一、84K杨叶片再生系统的建立（论文文献综述）
程赫[1]（2021）在《PtrUNE12在84K杨次生生长和盐胁迫响应的生物学功能分析》文中指出木材作为一种贮量最为丰富可再生资源和大气CO2主要固定者,在应对全球能源危机和气候变化的过程中发挥着重要作用。培育抗逆性强、材质材性优良和生长量大的林木新品种是缓解土壤盐渍化造成的生态安全问题的有力措施。植物bHLH转录因子家族基因在植物多个生物学过程中发挥着重要作用,然而目前为止尚未发现对树木次生生长和盐胁迫均具有调控功能的bHLH家族基因。本项研究对毛果杨bHLH家族PtrUNE12在杨树次生生长与盐胁迫响应中的生物学功能进行了研究,结论如下:（1）PtrUNE12表达特性分析表明,PtrUNE12在杨树不同发育阶段的根、茎和叶中均有不同程度的表达,但在次生茎部以及成熟叶片次生生长旺盛的部位表达量相对较高。PtrUNE12对盐胁迫响应具有组织特异性,其中叶片和根部组织中PtrUNE12表达量最高。PtrUNE12 cDNA全长903 bp,其启动子区域包含SCW形成生物学途径中高频率元件 SMRE、SNBE、AC-1 和 AC-2,逆境胁迫 ABRE、MYC、MYB、MeJA响应、GA响应、SA响应和ABA响应元件。上述结果初步表明,PtrUNE12参与杨树的次生生长与盐胁迫响应过程。（2）烟草叶片瞬时转化研究表明,PtrUNE12定位于细胞核。酵母杂交分析发现,PtrUNE12具有转录自激活性,且激活区域位于其编码蛋白N端。（3）利用农杆菌侵染法,获得了过表达和pROKⅡ-PtrUNE12-SRDX显着性抑制转基因84K杨。PtrUNE12过表达转基因株系表型正常、生长旺盛,显性抑制转基因株系表现出畸形生长状态、生长势较弱。根部性状分析表明:PtrUNE12过表达转基因株系根系发育旺盛,根长、根的鲜重与干重、不定根数增加,主根的木质部导管数量与直径以及纤维SCW厚度与对照相比均显着增加,而显着抑制转基因株系则显着下降。叶部性状观测表明:过表达转基因株系叶长与叶宽显着增加,显着抑制上述性状表现刚好相反,叶部发育缓慢且有明显卷曲现象。茎部性状分析表明:过表达转基因株系茎节数、株高与地径均显着高于对照,抑制表达转基因株系显着低于对照;过表达转基因株系纤维素SCW厚度以及导管数量与直径大小显着高于对照,而显着抑制株系纤维与导管各性状均显着低于对照（图5-4）;间苯三酚染色表明,过表达转基因株系IN 4-11茎节次生生长和木质素含量增加,抑制表达转基因株系则相反。次生木质部定量PCR分析表明:过表达转基因株系SCW组分（木质素、纤维素与半纤维素）合成基因表达量显着上升,而显着抑制转基因株系SCW组分合成基因表达量无明显变化或显着下降（图5-11）。利用酵母单杂交技术进一步研究表明,PtrUNE12对木质素合成基因PAL1以及CCR2启动子具有直接结合功能。综上所述,PtrUNE12不仅能促进植物的初生生长（如根、茎和叶发育更好）,而且也能增加杨树次生生长和SCW形成。（4）叶片组织化学染色结果表明:与野生型对照相比,正常生长条件下,PtrUNE12过表达转基因系与显着抑制转基因株系体内活性氧含量无显着变化,细胞结构完整。盐胁迫24h时,过表达转基因株系叶片NBT和DAB染色强度变弱,而显性抑制表达载体则增加。主要活性氧清除酶活性测定表明:正常生长条件下,PtrUNE12过表达转基因系与显着抑制转基因株系体内活性氧主要清除酶SOD和POD超氧物阴离子（OFR）和丙二醛（MDA）含量与对照相比无明显变化;盐胁迫24h时后,过表达PtrUNE12转基因株系SOD、POD酶活性显着上升,而OFR和MDA含量显着下降;显着抑制转基因株系上述性状表现则相反（图6-6、图6-7）。渗透胁迫相关基因定量PCR研究表明:正常生长条件下,PtrUNE12过表达转基因系与显着抑制转基因株系和野生型对照相比,渗透胁迫相关基因（RD22、RD29A、AREB1A、AREB1B和DREB2A）表达量无明显差异;盐胁迫下,PtrUNE12过表达转基因系上述基因表达量显着上升,而抑制表达株系上述基因显着下降。上述结果表明,正常条件下,PtrUNE12并不参与杨树体内活性氧代谢途径和胁迫响应途径的调控,而盐胁迫下,PtrUNE12可以通过调控杨树活性氧代谢与胁迫响应基因表达生物学途径来响应盐胁迫。
苗金明[2]（2020）在《PtPLT1和PtWOX5B在杨树芽再生过程中的作用》文中认为植物的组织和器官在合适的人工培养条件下能够通过产生愈伤组织形成再生芽,进而再生出完整的新个体。植物再生是进行离体快繁和基因工程的先决条件,而产生具有再生潜能的愈伤组织是再生的关键环节。前人对模式植物拟南芥的研究发现,愈伤组织具有根端分生组织的细胞性质,PLETHORA 1（PLT1）和WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 5（WOX5）等根端分生组织关键调控基因的表达是愈伤组织获得再生能力的必要条件。然而上述基因在林木再生过程中是否也发挥了相似的作用目前尚不清楚。本研究以84K（Populus alba×Populus gllandulosa）杨为材料,根据序列同源性,分离得到拟南芥PLT1和WOX5的同源基因PtPLT1和PtWOX5B,进化树分析结果显示,PLT1和WOX5B基因在植物的进化过程中存在保守性,序列同源性与物种的亲缘和进化关系相一致。qRT-PCR结果发现,与茎、叶片等器官相比,PtPLT1和PtWOX5B均在根中呈现出较高的表达水平,原位杂交结果显示,PtPLT1的表达信号集中在根端干细胞池所在的位置。亚细胞定位分析发现,PtPLT1和PtWOX5B蛋白均定位于细胞核中,这与拟南芥PLT1和WOX5的定位结果相同。我们构建了pER8::PtPLT1和pER8::PtWOX5B两个雌激素诱导型表达载体,分别侵染84K杨并获得转基因株系,以期通过时期特异性地诱导PtPLT1和PtWOX5B表达分析二者在杨树芽再生过程中的作用。qRT-PCR检测结果表明,外施雌激素诱导6天后,PtPLT1和PtWOX5B的表达水平均显着提高。分析结果发现,在添加雌激素的分化培养基上处理2周的外植体,转移至普通分化培养基上培养7天后,诱导了不定根的发生。上述结果表明,2周的雌激素处理时间对于诱导芽再生来说是偏长的,同时也证明了PtPLT1决定根端分生组织细胞性质的功能。进一步的分析发现,在添加雌激素的分化培养基上处理6天后的pER8::PtPLT1外植体,转入普通分化培养基35天后,与经过同样处理的转化空载体的对照相比,芽再生的频率和每块外植体上再生芽的数量都显着提高。而来源于pER8::PtWOX5B株系的外植体与对照相比并没有表现出明显的表型。以上结果表明,PtPLT1基因发挥了决定杨树根端分生组织细胞性质的作用。在愈伤组织形成阶段特异诱导PtPLT1的表达,促进了离体芽的发生,说明具备根端分生组织的细胞性质是杨树愈伤组织获得再生能力的关键。本研究结果为理解林木芽再生的分子机理提供了新信息,对于推动林木离体快繁和遗传转化体系的建立具有积极的理论和实践价值。
罗莹[3]（2020）在《杨树SPR1互作蛋白的鉴定及功能初探》文中研究表明微管由α-微管蛋白和β-微管蛋白以异二聚体的形式聚合而成,与微丝和中间纤维共同组成了细胞骨架。微管在植物细胞形态、植株生长发育、木材形成和抗逆等方面具有重要作用。微管列阵的动态变化与功能受到微管蛋白和微管结合蛋白的调控。SPR1蛋白是植物特有的一种微管结合蛋白,各项研究表明SPR1参与调节周质微管列阵的排列,从而对植物细胞的生长方向产生影响,并促进盐胁迫下微管的解聚,提高植物对盐胁迫的耐受性。目前对林木微管蛋白功能的研究鲜有报道,特别是微管调控林木形态与材性的分子机制的研究尚属空白,且关于林木SPR1蛋白的功能及其对微管的调控机制尚不明确。为获得观察微管形态的活体材料,本研究以毛果杨微管蛋白Pt TUA5和Pt TUB16基因序列为模板设计引物,同源克隆得到了84K杨的84KTUA5和84KTUB16基因序列,分别构建84KTUA5和84KTUB16与红色荧光蛋白m Cherry融合的四种植物过表达载体,经过烟草瞬时表达验证后转化84K杨;以毛果杨SPR1基因序列为模板设计引物,对84K杨的84KSPR1基因进行同源克隆,通过酵母双杂交技术筛选84KSPR1的候选互作蛋白,利用Bi FC技术验证84KSPR1与其候选互作蛋白的相互作用,并探究84KSPR1互作蛋白之间的相互作用。主要结果如下:1.成功获得了稳定遗传的12个84KTUA5转基因株系和24个84KTUB16转基因株系,为进一步研究杨树微管功能提供了背景材料。2.通过酵母双杂交技术筛选到11个84KSPR1候选互作蛋白。通过Bi FC发现其中10个蛋白可以与84KSPR1产生互作,其中IQD14蛋白与84KSPR1的相互作用位点在微管列阵上。此外对84KSPR1互作蛋白之间的相互作用也进行了Bi FC验证,发现EF1A、HIR1、DRM4两两之间都没有相互作用,而IQD14分别与EF1A、HIR1和DRM4之间产生互作,根据前人的研究,作者推测IQD14可能与Ca M和84KSPR1形成多聚蛋白复合物调节彼此的活性,并可能介导了84KSPR1与其他互作蛋白（EF1A、HIR1、DRM4等）之间的相互作用,从而调控微管列阵的动态变化。本研究为探究林木SPR1蛋白的功能及微管调控机制提供了新的线索。
曾明[4]（2020）在《胡杨异形叶性的环境适应分子机制研究》文中提出异形叶性是植物基于表型可塑性在同一植株产生不同形态叶片的现象,是植物对环境适应及资源最优化利用的一种生存策略。胡杨是一种典型的木本异形叶植物,它是中亚和中国西北荒漠地区唯一的天然乔木树种和重要的建群树种,在抵御风沙、维护区域生态平衡和生物多样性方面发挥重要作用。成年胡杨具有披针形叶、卵圆形叶、锯齿卵圆形叶等多种形态叶片,对不利环境条件有较好的适应能力,因而是研究树木对环境适应的重要模式树种。目前,对胡杨异形叶特性及环境适应机制的研究主要集中在形态结构及生理特性的解析,有关其分子调控机制的研究相对较少。开展胡杨异形叶分子生物学的比较研究,能够从一定层面揭示胡杨对环境的适应机制,对胡杨林的保护和更新复壮、干旱半干旱地区植被恢复等工作有重要的理论和实践指导意义。本文以胡杨的披针形叶、卵圆形叶及锯齿卵圆形叶为研究材料,分别对其生理生化特性、蛋白表达特征、编码基因及非编码RNA（lncRNA,circRNA,miRNA）的表达特征进行比较分析。在此基础上,进一步开展了竞争性内源RNA调控网络分析,并对竞争性内源RNA调控网络中差异表达的关键基因PePIP2;5进行功能研究。旨在揭示胡杨异形叶性的环境适应分子机制,为异形叶植物尤其是木本异形叶植物的环境适应性的机制研究提供参考。主要研究结果如下:（1）探究了胡杨三种典型异形叶生理生化特性与异质环境适应性的关系。结果表明,冠层上部叶片的光照条件优于冠层下部的叶片,处于冠层下部的披针形叶表现出耐荫性,具有较小的比叶重、暗呼吸速率及光饱和点,使其在弱光环境中更有效地捕获光能,降低碳损耗,提高光合产物积累。而处于冠层上部的锯齿卵圆形叶和卵圆形叶表现出对强光的适应性,具有较大的比叶重、光饱和点及最大光合速率。值得注意的是,锯齿卵圆形叶表现出明显的旱生结构和较好的抗逆性:该形态叶气孔下陷、气孔尺寸小密度大、具有表皮毛结构,能够有效调节蒸腾失水。此外,锯齿卵圆形叶中类黄酮、总酚、类胡萝卜素、木质素含量较高,对不利环境条件的耐受性较好。（2）分析了三种典型异形叶的蛋白表达特征与环境适应性的关系。由此构建了胡杨异形叶差异表达蛋白互作网络,提出了胡杨异形叶环境适应的代谢调控网络。结果表明,光系统I反应中心亚基V家族蛋白和光系统II放氧复合体蛋白等在内的光合光反应相关蛋白质在卵圆形叶与锯齿卵圆形叶中表达量较高,冠层上部的叶片具有较高的光合能力。与植物碳代谢和氮代谢等基础代谢相关蛋白质如丙酮酸激酶与谷氨酸脱羧酶等在卵圆形叶中的表达量较高,表明卵圆形叶片具有较高的基础代谢能力。与植物逆境响应相关的蛋白,如过氧化物酶、咖啡酸-O-甲基转移酶、谷氨酰胺合成酶等蛋白在锯齿卵圆形叶中表达量较高,有利于锯齿卵圆形叶对强光、高温、干旱等不利环境的响应。（3）基于高通量测序分析了异形叶编码基因和非编码RNA（lncRNA,circRNA,miRNA）。在披针形叶和锯齿卵圆形叶中鉴定586个差异基因,包括WRKY、NAC、COL、C2H2等17类植物重要的转录因子。差异基因主要参与植物防御反应及生物碱、木质素等次生代谢过程。参与胡杨逆境响应及次生代谢的b HLH转录因子、NAC转录因子及调控叶片形状的TCP转录因子在锯齿卵圆形叶中上调,能够使锯齿卵圆形叶具有较好抗逆性并导致胡杨不同形态叶片的产生。鉴定了1725个胡杨异形叶lncRNA,其中54个lncRNA在披针形叶和锯齿卵圆形叶中差异表达,并参与调控光适应、蛋白修复、胁迫响应和生长发育相关的靶基因的表达,有利于植株高效利用环境资源、响应不利环境条件。通过系统分析,构建了环境适应相关的差异lncRNA-差异靶基因互作网络,提出了胡杨异形叶对异质光环境的响应规律,位于冠层上部的锯齿卵圆形叶通过调控表皮蜡合成及依赖叶黄素循环的光保护机制避免强光损伤及抑制;位于冠层下部的披针形叶通过上调表达光合天线蛋白,增强在弱光环境下的光捕获能力。在胡杨异形叶中鉴定了1702个circRNA,76个在披针形叶和锯齿卵圆形叶中差异表达。差异circRNA主要参与氧化还原过程、植物防御反应、乙醛酸盐和二羧酸根阴离子代谢和氮代谢等过程。构建了胡杨两种异形叶circRNA-miRNA靶向关系网络,其中59个circRNA能与72个miRNA结合,参与编码基因转录后调控。在异形叶中鉴定了517个已知miRNA及127个新预测miRNA,22个在披针形叶和锯齿卵圆形叶中差异表达。差异表达miRNA主要参与细胞对盐胁迫的响应、RNA降解、磷酸肌醇代谢、角质、软木脂和蜡的生物合成、碱基切除修复等与植物抗逆相关的代谢途径,能够调控在胡杨抗旱及耐盐过程中发挥重要作用的核转录因子Y、F-box蛋白、b HLH转录因子、NAC转录因子及阳离子质子反向运输载体等的表达,使锯齿卵圆形叶对不利环境条件具有较好的耐受性。对异形叶竞争性内源RNA（ce RNA）调控网络进行预测,获得由差异表达的5个circRNA、9个lncRNA、17个miRNA、93个m RNA构成了胡杨异形叶ce RNA调控网络。分析鉴定了包括水通道蛋白PePIP2;5等在内的4个ce RNA调控组符合ce RNA表达调控特征。建立了胡杨两种异形叶的竞争性内源RNA调控网络。（4）克隆到胡杨PePIP2;5基因,并对其表达模式进行分析,结果表明PePIP2;5在胡杨不同组织及不同形态叶片中的表达量存在差异,在锯齿卵圆形叶中高表达,有利于该形态叶片更好地应对高光、高温、水分亏缺等不利环境条件。利用叶盘法将构建的PePIP2;5过表达载体转化野生型84K杨树,获得PePIP2;5过表达的84K转基因植株并进行功能研究。异源转化证明PePIP2;5能够增强植株抗干旱胁迫的能力,使植株在干旱胁迫条件下维持较好的渗透调节能力和抗氧化酶活性,有利于植株保水及对抗氧化胁迫,使植株在胁迫条件下能保持一定的光合效率,提升植株在胁迫环境下的生存能力。进一步证明了锯齿卵圆形叶上调表达的PePIP2;5能够增强其抗干旱胁迫的能力,缓解其在水分亏缺的环境条件下所受生理抑制,维持一定的光合生产能力。以上结果表明胡杨异形叶性是一种植物响应异质环境的机制,是以提高植株自身生存能力和生产效率为目的的适应策略。本研究结果为理解胡杨及其它异形叶植物环境适应性的分子机制奠定了一定基础。
殷时光[5]（2020）在《LBD21-31基因调控杨树茎干次生生长的功能分析》文中进行了进一步梳理木材资源对于整个人类社会具有不可缺少的重要意义。木材作为燃烧能源以及在造纸和建筑方面具有不可缺少的重要地位,树木的大部分生物量是木材,木材也称次生木质部。次生生长过程中维管形成层向内分化产生次生木质部,向外分化产生次生韧皮部,后续经历细胞膨胀扩增,次生壁沉积,细胞程序性死亡等一系列复杂发育过程使树干增粗,因此植物次生生长的基因调控网络具有重要的科研价值。本研究通过分析前期的基因表达数据选定LBD基因家族中的LBD21-31（Potri.010G186000）基因为研究对象,以杂交杨树84K为实验材料,克隆得到杨树LBD21-31基因片段,并成功构建35S::LBD21-31过表达载体,使用农杆菌介导的叶盘侵染转化技术侵染得到LBD21-31过表达转基因植株,通过RT-qPCR检测了LBD21-31在不同转基因植株中的表达量,后续通过表型分析和植株茎段切片观察分析了LBD21-31对杨树愈伤发育、根系发育及次生木质部发育的影响,使用DAP-seq分析了与LBD21-31直接作用的靶基因,为LBD基因家族研究和杨树良种选育提供了重要的理论依据,现有主要研究结果如下:（1）LBD21-31基因在次生木质部的表达水平显着高于次生韧皮部。（2）参考毛果杨LBD21-31基因序列,成功在84K杨基因组中克隆出LBD21-31的CDS序列。其CDS全长为492bp,与毛果杨碱基序列相似度为98.2%,氨基酸序列相似度100%。（3）成功构建35S::LBD21-31过表达载体,使用农杆菌侵染技术获得35S::LBD21-31过表达转基因植株。（4）RT-qPCR对转基因植株的基因表达量分析结果显示,LBD21-31表达量高的转基因植株在高度和茎粗上出现明显下降,木质部发育存在缺陷。（5）LBD21-31过表达植株愈伤组织过度增殖,植株生根困难。（6）外源生长素和细胞分裂素处理可抑制LBD21-31基因表达。（7）通过DAP-seq发现1637个与LBD21-31直接结合的靶基因,其中包括NAC转录因子、MYB转录因子以及生长素合成、转运、响应相关因子等。
国浩平[6]（2020）在《杨树PagD53基因的克隆表达及其与PagD14基因的相互作用的研究》文中指出杨树是我国重要的工业用材和造林绿化树种,提高杨树木材的生产力,培育出优良品质的杨树品种这一工作尤为重要。光能是植物积累生物量的初级能源,而树冠是树木截获光能、进行光合作用的场所,因此冠型结构和冠层密度是决定林分木材产量的重要因素。杨树的冠型结构和冠层密度主要由分枝发育决定。在木本植物中,分枝发育主要是指侧枝的发育和调控,侧枝是由叶腋处的腋芽发育而来,而侧芽与侧枝的发育是一个极为复杂的生理过程,受到植物自身的遗传性、激素调节、生长环境和营养条件等多种因素的调控。大量研究表明,植物激素对分枝发育调控具有极为重要的作用,已有报道,植物激素独角金内脂（SLs）在植物分枝发育调控中发挥着重要作用。在拟南芥和水稻的研究中表明独角金内酯信号转导通路中的关键基因D14可以调控分枝发育,D14蛋白编码了一个水解酶,其可以是感知独脚金内酯的信号,并且具备水解独脚金内酯的能力。在植物中,除了D14蛋白之外,能够接受独脚金内酯的受体还包括F-box蛋白D3和Clp蛋白酶家族蛋白D53,三者通过相互作用形成复合体参与独角金内酯的信号调控。本文以银腺杨（Populus alba×P.glandulosa）为实验材料,提取银腺杨总RNA,反转录得到的cDNA为模板,根据JGI数据库中D53基因（Potri.009G046700）设计引物,克隆得到了PagD53基因,构建了关于PagD53的表达载体,包括:35S::PagD53、PBI121-PagD53-GFP、pGBKT7-PagD14、pGADT7-PagD53、pSPYNE-PagD14、pSPYCE-PagD53。其中35S::PagD53用于农杆菌介导侵染84K植株的转基因研究;PBI121-PagD53-GFP用于烟草的亚细胞定位;pGBKT7-PagD14和pGADT7-PagD53用于酵母双杂交实验（Y2H）;pSPYNE-PagD14与pSPYCE-PagD53用于双分子萤光互补实验（BiFc）。通过上述实验对PagD53基因的功能、亚细胞定位及其互作蛋白进行初步探究,进而研究PagD53基因在杨树分枝发育中的功能及其作用机理,本研究得出以下结论:1.克隆得到了杨树的PagD53基因,基因全长为3345bp,编码1114个氨基酸,对PagD53蛋白进行分析发现,其分子量为121943.92 Da,理论等电点（PI）为6.45,分子式为C5301H8494N1510O1683S51,原子总数为17039,脂肪系数为80.85,总平均亲水性（GRAVY）为-0.313,预测为亲水蛋白。2.通过荧光定量PCR检测84K杨不同组织的PagD53表达量,结果表明:PagD53在不同组织中表达量由高到低的排序依次为:芽、根、茎、叶,其中芽的相对表达量为2.548,约为根的6.67倍。通过不同组织的表达量结果可知PagD53可能与独角金内酯含有相反的表达模式,由此推测PagD53可能参与到抑制独脚金内酯的信号传导过程中,从而调节杨树的分枝发育。3.构建了超表达载体35S::PagD53,通过农杆菌介导法转化84K杨,最终获得4株转基因杨树株系。4.构建了PBI121-PagD53-GFP融合蛋白表达载体,通过烟草的瞬时转化进行亚细胞定位,结果显示PagD53位于细胞核中。5.构建了pGBKT7-PagD14和pGADT7-PagD53表达载体,转化入酵母菌AH109中,无自激活现象后,将两者共转化到酵母菌AH109中,酵母菌可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺板上生长,这一结果表明PagD53蛋白与PagD14蛋白在酵母体内存在互作。6.构建pSPYNE-PagD14与pSPYCE-PagD53载体,采用携带重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片,经共聚焦显微镜镜检后,观测到烟草叶肉细胞中含有黄色荧光,说明PagD53和PagD14在植物体内存在互作现象,进而推测PagD53基因可能和PagD14基因共同对独脚金内酯的信号传导途径进行调控,从而影响杨树的分枝发育。
胡新玲[7]（2020）在《红豆杉紫杉烷7-木糖基转移酶基因鉴定及功能研究》文中提出紫杉醇（Paclitaxel）是从红豆杉的树皮中分离得到的一种二萜类化合物,其抗癌活性广谱而高效。7-木糖基紫杉烷类的木糖基化代谢处于紫杉醇等7-羟基紫杉烷生物合成的分支途径,是影响红豆杉紫杉醇含量的重要步骤,其关键酶为紫杉烷7-木糖基转移酶（Taxane 7-xylosyltransferase）。鉴定并实现编码基因的定向调控,对显着提高紫杉醇的含量、降低紫杉醇的生产成本具有重大意义和应用价值。目前,关于紫杉烷7-木糖基转移酶的功能及其编码基因的研究目前尚未见有报道。为了充分挖掘紫杉烷7-木糖基转移酶,以拟南芥木糖基转移酶和糖基转移酶为检索序列,对红豆杉糖基转移酶进行了大范围的鉴定和分析,并对筛选出的候选基因进行了蛋白表达及功能验证,同时分析了可能参与其表达调控的转录因子。期望为进一步研究红豆杉中紫杉醇合成和代谢的调控机制以及提高紫杉醇产量提供理论依据。主要研究结果如下:（1）基于红豆杉转录组测序数据,以拟南芥等植物木糖基转移酶为检索序列筛选出12个木糖基转移酶候选基因,分别命名为TcXT1～TcXT12。生物学特性分析发现它们多为膜蛋白,且富含稀有密码子。利用qRT-PCR技术分析了这12个候选基因的表达模式,结果显示它们的表达具有一定时空特异性,其中TcXT3、TcXT4、TcXT10和TcXT11在根和茎中相对表达量较高。（2）为了研究候选蛋白是否具有目标酶活,利用原核表达系统对12个候选基因进行蛋白表达,采用MBP、SUMO等标签和大肠杆菌Rosetta（DE3）表达菌株得到TcXT4、TcXT10和TcXT12可溶性目的蛋白,体外酶活反应后未检测到目标产物。为了获得有活性的目标蛋白,成功构建了真核表达系统毕赤酵母pPIC9k载体/GS115菌株,但未能获得目的蛋白,表明该表达系统不利于这些候选基因的表达。利用农杆菌介导的叶盘法获得了TcXT1、TcXT2、TcXT4、TcXT5、TcXT6和TcXT10等6个基因的84K杨（Populus alba×Populus glandulosa）转基因植株,并且进行了TcXT4和TcXT5在烟草中的瞬时表达,结果表明这些候选基因在异源植物中的蛋白表达量均较低。（3）由于前期筛选的木糖基转移酶未能验证到目标活性,因此,扩大筛选范围,以拟南芥的糖基转移酶为检索序列,进一步挖掘候选基因。用目标底物10-去乙酰基紫杉醇（10-Deacetyltaxol,DAT）或目标产物7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇（7-Xylosyl-10-deacetyltaxol,7-XDT）分别处理红豆杉悬浮细胞,进行转录组测序筛选目标糖基转移酶。首次从红豆杉中鉴定出65个尿苷二磷酸糖基转移酶,将其与拟南芥的同家族成员聚类分为15个亚类,其中包括共有红豆杉和拟南芥家族成员的9个亚类和6个物种特异性的亚类。筛选到在目标底物DAT处理条件下体内表达量显着上调,而在目标产物7-XDT处理条件下显着下调的5个糖基转移酶全长基因:TmUGT34、TmUGT9、Tm GT1、Tm GT2和Tm GT3,其中TmUGT34（属于K亚类）差异最大。（4）为了进一步鉴定筛选出的糖基转移酶是否具有目标活性,在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株和84K杨中进行了目的蛋白的表达。84K杨中目的基因在转录水平高表达,仅在大肠杆菌获得可溶性目的蛋白,体外酶活反应未能检测到目标活性。而利用农杆菌介导的真空抽滤—瞬时转化红豆杉小苗的体内酶活检测发现,过表达TmUGT34基因能够显着提高植株体内目标化合物7-木糖基紫杉醇（7-Xylosyltaxol,7-XT）和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量,7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇C（7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C,7-XDTc）及其它底物含量在两组中无显着变化,这表明TmUGT34具有紫杉烷7-木糖基转移酶的活性。这是首次在红豆杉中鉴定出紫杉烷7-木糖基转移酶。（5）对已鉴定的紫杉烷7-木糖基转移酶基因TmUGT34的启动子分析表明,MYB转录因子能够与其启动子区域序列结合。基于此,首次在红豆杉中鉴定了R2R3-MYB基因家族,最终获得了72个Tc MYB基因。系统发育分析表明这些R2R3-MYB蛋白序列与拟南芥中的R2R3-MYB转录因子聚类分为36个亚类。通过q RT-PCR检测发现Tc MYBs在红豆杉叶片、韧皮部、木质部和根部有不同程度的表达。对miRNA介导的Tc MYB基因转录后调控分析发现,有18个Tc MYB基因被miR858、miR159和miR828靶向。这些研究结果为进一步研究R2R3-MYB转录因子对7-木糖基紫杉烷类化合物生物合成的调控机制奠定了基础。综上,本课题研究结果为深入解析紫杉烷7-木糖基转移酶调控紫杉醇代谢的分子机制奠定了基础,为提高红豆杉中紫杉醇产量提供了新思路。
张立莎[8]（2020）在《红豆杉TcLBD6转录因子在树木叶片发育及次生代谢中作用的研究》文中研究说明LBD（Lateral Organ Boundaries Domain）蛋白是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育、代谢及防御等过程中均起着重要的调控作用。LBD家族成员众多,在拟南芥中共鉴定到43个LBD蛋白。前人研究表明拟南芥LBD6对侧生器官的发生、器官的极性建立及花粉的正常发育等有重要的调控作用;其在水稻中的同源基因Os AS2的过表达能抑制水稻芽的分化,促进细胞分裂;其在玉米中的同源基因RAMOSA2,决定玉米分枝分生组织细胞的命运;其在大麦中的同源基因Vrs4,控制大麦小穗的形成和排列方式。因此,推测其同源基因在树木的生长发育过程中也起到重要的调控作用。红豆杉（Taxus chinensis）是重要的药用木本植物,有关生长发育调控因子的研究对其遗传改良有重要理论研究意义。TcLBD6是本课题组从红豆杉树皮中克隆到的一个LBD6的同源基因,但其功能尚不清楚。为了进一步研究TcLBD6转录因子在树木生长发育过程中的作用,本文构建了红豆杉TcLBD6编码基因的过表达载体,并转化84K（Populus alba×Populus glandulosa）杨,对过表达及对照植株进行了表型分析。鉴于叶片的表型差异最明显,对过表达及对照植株的叶片进行了代谢组、转录组、蛋白质组等多组学比较分析,并对TcLBD6作用机制进行了初步探讨,重点从下游代谢物层面分析了TcLBD6影响树木叶片生长发育的机制。此外,鉴于代谢组分析显示花青素在TcLBD6异源过表达84K中显着上调,在红豆杉中鉴定了25个与花青素合成相关的基因,并进行了启动子结合预测和表达模式分析。这些结果为今后进一步深入研究红豆杉TcLBD6参与树木生长发育、次生代谢调控的分子机理及红豆杉中多种药用成分开发奠定了理论基础。主要研究结果如下:（1）构建了红豆杉TcLBD6过表达载体并异源转化84K杨,得到了稳定表达的3个转基因株系TcLBD6-oe。表型分析结果表明,典型的TcLBD6-oe植株与对照WT-84K相比,植株生长受到抑制,其中叶片的表型差异最大,具体表现为叶片变小甚至收缩成针状,叶长、叶宽分别为对照植株的35%和2%,叶片维管组织分布分散,未见明显的栅栏组织结构,远轴面出现类似于栅栏组织的细胞。这些结果说明,红豆杉TcLBD6过表达对叶片的生长发育有显着的抑制作用。（2）为了比较异源过表达与同源过表达产生的植株表型差异,克隆并构建了84K杨中与TcLBD6同源性较高的Pag LBD6、Pag LBD25和Pag LBD36基因及其过表达载体,并转化84K杨,得到了Pag LBD6的同源过表达植株Pag LBD6-oe,其表型为植株矮小、叶片缩小,与TcLBD6-oe的叶片表型类似,说明TcLBD6对叶片发育的抑制作用是该基因本身的作用,与其来源于针叶树种无关。（3）为了研究TcLBD6过表达在代谢物层面上引起的变化,鉴于叶片的表型差异最明显,对TcLBD6-oe及WT-84K的叶片进行了代谢组分析,结果显示:TcLBD6过表达引起了多种代谢物的上调或下调,其中L-多巴、甲基多巴、异鼠李素、樱花素、木犀草素、秦皮素、矢车菊素和芍药素等多种有药用价值的代谢物显着上调,暗示了其在提高药用植物药物产量上的潜在利用价值。测得的所有差异代谢物中,L-多巴的上调倍数最大,且有抑制杂草生长的生物学功能;黄酮及其衍生物类物质上调或下调的种类最多,其中花青素类物质只表现为上调。这些结果说明,TcLBD6过表达能显着提高叶片中多种有药用价值的次生代谢物的含量。（4）为了验证代谢组的测定结果,提取了TcLBD6-oe及WT-84K叶片的L-多巴进行定性与定量分析,结果表明TcLBD6-oe叶片L-多巴含量显着高于WT-84K,进一步说明TcLBD6过表达对叶片L-多巴生物合成有促进作用;为了验证L-多巴对木本植物的生物学效应,用2m M的L-多巴水溶液对84K杨组培苗进行处理,结果表明与蒸馏水处理相比,L-多巴处理能够明显抑制84K杨的生长发育。（5）为了探讨TcLBD6促进84K杨L-多巴和花青素合成的机制,对TcLBD6-oe及WT-84K叶片进行了转录组分析,共检测到10 329个差异表达的基因,其中6 771个上调表达,3 558个下调表达。差异基因KEGG代谢通路分析显示:L-多巴生物合成通路中多个基因上调表达,其中多酚氧化酶（PPO）编码基因上调表达6.85倍,花青素合成通路中的基因普遍上调表达。JASPAR软件预测也显示84K杨多酚氧化酶（PPO）编码基因以及花青素合成通路中的查尔酮合成酶（CHS）和黄烷酮3-羟化酶（F3H）编码基因的启动子区域存在多个LBD转录因子结合位点,这为进一步研究TcLBD6与靶基因的互作奠定了基础。（6）为了探讨L-多巴抑制叶片发育的原因,本文聚焦非蛋白质氨基酸L-多巴的替换研究,采用Lable-free的方法对TcLBD6-oe及WT-84K叶片进行了蛋白质组分析,共鉴定到2 473个蛋白,其中差异表达的蛋白有130个,包括上调77个,下调53个。TcLBD6-oe与WT-84K植株蛋白质的氨基酸残基替换检索发现,TcLBD6-oe植株中多个蛋白出现特异位点L-多巴残基的替换。其中,内几丁质酶populus＿84k053195.T1第60位酪氨酸残基被L-多巴残基替换,第82位苯丙氨酸残基被L-多巴残基替换,表明TcLBD6过表达后可以引起转基因植株中一些蛋白质的酪氨酸残基或苯丙氨酸残基被L-多巴残基所替换,这是一个全新的发现。这些结果为研究TcLBD6通过L-多巴抑制叶片发育的作用机理提供了一个新的思路,值得今后进一步深入研究。（7）鉴于代谢组分析显示花青素在TcLBD6过表达的84K杨植株中显着上调,本文又初步分析了红豆杉中TcLBD6与其花青素生物合成基因之间的关系。通过序列搜索、多序列比对、保守结构域及系统发育关系分析,在红豆杉中鉴定了包括Tc CHS、Tc CH1-Tc HI2、Tc F3H1-Tc F3H5、Tc F3’H1-Tc F3’H4、Tc F3’5’H、Tc DFR1-Tc DFR8、Tc ANS、Tc ANR和TcLAR1-TcLAR2在内的25个花青素生物合成相关酶的基因,并分析了这些基因的组织表达特异性。JASPAR软件预测显示,Tc CHI1、Tc F3H3、Tc F3’H4及Tc ANS基因启动子区域存在LBD转录因子的结合位点,这些结果为今后深入研究红豆杉中TcLBD6与其花青素生物合成基因之间的调控关系奠定了理论基础。
宋程威[9]（2019）在《PagUNE12参与调控杨树次生维管组织发育的研究》文中研究说明植物的次生生长发生在初生生长结束之后,由次生分生组织,特别是维管形成层的活动不断产生新的细胞组织,主要表现为植物根、茎的加粗。近年来研究表明,植物次生生长过程中维管组织的发育受到很多遗传和内源因子的调控,尤其是一些转录因子。bHLH（basichelix-loop-helix protein）是真核生物中广泛存在的转录因子家族之一,在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用。迄今为止,由于植物bHLH家族成员众多、参与的生物过程复杂,对其功能的了解还不是十分清楚。本研究以木本模式植物—杨树为研究对象,从84K杨中克隆获得了一个bHLH转录因子PagUNE12,优化建立了 84K杨遗传转化体系,并通过该体系,获得了过表达PagUN12的转基因杨树;之后结合生物信息学、细胞生物学以及多层组学联合分析,揭示了 PagUNE12转录因子在木本植物次生生长发育过程中的调控作用。主要结果如下:通过对84K杨遗传转化过程中多个因素的分析,优化获得84K杨遗传转化体系,使用OD600值为0.6的农杆菌侵染84K杨幼嫩叶片15 min后,共培养3天,获得了最高的遗传转化效率。采用优化得到的84K杨遗传转化体系,通过Kan筛选和PCR验证,共获得了 12个过表达PagUNE12的转基因杨树株系。通过荧光定量PCR和Western blot检测,证实在84K杨中过表达的PagUNE12基因能够稳定地翻译表达成蛋白质。组织表达模式检测显示,PagUNE12在84K杨的所有维管组织中均有表达,包括初生韧皮部、次生韧皮部、初生木质部和次生木质部。亚细胞定位分析发现,PagUNE12主要定位于细胞核中。酵母双杂实验结果显示,所分离鉴定的PagUNE12能够发生自激活。表型分析发现,与84K野生型植株相比,PagUNE12过表达植株株高较矮,节间数较多,节间长度较短,并且叶片发生明显的皱缩。生理分析结果显示,过表达PagUNE12显着提高了 84K杨的光合作用,其净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均高于84K杨野生型植株。利用半薄切片观察野生型和过表达PagUNE12植株次生木质部的结构,发现过表达PagUNE12能够促进84K杨次生木质部的发育。运用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）对次生木质部细胞的超微结构进行观察发现,过表达PagUNE12植株的次生细胞壁的厚度明显厚于84K野生型植株。上述结果说明,PagUNE12参与调控了植株次生木质部的形态建成。运用傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）检测茎部次生木质部木质素含量,结果显示过表达PagUNE12导致84K杨植株木质素含量升高;共聚焦拉曼显微光谱（confocol Raman microspectroscopy）对茎部次生木质部木质素的非标记、原位成像发现,过表达PagUNE12植株次生木质部细胞壁中木质素的荧光强度比野生型植株显着提高,说明过表达PagUNE12能够促进84K杨次生木质部次生细胞壁中木质素的沉积。此外,二维核磁共振（nuclearmagneticresonance,NMR）分析发现,过表达PagUNE12能够降低84K杨次生木质部中紫丁香基（syringyl,S）木质素单体的含量,同时提高愈创木基（guaiacyl,G）木质素单体的含量,从而使PagUNE12过表达植株具有更低的S/G比值。转录组测序结果显示,在PagUNE12过表达植株中,肉桂酸辅酶A还原酶（cinnamoyl-CoAreductase,CCR）和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）的编码基因表达量显着上升,其中CCR是木质素单体生物合成的关键酶,PEPCK催化丙酮酸的产生,丙酮酸是植物碳水化合物代谢的中间产物。此外,转录组和miRNA组联合分析结果显示,过表达PagUNE12能够降低84K杨中miR6462c的表达量,进而上调其靶基因淀粉合酶（starch synthase 1,SS1）的表达,促进光合作用产物的代谢。综上所述,本研究以84K杨为材料,通过对PagUNE12基因组织表达模式和遗传转化材料的分析,发现过表达PagUNE12能够促使84K杨次生木质部提前发育,并提高次生木质部木质素的含量,表明PagUNE12基因参与调控84K杨次生维管组织的发育,并影响木质素单体的聚合,为进一步探究PagUNE12对植物维管组织发育的调节机理奠定了基础。
苟路正,曲春浦,刘关君,杨成君[10]（2018）在《84k杨叶片离体快繁体系的优化》文中指出以84k杨成熟叶片为外植体,诱导愈伤组织及不定芽的分化,经过壮苗、生根过程获得再生植株,建立了84k杨组织培养和快速繁殖技术新体系。结果表明:最佳叶片不定芽诱导培养基MS+6-BA 0.8mg/L+NAA0.1mg/L,诱导率100%,平均丛生芽数为15.06;最佳壮苗培养基为MS+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.1mg/L;最佳生根适宜培养基为MS+IBA 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L,生根率100%;将生长良好的组培苗移栽并扣瓶培养1周,成活率达97%。
二、84K杨叶片再生系统的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、84K杨叶片再生系统的建立（论文提纲范文）
（1）PtrUNE12在84K杨次生生长和盐胁迫响应的生物学功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物次生生长的转录调控机制及研究现状 |
| 1.3 植物参与盐胁迫响应的转录调控机制及研究现状 |
| 1.4 bHLH转录因子的结构 |
| 1.5 bHLH转录因子的功能 |
| 1.5.1 参与植物根系发育过程 |
| 1.5.2 参与植物茎部发育过程 |
| 1.5.3 参与植物叶片发育过程 |
| 1.5.4 参与植物盐胁迫应答过程 |
| 1.6 UNE12与植物的生长发育以及非生物胁迫的关系 |
| 1.7 研究的目的及意义 |
| 2 PtrUNE12的克隆及功能分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PtrUNE12的组织以及盐胁迫表达模式分析 |
| 2.2.2 PtrUNE12的克隆 |
| 2.2.3 PtrUNE12启动子调控元件分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 PtrUNE12组织表达模式以及耐盐性分析 |
| 2.3.2 PtrUNE12编码区域的克隆 |
| 2.3.3 PtrUNE12启动子调控元件分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 PtrUNE12转录因子基本特性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要仪器和试剂 |
| 3.1.4 药品和培养基配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 pEASY~(TM)-Blunt-PtrUNE12载体的构建 |
| 3.2.2 pFGC-eGFP-PtrUNE12载体的构建 |
| 3.2.3 pFGC-eGFP-PtrUNE12转化根瘤农杆菌 |
| 3.2.4 烟草叶片瞬时侵染 |
| 3.2.5 PtrUNE12分段转录激活活性分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 pEASY~(TM)-Blunt-PtrUNE12载体的构建 |
| 3.3.2 PtrUNE12亚细胞定位 |
| 3.3.3 PtrUNE12分段转录激活活性分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 PtrUNE12抑制表达载体的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 主要仪器和试剂 |
| 4.1.4 药品和培养基配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 PtrUNE12抑制表达载体的构建 |
| 4.2.2 pROKⅡ-PtrUNE12-SRDX重组质粒转化根瘤农杆菌 |
| 4.2.3 pROKⅡ-PtrUNE12-SRDX载体84K杨转化及筛选 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pROKⅡ-PtrUNE12-SRDX表达载体的构建 |
| 4.3.2 pROKⅡ-PtrUNE12-SRDX重组质粒转化农杆菌 |
| 4.3.3 pROKⅡ-PtrUNE12-SRDX载体84K杨转化及筛选 |
| 4.3.4 PtrUNE12转基因84K杨的DNA水平验证 |
| 4.3.5 PtrUNE12转基因84K杨的RNA水平验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 转PtrUNE12过表达、抑制表达84K杨的表型以及次生性状分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 主要仪器和试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨表型观测 |
| 5.2.2 PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨次生性状测定 |
| 5.2.3 PtrUNE12与其下游基因启动子结合分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨表型观测 |
| 5.3.2 PtrUNE12与其下游基因启动子结合分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 转PtrUNE12过表达、抑制表达84K杨的耐盐性分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 主要仪器和试剂 |
| 6.1.3 药品和培养基配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 盐胁迫下PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨表型观测 |
| 6.2.2 盐胁迫下PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨活性氧染色 |
| 6.2.3 盐胁迫下PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨酶活性、含量检测 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 盐胁迫下PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨表型观测 |
| 6.3.2 盐胁迫下PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨活性氧染色 |
| 6.3.3 盐胁迫下PtrUNE12过表达、抑制表达转基因84K杨酶活性、含量检测 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 讨论 |
| 7.1 PtrUNE12的研究方法 |
| 7.2 PtrUNE12调控84K杨次生生长过程 |
| 7.3 PtrUNE12调控84K杨盐胁迫响应过程 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词对照表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）PtPLT1和PtWOX5B在杨树芽再生过程中的作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物再生的细胞来源 |
| 1.2 愈伤组织的形成 |
| 1.2.1 激素诱导愈伤组织形成 |
| 1.2.2 损伤诱导愈伤组织 |
| 1.2.3 愈伤组织的细胞性质及其分子基础 |
| 1.3 芽再生机理的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 酶与生化试剂 |
| 2.1.3 载体与菌株 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 分析软件及数据库 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CTAB法提取杨树基因组 |
| 2.2.2 植物总RNA的提取 |
| 2.2.3 培养基的制备 |
| 2.2.4 表达载体的构建 |
| 2.2.5 农杆菌介导的84K杨树叶盘法遗传转化及抗性植株的获得 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 2.2.7 共聚焦显微镜的观察和图像处理方法 |
| 2.2.8 烟草介导的瞬时转化方法 |
| 2.2.9原位杂交实验 |
| 2.2.10 再生芽数量统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 杨树PtPLT1和PtWOX5B基因的克隆 |
| 3.2 PtPLT1和PtWOX5B基因的系统发育树分析 |
| 3.3 PtPLT1和PtWOX5B的表达模式分析 |
| 3.4 PtPLT1和PtWOX5B的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PtPLT1和PtWOX5B在芽再生过程中的功能分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PLT1和WOX5功能的保守性 |
| 4.2 植物再生过程中的细胞命运转化 |
| 4.3 诱导表达根端分生组织关键基因在林木再生体系建立中的潜在价值 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）杨树SPR1互作蛋白的鉴定及功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词与专有名词明细 |
| 1.前言 |
| 1.1 微管 |
| 1.1.1 微管的结构 |
| 1.1.2 微管的动态组装特性 |
| 1.1.3 植物微管的列阵类型与功能 |
| 1.2 微管蛋白 |
| 1.2.1 微管蛋白的基因家族 |
| 1.2.2 微管蛋白的翻译后修饰及功能 |
| 1.3 微管结合蛋白 |
| 1.3.1 与微管正末端结合的微管结合蛋白(+TIPs) |
| 1.3.2 与微管聚合相关的微管结合蛋白 |
| 1.3.3 与微管解聚相关的微管结合蛋白 |
| 1.3.4 与微管成束相关的微管结合蛋白 |
| 1.4 蛋白质相互作用的研究方法 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 双分子荧光互补技术 |
| 1.5 实验室前期工作进展 |
| 1.6 研究意义 |
| 2.84K杨TUA5和TUB16基因的克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 RNA纯度的检测 |
| 2.2.2 84K杨 TUA5和TUB16 基因的克隆 |
| 2.3 小结 |
| 3.植物过表达载体的构建及84K杨遗传转化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 重组表达载体的鉴定 |
| 3.2.2 烟草瞬时表达分析 |
| 3.2.3 转基因杨树的抗性筛选 |
| 3.3 小结 |
| 4.酵母双杂筛选84KSPR1互作蛋白 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 cDNA文库的检测 |
| 4.2.2 目的基因的扩增与诱饵载体的鉴定 |
| 4.2.3 自激活检测与毒性检测 |
| 4.2.4 阳性克隆的筛选 |
| 4.2.5 同源比对分析 |
| 4.3 小结 |
| 5.84KSPR1候选互作蛋白的基因克隆与BIFC验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果与分析 |
| 5.2.1 84KSPR1候选互作蛋白的克隆 |
| 5.2.2 BiFC载体的构建 |
| 5.2.3 BiFC验证84KSPR1及其候选互作蛋白的相互作用 |
| 5.2.4 BiFC验证84KSPR1互作蛋白之间相互作用 |
| 5.3 小结 |
| 6.讨论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 84K杨84KTUA5和84KTUB16转基因株系的构建 |
| 6.1.2 酵母双杂筛选84KSPR1互作蛋白 |
| 6.1.3 84KSPR1候选互作蛋白的基因克隆与Bi FC验证 |
| 6.2 展望 |
| 7.结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（4）胡杨异形叶性的环境适应分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 植物的异形叶性 |
| 1.1.1 异形叶的定义 |
| 1.1.2 植物异形叶适应环境的机制 |
| 1.1.3 胡杨的异形叶性 |
| 1.2 蛋白质组学在植物环境适应性研究中的应用 |
| 1.2.1 蛋白质组学研究的技术方法 |
| 1.2.2 蛋白质组学在植物环境适应性研究中的应用 |
| 1.3 非编码RNA对植物基因表达的调控 |
| 1.3.1 lncRNA的特征及其调控作用 |
| 1.3.2 microRNA的特征及其调控作用 |
| 1.3.3 CircRNA的特征及其调控作用 |
| 1.3.4 竞争性内源RNA调控机理及其生物学意义 |
| 1.4 水通道蛋白与植物的环境适应性 |
| 1.4.1 植物水通道蛋白的发现及结构 |
| 1.4.2 水通道蛋白的功能与对环境的响应 |
| 1.5 本研究的目的与内容 |
| 2 胡杨异形叶结构及生理特性与环境适应性 |
| 2.1 植物材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 叶片比叶重的测量 |
| 2.2.2 光响应曲线、叶片光强及叶温的测量 |
| 2.2.3 叶片表皮结构的观察 |
| 2.2.4 类黄酮含量的测定 |
| 2.2.5 总酚含量的测定 |
| 2.2.6 类胡萝卜素含量的测定 |
| 2.2.7 木质素含量的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 叶片形态和比叶重的差异 |
| 2.3.2 叶片所受光强差异及光响应曲线 |
| 2.3.3 叶片气孔及表皮特征 |
| 2.3.4 类黄酮、总酚、类胡萝卜素、木质素等次生代谢物含量差异 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 3 异形叶差异表达蛋白与胡杨环境适应性 |
| 3.1 植物材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 叶片蛋白质提取和裂解 |
| 3.2.2 蛋白质定量检测 |
| 3.2.3 蛋白质酶解及肽段标记 |
| 3.2.4 LC-MS/MS质谱鉴定 |
| 3.2.5 质谱数据分析 |
| 3.2.6 差异蛋白鉴定及生物信息学分析 |
| 3.2.7 差异蛋白互作网络构建 |
| 3.2.8 异形叶环境适应相关蛋白的转录水平验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 差异表达蛋白的鉴定及统计 |
| 3.3.2 差异表达蛋白的功能注释及生物信息学分析 |
| 3.3.3 差异蛋白互作关系 |
| 3.3.4 q RT-PCR对 i TRAQ数据中环境适应相关蛋白的验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 与光合作用相关的蛋白 |
| 3.4.2 与基础代谢相关的蛋白 |
| 3.4.3 与逆境响应相关的蛋白 |
| 3.5 小结 |
| 4 异形叶转录组及非编码RNA对胡杨环境适应性的调控作用 |
| 4.1 植物材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 转录组测序及基因功能分析 |
| 4.2.2 lncRNA测序、鉴定与功能分析 |
| 4.2.3 circRNA测序、鉴定与功能分析 |
| 4.2.4 miRNA测序、鉴定与功能分析 |
| 4.2.5 ceRNA调控网络分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 两种异形叶基因表达及差异基因功能分析 |
| 4.3.2 两种异形叶lncRNA表达及差异lncRNA功能分析 |
| 4.3.3 两种异形叶circRNA表达及差异circRNA功能分析 |
| 4.3.4 两种异形叶mi RNA表达及差异mi RNA功能分析 |
| 4.3.5 两种异形叶中ceRNA调控网络及功能分析 |
| 4.4 小结 |
| 5 胡杨异形叶PePIP2;5的表达模式及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株及质粒 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 生物信息学分析 |
| 5.2.2 基因组DNA的提取 |
| 5.2.3 总RNA的提取 |
| 5.2.4 cDNA的合成 |
| 5.2.5 目的片段的扩增和凝胶检测 |
| 5.2.6 胡杨PePIP2;5基因扩增 |
| 5.2.7 扩增目的片段的胶回收及纯化 |
| 5.2.8 T载体的连接及转化 |
| 5.2.9 阳性克隆验证和质粒提取及酶切 |
| 5.2.10 重组质粒构建与鉴定 |
| 5.2.11 重组质粒转化农杆菌 |
| 5.2.12 农杆菌介导的遗传转化和植株阳性检测 |
| 5.2.13 转基因植株在干旱胁迫下的表型和生理检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 胡杨PePIP2;5基因的克隆与生物信息学分析 |
| 5.3.2 PePIP2;5基因过表达载体的构建 |
| 5.3.3 Pe PIP2;5 基因的84K杨遗传转化 |
| 5.3.4 转基因84K杨的分子检测 |
| 5.3.5 转PePIP2;5基因植株的抗逆性分析 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 成果目录清单 |
| 致谢 |
（5）LBD21-31基因调控杨树茎干次生生长的功能分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 杨树相比拟南芥的研究优势 |
| 1.2 树木次生生长 |
| 1.2.1 树木次生生长的意义及过程 |
| 1.2.2 次生生长的分子调控 |
| 1.2.2.1 植物激素对次生生长的调控 |
| 1.2.2.2 顶端分生组织相关基因对形成层活动的影响 |
| 1.2.2.3 HD-ZIP III基因家族对形成层和木质部发育的调控 |
| 1.2.2.4 NAC和 MYB转录因子对次生壁生物合成的调控 |
| 1.3 LBD家族简介 |
| 1.3.1 LBD家族特征 |
| 1.3.2 LBD转录因子的功能研究 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料的准备 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 药品、试剂与主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 LBD21-31 过表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 LBD21-31 基因序列和载体图谱 |
| 2.2.1.2 引物的确定和合成 |
| 2.2.1.3 植物总RNA的提取 |
| 2.2.1.4 RNA纯化与反转录 |
| 2.2.1.5 LBD21-31 基因的克隆 |
| 2.2.1.6 将LBD21-31 基因插入克隆载体 |
| 2.2.1.7 将LBD21-31 基因连入过表达载体PzP211+35s+PolyA |
| 2.2.2 农杆菌侵染转化84K杨树 |
| 2.2.2.1 农杆菌侵染原理 |
| 2.2.2.2 培养基配方 |
| 2.2.2.3 LBD21-31 过表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.2.4 农杆菌侵染步骤 |
| 2.2.3 转基因苗的基因鉴定 |
| 2.2.3.1 转基因苗的DNA提取 |
| 2.2.3.2 PCR鉴定 |
| 2.2.4 茎段徒手切片和染色 |
| 2.2.5 植物激素处理 |
| 2.2.6 RT-qPCR检测LBD21-31 基因表达量 |
| 2.2.7 DAP-seq实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 LBD21-31 基因在杨树各部位表达量结果分析 |
| 3.2 杨树LBD21-31 基因的过表达载体构建及序列分析 |
| 3.3 35S::LBD21-31 不同株系转基因苗鉴定 |
| 3.4 35S::LBD21-31 转基因植株表型分析 |
| 3.5 35S::LBD21-31 转基因植株茎切片分析 |
| 3.6 LBD21-31 过表达植株愈伤组织与根系变化 |
| 3.7 激素处理对LBD21-31 基因表达量影响 |
| 3.8 DAP-seq结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 LBD21-31 基因在木质部的表达水平 |
| 4.2 LBD21-31 基因对次生生长的影响 |
| 4.3 LBD21-31 基因对愈伤形成及植株激素的影响 |
| 4.4 显性抑制转基因植株 |
| 4.5 DAP-seq鉴定LBD21-31 结合的靶基因 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）杨树PagD53基因的克隆表达及其与PagD14基因的相互作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 林木理想株型 |
| 1.2 杨树的研究进展 |
| 1.3 独脚金内酯调控植物分枝发育 |
| 1.3.1 独脚金内酯的生物合成与信号传导 |
| 1.3.2 独脚金内酯与其他激素共同调节植物分枝发育 |
| 1.3.3 参与独角金内酯信号传导的相关基因 |
| 1.4 D53的生物学功能 |
| 1.4.1 D53的结构 |
| 1.4.2 D53的功能 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2.试验材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌种材料 |
| 2.1.3 酶及试剂 |
| 2.1.4 主要的仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PagD53 基因克隆与35S::PagD53 过表达载体的构建 |
| 2.2.2 qRT-PCR检测84K杨中不同组织的PagD53 基因表达量 |
| 2.2.3 PagD53的农杆菌介导转化84K杨 |
| 2.2.4 PBI121-PagD53-GFP的表达载体构建及烟草亚细胞定位 |
| 2.2.5 pGBKT7-PagD14与pGADT7-PagD53 载体的构建及酵母双杂实验 |
| 2.2.6 pSPYNE-PagD14与pSPYCE-PagD53 表达载体的构建及烟草荧光双光子互作实验 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 PagD53基因克隆及生物信息学分析 |
| 3.1.1 PagD53基因克隆 |
| 3.1.2 PagD53蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1.3 PagD53基因在不同组织部位中的表达分析 |
| 3.1.4 35S::PagD53 超表达载体的构建与农杆菌介导的84K转化 |
| 3.2 PagD53::GFP重组载体的构建与本生烟草瞬时转化分析 |
| 3.3 pGBKT7-PagD14与pGADT7-PagD53 载体的构建及酵母双杂结果分析 |
| 3.3.1 pGBKT7-PagD14与pGADT7-PagD53 载体的构建 |
| 3.3.2 自激活检测 |
| 3.3.3 酵母双杂交检测 |
| 3.4 pSPYNE-PagD14与pSPYCE-PagD53 重组载体的构建及烟草荧光双光子检测结果分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 杨树PagD53 蛋白是含有Clp结构域的功能蛋白 |
| 4.2 杨树PagD53基因表达部位与其对独脚金内酯信号传导影响的推测 |
| 4.3 杨树PagD53蛋白定位于细胞核内 |
| 4.4 杨树PagD53 蛋白与PagD14 蛋白存在相互作用 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）红豆杉紫杉烷7-木糖基转移酶基因鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2.1 紫杉醇应用现状 |
| 1.2.2 紫杉醇生物合成及7-木糖基紫杉烷 |
| 1.2.3 糖基化及糖基转移酶研究进展 |
| 1.2.4 MYB转录因子调控机制研究进展 |
| 1.3 研究目标和主要研究内容 |
| 1.3.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.3.3 研究技术路线 |
| 1.4 项目来源与经费支持 |
| 2 红豆杉木糖基转移酶基因鉴定及表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 红豆杉木糖基转移酶候选基因筛选及生物学特性分析 |
| 2.3.2 红豆杉木糖基转移酶候选基因蛋白二级结构预测 |
| 2.3.3 红豆杉木糖基转移酶候选基因组织表达模式分析 |
| 2.3.4 红豆杉木糖基转移酶候选基因底物处理条件下表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 红豆杉木糖基转移酶基因克隆、蛋白表达及功能研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 红豆杉木糖基转移酶候选基因原核表达菌株筛选 |
| 3.3.2 红豆杉木糖基转移酶候选基因原核表达优化 |
| 3.3.3 红豆杉木糖基转移酶候选基因酵母表达 |
| 3.3.4 农杆菌介导的84K杨转目的基因表达分析 |
| 3.3.5 农杆菌介导的目的基因瞬转烟草表达分析 |
| 3.3.6 红豆杉木糖基转移酶候选蛋白体外酶活实验及产物检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 红豆杉糖基转移酶基因的筛选与鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 红豆杉细胞底物或产物处理样品转录组测序 |
| 4.3.2 红豆杉细胞转录组测序数据分析 |
| 4.3.3 红豆杉细胞转录组测序差异表达分析 |
| 4.3.4 红豆杉尿苷二磷酸糖基转移酶基因家族成员鉴定 |
| 4.3.5 红豆杉尿苷二磷酸糖基转移酶基因家族系统发育分析 |
| 4.3.6 红豆杉尿苷二磷酸糖基转移酶保守结构域分析 |
| 4.3.7 红豆杉差异表达糖基转移酶基因筛选 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 红豆杉糖基转移酶基因的克隆、蛋白表达及功能研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 红豆杉糖基转移酶原核表达蛋白分析 |
| 5.3.2 红豆杉糖基转移酶原核表达蛋白体外酶活分析 |
| 5.3.3 农杆菌介导红豆杉糖基转移酶基因转84K杨 |
| 5.3.4 84K杨转基因植株Tm UGT34 表达分析 |
| 5.3.5 农杆菌介导瞬时红豆杉小苗Tm UGT34 表达分析 |
| 5.3.6 农杆菌介导瞬转红豆杉小苗次生代谢产物检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 红豆杉Tm UGT34 基因转录调控因子分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 Tm UGT34 基因启动子与MYB转录因子结合序列预测 |
| 6.3.2 红豆杉R2R3-MYB基因家族成员鉴定 |
| 6.3.3 红豆杉R2R3-MYB基因家族系统发育分析 |
| 6.3.4 红豆杉R2R3-MYB蛋白保守结构域分析 |
| 6.3.5 红豆杉R2R3-MYB基因组织特异性表达分析 |
| 6.3.6 红豆杉mi RNA介导的Tc MYBs基因转录后调控 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 结论和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 引物列表 |
| 附录B 英文缩略词 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（8）红豆杉TcLBD6转录因子在树木叶片发育及次生代谢中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2 研究目标和主要研究内容 |
| 1.2.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.2.2 主要研究内容 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 2 LBD6 基因在杨树中的过表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 植物过表达载体的构建与转化 |
| 2.2.2 LBD6 相关基因在84K中过表达对植株表型的影响 |
| 2.3 小结 |
| 3 TcLBD6 转基因植株的多组学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 TcLBD6 转基因植株代谢组分析 |
| 3.2.2 TcLBD6 转基因植株L-多巴绝对定量 |
| 3.2.3 外源施用L-多巴对84-K杨生长发育的影响 |
| 3.2.4 TcLBD6 转基因植株转录组分析 |
| 3.2.5 TcLBD6 转基因植株蛋白质组(Lable-free)分析 |
| 3.3 小结 |
| 4 红豆杉花青素生物合成相关基因的鉴定及表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 花青素生物合成相关基因的鉴定 |
| 4.2.2 生物信息学及组织表达特异性分析 |
| 4.2.3 TcLBD6 与花青素合成相关基因启动子相互作用的预测 |
| 4.3 小结 |
| 5 结论与讨论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 讨论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（9）PagUNE12参与调控杨树次生维管组织发育的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写符号及中英文对照表 |
| 1 引言 |
| 1.1 植物转录因子 |
| 1.1.1 转录因子结构及分类 |
| 1.1.2 植物主要转录因子家族 |
| 1.1.3 bHLH转录因子结构 |
| 1.1.4 bHLH转录因子功能 |
| 1.1.4.1 bHLH转录因子参与植物生长发育和形态建成 |
| 1.1.4.2 bHLH转录因子参与植物逆境胁迫响应 |
| 1.1.5 转录因子研究技术 |
| 1.2 植物次生生长 |
| 1.2.1 维管形成层的分化 |
| 1.2.2 形成层活动的调控 |
| 1.2.2.1 植物激素调控形成层活动 |
| 1.2.2.2 转录因子调控形成层活动 |
| 1.2.3 次生细胞壁的形成与木质素的沉积 |
| 1.2.4 转录因子调控木质素生物合成 |
| 1.3 杨树遗传转化 |
| 1.3.1.1 直接分化再生 |
| 1.3.1.2 愈伤组织分化再生 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 PagUNE12基因的分离与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.2 仪器设备 |
| 2.1.1.3 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.1.4 引物合成及测序 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.1.2.2 cDNA合成 |
| 2.1.2.3 目的基因的扩增 |
| 2.1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.1.2.5 PagUNE12生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PagUNE12基因序列 |
| 2.2.2 PagUNE12蛋白特性 |
| 2.2.3 PtrUNE12启动子调控元件 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 84K杨遗传转化体系的优化及转基因植株的获取 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.2 工程菌种和质粒 |
| 3.1.1.3 仪器设备 |
| 3.1.1.4 主要试剂及配制方法 |
| 3.1.1.5 引物合成及测序 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 植物基因组DNA的提取 |
| 3.1.2.2 植物总RNA提取及目的基因的扩增 |
| 3.1.2.3 PCR产物回收 |
| 3.1.2.4 质粒的提取 |
| 3.1.2.5 目的片段和载体的酶切 |
| 3.1.2.6 目的片段的连接与转化 |
| 3.1.2.7 农杆菌感受态的制备与转化 |
| 3.1.2.8 CRISPR/Cas9载体的构建 |
| 3.1.2.9 84K杨遗传转化 |
| 3.1.2.10 PCR检测 |
| 3.1.2.11 荧光定量PCR检测 |
| 3.1.2.12 PagUNE12原核表达蛋白的纯化 |
| 3.1.2.13 PagUNE12多克隆抗体的制备 |
| 3.1.2.14 蛋白免疫印迹 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 84K杨遗传转化体系 |
| 3.2.2 获得84K转基因植株 |
| 3.2.3 鉴定转基因植株 |
| 3.2.3.1 PCR检测阳性植株 |
| 3.2.3.2 转基因植株PagUNE12表达量 |
| 3.2.3.3 PagUNE12多克隆抗体 |
| 3.2.3.4 转基因植株PagUNE12蛋白表达 |
| 3.2.3.5 CRISPR/Cas9转基因植株 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 PagUNE12参与调控杨树次生维管组织发育 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 植物材料 |
| 4.1.1.2 工程菌种及质粒 |
| 4.1.1.3 仪器设备 |
| 4.1.1.4 主要试剂及配制方法 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 荧光定量PCR检测 |
| 4.1.2.2 免疫组织化学染色 |
| 4.1.2.3 烟草瞬时转化 |
| 4.1.2.4 酵母双杂交载体的构建 |
| 4.1.2.5 酵母感受态细胞的制备与转化 |
| 4.1.2.6 植株表型和生长指标的测定 |
| 4.1.2.7 光合相关参数的测定 |
| 4.1.2.8 石蜡切片的制作及脱蜡 |
| 4.1.2.9 Spurr树脂包埋材料的制备、切片及观察 |
| 4.1.2.10 杨树超薄切片的制作及观察 |
| 4.1.2.11 傅立叶变换红外光谱分析 |
| 4.1.2.12 共聚焦拉曼显微光谱分析 |
| 4.1.2.13 核磁共振光谱分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 PagUNE12基因的组织表达特异性 |
| 4.2.2 PagUNE12亚细胞定位 |
| 4.2.3 PagUNE12转录活性 |
| 4.2.4 PagUNE12过表达植株表型 |
| 4.2.5 不同植株生长指标 |
| 4.2.5.1 PagUNE12过表达杨树的生长指标 |
| 4.2.5.2 PagUNE12过表达杨树的光合指标 |
| 4.2.6 不同植株细胞学结构 |
| 4.2.6.1 不同植株组培苗次生木质部结构 |
| 4.2.6.2 不同植株移栽苗次生木质部连续切片 |
| 4.2.6.3 不同植株次生木质部细胞超微结构 |
| 4.2.7 不同植株木质素变化 |
| 4.2.7.1 不同植株木质素含量变化 |
| 4.2.7.2 不同植株木质素成分变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 转基因杨树转录组和miRNA组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.2.1 RNA的提取 |
| 5.1.2.2 cDNA文库制备与测序 |
| 5.1.2.3 数据分析及处理 |
| 5.1.2.4 荧光定量PCR验证 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 转录组测序基本数据 |
| 5.2.2 转录组差异表达基因 |
| 5.2.2.1 转录组差异基因表达水平 |
| 5.2.2.2 转录组差异基因GO注释 |
| 5.2.2.3 转录组差异基因KEGG注释 |
| 5.2.2.4 木质素合成代谢差异表达基因 |
| 5.2.2.5 荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 5.2.3 miRNA组差异表达miRNA |
| 5.2.3.1 miRNA组差异表达miRNA表达水平 |
| 5.2.3.2 miRNA组差异表达miRNA靶基因GO注释 |
| 5.2.3.3 miRNA组差异表达miRNA靶基因KEGG注释 |
| 5.2.4 转录组和miRNA组联合分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（10）84k杨叶片离体快繁体系的优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 统计及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 叶片不定芽诱导 |
| 2.2 壮苗培养 |
| 2.3 84k杨生根培养 |
| 2.4 生根苗移栽 |
| 3 结论与讨论 |
四、84K杨叶片再生系统的建立（论文参考文献）
- [1]PtrUNE12在84K杨次生生长和盐胁迫响应的生物学功能分析[D]. 程赫. 东北林业大学, 2021
- [2]PtPLT1和PtWOX5B在杨树芽再生过程中的作用[D]. 苗金明. 山东农业大学, 2020(01)
- [3]杨树SPR1互作蛋白的鉴定及功能初探[D]. 罗莹. 北京林业大学, 2020(02)
- [4]胡杨异形叶性的环境适应分子机制研究[D]. 曾明. 北京林业大学, 2020(01)
- [5]LBD21-31基因调控杨树茎干次生生长的功能分析[D]. 殷时光. 山东农业大学, 2020(11)
- [6]杨树PagD53基因的克隆表达及其与PagD14基因的相互作用的研究[D]. 国浩平. 山东农业大学, 2020(01)
- [7]红豆杉紫杉烷7-木糖基转移酶基因鉴定及功能研究[D]. 胡新玲. 中国林业科学研究院, 2020
- [8]红豆杉TcLBD6转录因子在树木叶片发育及次生代谢中作用的研究[D]. 张立莎. 中国林业科学研究院, 2020
- [9]PagUNE12参与调控杨树次生维管组织发育的研究[D]. 宋程威. 北京林业大学, 2019(12)
- [10]84k杨叶片离体快繁体系的优化[J]. 苟路正,曲春浦,刘关君,杨成君. 西部林业科学, 2018(03)