治疗组相比,两者间平均每日住院费用的差异无统计学意义（P>0.05）。（13）成本-效果分析:每取得1%的治疗效果,左西孟旦组的治疗成本最少,为150.11元;重组人利钠肽组所需的治疗成本居中,为275.95元;而联合治疗组所需治疗成本最多,为284.82元。与重组人利钠肽组相比较,每增加1%的治疗效果,左西孟旦组反而少花费460.06元,联合治疗组则要多花费402.07元。（14）敏感度分析:敏感度分析结果与成本-效果分析结果一致。结论:1.左西孟旦、重组人利钠肽及二者联合对心衰患者治疗效果明显,均可明显降低患者NT-proBNP,降幅可达50%以上,三种方案治疗效果无显着差异。2.联合治疗组住院费用最高,重组人利钠肽组住院费用次之,左西孟旦组住院费用最低。3.左西孟旦单药治疗总有效率高于其他二种方案且成本最低,是成本-效果最优的治疗方案,其他二种方案可根据患者病情、经济条件及意愿进行选择。
周胜男[6]（2020）在《蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究》文中提出论文ⅠPGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究研究背景硝酸酯类药物作为最古老的心血管药物之一,由于其起效快,作用恒定等特点,仍被广泛应用于临床冠心病的治疗。临床上常用的硝酸酯类药物包括硝酸甘油（nitroglycerin,GTN）、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯等。硝酸酯类药物通过扩张外周血管,改善心肌血液分布,抑制血小板的聚集和黏附等作用,被应用于各种类型心绞痛的治疗。然而在频繁给药及连续应用的情况下,其抗缺血作用减弱甚至消失,即产生硝酸酯类药物耐受,从而成为其临床应用的一大阻碍。硝酸酯类耐受机制的研究主要有以下学说:血容量扩张学说,巯基耗竭学说,神经激素激活学说,线粒体功能障碍学说等。由此可见,硝酸酯类药物耐受的机制是复杂而尚不明确的,探索其中可能的机理是临床应用硝酸酯类药物中亟待解决的问题。硝酸酯类药物作为外源性一氧化氮（nitricoxide,NO）供体,在体内经过生物转换作用释放NO。NO通过经典的sGC/cGMP/PKG途径介导硝酸酯类药物的扩血管效应。作为体内重要的信号分子,NO除依赖经典的sGC/cGMP/PKG途径外,还可通过参与蛋白质的巯基亚硝基化过程调节细胞功能。蛋白质巯基亚硝基化修饰是NO与蛋白质半胱氨酸残基中的自由巯基（-SH）共价结合形成亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的过程。研究表明,蛋白质亚硝基化修饰影响蛋白质的生物活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质间相互作用,从而导致蛋白质结构和功能的改变,继而影响细胞的多种病理和生理过程。在花生四烯酸代谢通路中,前列腺素H2（Prostaglandin H2,PGH2）分别在前列环素合酶（Prostacyclin synthase,PGIS）和血栓素A2合酶的催化下形成前列环素（Prostacyclin,PGI2）和血栓素 A2（Thromboxane A2,TXA2）。TXA2 通过激活血栓烷素受体（TPr）引起血管收缩,而PGI2通过其特异受体诱导血管舒张,因此PGI2和TXA2共同调节血管舒张和收缩的平衡稳态。PGIS作为PGI2生物合成的限速酶,主要分布于血管内皮细胞和平滑肌细胞。PGIS活性下降或PGI2生成减少均可导致血管平滑肌细胞舒张反应减弱而收缩反应增强,使血管扩张效应降低。有研究报道,PGIS的功能缺失是导致硝酸酯类药物耐受的机制之一。研究表明,sGC亚硝基化是主动脉平滑肌细胞对NO脱敏的机制之一,证明蛋白质亚硝基化可能是硝酸酯类交叉耐受的重要原因。我们通过蛋白质氨基酸序列对比发现,不同物种PGIS蛋白在231位和441位氨基酸位点上均存在两个半胱氨酸,使得PGIS可能成为亚硝基化修饰的可能靶点。那么,PGIS是否可被NO巯基亚硝基化修饰?PGIS亚硝基化修饰对PGIS的功能产生怎样的影响?PGIS亚硝基化修饰是否为硝酸酯类药物交叉耐受的可能原因?基于以上分析,本研究拟从体外和体内水平探究各NO供体与PGIS的巯基亚硝基化反应,观察其对血管舒张功能的影响,并进一步探究PGIS发生亚硝基化修饰的半胱氨酸位点,为临床上硝酸酯类药物耐受的研究及预防提供相应实验依据。研究目的1.研究GTN是否诱导内皮细胞中PGIS亚硝基化修饰;2.研究PGIS亚硝基化修饰是否介导血管硝酸酯类耐受3.探究预防GTN耐受的方法。研究方法1.细胞刺激和转染（1）将 0.1 μM,1 μM,10 μM,50 μM,100 μM 浓度梯度的 GTN 与 HUVECs反应8小时,观察细胞中PGIS亚硝基化修饰水平和PGIS活性及PGI2、TXA2的生成;山东大学博士学位论文（2）预先用0.3 mM的NO清除剂Carboxy-PTIO或2.5 mM亚硝基化拮抗剂NAC处理细胞0.5小时,再向细胞加入10 μMGTN刺激8小时。观察各组细胞内PGIS亚硝基化水平和活性及PGI2、TXA2的生成;（3）合成野生型 PGIS（WT-PGIS）和突变型 PGIS（MT-PGIS-C231A、C441A、C231/441A）cDNA腺病毒并感染HUVECs。细胞转染腺病毒48小时后,加入10μMGTN反应8小时。观察细胞内PGIS亚硝基化水平及Cys231和Cys441突变对PGIS活性的影响。2.重组蛋白的体外实验构建及表达野生型和突变型PGIS（WT、C23IA、C441A、C231/441A）纯化蛋白。（1）将重组人PGIS蛋白与10μM的NO供体（GTN,GSNO,SNAP,SNP和SPNO）孵育两小时;（2）将野生型或突变型人PGIS蛋白与10 μM的GTN孵育两小时,检测各组PGIS蛋白亚硝基化修饰水平和PGIS蛋白活性。3.动物棋型建立（1）取40只8周龄SD雄鼠,随机分为以下4组:对照组,GTN组,NAC组,GTN+NAC组（每组10只）。预先给予NAC（50mg/kg/天）灌胃7天,7天后将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后将大鼠处死;（2）选取60只8周龄ApoE-/-雄鼠并随机分为4组:WT-PGIS组,MT-PGIS组,WT-PGIS+GTN 组,MT-PGIS+GTN 组（每组 15 只）。尾静脉注射 WT-PGIS或MT-PGIS cDNA腺病毒,2周后,将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将小鼠处死;（3）选取60只8周龄SD雄鼠并分为以下4组:空白对照组,GTN组,GTN+阿司匹林组,GTN+贝前列素组（每组15只）。阿司匹林（10mg/kg/天）或贝前列素（200μg/kg/天）灌胃两周,而后将含有GTN（100 mg/kg/天）的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将大鼠处死;（4）取40只8周龄SD雄鼠,取出主动脉并制备主动脉环,将主动脉环在生理盐水或1 mM的Tranylcypromine中孵育30分钟。通过离体血管环实验观察血管对GTN和SNP的张力变化。4.免疫沉淀反应（IP）提取细胞或组织蛋白,加入PGIS抗体与蛋白裂解液4℃旋转过夜。加入Protein A/G Agarose孵育4小时后离心取上清,经过Western blot检测细胞或组织中PGIS蛋白亚硝基化水平。5.蛋白免疫印迹分析（Western blot）细胞或组织蛋白经过凝胶电泳、转膜、一抗孵育、二抗结合、ECL等步骤观察PGIS蛋白表达及其亚硝基化修饰水平。6.组织免疫荧光染色（IF）免疫荧光染色检测主动脉血管中PGIS亚硝基化修饰水平。7.大鼠离体血管张力检测分离大鼠主动脉并制备5mm的环形血管环,通过离体血管环实验检测主动脉对硝酸酯类的舒张反应性。8.PGIS活性及PGI2,TXA2含量测定PGI2含量的测定由其稳定的代谢产物6-酮-PGF1α的测定替代。用ELISA试剂盒测定细胞或组织裂解液或血清中6-酮-PGF1α的水平。由于TXA2的不稳定性,通过测定其稳定的代谢产物TXB2代表TXA2的产生。取组织或细胞裂解液,使用ELISA试剂盒进行测量。研究结果1.GTN诱导PGIS巯基亚硝基化修饰体外实验中,NO供体（GTN,GSNO,SNAP,SNP,SPNO）均可与重组人PGIS蛋白发生巯基亚硝基化修饰;GTN使HUVECs中PGIS的巯基亚硝基化水平呈现浓度依懒性增加。体内实验中,Western blot及组织免疫荧光实验显示,GTN使主动脉组织中PGIS巯基亚硝基化水平显着升高。山东大学博士学位论文2.GTN抑制PGIS活性及PG12的合成体内实验与体外实验结果均显示:GTN使PGIS活性明显降低,使前列腺素代谢向PGI2方向转化减少,PGI2代谢产物6-酮-PGF1α生成减少。3.PTIO和NAG阻断GTN诱导的PGIS亚硝基化及对PG IS活性的抑制PTIO及NAC均可显着降低HUVECs和主动脉中由GTN所诱导的PGIS巯基亚硝基化水平。PTIO及NAC均可阻断GTN对PGIS活性的抑制,使6-酮-PGF1α和PGI2的生成增加,证明PGIS活性的降低可能为PGIS亚硝基化修饰所介导。4.蛋白质巯基亚硝基化导致GTN耐受体内实验中,NAC干预组的大鼠血管环恢复对GTN的舒张反应,抑制了GTN耐受,证明蛋白质的巯基亚硝基化是GTN耐药的重要影响因素。5.GTN诱导的PGIS巯基亚硝基化位于231及441号半胱氨酸位点体外实验中,分别突变Cys231或Cys441后PGIS亚硝基化反应减弱,而Cys231及Cys441均突变后PGIS亚硝基化水平明显减弱。体内试验中,尾静脉注射野生型及突变型PGIS cDNA腺病毒,结果显示突变C231/C441显着抑制了GTN对主动脉组织中PGIS的亚硝基化修饰。6.Cys231/Cys441突变抑制了 GTN诱导的PGIS活性下降及PG 12合成减少与GTN+WT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成明显下降相比,GTN+MT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成增加,且前列腺素代谢向PGI2方向转化增加,向TXA2方向转化减少。7.PGIS的231及441号半胱氨酸位点突变改善硝酸酯类交叉耐受离体血管环实验显示,Cys231/Cys441突变可明显改善血管环对于GTN、SNP和SNAP的舒张反应。8.阿司匹林和贝前列素对硝酸酯类交叉耐受的影响离体血管环实验显示,贝前列素和阿司匹林可明显改善主动脉环对GTN、SNP和SNAP的浓度依赖性舒张反应。9.Tranylcypromine 对 GTN 耐受的影响离体血管环实验显示,Tranylcypromine可使血管对GTN和SNP的浓度依赖性舒张反应显着减弱。结论1.GTN诱导PGIS的Cys231和Cys441位点亚硝基化修饰;2.GTN通过PGIS亚硝基化修饰使PGIS活性下降,PGI2生成减少;3.PGIS亚硝基化修饰介导体内硝酸酯类交叉耐受;4.应用阿司匹林和贝前列素可改善硝酸酯类交叉耐受。论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究研究背景糖尿病（diabetesmellitus,DM）是血管动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的重要危险因素之一。钙化作为糖尿病动脉粥样硬化（diabetic atherosclerosis,DA）最常见的并发症之一,一度被认为是不良心血管事件的独立预测因子,与斑块进展和不稳定性有密切关系。血管钙化是受血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）表型转换驱动的一个主动调节过程,VSMCs向成骨细胞表型转化以及VSMCs中骨矿物羟基磷灰石和基质囊泡的形成是血管钙化的核心事件。研究发现高糖可通过诱导成骨细胞结合因子和成骨细胞转录因子的表达,促进VSMCs转化为成骨样细胞,从而加速DA斑块内膜钙化的发生发展。尽管高糖促进VSMCs钙化的作用己被普遍认可,而其中的相关机制并不十分明确。腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase,AMPK）是一种异源三聚体丝/苏氨酸蛋白激酶,由α（α1,α2）催化亚基与β（β1,β2）和γ（γ1,γ2,γ3）调节亚基组成,负责调节代谢和能量的平衡。β亚基C-端区域同源性较高,为连接α与γ亚基的桥梁。β亚基的CBM区域为糖原结合结构域,可能参与糖原对AMPK的调节作用。此外,β亚基还含有豆蔻酰化和磷酸化位点,参与调节AMPK活性和亚细胞定位。β1在肝脏中高表达,在骨骼肌中低表达;β2则相反。而在大部分细胞中主要以α1、β1、γ1异构体为主。本课题组前期实验显示,在高糖刺激下,VSMCs中AMPKβ1蛋白表达显着下降。多项研究表明,AMPK可负向调节斑块钙化进程,AMPK激活剂AICAR和二甲双胍均可抑制体外VSMCs钙化。那么AMPKβ1是否在高糖诱导的VSMCs钙化中发挥调节作用?而高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达降低是通过什么机制导致?两者是否存在关联?这些问题尚未被研究者重视及探究。蛋白质巯基亚硝基化修饰是指游离的一氧化氮（nitricoxide,NO）与蛋白质内的半胱氨酸自由巯基共价结合形成亚硝基硫醇（S-nitrosothiols,SNOs）的过程。蛋白质亚硝基化修饰可影响蛋白质稳定性、活性、亚细胞定位和蛋白质间的相互作用,进而参与多种病理和生理过程。有研究表明,Western blot和PCR实验均证实在糖尿病模型大鼠中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达显着增加,NO产生增加。那么高糖诱导下AMPKβ1的降低是否由增加的NO与AMPKβ1的亚硝基化修饰导致?综上分析,本研究拟通过高糖和β-甘油磷酸诱导人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cells,HAMSCs）钙化,研究高糖诱导下AMPKβ 1蛋白表达降低的相关机制及AMPKβ1对高糖促进的VSMCs钙化的影响,为临床上预防和治疗血管钙化提供实验依据。研究目的1.研究高糖刺激是否诱导AMPKβ1亚硝基化修饰;2.构建并转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒,研究AMPKβ1亚硝基化修饰对高糖促进VSMCs钙化的影响及相关机制。研究方法1.细胞刺激与转染取6-8代HASMCs进行细胞实验,分别将5.5 mM及30 mM的葡萄糖溶液作为正常糖（NG）和高糖（HG）刺激。（1）将HG溶液分别按照0,6,12,24,48,72小时的时间梯度加入六孔板内,Western blot及RT-PCR分别检测AMPKβ1和iNOS的蛋白和mRNA表达水平;在10ng/ml白细胞介素-1β（IL-1β）孵育下,分别于0,6,12,24,48,72小时的时间梯度下加入HG,用一氧化氮检测试剂盒测定细胞内NO的生成;（2）分别将终浓度为0.2mM的Carboxy-PTIO,100 μM的 1400W或0.4μM的MG132预处理HASMCs2小时,而后加入高糖刺激。24小时后收集细胞,检测AMPKβ1的蛋白表达及亚硝基化水平;（3）研究高糖刺激对HASMCs钙化的影响。向培养基中加入10 mmol/的β-甘油磷酸（β-GP）以诱导细胞钙化。将实验分为以下四组:NG,NG+β-GP,HG,HG+β-GP,检测各组细胞的钙化水平;（4）将AMPKβ1过表达腺病毒转染HASMCs中,实验分四组:正常糖+空载体组（NG+Vector）,正常糖+AMPKβ1过表达组（NG+AMPKβ1）,高糖+空载体组（HG+Vector）,高糖+AMPKβ1过表达组（HG+AMPKβ1）,各组均加入10 mM β-GP诱导钙化,反应结束后收集细胞并检测各组细胞的钙化水平;（5）将野生型AMPKβ1 和突变型AMPKβ1（MT-AMPKβ1-C173A、MT-AMPKβ1-C223A及MT-AMPKβ1-C173/223A）转染HASMCs,转染成功后加入HG和10 mM β-GP诱导钙化,检测AMPKβ1亚硝基化水平及细胞钙化水平。（6）野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1（MT-AMPKβ1-C173/223A）转染HASMCs,24小时高糖刺激后检测细胞中AMPKβ1蛋白泛素化水平。2.生物素转化法（Biotin switch）用蛋白裂解液提取细胞蛋白,通过封闭游离巯基、Biotin标记、纯化Biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot实验检测AMPKβ1的亚硝基化水平。3.免疫沉淀反应（IP）提取细胞蛋白,加入AMPKβ1抗体（1:50稀释度）与蛋白裂解液4度旋转过夜。加入Protein A/GAgorose并孵育4小时,离心取上清即得到AMPKβ1蛋白-抗体-珠子复合体。Western blot检测AMPKβ1的泛素化水平。4.蛋白免疫印迹检测（Western blot）提取HASMCs中的总蛋白,检测iNOS、AMPKβ1和Runx2的蛋白表达水平。5.实时荧光定量PCR（qRT-PGR）收集高糖刺激后的HASMCs并提取细胞内总RNA,检测AMPKβ1和iNOS的mRNA水平。6.茜素红染色4%的多聚甲醛固定细胞后,用茜素红染色液将六孔板内的细胞进行染色30分钟,PBS洗涤3次后置于显微镜下观察。7.钙含量测定用裂解液（PBS+1%TritonX-100）裂解细胞后,离心取上清并按照试剂盒说明测定细胞中的钙含量。8.碱性磷酸酶活性测定根据碱性磷酸酶试剂盒说明测定细胞中碱性磷酸酶活性。9.一扬化氮含量测定用一氧化氮检测试剂盒测定细胞中一氧化氮的含量。研究结果1.高糖刺激使HASMCs中AMPK β 1表达降低而i N0S表达增加HASMCs与HG溶液按时间梯度孵育,Western blot及qRT-PCR结果显示,随着时间递增,HASMCs中AMPKβ1蛋白表达逐渐下降,mRNA水平无显着变化;iNOS蛋白及mRNA水平均逐渐增加,细胞裂解液中NO含量逐渐增加。2.离糖诱导AMPK β 1中Cys173和Cys223位点亚硝基化修饰与放线菌酮刺激下的AMPKβ1降解速率相比,HG可明显增加HASMCs中AMPKβ1的降解速率,证明高糖诱导下AMPKβ1表达下降是由蛋白质降解增加所致。Biotinswitch实验显示,HG刺激下AMPKβ1的亚硝基化水平明显升高,并可被PTIO和1400W抑制。Cys173和（或）Cys223位点突变后,可明显减弱高糖诱导的AMPKβ1的亚硝基化水平。3.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统促使AMPK β1降解Cys173及Cys223的突变显着抑制高糖诱导的AMPKβ1泛素化水平的升高。MG132可逆转高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降。4.高糖促进HASMCs钙化与对照组相比,高糖刺激可明显提高HASMCs中Runx2表达,碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量。5.AMPKβ1与HASMCs钙化呈负相关AMPKβ1过表达可显着降低HASMCs中钙含量、Runx2的表达及ALP活性,证明AMPKβ1参与高糖刺激下HASMCs钙化进程且负向调节高糖刺激的HASMCs 钙化。6.AMPKβ 1亚硝基化对HASMCs钙化的影响与对照组相比,PTIO及NAC均可抑制高糖诱导的HASMCs钙化水平的升高。在HG刺激HASMCs的钙化中,与WT-AMPKβ1转染组相比,Cys173和（或）Cys223的突变可使细胞Runx2表达水平、钙含量测定和茜素红染色明显降低。7.亚硝基化通过降低AMPK β 1稳定性影响HASMCs钙化与对照组相比,MG132可明显下调HG诱导下HASMCs内Runx2蛋白表达。结论1.高糖通过促进iNOS/NO产生介导AMPKβ1中Cys173和Cys223位点发生疏基亚硝基化修饰;2.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统介导高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降;3.AMPK|β1亚硝基化促进高糖刺激下HASMCs的钙化。论文Ⅲ AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究研究背景血管钙化（vascularcalcification,VC）是动脉粥样硬化和糖尿病血管病变的并发症,是不良心血管事件的独立预测因子。血管钙化是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）在钙化调节因子的诱导下分化为成骨样细胞,并伴随磷酸钙羟基磷灰石晶体沉积在细胞外基质的过程。根据位置不同,血管钙化主要分为两种类型:动脉粥样硬化性内膜钙化和与糖尿病、慢性肾病等相关的中膜钙化。动脉粥样硬化钙化主要位于在血管内膜,随着病变进展可累及中膜。研究表明血管钙化的形成是一个涉及多因素、多系统控制的主动调节过程,包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、脂质代谢紊乱、高血糖等。多项研究证实,高血糖是促进VC发生发展的重要因素之一,然而其中的具体机制尚不清楚。我们研究表明,AMPKβl亚硝基化修饰促进高糖诱导下HASMCs钙化,然而AMPKβ1亚硝基化修饰在体内水平对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及相关机制尚未被研究。本研究拟通过构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型研究AMPKβ1亚硝基化修饰对斑块内膜钙化的影响,为临床上预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化提供实验依据。研究目的1.研究AMPKβ1亚硝基化修饰促进高糖刺激下HASMCs钙化的机制;2.建立糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型,通过转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒研究AMPKβ1亚硝基化对斑块内膜钙化的影响及其机制。研究方法1.细胞模型（1）将野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1 cDNA腺病毒转染HASMCs,加入高糖和10 mM β-甘油磷酸刺激,Western blot检测p-AKT及AKT蛋白表达;（2）HASMCs与10nmol/L胰岛素孵育2小时后,转染AMPKβ1过表达和对照病毒并加入高糖和10 mM β-甘油磷酸诱导钙化,Western blot检测p-AKT、AKT和Runx2蛋白表达。2.动物模型的建立（1）糖尿病小鼠模型的建立:将链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）按60mg/kg的量连续5天腹腔注射打入小鼠体内。血糖≥16.7mmol/L视为造模成功。（2）构建并转染 WT-AMPKβ1 和 MT-AMPK-C173/223A cDNA 腺病毒。建立2型糖尿病ApoE-/-小鼠模型并给与高脂喂养。2月后尾静脉注射WT-AMPKβ1或MT-AMPKβ1 cDNA腺病毒,继续饲养1个月后取材。3.体重及血液学指标的检测测量实验前后小鼠体重并用酶学法检测血清标本中血糖及血脂水平。4.组织学检测留取实验小鼠主动脉和心脏标本并制备成组织匀浆,一部分检测AMPKβ1亚硝基化水平和Runx2、p-AKT及AMPKβ1的蛋白表达,一部分检测主动脉中钙含量。制备主动脉根部冰冻切片,免疫组织化学染色方法检测斑块中Runx2和p-AKT的表达水平。5.生物素转化法（Biotin switch）提取主动脉组织蛋白,通过封闭游离巯基、biotin标记和纯化biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot检测AMPKβ1的亚硝基化水平。6.蛋白免疫印迹检测（Western blot）提取细胞或主动脉组织中的总蛋白并检测AMPKβ1、Runx2和p-AKT的蛋白表达水平。7.钙含量测定用裂解液（PBS+1%TritonX-100）裂解主动脉组织,离心取上清后并按照试剂盒说明测定组织的钙含量。8.免疫组织化学染色将主动脉根部冰冻切片进行免疫组织化学染色以测定其中Runx2和p-AKT的表达水平。研究结果1.实验小鼠基本情况各组小鼠间体重及血脂水平无显着性差异。糖尿病组小鼠空腹血糖水平与对照组间有显着差异。2.AKT激活剂-胰岛素对AMPK β 1调节的HASMCs钙化的影响HASMCs钙化中,高糖刺激可显着提高AKT活性。与AMPKβ1过表达组中p-AKT和Runx2的低水平相比,胰岛素可显着提高AMPKβ1过表达HASMCs中p-AKT和Runx2的表达水平,证明AMPKβ1通过AKT/Runx2通路调节HASMCs 钙化。3.AMPK β 1亚硝基化修饰通过调节AKT活性影响HASMCs钙化Cys173和Cys223的突变可显着降低高糖诱导HASMCs钙化中AKT活性。4.AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠斑块钙化的影响Western blot、组织切片免疫组化及主动脉钙含量检测显示,Cys173和Cys223突变可显着降低主动脉组织中p-AKT和Runx2蛋白表达及斑块中钙化水平。结论1.AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT/Runx2通路活性促进高糖诱导的HASMCs 钙化;2.糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠中,AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT活性促使斑块内膜钙化水平升高。
周建明[7]（2019）在《活化蛋白C在体外循环中对肺的保护作用》文中研究说明第一章体外循环围术期活化蛋白C浓度变化与术后急性肺损伤的相关性研究背景:随着人工心肺机（cardio-pulmonary bypass,CPB）的不断完善,心脏外科技术得以迅速发展,心脏直视手术安全性逐步提高。但CPB相关器官损伤仍是困扰心脏外科医生的疑难问题,特别是急性肺损伤（acute lung injury,ALI）仍有较高的发病率,严重时可导致成人呼吸窘迫综合征（acute respiratory distresssyndrome,ARDS）。活化蛋白C（activited protein C,APC）是蛋白C抗凝系统中最主要的成份。除抗凝作用外,它还具有抗炎、抗凋亡、内皮细胞保护等作用,并被实验证实对急性肺损伤有良好的治疗效果。目的:通过监测CPB心脏直视手术围术期中心静脉血APC的动态变化,探讨APC在CPB术后急性肺损伤ALI发生、发展中作用。方法:选取我院胸心外科2011年05月至2013年03月CPB下直视心脏手术患者30例。分别于手术开始前（T1）、CPB开始（T2）、CPB10分钟（T3）、CPB20分钟（T4）、CPB30分钟（T5）、CPB停止（T6）、CPB后30分钟（T7）、CPB后4小时（T8）、CPB后8小时（T9）、脱呼吸机后30分钟（T10）,十个时间点经中心静脉采血,低温离心机4000rpm离心,取上清-80℃冰箱保存,双抗体夹心酶联免疫分析法（ELISA）法集中检测血浆APC浓度;同时于T1、T6、T7、T8、T9、T10行动脉血气分析,记录潮气量、气道峰压数值,计算肺泡动脉氧分压差（PA-a DO2）、氧合指数（OI）、静态顺应性（Cst）,观察肺功能变化;Murray肺损伤评分系统评价T8时点肺损伤程度。结果:本组患者血浆APC浓度在CPB开始后迅速升高,并于10分钟达到峰值,其后缓慢下降,CPB停止后逐渐到达平台期。患者PA-a DO2在T6T10各时间点与T1比较均有明显升高（P<0.01）;氧合指数在T6T10各时间点与T1比较均有明显下降（P<0.01）;RI在T6T10各时间点与T1比有升高（P<0.05）。T8时点APC浓度与相应时间点Murray评分无相关性（P=0.587）;血浆APC浓度与相应时间点PA-a DO2、OI、RI之间无相关性（P>0.05）;血浆APC峰浓度和CPB前浓度的差值与T8时点Murray评分之间存在负相关性（r=-0.851,P<0.01）;与血浆APC浓度的差值与T7、T8、T9、T10各时间点PA-a DO2之间存在负相关性[P<0.01,P<0.05（T10）];与T7、T8、T9、T10各时间点OI之间存在正相关性[P<0.01,P<0.05（T10）];与T7、T8、T9、T10各时间点RI之间存在负相关性[P<0.01,P<0.05（T10）]。结论:体外循环心脏直视手术后患者血浆APC浓度升高,但升高幅度不尽相同;血浆APC浓度与CPB术后患者肺损伤程度无密切相关;CPB引起APC浓度增加幅度与手术后患者肺损伤程度负相关,即APC浓度增幅越大术后肺损伤越轻。第二章活化蛋白C在大鼠体外循环中对肺的保护作用目的:体外循环引起的全身炎症反应造成术后急性肺损伤,APC在降低全身炎症反应起着重要作用,本实验旨在明确APC对CPB所致肺损伤的保护作用。方法:建立大鼠体外循环模型,将48只大鼠随机分为四组（n=12）,C组（对照组）、T组（凝血酶组）、A组（APC组）、A+T组（APC+凝血酶组）。CPB开始即时根据分组给药:A组:APC 0.1mg/kg;T组:凝血酶0.5U/kg;A+T组:APC 0.1mg/kg+凝血酶0.5U/kg;C组:等量生理盐水。检测CPB前、术后即时及术后60分钟,CD11b/CD18、血浆IL-8、血浆弹性蛋白酶（NE）。术后取肺组织称重计算肺干湿重比（W/D）。行支气管肺泡灌洗（BAL）,收集灌洗液,行白细胞计数、蛋白含量检测,并根据蛋白含量计算肺通透性指数。肺组织匀浆后检测:TNF-α含量。取部分肺组织行光镜病理检查。结果:四组光镜下观察均可发现CPB后肺泡壁毛细血管扩张、出血;肺间质及肺泡腔内炎性细胞侵润。A组上述改变明显少于其他三组。术后肺组织匀浆中TNF-α含量,A组、A+T组显低于C组和T组。血清中IL–8、NE、CD11b/CD18停机后即时及60min时A组、A+T组显低于C组和T组（P<0.05）。肺泡盥洗液中白细胞计数、肺通透性指数,W/D,A组均低于其他各组（P<0.05）。结论:大鼠体外循环转流前,给予APC（0.1mg/kg）可有效减轻CPB引起的全身炎症反应造成的肺损伤,其部分可能的机制是在一定程度上逆转激活的凝血酶对肺的损伤。
谢晶莹,张勇,冯若飞[8]（2018）在《乳腺生物反应器在生物制药领域的研究进展》文中进行了进一步梳理乳腺生物反应器是利用转基因动物生产功能蛋白质的技术.这项技术开创了基因工程制药的新途径.而其具有的低成本、高质量,稳定的生物学活性、较短的生产周期、较高的经济效益等一系列研发特点,使得这一生产方式成为医药产业的主要手段.
王亚芳[9]（2018）在《纤维素水合蛋白作用机理的探究》文中研究表明纤维素作为一种重要的生产生物乙醇的来源物质,由于结构复杂而很难被微生物直接利用。近年来,纤维素的生物降解研究还处于起步阶段,但对于降解过程的机理已经有学者做出各种推测。其中,C1-Cx理论得到学术界的普遍认可。该理论认为纤维素的致密结构先被某种膨胀因子打开,随后被有催化活力的水解酶降解。截至目前,该理论并未得到完整的证实,膨胀因子的研究也仅限于Expansins、Swollenins以及EXLX1蛋白的研究,且其作用机理并不十分明确。因此,寻找具有C1-Cx特性的蛋白并对其作用机理进行深入研究具有十分重要的理论价值。本课题组在前期工作中,从一株具有降解纤维素能力的菌株Arthrobotrys sp.Cx1中分离出一种新型蛋白C22,该蛋白属于糖苷水解酶6家族;前期研究结果表明,C22能够降低滤纸的结晶度并增大其水合度;C22的结构预测分析结果表明,该蛋白由糖苷水解酶6家族（Glycoside hydrolyses,GH6）核心催化区域（CLF）、功能未知连接肽段（Linker）及碳水化合物单元（Carbohydrate binding module,CBM1）三部分构成。为了进一步研究该蛋白的C1-Cx作用机制,本工作围绕C22不同结构域的功能展开研究。本工作构建了CF（含有水合蛋白C22核心催化区域以及Linker）、CLF和CBM-GFP（碳水化合物结合单元-荧光蛋白）重组蛋白,为了研究水合蛋白C22的作用机理,本工作重点对C22、CF和CLF三种重组蛋白进行定量及定性的酶学性质表征,定量实验主要包括:保水值、动力学、蛋白活性检测、纤维素结晶度测定。定性实验包括:通过荧光显微镜观察被CLF重组蛋白处理棉花的形态变化、CLF和CBM分别与不同结晶度Avicel的结合能力。定量实验的结果表明,C22、CF和CLF作用于滤纸,滤纸保水值分别增加了25.6%、21.5%、14.7%,跟水合蛋白C22相比,CF和CLF的保水值都有不同程度的降低,尤其是CLF下降比较明显,说明Linker在水合过程中起主要作用。利用X射线衍射检测被三种重组蛋白处理后的滤纸的结晶度,结果发现三种重组蛋白处理后的滤纸结晶度（CrI）相比未处理的滤纸均降低了13%左右,且没有显着性差异,该结果表明水合蛋白C22的核心催化结构域能够破坏滤纸结晶度,而CBM、Linker不具有破坏纤维素结晶结构的能力。三种重组蛋白进行吸附等温线的测定结果表明,C22、CF和CLF对滤纸和Avicel的吸附能力依次下降,说明水合蛋白C22中的CBM和Linker协助核心催化结构域与滤纸/Avicel结合。定性实验结果表明,CLF处理后的棉花纤维发生明显膨胀,直径变粗,在断裂的节点处膨胀现象更为明显,再次说明水合蛋白C22的核心催化结构域具有破坏纤维素结晶结构的能力,而CBM和Linker不具备。由此,推测水合蛋C22的纤维素水合作用机理为,当C22跟纤维素底物反应时,CBM和Linker协助核心催化域与纤维素底物结合,随后核心催化结构域破坏纤维素结晶区,linker将水分子带入到纤维素内部,使其发生水合作用。本课题的研究为阐明纤维素降解的C1-Cx研究打下重要基础。
于在林,富岩[10]（2017）在《更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白》文中提出更优生物药是指治疗用生物制品蛋白质药物,其可通过生物药经化学分子修饰、或蛋白质与小分子药物化合价偶联,形成新的物理结构或改善构象,或通过生物药物与蛋白质、生物药物之间的基因融合以达到延长生物药物在体内半衰期、或达到生物药物可定向作用于药靶为目的所研制的创新生物药。白蛋白与生物药形成的融合蛋白,抗体、抗体片段（Fc）与生物药形成的融合蛋白的研制都属于更优生物药研发领域。生物药基因融合形成二聚体融合蛋白,白蛋
二、重组人蛋白C的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人蛋白C的研究进展（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）应用大黄治疗脓毒症性凝血病的回顾性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英汉缩略词注释表 |
| 引言 |
| 历史回顾 脓毒症性凝血病的诊疗进展 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象与分组 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 分组标准 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大黄治疗组与对照组患者的基础资料比较 |
| 2.2 生存分析 |
| 2.3 大黄治疗组与对照组患者的感染指标和血小板计数比较 |
| 2.4 大黄治疗组与对照组患者的凝血指标比较 |
| 2.5 大黄治疗组与对照组患者的FDP和DD指标比较 |
| 2.6 大黄治疗组与对照组患者的弹力图指标比较 |
| 2.7 大黄治疗组与对照组广义估计方程GEE分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（3）循环组蛋白与急重症时多器官功能障碍综合征发病机制相关性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 循环组蛋白在急重症患者的特征及其临床意义 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 本章小结 |
| 第二章 胞外组蛋白对多种器官来源细胞的毒性作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 循环组蛋白在急重症模型小鼠MODS发病机制中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 急重症模型小鼠的循环组蛋白来源的初步探讨 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 本章小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处(详见学术成果之已发表论着2) |
| 文献综述 细菌 DNA、免疫细胞死亡与脓毒症 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间学术成果 |
| 致谢 |
（4）马铃薯StMAPKK1互作蛋白筛选及其互作蛋白基因功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物对干旱胁迫的响应 |
| 1.2 植物促分裂原活化蛋白激酶级联途径 |
| 1.3 MAPKK研究进展 |
| 1.4 马铃薯StMAPKK1 基因研究进展 |
| 1.5 酵母双杂交技术在MAPK级联反应研究中的应用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 马铃薯StMAPKK1 基因生物信息学分析 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 MAPKK1基因进化分析 |
| 2.1.2 马铃薯StMAPKK1 蛋白质特性分析 |
| 2.1.3 马铃薯StMAPKK1 蛋白质结构域分析 |
| 2.1.4 马铃薯StMAPKK1 基因亚细胞定位预测 |
| 2.1.5 马铃薯StMAPKK1 基因功能分析 |
| 2.1.6 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白预测分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 MAPKK1基因进化分析 |
| 2.2.2 马铃薯StMAPKK1 蛋白质理化性质分析 |
| 2.2.3 马铃薯StMAPKK1 蛋白质信号肽和跨膜结构域分析 |
| 2.2.4 马铃薯StMAPKK1 蛋白质磷酸化位点预测 |
| 2.2.5 马铃薯StMAPKK1 蛋白质结构域分析 |
| 2.2.6 马铃薯StMAPKK1 基因亚细胞定位预测 |
| 2.2.7 马铃薯StMAPKK1 基因GO功能注释分析 |
| 2.2.8 马铃薯StMAPKK1 基因顺式作用元件分析 |
| 2.2.9 马铃薯StMAPKK1 基因表达差异性分析 |
| 2.2.10 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白预测分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 马铃薯StMAPKK1 基因的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 植物材料的培养 |
| 3.1.3 载体和菌株 |
| 3.1.4 酶与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 qRT-PCR分析马铃薯StMAPKK1 基因组织表达差异性 |
| 3.2.2 马铃薯试管苗总RNA提取 |
| 3.2.3 马铃薯试管苗cDNA第一条链的合成 |
| 3.2.4 马铃薯StMAPKK1 基因引物设计及克隆 |
| 3.2.5 诱饵载体pGBKT7载体线性化 |
| 3.2.6 线性化载体与目的片段同源重组连接 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态的制备及转化 |
| 3.2.8 诱饵载体重组质粒大肠杆菌菌液PCR及双酶切检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 qRT-PCR分析马铃薯StMAPKK1 基因组织表达差异性 |
| 3.3.2 马铃薯StMAPKK1 基因的克隆 |
| 3.3.3 酵母双杂交诱饵载体pGBKT7的载体线性化 |
| 3.3.4 诱饵载体重组质粒大肠杆菌菌液PCR及双酶切检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 酵母双杂交技术筛选马铃薯StMAPKK1 互作蛋白 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.2 载体、菌株及文库 |
| 4.1.3 酶与试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 酵母双杂交诱饵载体的酵母感受态转化 |
| 4.2.2 酵母双杂交诱饵载体的毒性和自激活活性检测 |
| 4.2.3 诱饵蛋白与酵母文库的杂交 |
| 4.2.4 初步X-α-Gal染色鉴定筛选 |
| 4.2.5 阳性克隆菌液PCR鉴定 |
| 4.2.6 阳性克隆小规模杂交验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 酵母双杂交诱饵载体的毒性和自激活活性检测 |
| 4.3.2 候选阳性克隆的X-α-Gal染色筛选 |
| 4.3.3 阳性克隆菌液PCR检测 |
| 4.3.4 阳性克隆小规模杂交验证 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因的鉴定及生物信息学分析 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 阳性克隆基因鉴定 |
| 5.1.2 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白的蛋白质特性分析 |
| 5.1.3 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白的蛋白质保守结构域分析 |
| 5.1.4 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因亚细胞定位预测 |
| 5.1.5 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因功能分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 阳性克隆基因鉴定 |
| 5.2.2 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白的蛋白质理化性质分析 |
| 5.2.3 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白信号肽和跨膜结构域分析 |
| 5.2.4 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白磷酸化位点预测 |
| 5.2.5 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白的蛋白质保守结构域分析 |
| 5.2.6 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因亚细胞定位预测 |
| 5.2.7 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因GO功能注释分析 |
| 5.2.8 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因启动子顺式作用元件分析 |
| 5.2.9 马铃薯StMAPKK1 互作蛋白基因表达谱分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 马铃薯StMAPKK1 基因亚细胞定位载体和双分子荧光互补载体的构建 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料及其培养 |
| 6.1.2 载体和菌株 |
| 6.1.3 酶与试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 马铃薯试管苗总RNA提取与c DNA第一条链的合成 |
| 6.2.3 马铃薯StMAPKK1 基因载体构建引物设计及克隆 |
| 6.2.4 亚细胞定位表达载体和双分子荧光互补表达载体线性化 |
| 6.2.5 线性化载体与目的片段同源重组连接及重组产物的转化 |
| 6.2.7 重组质粒大肠杆菌菌液PCR检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 马铃薯StMAPKK1 基因载体插入片段的克隆 |
| 6.3.2 亚细胞定位表达载体和双分子荧光互补表达载体线性化 |
| 6.3.3 重组质粒大肠杆菌菌液PCR检测 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 试剂的配制 |
| 附录2 培养基的配制 |
| 附录3 载体图谱 |
| 附录4 RNA的提取 |
| 附录5 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 附录6 大肠杆菌感受态的制备及转化 |
| 附录7 大肠杆菌中质粒的提取 |
| 附录8 酵母感受态的制备及转化 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（5）左西孟旦与重组人利钠肽治疗急性心衰的疗效及成本分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新性 |
| 局限性 |
| 附录、附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ PGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅲ AMPKβ1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
（7）活化蛋白C在体外循环中对肺的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词注释表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 第一章 体外循环围术期活化蛋白C浓度变化与急性肺损伤的相关性研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 资料采集 |
| 1.6 CPB术后Murray急性肺损伤评分 |
| 1.7 数据统计分析 |
| 第二节 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 CPB前后呼吸功能变化 |
| 2.3 CPB前后血浆APC浓度的变化 |
| 2.4 血浆APC浓度与术后肺损伤程度的相关性 |
| 第三节 讨论 |
| 3.1 体外循环致肺功能变化 |
| 3.2 CPB后肺损伤的评价 |
| 3.3 活化蛋白C与体外循环后急性肺损伤 |
| 第四节 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 活化蛋白C在大鼠体外循环中对肺的保护作用 |
| 第一节 实验方法 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 标本采集 |
| 1.3 肺组织光镜病理 |
| 1.4 统计学方法 |
| 第二节 结果 |
| 2.1 活化蛋白C对体外循环术后肺组织病理改变及肺毛细血管通透性的影响 |
| 2.2 活化蛋白C对大鼠体外循环术后炎症细胞及介质的影响 |
| 2.3 活化蛋白C对体外循环术后凝血的影响 |
| 第三节 讨论 |
| 3.1 凝血功能紊乱及肺毛细血管微栓形成 |
| 3.2 CPB相关全身炎症反应(SIRS) |
| 3.3 凝血酶、活化蛋白C和体外循环肺损伤 |
| 第四节 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）乳腺生物反应器在生物制药领域的研究进展（论文提纲范文）
| 1 乳腺生物反应器的原理 |
| 2 乳腺生物反应器的优势 |
| 3 乳腺生物反应器的应用 |
| 3.1 生产药用蛋白 |
| 3.2 建立转基因动物生物反应器 |
| 3.3 提高乳品质 |
| 4 结语 |
（9）纤维素水合蛋白作用机理的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 纤维素的基本概况 |
| 1.1.1 纤维素简介 |
| 1.1.2 纤维素的天然组成及结构 |
| 1.1.3 纤维素预处理方式 |
| 1.1.4 纤维素的结构分析常用方法 |
| 1.2 纤维素的生物降解 |
| 1.2.1 纤维素生物降解研究过程中存在的问题 |
| 1.2.2 纤维素生物降解的研究现状 |
| 1.2.2.1 纤维素降解的非复合体降解机制 |
| 1.2.2.2 纤维素降解的纤维小体机制 |
| 1.2.2.3 纤维素降解的C1-Cx理论 |
| 1.2.3 纤维素膨胀因子的研究 |
| 1.2.4 纤维素酶的研究 |
| 1.2.4.1 纤维素酶的定义及来源 |
| 1.2.4.2 纤维素酶的分类 |
| 1.2.4.3 纤维素酶的分子结构 |
| 1.2.4.4 纤维素酶存在的问题 |
| 1.2.5 纤维素降解菌Arthrobotrys sp.CX1 的研究进展 |
| 1.3 课题研究的目的及主要内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 本课题的实验流程 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒与菌株 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 培养基的配置 |
| 2.2.4 试剂配方 |
| 2.2.5 仪器与设备 |
| 2.2.6 本实验所用到的引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 水合蛋白C22 突变体和CBM-Linker编码基因的获取 |
| 2.3.2 .大肠杆菌DH10B电击感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 水合蛋白C22突变体真核表达载体的构建 |
| 2.3.4 水合蛋白C22突变体毕赤酵母X-33表达菌株的构建 |
| 2.3.4.1 水合蛋白C22 突变体及CBM-Linker-GFP真核表达载体的线性化 |
| 2.3.4.2 X-33电击转化感受态细胞的制备 |
| 2.3.4.3 水合蛋白C22突变体毕赤酵母X-33表达菌株的阳性克隆筛选 |
| 2.3.5 水合蛋白C22突变体毕赤酵母重组菌的小体系诱导表达 |
| 2.3.6 水合蛋白C22及突变体毕赤酵母表达菌株的大体系表达 |
| 2.3.7 水合蛋白C22及突变体蛋白质浓度的测定 |
| 2.3.8 水合蛋白C22及突变体的性质表征 |
| 2.3.8.1 水合蛋白C22及突变体的酶活 |
| 2.3.8.2 水合蛋白C22及突变体作用的滤纸保水值 |
| 2.3.8.3 水合蛋白C22及突变体作用的滤纸结晶度变化 |
| 2.3.8.4 水合蛋白C22及突变体与纤维素的吸附能力 |
| 2.3.8.5 CLF作用于棉花的形态变化 |
| 2.3.8.6 CLF作用于不同结晶度Avicel的荧光强度 |
| 2.3.8.7 CBM-Linker-GFP作用于不同结晶度Avicel的荧光强度 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 水合蛋白C22突变体真核表达载体的构建 |
| 3.2 水合蛋白 C22 突变体毕赤酵母 X-33 表达菌株的构建 |
| 3.3 水合蛋白C22突变体毕赤酵母的小体系诱导表达 |
| 3.4 水合蛋白C22及突变体的酶活 |
| 3.5 水合蛋白C22及突变体作用后滤纸的保水值 |
| 3.6 水合蛋白C22及突变体作用后滤纸的结晶度变化 |
| 3.7 水合蛋白C22及突变体与纤维素的结合能力 |
| 3.8 CLF作用棉花后的形态变化 |
| 3.9 CLF作用于不同结晶度Avicel的荧光强度 |
| 3.10 CBM-Linker-GFP作用于不同结晶度Avicel的荧光强度 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白（论文提纲范文）
| 1 白蛋白融合蛋白作为更优生物创新药发展的轨迹 |
| 2 白蛋白融合蛋白创新药主要品种 |
| 2.1 注射用重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽-1融合蛋白 |
| 2.2 重组人血清白蛋白/凝血因子-IX融合蛋白 |
| 2.3 重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白 |
| 2.4 重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白 |
| 2.5 注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白 |
| 2.6 正在临床前研究阶段的几个具有成药性的注射用重组人血清白蛋白融合蛋白 |
| 2.6.1 重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白 |
| 2.6.2 重组人血清白蛋白/白介素-11融合蛋白 |
| 2.6.3 重组人血清白蛋白/尿酸氧化酶融合蛋白 |
| 2.6.4 重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白 |
| 2.7 重组人血清白蛋白/皮肤生长因子融合蛋白外用药和滴眼液的研究 |
| 2.8 重组人血清白蛋白融合蛋白口服制剂的研究 |
| 3 目前国内外正在研究中的白蛋白融合蛋白创新药品种 |
| 4 问题与展望 |
四、重组人蛋白C的研究进展（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]应用大黄治疗脓毒症性凝血病的回顾性研究[D]. 胡艳晶. 江西中医药大学, 2021(01)
- [3]循环组蛋白与急重症时多器官功能障碍综合征发病机制相关性的研究[D]. 程振兴. 东南大学, 2020
- [4]马铃薯StMAPKK1互作蛋白筛选及其互作蛋白基因功能解析[D]. 廖钰秋. 甘肃农业大学, 2020(12)
- [5]左西孟旦与重组人利钠肽治疗急性心衰的疗效及成本分析[D]. 程延良. 山东大学, 2020(02)
- [6]蛋白质亚硝基化修饰在硝酸酯类耐受和血管钙化中的作用及机制研究[D]. 周胜男. 山东大学, 2020(10)
- [7]活化蛋白C在体外循环中对肺的保护作用[D]. 周建明. 东南大学, 2019(01)
- [8]乳腺生物反应器在生物制药领域的研究进展[J]. 谢晶莹,张勇,冯若飞. 西北民族大学学报(自然科学版), 2018(02)
- [9]纤维素水合蛋白作用机理的探究[D]. 王亚芳. 大连工业大学, 2018(01)
- [10]更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白[J]. 于在林,富岩. 中国医药生物技术, 2017(03)