一、大鼠脑创伤后皮质Bax蛋白表达及神经细胞凋亡对运动功能影响的实验研究（论文文献综述）
李威[1]（2021）在《下丘脑多巴胺受体参与手十二井穴刺络放血促进重型颅脑创伤大鼠苏醒的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）后昏迷是神经外科常见急危重症,具有高致残死率的特点。TBI后昏迷患者能否尽快苏醒是影响临床预后的重要因素,且如何促醒是国内外神经科学界研究的热点和难点。手十二井穴刺络放血（简称井穴放血）是中医传统的急救促醒技术,本团队应用该法治疗中枢神经损伤开展多个临床试验证实井穴放血法可安全、有效改善TBI、中风及一氧化碳中毒患者急性期的意识水平,但其促醒机制尚未阐明,限制了该疗法的临床应用与推广。课题组前期研究基于井穴放血对TBI后昏迷大鼠有效促醒效应,发现该法可上调TBI后昏迷大鼠腹侧中脑导水管周围灰质（ventral Periaqueductal gray,v PAG）的P2RX7神经元表达、P2RX7和多巴胺（Dopamine,DA）神经元的兴奋性;通过脑室内注射拮抗剂发现脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3及TRPV1介导手十二井穴放血促醒。本研究围绕v PAG的P2RX7受体及多巴胺神经元向下丘脑投射的多巴胺受体进一步阐释井穴放血促进TBI后昏迷大鼠苏醒的生物学机制。方法:1.复制井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应平台（1）复制重型TBI后昏迷大鼠平台:筛选32只健康成年（8周）雄性（Sprague Dawley,SD）大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（TBI组）、TBI+井穴放血组（Hand Acu组）,假手术组+井穴放血组（Sham+Hand Acu组）,样本量每组8只。Sham组仅打开颅窗而不进行撞击;TBI组则是打开颅窗后利用电子控制性脑皮质撞击仪（electricity Controlled cortical impact,e CCI）制备重型TBI大鼠模型。根据I-VI级意识状态分级量表进行评级,把符合V、VI级昏迷意识状态TBI大鼠纳入实验;Sham组和TBI组均不给予井穴放血治疗,Hand Acu组、Sham+Hand Acu组在相应造模成功基础上立即给予手十二井穴放血干预治疗,疗效评价主要指标是实时观察实验大鼠的昏迷时程。（2）引入脑电监测技术初步探索基于脑电监测评价井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应:筛选6只健康成年（8周）雄性SD大鼠随机分成TBI组、Hand Acu组,样本量每组3只。造模成功后给予安装脑电监测电极连接到Power Lab生物信号采集系统上进行实时脑电监测。利用Mathlab软件提取Alpha、Beta、Delta、Theta波的相对频带能量,并计算Alpha/Theta波相对频带能量的比值来量化井穴放血促醒效应。2.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导井穴放血促醒的研究前期结果发现井穴放血可提高造模后1 h v PAG部位的P2RX7的表达及其兴奋性。故本实验进一步探讨v PAG核团注射P2RX7拮抗剂后观察井穴放血的促醒效应是否消失,以明确v PAG核团的P2RX7受体是否介导井穴放血促醒。实验动物分为4组（n=6只/组）:TBI+DMSO组、Hand Acu+DMSO组、TBI+P2RX7拮抗剂组、Hand Acu+P2RX7拮抗剂组,所有分组均在v PAG核团注射30min后进行造模,其中,Hand Acu+DMSO组、Hand Acu+P2RX7拮抗剂组在行v PAG核团注射及造模成功的基础上进行井穴放血干预。疗效评价指标为实时观察实验大鼠的昏迷时程和改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,m NSS）,评估造模后6h大鼠神经功能缺损情况。3.井穴放血对下丘脑多巴胺受体表达的影响研究实验二明确了v PAG脑区P2RX7受体介导井穴放血促醒。课题组前期研究发现v PAG脑区DA神经元表达P2RX7受体,且井穴放血可提高v PAG脑区DA神经元、P2RX7神经元的兴奋性。既往文献报道v PAG的DA神经元可直接投射到下丘脑外侧区（lateral hypothalamus,LH）的食欲素（orexin,ORX）神经元以维持觉醒,下丘脑乳头结节核脑区（tuberomammillary nucleus,TMN）组胺神经元（Histamine,HA）接受多巴胺调节在调控睡眠觉醒中发挥重要作用。因此,本研究进一步探讨井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核脑区多巴胺受体表达量的影响。采用RT-q PCR技术检测造模及井穴放血干预后1h下丘脑多巴胺受体D1（Dopamine receptor D1,DRD1）、多巴胺受体D2（Dopamine receptor D2,DRD2）、多巴胺受体D3（Dopamine receptor D3,DRD3）的基因含量;采用免疫荧光染色方法,DRD1/DRD2/DRD3+DAPI共染,分别检测下丘脑部位LH及TMN核团多巴胺受体的表达情况。4.井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2神经元兴奋性的调控研究本实验探讨了井穴放血对下丘脑LH及TMN区的DRD2神经元的调控作用。采用Sham组、TBI组、Hand Acu组分组设置,采用多重免疫荧光染色方法检测DRD2+cFos+DAPI共染情况,样本量每组n=4,观察井穴放血干预后下丘脑LH及TMN区DRD2表达情况;同时应用Image J检测LH及TMN区的DRD2神经元的兴奋性。另外,选取Hand Acu组样本进行Orexin+DRD2+DAPI、Orexin+c-Fos+DAPI共染,明确下丘脑LH脑区ORX神经元是否表达DRD2受体及井穴放血是否可激活ORX神经元表达c-Fos蛋白。为进一步明确井穴放血是否可激活ORX神经元,选取Sham组、TBI组、Hand Acu组样本（n=4）进行Orexin+c-Fos+DAPI共染。此外,选取Sham组、TBI组、Hand Acu组样本（n=4）进行组胺神经元免疫组化染色,观察井穴放血疗法对TMN脑组胺神经元的影响。结果:1.井穴放血可缩短重型颅脑创伤后昏迷大鼠的昏迷时间本实验观察井穴放血对TBI大鼠昏迷时程的影响,结果发现:（1）假手术+井穴放血组与假手术组相比,昏迷时程无明显变化,提示井穴放血对水合氯醛所致昏迷无促醒作用。大鼠TBI造模,TBI组的昏迷时程与假手术组相比明显升高,提示TBI大鼠模型复制成功。井穴放血干预后,昏迷时程缩短。以上结果说明井穴放血可促进TBI后昏迷大鼠苏醒。（2）脑电图显示,大鼠在昏迷时期脑电呈慢波、波幅高为特点;清醒时期脑电波频率较昏迷时期快、波幅较昏迷时期低为特点。脑电数据分析显示,TBI造模及井穴放血干预后30-40min,TBI组与井穴放血组脑电Alpha/Theta波相对频带能量的比值变化不明显。TBI组造模后40min开始到100min大鼠Alpha/Theta波相对频带能量的比值持续低平。井穴放血干预后40-100min,Alpha/Theta波相对频带能量比值均较TBI组高（升高8.73～19.47%）。以上结果提示井穴放血可一定程度改善TBI后昏迷大鼠的意识。2.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导井穴放血促醒TBI组与TBI+P2RX7拮抗剂组相比,昏迷时程无明显变化,提示P2RX7拮抗剂对TBI大鼠昏迷时程无明显影响。井穴放血组与TBI组相比,井穴放血干预后可明显缩短TBI大鼠昏迷时间且有统计学意义;其与TBI+P2RX7拮抗剂组相比,也可明显缩短TBI大鼠昏迷时间且有统计学意义。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与井穴放血组相比,大鼠昏迷时程升高有统计学意义;井穴放血+P2RX7拮抗剂组与TBI组及TBI+P2RX7拮抗剂组相比,昏迷时间均无统计学意义。在m NSS评分方面:井穴放血组与TBI组及TBI+P2RX7拮抗剂组相比,6h m NSS评分得到改善。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与井穴放血组相比,m NSS评分有一定升高,但无统计学差异。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与TBI组、TBI+P2RX7拮抗剂组相比,m NSS评分有一定下降,但无统计学差异。以上实验结果提示,v PAG的P2RX7受体信号通路可能介导井穴放血的促醒效应。3.井穴放血可提高下丘脑LH及TMN脑区DRD2的表达量下丘脑多巴胺受体基因含量检测结果显示,井穴放血干预后1h下丘脑DRD1、DRD2、DRD3基因含量均明显升高且有统计学意义。免疫荧光染色结果显示,井穴放血干预后1h在下丘脑LH及TMN区DRD2有大量表达,DRD1、DRD3无表达。荧光定量结果显示,在下丘脑LH区,与假手术组相比,造模后TBI组DRD2下降有统计学意义;井穴放血组与TBI组相比,井穴放血干预后DRD2升高有统计学意义;井穴放血组与假手术组相比,DRD2升高有统计学意义。在TMN区,TBI组与假手术组相比,造模后DRD2下降不明显;井穴放血干预后,与TBI组相比,井穴放血组DRD2升高有统计学意义;井穴放血组与假手术组相比,DRD2升高29.36%,但无统计学差异。实验结果表明,井穴放血可上调下丘脑LH及TMN脑区DRD2的表达量。4.井穴放血可提高下丘脑LH及TMN区DRD2神经元兴奋性下丘脑LH及TMN区多重免疫荧光染色结果分析显示:井穴放血干预后,TBI后昏迷大鼠下丘脑LH及TMN区DRD2神经元兴奋性明显升高且有统计学意义。共染结果发现LH区ORX神经元表达DRD2,井穴放血使LH区ORX神经元与c-Fos共染率达81.6%的（0.816±0.020）;且井穴放血可显着上调下丘脑LH区ORX神经元的表达量。下丘脑TMN的组胺组化结果显示,与假手术组比,TBI组造模后1h下丘脑TMN区组胺神经元表达增多;与TBI组比,井穴放血干预后,可显着下调1h下丘脑TMN区组胺神经元的表达量。以上实验结果表明井穴放血可增加下丘脑LH及TMN核团DRD2神经元兴奋性;LH核团食欲素神经元表达DRD2,井穴放血可上调LH核团ORX神经元表达,并兴奋ORX神经元;井穴放血可下调放血干预后1h下丘脑TMN区组胺神经元表达。结论:1.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导手十二井穴放血促醒作用。2.手十二井穴放血可增加下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2表达及其神经元兴奋性,可能是井穴放血促醒的作用环节之一。3.井穴放血可上调下丘脑外侧区食欲素神经元数量,抑制下丘脑乳头结节核区组胺神经元数量;但其介导井穴放血促醒机制尚需进一步验证。
张容超[2]（2020）在《基于PI3K/AKT信号通路研究电针对TBI大鼠脑神经细胞凋亡的调控机制》文中认为目的本研究以颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）大鼠模型为研究对象,以电针治疗为干预手段,研究电针治疗对TBI大鼠模型脑神经细胞凋亡的调控效应,以及该效应与PI3K/AKT信号通路之间的关联,以期揭示电针治疗TBI的部分效应机制,为TBI的电针治疗提供科学依据。方法选用160只SD大鼠（SPF级）,随机（随机数字表法）分为空白组（10只）、假手术组（30只）、模型组（30只）、阻断剂组（30只）、电针+阻断组（30只）、电针组（30只）。在阻断剂组、电针+阻断组应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002,于造模（自由落体撞击法）术后24 h开始电针治疗（电针组、电针+阻断组）,选穴:“百会、水沟、曲池、内关、足三里、涌泉”,每天1次,共治疗14 d。（1）对造模前1 d、电针治疗后3 d、7 d、14 d大鼠的行为学功能进行评价（平衡、行走、及神经功能等）,对各评价时间点大鼠损伤脑组织的病理形态学（HE染色）改变和脑细胞凋亡情况（TUNEL法）进行观测,对各时间点大鼠血清中NSE（神经元特异性烯醇化酶）浓度进行观测,评价电针对TBI大鼠的治疗效应。（2）运用免疫荧光、Western-blot实验技术通过一系列实验从不同层次和角度,对经电针治疗后TBI大鼠损伤脑组织中细胞凋亡因子（促凋亡:Bad、bak、bax;抗凋亡:bcl-xl、NF-k B、Bcl-2）的表达情况进行观测,探讨电针治疗对TBI大鼠脑神经细胞凋亡因子的调节作用,及该效应与PI3K/AKT通路与之间的关联。（3）运用免疫荧光、Western-blot、Real-time PCR实验技术通过一系列实验从不同层次和角度,对电针治疗后TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白PI3K、PDK1、AKT、p-AKT及其m RNA的表达情况进行检测,分析该通路关键蛋白表达量的变化与通路阻断剂（LY294002）及电针干预之间的关联。结果（1）行为学评价:造模前各组大鼠行为学功能评分之间比较,P>0.05;治疗后3 d、7 d、14 d相应评价时间点行为学功能评分,假手术组与空白组之间,P>0.05;在3个相应评价时间点,假手术组行为学功能评分结果优于模型组（P<0.01）,而模型组结果优于阻断剂组（P<0.05）;治疗后3 d,电针组大鼠的平衡、行走功能评价结果与模型组相比,P>0.05,而两组间其他行为学评价结果（神经功能、肢体回缩力）分别进行比较,P<0.05;治疗后7 d、14 d电针组大鼠的行为学功能评价结果均优于模型组（P<0.05）;治疗后3个评价时间点,电针组评价结果均优于电针+阻断组（P<0.05）;电针+阻断组与阻断剂组之间相比,在治疗后3 d、7 d,P>0.05,14 d时,P<0.05。（2）病理形态学:TBI大鼠损伤脑组织病理切片HE染色结果:治疗后3 d、7 d、14 d假手术组和空白组之间相比差异不明显,且结构正常;治疗后3 d:模型组大鼠的损伤脑组织炎症、水肿、核固缩现象较为明显;阻断剂组大鼠的损伤脑组织病理形态结构改变最为明显,受损部位有炎性细胞浸润、渗出较多、间质出血及水肿严重,组织空泡样改变明显,且出现坏死区域,坏死区细胞正常形态消失、不规则排列,核固缩及裂解明显;电针组大鼠的脑组织形态结构表现与模型组之间差异不明显,但优于电针+阻断组;阻断剂组与电针+阻断组之间差异不明显;治疗后7 d、14 d:模型组大鼠的损伤脑组织炎症、水肿较前减轻,核固缩现象明显;阻断剂组大鼠的损伤脑组织病理形态结构改变最为明显,受损部位炎性细胞浸润较前增加、渗出较前减少、间质水肿严重,组织空泡样改变较前明显,坏死区域变大,且坏死区细胞正常形态消失,核固缩及裂解较前增加;电针组大鼠脑组织形态结构表现明显优于模型组、电针+阻断组,阻断剂组与电针+阻断组之间可见差异。（3）血清中NSE的浓度:ELISA检测大鼠血清中NSE（神经元特异性烯醇化酶）浓度:治疗后3 d、7 d、14 d,假手术组与空白组间相比,P>0.05,模型组浓度均高于假手术组（P<0.01）,阻断剂组浓度高于模型组（P<0.05）;治疗后3 d电针组与模型组相比,P>0.05;治疗后7 d、14 d电针组浓度低于模型组,P<0.01;治疗后的3个检测时间点,电针组浓度均低于电针+阻断组（P<0.01）;阻断剂组与阻断+电针组相比较（治疗后3 d、7 d:P>0.05,14 d:P<0.05）。（4）脑细胞凋亡情况:TUNEL法凋亡检测结果（以凋亡检测荧光图像平均光密度值高低表示）:治疗后3 d、7 d、14 d,假手术组与空白组相比,P>0.05,模型组高于假手术组（P<0.01）,阻断剂组高于模型组（P<0.01）;治疗后3 d,电针组与模型组相比,P>0.05,电针组低于电针+阻断组（P<0.05）;治疗后7 d、14 d电针组低于模型组（P<0.01）,且低于电针+阻断组（P<0.05）;在治疗后各时间点阻断剂组与电针+阻断组间比较,P>0.05。（5）促细胞凋亡蛋白的变化:免疫荧光（IF）、Western-blot检测TBI大鼠损伤脑组织中Bad、bak、bax的表达情况（以IF图像平均光密度值高低表示）:治疗后3 d、7 d、14 d的各相应时间点,假手术组与空白组间相比,P>0.05;模型组高于假手术组（P<0.05）,模型组低于阻断剂组（P<0.05）;在治疗后3 d,电针组与模型组间相比,P>0.05,而电针组低于电针+阻断组（P<0.05）;在治疗后7 d、14 d的各相应时间点,电针组低于模型组（P<0.05）,且低于电针+阻断组（P<0.05）;阻断剂组与电针+阻断组相比较,在治疗后3 d时,Bad、bak、bax检测结果P>0.05,在治疗后7 d时Bad、bak检测结果P>0.05,bax检测结果P<0.05,在治疗后14 d时,Bad、bak、bax检测结果P<0.05。（6）抗细胞凋亡蛋白的变化:IF、Western-blot检测TBI大鼠损伤脑组织中bcl-2、NF-k B、bcl-xl的表达情况（以IF图像平均光密度值高低表示）:在治疗后3 d、7 d、14 d的各相应检测时间点,假手术组与空白组之间相比,P>0.05,模型组与假手术组之间相比,P<0.05,模型组高于阻断剂组（P<0.05）;在治疗后3 d,电针组与模型组之间相比,P>0.05,而电针组高于电针+阻断组（P<0.05）;在治疗后7 d、14 d的各相应时间点,电针组高于模型组（P<0.05）,且高于电针+阻断组（P<0.01）;阻断剂组与电针+阻断组相比较,bcl-xl在治疗后3个相应检测时间点,P>0.05,而bcl-2、NF-k B在治疗后3 d、7 d时,P>0.05,14 d时,P<0.05。（7）PI3K、PDK1、AKT、p-AKT的变化IF检测:IF检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白的表达情况（以IF图像平均光密度值高低表示）:治疗后3 d、7 d、14 d相应时间点,假手术组各指标与空白组之间相比,P>0.05,模型组各指标与假手术组之间相比,P<0.05,模型组与阻断剂组之间相比,P<0.05;治疗后3 d电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量与模型组相比,P>0.05;治疗后7 d、14 d电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于模型组（P<0.05）;治疗后的3个相应检测时间点,电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于电针+阻断组（P<0.01）,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。在各相应检测时间点,电针组AKT的磷酸化水平（p-AKT）表达量高于模型组（P<0.05）,且高于电针+阻断组（P<0.01）,此外,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。（8）PI3K、PDK1、AKT、p-AKT的变化Western-blot（W-b）检测:Wb检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白的表达情况:治疗后3 d、7 d、14 d相应时间点,假手术组各指标与空白组之间相比,P>0.05,模型组各指标的表达量与假手术组之间相比,P<0.05,模型组与阻断剂组之间相比,P<0.05;治疗后3 d,电针组PI3K、PDK1的表达量与模型组相比,P>0.05,电针组AKT的表达量高于模型组（P<0.05）;治疗后7 d电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于模型组相比（P<0.05）;治疗后14 d,电针组PI3K、PDK1的表达量高于模型组（P<0.05）,电针组AKT的表达量与模型组相比P>0.05;在3个相应检测时间点,电针组PI3K、PDK1、AKT的表达量高于电针+阻断组（P<0.01）,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05;在电针后各相应检测时间点,电针组AKT的磷酸化水平（p-AKT）表达量高于模型组（P<0.05）,且高于电针+阻断组（P<0.01）,此外,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。（9）PI3K、PDK1、AKT m RNA的变化Real-time PCR检测:Real-time PCR检测TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白m RNA的表达情况:治疗后3 d、7 d、14 d相应时间点,假手术组各指标与空白组之间相比,P>0.05,模型组与假手术组之间相比,P<0.05,模型组与阻断剂组之间相比,P<0.05;治疗后3 d,电针组PI3K、PDK1的m RNA表达量与模型组相比,P>0.05,电针组AKT m RNA的表达量高于模型组（P<0.05）;治疗后7 d、14 d电针组PI3K、PDK1、AKT的m RNA的表达量高于模型组（P<0.05）;在3个相应检测时间点,电针组PI3K、PDK1、AKT的m RNA的表达量高于电针+阻断组（P<0.01）,阻断剂组与电针+阻断组之间相比,P>0.05。结论（1）电针可有效改善TBI大鼠的行为学功能,减轻损伤脑组织的渗出、炎症、水肿,降低TBI大鼠血清中NSE的浓度,促进TBI的恢复。（2）电针干预可下调TBI大鼠损伤脑组织中Bad、bak、bax蛋白的表达,上调Bcl-2、NF-k B、bcl-xl蛋白的表达,从而抑制脑神经细胞的凋亡。（3）电针干预可上调TBI大鼠损伤脑组织中PI3K、PDK1、AKT、p-AKT及其m RNA的表达,且该效应受抑制剂LY294002的影响。（4）电针干预对TBI大鼠行为学功能和病理形态学的改善,以及对TBI大鼠脑神经细胞凋亡的抑制而发挥的治疗效应与PI3K/AKT信号通路相关。
王艳雪[3]（2019）在《右美托咪定通过SIRT1信号通路抑制创伤性脑损伤大鼠神经细胞凋亡的研究》文中研究表明[研究背景]近年来随着建筑、交通运输业等经济的不断发展,创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）的发病率逐年升高。TBI因外力直接或间接作用于头部引起,是一种以轴突破坏,神经元丢失和脱髓鞘为特征的病理事件,主要表现为头痛、恶心、意识障碍、肢体瘫痪等,严重时甚至发生脑疝而危及患者生命,给患者带来极大的安全隐患。TBI是世界各地年轻人死亡和残疾的主要原因,被认为是世界性的重大公共卫生问题。TBI具有高医疗成本、高发病率和高致死率等特点,根据2005年的统计数据,仅在美国每年发病率为200至250万。从疾病发生的病理生理学角度来看,TBI引起的损伤可分为原发性损伤和继发性损伤两个阶段。原发性损伤是由机械性外力冲击的直接效应导致的瞬时损伤,继发性脑损伤是继原发性脑组织机械损伤之后,发生在数小时或数天内,病理过程复杂,包括氧化应激、超氧自由基产生和神经炎症反应等,从而导致神经元损伤和凋亡,因此神经元凋亡是继发性损伤的重要环节。TBI幸存者不仅存在身体残疾,还存在神经行为功能障碍,这都增加了患者对阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的易感性。据世界卫生组织报告,TBI现在已被公认为全球公共卫生流行病,预计到2020年将成为世界上所有年龄组神经残疾的主要原因。在美国,估计每年会接诊110万名TBI患者,其中124,000名患者遗留有长期残疾,50,000名患者死亡,使得TBI成为过早死亡的主要原因。此外,长期医疗保健和收入损失造成相当大的社会和经济负担,这仍然是一个尚未解决的公共卫生问题。目前TBI临床治疗策略主要围绕颅内压、脑灌注、脑血流、脑代谢和脑血管自动调节功能等方面的管理,尚无特效的神经保护药物,因此探索针对TBI后继发性脑损伤具有神经保护作用的药物是TBI治疗非常重要的研究方向。右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）是一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇痛、镇静和抑制交感神经活性的特性,目前广泛应用于重症患者的镇静治疗。DEX是在20世纪80年代和90年代开发和研究的,近年来大量研究表明DEX具有抗炎、抗氧化应激和抗细胞凋亡的作用,在神经系统疾病中发挥神经保护作用。课题组前期实验结果也表明右美托咪定预处理能够抑制TBI所致的神经元凋亡,并且表明100ug/kg为最佳治疗剂量,但作用机制尚不明确。沉默信息调节因子 1（silent information regulator family protein 1,SIRT1）是一种保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性组蛋白去乙酰化酶,涉及多种细胞内信号通路,如衰老、炎症、细胞凋亡和自噬,具有神经保护作用,在各种病理动物模型中显示出神经保护作用,包括缺血性脑损伤、创伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血和神经退行性疾病等。有文献表明抑制SIRT1的表达可加重TBI诱导的线粒体损伤,促进神经元凋亡。因此,本文通过DEX预处理和抑制体内SIRT1蛋白的表达,探明右美托咪定是否通过SIRT1信号通路来抑制TBI后神经元凋亡的发生,为右美托咪定治疗TBI的药理机制提供新理论基础。[目的]通过Feeney自由落体法构建SD大鼠TBI模型,探讨DEX是否通过调控SIRT1信号通路抑制TBI大鼠神经细胞凋亡,为临床应用DEX治疗TBI提供理论依据。[方法]（1）应用Feeney自由落体法构建SD大鼠TBI模型,实验分组分为4组:Sham组（假手术组,无药物治疗）、TBI+NS组（大鼠造模前1Omin腹腔注射生理盐水）、TBI+DEX组（大鼠造模前10min右美托咪定100μg/kg腹腔注射）、TBI+DEX+EX527组（以5mg/kg的剂量腹腔注射SIRT1特异性抑制剂EX527,在TBI造模前每2d以5mg/kg的剂量腹腔注射EX527,共注射4次,然后在TBI造模前10min给予DEX100μg/kg腹腔注射）。（2）在TBI造模成功后24h,采用mNSS评分标准对各组大鼠进行神经功能评分。（3）神经功能评分完成后,分别进行下述实验:①通过HE染色方法观察各组大鼠皮质损伤区脑组织形态学变化。②采用免疫荧光法检测各组大鼠皮质损伤区SIRT1、Cleaved-caspase3的免疫荧光表达;③采用蛋白质免疫印迹法检测各组大鼠皮质损伤区SIRT1、Bax、Cleaved-caspase3和Bcl-2蛋白表达含量变化。[结果]（1）神经功能缺损评分表明,TBI后各组的神经功能缺损评分均较Sham组明显增高（P<0.05）。与TBI+NS组相比,TBI+DEX组大鼠的神经功能缺损评分显着降低（P<0.05）。与TBI+DEX组相比,TBI+DEX+EX527组大鼠的神经功能缺损评分明显升高（P<0.05）。（2）HE染色:①与Sham组比较,TBI+NS组损伤区脑皮质的神经元发生固缩性坏死,细胞胞体缩小,染色深,部分神经元发生变性、水肿,胞浆空泡形成,核固缩明显;②与TBI+NS组比较,TBI+DEX组细胞变性、水肿减轻,胞浆空泡减少,神经元损伤减轻;③与TBI+DEX组比较,TBI+DEX+EX527组的神经元损伤严重。（3）免疫荧光检测:1)凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表达:①与Sham组比较,TBI+NS 组、TBI+DEX 组和 TBI+DEX+EX527 组的 Cleaved-caspase3 蛋白的荧光表达均显着增加（P<0.05）;②与TBI+NS组比较,TBI+DEX组Cleaved-caspase3蛋白荧光表达显着降低（P<0.05）,TBI+DEX+EX527组Cleaved-caspase3蛋白荧光表达轻微降低,但差异无统计学意义（P>0.05）;③与TBI+DEX组比较,TBI+DEX+EX527 组 Cleaved-caspase3 蛋白荧光表达显着增加（P<0.05）。2)SIRT1蛋白的表达:①与Sham组比较,TBI+NS组和TBI+DEX组SIRTI蛋白荧光表达显着增加（P<0.05）;②与TBI+NS组比较,TBI+DEX组SIRT1蛋白荧光表达显着增加（P<0.05）;③与TBI+DEX组比较,TBI+DEX+EX527组SIRT1蛋白荧光表达显着降低（P<0.05）。（4）蛋白质免疫印迹法检测:1)TBI后各组皮质损伤区促凋亡因子Cleaved-caspase3、Bax 和抗凋亡因子Bcl-2 表达:①与 Sham 组相比,TBI+NS组Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达量显着升高（P<0.05）;②与TBI+NS组相比,TBI+DEX组大鼠Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达量明显降低（P<0.05）;③与TBI+DEX组相比,TBI+DEX+EX527组大鼠Bax蛋白表达量明显升高（P<0.05）,Cleaved-caspase3蛋白表达量较TBI+DEX组有轻度升高,但无统计学差异（P>0.05）。Bcl-2蛋白表达趋势与Bax基本一致。2)TBI后各组皮质损伤区SIRT1表达:①与Sham组相比,TBI+NS组大鼠SIRT1蛋白表达量升高（P<0.05）;②与TBI+NS组相比,TBI+DEX组大鼠SIRT1蛋白表达量明显升高（P<0.05）;③与TBI+DEX组相比,TBI+DEX+EX527组大鼠SIRT1蛋白表达量明显降低（P<0.05）。[结论]（1）右美托咪定可在一定程度上减轻大鼠TBI的继发性损害,从而发挥神经保护作用。（2）右美托咪定能够通过调控SIRT1信号通路,减少TBI后神经元凋亡的发生。
宋亚琪[4]（2019）在《甲酯化脂氧素A4对脑出血的神经保护作用及其机制研究》文中研究表明背景:脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是急性脑血管病中死亡率最高的疾病,而且易遗留运动认知等多方面的功能障碍,给患者带来极大痛苦,增加了社会负担。尽管对脑出血发病机制进行了诸多研究,但进展有限,尚未转化为明显的临床获益。探讨脑出血早期病理变化及影响因素,寻找积极有效的治疗方案,可能抓住治疗时间窗提高疗效。近年来的研究发现,脑出血早期血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）通透性增加诱发脑水肿等继发性脑损伤,是导致脑出血不良预后的主要原因。在此过程中,伴随炎症、氧化应激和凋亡因子的激活,以级联反应模式,互相影响,加剧了脑组织结构及功能损伤。因此加强对以上影响因素的研究,可能为脑出血的治疗寻找到潜在的新方向。脂氧素（Lipoxins,LXs）是由脂氧合酶作用于花生四烯酸后生成的一种内源性活性介质,脂氧素A4（Lipoxins A4,LXA4）是其主要生理活性形式之一,在各种炎症相关性疾病方面发挥抗炎和促炎症消退的作用。内源性脂氧素在脱氢酶的作用下迅速失活,不稳定,因人工合成的活性更稳定的脂氧素类似物即甲酯化脂氧素A4（lipoxin A4methyl ester,LXA4 ME）被广泛应用于实验研究。病理状态下,脂氧素通过抑制炎性细胞的募集和活性氧生成,调节小胶质细胞活性,下调基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9,MMP-9）的表达等途径,在慢性神经退行性病变、缺血再灌注脑损伤、脑创伤等神经系统疾病中,发挥着十分重要的作用。但脂氧素对脑出后继发脑损伤的神经保护作用,尤其对脑出血早期的影响及有关调控机制尚不清楚。目的:探讨LXA4 ME对大鼠脑出血早期继发性损伤的神经保护作用及相关调控机制。方法:1.通过自体血建立大鼠ICH模型,侧脑室注射药物LXA4 ME（低剂量组:10ng/ul,高剂量组:100ng/ul）治疗,术后1-5天通过改良神经严重程度评分（Modified neurological severity score,MNSS）和转棒试验评估大鼠神经功能恢复情况。于术后24h处死大鼠取脑,通过HE染色和尼氏染色,观察脑组织病理形态变化和神经细胞存活情况;尼式染色观察ICH后24h血肿周围脑组织神经元密度。通过脑组织含水量及伊文思蓝（Evans blue,EB）测定,评估ICH后1-3天血脑屏障的通透性变化。2.通过末端脱氧核苷酸转移酶介导缺口末端标记（Terminal-deoxy nucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）法检测细胞凋亡;Western-blot检测ICH后血肿周围区受损脑组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65和BBB通透性相关因子MMP-9、Occludin、闭锁小带蛋白（Zonulaoccludens1,ZO）-1的表达;凝胶酶谱电泳分析检测MMP-9的活性。探讨甲酯化脂氧素A4在脑出血中的抗炎及降低血脑屏障通透性的作用机制。3.给予丙二醇甲醚醋酸酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）干预,通过MNSS和转棒试验评估大鼠神经功能障碍情况;TUNEL法检测神经元凋亡;Western-blot及RT-PCR检测ICH后血肿周围区受损脑组织中炎症因子NF-κBp65,线粒体功能相关蛋白腺嘌呤核苷酸转运子-1（Adenine nucleotide translocator-1,ANT1）,融合蛋白2（Mitofusin 2,MFN2）,凋亡相关因子细胞色素C（Cytochrome,CytoC）,Bcl-2/Bax,caspase-3的表达;同时检测线粒体活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）及线粒体膜电位,评估线粒体功能障碍情况。结果:1.大鼠ICH后神经细胞肿胀,神经元数量减少,血脑屏障通透性和脑含水量增加,神经运动功能障碍（P<0.05）。给予LXA4 ME治疗,可以改善神经元形态学变化,减轻脑水肿,改善ICH大鼠神经功能障碍（P<0.05）,起到神经保护作用,且该作用呈剂量依赖性。2.大鼠脑出血后,血肿周围区域神经元凋亡增加（P<0.05）,IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κBp65、MMP-9表达增加（P<0.05）,而Occludin、ZO-1的表达减少（P<0.05）,MMP-9的活性增加（P<0.05）。LXA4 ME通过NF-κB/MMP-9通路抑制炎症反应、减少神经细胞凋亡,降低血脑屏障通透性。3.通过PMA激活NF-κB,促进了神经功能损伤,增加神经元凋亡（P<0.05）;降低ANT1、MFN2、Bcl-2的蛋白和mRNA水平表达（P<0.05）,增加了线粒体NF-κBp65、CytoC、Bax、caspase-3蛋白和mRNA表达（P<0.05）;同时增加线粒体ROS含量,降低线粒体ATP和膜电位（P<0.05）。结论:甲酯化脂氧素A4通过抑制炎症反应和细胞凋亡,减轻早期脑出血后神经功能损伤,该神经保护作用可能是通过抑制NF-κB/MMP-9通路的激活来实现的。
付江泉[5]（2018）在《富氢水对大鼠创伤性脑损伤神经保护相关机制的研究》文中研究指明第一部分富氢水处理对大鼠创伤性脑损伤半暗带区的保护作用目的:观察富氢水对大鼠创伤性脑损伤半暗带区脑组织炎症反应及细胞凋亡的影响。方法:54只雄性SD大鼠随机分为假手术（Sham）组、创伤组（TBI组）及创伤+富氢水组（TBI+HW组）3组,每组分为1d、3d、7d 3个亚组。TBI组及TBI+HW组进行颅脑撞击;TBI+HW组于造模后立即腹腔注射富氢水5 ml/kg,之后每日腹腔注射富氢水（5 ml/kg）1次,直至处死;Sham组和TBI组于相同时间点腹腔注射等量生理盐水。观察NSS评分、创伤半暗带区脑组织病理学改变、TUNEL法检测凋亡细胞及凋亡指数、酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测半暗带区脑组织炎症因子（TNF-α-IL-1β）表达。结果:TBI组和TBI+HW组大鼠伤后NSS评分明显增高,伤后3d、7d TBI+HW组较TBI组NSS评分显着降低,TBI+HW组脑组织坏死范围有缩小,脑水肿有减轻。与TBI组比较,TBI+HW组凋亡指数均有明显降低,炎症因子（TNF-α、IL-1β）表达均明显降低。结论:富氢水能抑制TBI后损伤半暗带区脑组织炎症因子的表达和凋亡的发生,减轻神经细胞损伤,改善神经功能。第二部分富氢水对大鼠创伤性脑损伤损伤半暗带区脑组织TLR4/MyD88/NF-KB信号通路介导的炎症反应的影响目的:观察富氢水对大鼠创伤性脑损伤半暗带区脑组织中TLR4/MyD88/NF-KB信号通路介导的炎症反应的影响。方法:54只SD雄性大鼠随机分为3组:sham组、TBI及TBI+HW三个大组,每一大组又分为24h、3d及7d三个亚组。TBI组及TBI+HW组进行颅脑撞击,TBI+HW组于造模后立即腹腔注射富氢水5 ml/kg,之后每日腹腔注射富氢水（5 ml/kg）1次,直至处死;Sham组和TBI组于相同时间点腹腔注射等量生理盐水。实验观察各组大鼠半暗带区TLR4、MyD88、NF-KB的蛋白、mRNA的表达、下游炎症因子（TNF-α、IL-Iβ）浓度及脑组织TLR4阳性细胞表达。结果:与sham组比较,TBI组与TBI+HW组的TLR4、MyD88、NF-KB的蛋白、mRNA的表达、炎症因子浓度及TLR4阳性细胞率均明显增高;与TBI组比较,TBI+HW组的TLR4、MyD88、NF-KB的蛋白、mRNA的表达炎症因子浓度及TLR4阳性细胞率均显着降低。结论:富氢水可以调节神经细胞TLR4/MyD88/NF-KB信号通路,进而调控TBI急性神经炎症反应,发挥神经保护功能。其具体机制可能是通过对神经细胞尤其是胶质细胞TLR4/MyD88/NF-κ B信号通路的调控来实现。第三部分富氢水对大鼠创伤性脑损伤损伤半暗带区脑组织线粒体途径凋亡的影响目的:研究富氢水对大鼠创伤性脑损伤损伤半暗带区脑组织线粒体途径凋亡的影响方法:54只SD雄性大鼠随机分为3组:sham组、TBI及TBI+HW三个大组,每一大组又分为24h、3d及7d三个亚组。TBI组及TBI+HW组进行颅脑撞击,TBI+HW组于造模后立即腹腔注射富氢水5 ml/kg,之后每日腹腔注射富氢水（5ml/kg）1次,直至处死;Sham组和TBI组于相同时间点腹腔注射等量生理盐水。实验观察各组大鼠半暗带区线粒体活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、线粒体膜通透性（MPTP）及BAX、BCL-2的蛋白表达。结果:与sham组比较,TBI组与TBI+HW组的线粒体活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）及BAX的表达均明显增高,线粒体膜通透性（MPTP）、BCL-2的蛋白表达均明显降低;与TBI组比较,TBI+HW组的线粒体活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）及BAX的表达均明显降低,线粒体膜通透性（MPTP）、BCL-2的蛋白表达均明显升高。结论:TBI早期即有线粒体ROS增高、MMP降低、线粒体通透性增强等线粒体损伤表现及细胞凋亡蛋白bax和bcl-2的表达异常,这些变化与神经细胞凋亡联系密切;而这些异常可能与NF-κB激活后的正向调控有关。腹腔注射富氢液可以减轻这类NF-κB介导的线粒体途径凋亡的发生,从而减轻TBI后神经细胞凋亡,从而达到脑保护作用。
郭新荣[6]（2013）在《不同时机针刺介入对TBI模型大鼠脑神经元的保护作用及机理研究》文中研究指明目的1.使用eCCI仪器,研究制备颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）大鼠动物模型,为针刺治疗TBI实验研究提供操作可控、损伤程度稳定、重复性好、死亡率低的模型制备方法。2.利用该方法制备SD大鼠TBI模型,研究不同时间点针刺介入治疗TBI的效果,揭示针刺干预对TBI动物神经元的保护作用及部分机理,为临床针刺治疗TBI的最佳介入时间提供实验依据、丰富针刺治疗TBI的科学内涵。方法1.选用65只SD大鼠,随机分为空白对照组、模型1组、模型2组、模型3组和假手术组,使用eCCI选定不同打击参数（模型1组速度3m/s、深度3mm；模型2组速度4m/s、深度3mm；模型3组速度5m/s、深度3mm）制备不同损伤程度的TBI模型,通过以下几方面评测模型的制备效果：（1）动物神经功能、平衡能力和行走能力评价。（2）HE染色光镜下观察脑组织形态学改变情况。（3）电镜观察脑组织超微结构的变化。（4） ELISA法检测动物血清中S100B、NSE含量的动态变化。（5）免疫组化法检测脑组织NGF、BDNF表达情况。（6）免疫组化法检测脑组织Bax、Bcl-2表达情况。2.选用70只SD大鼠,随机分为空白对照组、针刺1组、针刺2组、针刺3组和模型对照组,使用eCCI仪器,选用打击参数为速度4m/s、深度3mm制备TBI动物模型。取百会、人中、内关（左侧）和足三里（左侧）,分别在脑损伤后第1日、第3日、第5日开始针刺治疗,各组治疗持续10次,等待结束点,在第15日取材,观察、检测相关指标：（1）光镜下HE染色观察脑组织病理改变情况。（2）免疫组化法、Western-blot法检查脑组织中NGF、BDNF蛋白的定位、含量及荧光定量PCR法检测NGFmRNA、BDNF mRNA的表达变化。（3）免疫组化法、Western-blot法检查脑组织中Bcl-2、Bax蛋白的定位、含量及荧光定量PCR法检测Bcl-2mRNA、Bax mRNA的表达变化。结果1.TBI模型大鼠制备研究（1）SD大鼠颅脑受到不同速度的外力打击后,模型1组、模型2组、模型3组出血量均随打击强度增加而增多,呼吸减慢,死亡动物数随之上升。于打击后第1日,对其神经功能、平衡能力、行走能力进行评价,结果显示神经功能、平衡能力、行走能力均随打击速度的增加而下降,且各组间有显着性差异（P<0.01）；于第3日进行评估,各组神经功能、平衡能力、行走能力均较第1日明显改善,但各组之间仍存在显着性差异（P<0.01）。（2）采用HE染色光镜下观察脑组织形态学变化,空白组和假手术组脑组织皮层细胞分布清晰致密、排列均匀、胞体饱满、胞核呈蓝色、轮廓清楚、神经元染色正常；模型各组受伤皮质可见不同程度红细胞溢出、大量炎性细胞浸润、间质水肿、组织疏松、血管周围间隙增宽,且随打击强度增加而明显加重。（3）电镜观察脑组超微结构变化,正常组和假手术组神经元整体结构完整、清晰,线粒体、核糖体、粗面内质网等细胞器含量丰富,线粒体具有清晰可见的内外膜结构、嵴排列整齐；而模型各组神经元细胞出现核固缩、溶解,胞浆变少,细胞器含量减少,线粒体、内质网肿胀等,且随打击力度增加而加重。（4）ELISA法动态检测血清中S100B、NSE含量的变化,模型各组动物当损伤发生后第1日、第2日、第3日均呈上升趋势,同空白组和假手术组比较均有显着性差异（P<0.01）；模型1组、模型2组、模型3组之间表现为随打击力度的增加S100B、NSE含量显着性增高,且各组之间具有显着性差异（P<0.01）。（5）免疫组化法检测脑组织中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2蛋白表达情况。阳性表达物主要分布在神经细胞内,以小颗粒为主、部分呈现为聚集分布。空白组和假手术组大鼠损伤脑组织大脑皮质、海马及小脑神经元胞浆中NGF、BDNF、 Bax、Bcl-2均有弱阳性反应。模型各组损伤后脑组织损伤区大脑皮质、海马、小脑神经元胞浆中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2呈强阳性反应,表达明显增多,且随损伤打击速度的增加而增多,各组之间具有统计学意义（P<0.01）。2.不同时机针刺介入治疗TBI对脑组织NGF、BDNF、Bax和Bcl-2调控的研究。（1）HE染色脑组织形态学变化。空白组脑神经细胞密集,可清楚地看到细胞的大体形态；模型组皮层神经细胞较少、神经元皱缩、胞质深染、核不清晰,有坏死神经细胞；针刺各组胶质细胞增多、凋亡小体减少、坏死细胞明显减少,神经元形态接近正常,坏死面积缩小,血液循环明显改善。（2）采用免疫组化检测脑组织中NGF、BDNF、Bax、Bcl-2蛋白表达定位及含量,又结合Western-blot定量检测其蛋白含量变化,针刺可上调脑组织损伤皮质中NGF、BDNF、Bcl-2蛋白的含量、下调脑组织损伤皮质中Bax蛋白的含量；同时,荧光定量PCR检测也发现,针刺可上调脑组织损伤皮质中NGF、BDNF、Bcl-2相应基因mRNA含量、下调脑组织损伤皮质中Bax基因1mRNA含量,且针刺1组优于针刺2组、针刺3组,组间比较具有统计学意义（P<0.01）。结论1.利用eCCI仪器制备TBI模型大鼠能够通过打击速度、打击深度参数的设置而精确控制模型的损伤程度,具有易操作、打击强度可控制、重复性好、死亡率可控等优点,能够根据研究需要制备各种理想损伤程度的动物模型。2.TBI后针刺介入治疗的时间点应尽可能早,更有利于发挥针刺上调脑组织神经元的神经生长因子（NGF、BDNF）及相应mRNA表达、调控凋亡因子（Bax、 Bcl-2）及相应mRNA的表达,达到保护脑组织神经元的作用。
廖正步[7]（2008）在《rhEPO对创伤性脑损伤保护作用的实验研究》文中研究表明创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）致死、致残率高,严重威胁人类的生命与生存质量。颅脑损伤后药物治疗的匮乏始终是大家关注的焦点。到目前为止,已经完成和即将完成的数百种药物治疗颅脑损伤的临床多中心随机双盲研究的结果表明,还没有一种药物具有确切的临床疗效。而最近的大量动物实验研究表明促红细胞生成素（erythrooietin,EPO）对颅脑损伤有一定的疗效。研究表明rhEPO对脑、脊髓在缺血后再灌注及低氧环境中神经的保护及损伤后修复等研究逐渐引起了人们的兴趣。而rhEPO是否对重型颅脑损伤有神经保护作用,无深入研究及报道。本研究拟采用Feeney氏法制备重型颅脑损伤模型来评价rhEPO的神经保护作用。首先观察大鼠重型颅脑损伤后EPO及EPOR的变化规律,寻找外源性rhEPO治疗颅脑创伤的理论依据。然后给予外源性rhEPO治疗,观察rhEPO对大鼠重型颅脑损伤后神经功能及脑水肿的改善和凋亡相关蛋白表达的影响,从行为学,形态学和分子生物学等多方面探讨EPO脑保护作用的机制,为进一步研究EPO在颅脑创伤中的神经保护作用寻找理论依据。一、促红细胞生成素及其受体在脑外伤后的表达及意义目的观察促红细胞生成素及受体在急性重型脑外伤后大脑皮质内的动态表达规律,并探讨其意义。方法采用改良的Feeney氏法建立脑外伤模型,采用RT-PCR、western blot及免疫荧光法检测促红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）及受体（erythropoietin receptor,EPOR）的mRNA及蛋白的动态表达。结果EPO在伤后12 h表达升高,至3 d达高峰,5 d降至正常水平。而EPOR在伤后12 h表达升高,至24 h达高峰,3 d、5 d和7 d仍维持在高表达水平,未见减弱。结论大鼠急性重型颅脑损伤后大脑皮质内EPO短暂升高,而EPOR持续高表达且呈时间依赖性,提示颅脑损伤后外源性EPO能与持续高表达的EPOR结合产生神经保护作用。二、rhEPO促进颅脑创伤大鼠神经功能障碍改善的实验研究目的探讨促红细胞生成素对大鼠重型颅脑损伤后神经功能及脑含水量的影响,旨在研究其对重型颅脑损伤是否有神经保护作用。方法将78只Wistar大鼠随机分为3组:rhEPO治疗组,脑损伤组,假手术组。72只采用改良的Feeney氏法制作重型脑损伤模型。rhEPO组大鼠致伤后即刻及每天腹腔内注rhEPO（5000IU/kg）,外伤组给予等量生理盐水。假手术组只行开颅手术操作,余步骤同前;假手术组经腹腔注射等量的生理盐水。在伤后5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d六个时间点断头取脑。采用NSS神经功能评分法,评定大鼠神经功能恢复情况;采用干湿重法测量脑含水量,根据公式脑含水量=（湿重一干重）/湿重x 100%,算出脑含水量。HE及NISS染色观察损伤周边区病理改变及神经细胞坏死情况。结果损伤组NSS评分为1 d: 15.17±2.15; 3 d: 16.01±1.54; 7 d: 12.69±1.60;rhEPO组为1 d: 14.28±1.56; 3 d: 12.42±1.37; 7 d: 6.29±1.25。rhEP治疗组与损伤组有显着性差异（P<0.05）。假手术组未见神经功能受损。重型颅脑损伤后3 d损伤组脑含水量为85.58±0.36,rhEPO组为79.57±0.67。rhEPO组与损伤组相比脑水肿有显着性差异（P<0.05）。H E染色:脑损伤组伤后5 h损伤灶中心区大量神经元消失,出现较多的红细胞,伴轻度细胞水肿;伤后24 h出现明显的坏死,病灶中心区神经细胞脱失更明显,范围较5 h增大,神经细胞水肿,炎性细胞浸润;伤后7 d见胶质细胞增生。rhEPO组与损伤组比较,坏死区缩小,神经元受损及脑水肿减轻。胶质细胞增生减轻。结论rhEPO能明显改善大鼠重型颅脑损伤后神经功能症状,减轻损伤周边区脑水肿;初步证实了rhEPO对重型颅脑损伤后脑损伤有明显的神经保护作用。三、促红细胞生成素对大鼠重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响目的通过观察rhEPO对大鼠重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响,探讨rhEPO是否能有效地抑制继发性颅脑损伤,抑制神经元的凋亡。方法实验动物分组、模型制备及用药同第二部分。RT-PCR,Western blot免疫荧光法检测Bcl-2、Bax基因及蛋白表达情况。细胞凋亡原位末端标记（TUNEL）法观察神经元凋亡情况。结果①脑损伤组Bc1-2mRNA在外伤后5 h弱表达,12 h表达增强,24 h达高峰,3 d降至基础水平;rhEPO组Bc1-2 mRNA在12 h达高峰,24 h、3 d持续高表达;5 d、7 d表达下调但仍高于对照组（P<0.05）。②Bcl-2蛋白主要分布在胞浆/胞膜内,在外伤组24 h表达增加,3 d恢复到基础水平;rhEPO组Bc1-2蛋白在24 h达高峰,3 d, 5 d,7 d持续高表达（P<0.05）。③Bax表达:脑损伤组在伤后12 h可见Bax蛋白表达,伤后24小时增加缓慢;伤后72 h其数量显着增加,持续高表达一周,而rhEPO治疗组在伤后12 h,24 h和72 h的Bax蛋白表达量与外伤组相比均显着降低（P<0.05）。假手术组未见明显bax表达。④Tunel染色:Tunel染色阳性细胞于外伤后5 h即已出现,3 d达高峰,7 d仍有表达;损伤组3 d和7d凋亡细胞数分别为68±7.51和64±5.75;rhEPO组凋亡细胞数分别为32±5.48士106和29±6.51与脑损伤组相比均有显着性差异（P<0.05）。假手术组未见细胞坏死和细胞凋亡。结论rhEPO能明显减少重型颅脑损伤后不同时间点的神经细胞凋亡,上调抗凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白bax表达,对大鼠重型颅脑损伤有明显神经保护作用。
梁海乾[8]（2008）在《骨桥蛋白在大鼠脑创伤中的作用研究》文中认为第一部分骨桥蛋白（OPN）添加对大鼠脑创伤影响的实验研究目的:研究OPN添加对大鼠脑创伤的作用。方法:1.建立培养大鼠脑皮质神经细胞离心损伤模型。模型建立后立即分别添加生理盐水或不同浓度（0.01μg/ml、0.05μg/ml和0.1μg/ml）OPN。分别于伤后24h、48h、72h、120h和168h收集培养神经细胞,用MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.制作大鼠侧方液压冲击（LFP）脑创伤模型,研制大鼠呼吸面罩。大鼠中度LFP脑创伤后24h内分别行立体定向脑室内注射生理盐水5μl或OPN5μl（50ng）。于伤后72h、120h和168h分别进行大鼠神经学评分、行走和平衡运动功能检测,Morris水迷宫记忆功能评价。随后大鼠行心脏灌注取脑,原位细胞凋亡检测。结果:1.添加OPN后神经细胞增殖活跃,凋亡率降低,呈剂量依赖关系。2.应用面罩呼吸机辅助呼吸,LFP脑创伤大鼠的死亡率由30%降低到11.84%。3.脑室内注射OPN后LFP脑创伤大鼠水迷宫记忆力、神经学评分、行走和平衡功能改善。结论:OPN可促进培养的神经胶质细胞增殖,抑制神经细胞凋亡。脑室内注射OPN可促进脑创伤后大鼠的记忆力和神经功能恢复,呈剂量依赖关系。第二部分OPN表达封闭对大鼠脑创伤影响的实验研究目的:研究OPN基因沉默对大鼠脑创伤的影响。方法:1.用载体TG005构建OPN表达载体:根据OPN基因信息设计并合成引物。提取胎鼠心肌总RNA,反转录合成cDNA,PCR合成目的片段。目的片段经Mlu1和Spe1双酶切、纯化。载体双酶切,去磷酸化。酶切目的片段和酶切载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,提取重组质粒,双酶切后测序鉴定命名为TG005-OPN。TG005-OPN与脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞,RT-PCR检测,电泳鉴定。2.构建OPN特异性RNAi慢病毒载体:根据OPN基因信息设计3条shRNA序列:OPN-Sh1:ACGATGATGACGACGACGA,OPN-Sh2:ATGACGACGACGATGACGA,OPN-Sh3:AGCACACAAGCAGACGTTT。合成三对互补的DNA片段,PCR扩增后用BamH I和Xho I双酶切,纯化,载体pRNAi-U6.2/Lenti双酶切,去磷酸化。酶切DNA片段与酶切载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,测序鉴定并命名为Lv-OPN-Sh。3.慢病毒载体包装,鉴定:用Lipofectamine 2000将慢病毒载体4质粒（pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G及Lv-OPN-Sh）转移至293T包装细胞,产生重组慢病毒颗粒。重组慢病毒颗粒与TG005-OPN共转染293T细胞,组织蛋白抽提及Western检测OPN基因沉默效果。4.慢病毒重组颗粒转染大鼠创伤神经细胞,检测神经细胞凋亡。5.慢病毒重组颗粒5μl/空载体5μl/生理盐水5μl/TG005-OPN 5μl分别行LFP脑创伤大鼠脑室内注射。于伤后72h、120h和168h分别进行大鼠神经行为学评价及记忆功能评价。结果:1.TG005与目的插入片段连接阳性菌落酶切电泳显示插入片段约1000bp,该片段测序并与GenBank中OPN序列比较证明该片段为OPN,OPN表达载体TG005-OPN制备成功。2.pRNAi-U6.2/Lenti载体与设计合成的3条OPN-shRNA连接,阳性菌落测序鉴定证明3个质粒构建成功并分别命名为Lv-OPN-Sh（1,2,3）。3.脂质体及慢病毒四质粒共转染包装细胞293T,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实有大量质粒转染入293T细胞。4.TG005-OPN与慢病毒共转染293T后Western检测显示Lv-OPN-Sh2可明显抑制OPN表达。5.Lv-OPN-Sh2慢病毒重组颗粒转染损伤神经细胞,神经细胞凋亡率增加,但无统计学意义。6.Lv-OPN-Sh2慢病毒重组颗粒脑室内注射后,大鼠的神经行为功能和记忆功能无明显改变。结论:慢病毒载体介导的OPN特异性RNAi基因沉默对大鼠创伤神经细胞的凋亡影响不明显,对LFP脑创伤大鼠的运动功能和记忆功能影响也不明显。
潘德生[9]（2007）在《黄体酮及其代谢产物对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究》文中进行了进一步梳理黄体酮及其代谢产物对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究研究背景创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）致死、致残率高，严重威胁人类的生命与生存质量。TBI后药物性神经保护治疗的匮乏始终是大家关注的焦点。作为神经甾体的一员，黄体酮（progesterone）及其代谢产物对脑、脊髓和周围神经的保护及损伤后修复等研究逐渐引起了人们的兴趣。无论是在TBI还是脑缺血中，黄体酮和它的代谢产物均被证实具有神经保护作用。黄体酮以及其代谢产物在TBI模型中可以明显改善大鼠的认知能力和运动功能，减轻脑水肿并且能够抑制炎症反应，减少神经元死亡。黄体酮在不同的体外实验中可以减少氧自由基损害，发挥脂质过氧化抑制作用，并具有剂量依赖性。一些学者报道，黄体酮及其代谢产物在不同的神经损伤中可以减少凋亡的发生。在大鼠脑损伤后注射黄体酮，结果发现脑组织局部细胞凋亡减少并且caspase-3活性降低。黄体酮的代谢产物别孕烯醇酮（allopregnanolone，ALLO）可以在损伤后减轻TBI大鼠的脑水肿程度，提高神经元存活、改善神经功能恢复。传统观点认为，黄体酮等甾体激素的作用模式是激素分子穿过细胞膜，与靶细胞内的胞浆受体或核受体结合，从而改变靶基因的转录活性。但一些作者发现黄体酮可能通过与黄体酮受体无关的信号转导机制而发挥效应。另一种可能的黄体酮神经保护机制是通过GABAA受体而发挥其兴奋抑制作用，减少脑损伤中兴奋性毒性所致的细胞死亡。为了研究黄体酮或它的代谢产物是否可以在创伤性脑损伤后发挥神经保护作用，以及其可能的作用机制，我们分别通过制作自由落体损伤TBI动物模型和体外原代培养神经元机械切割伤模型，观察黄体酮以及ALLO的作用，并且检测与损伤后炎症、自由基损伤和凋亡等相关的指标，研究这些神经甾体的可能作用机制。此外，我们还采用黄体酮受体抑制剂米非司酮（mifepristone）来观察黄体酮的神经保护作用是否会因经典的黄体酮受体阻滞而被抑制。第一部分黄体酮对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究本实验的目的是研究黄体酮是否可以在实验性TBI后发挥神经保护作用，并通过检测与TBI后炎症、自由基损伤、凋亡等相关的指标，研究黄体酮的可能作用机制。本实验还采用特异性黄体酮受体抑制剂米非司酮（mifepristone）观察黄体酮的神经保护作用是否会因细胞内的黄体酮受体阻滞而被抑制。材料和方法成年雄性SD大鼠165只，采用改进的Feeney’s自由落体撞击方法制作重型TBI模型。将大鼠随机分为五组：（1）假手术+HBC注射（SV组）；（2）假手术+黄体酮注射（SP组）；（3）损伤+HBC注射（IV组）；（4）损伤+黄体酮注射（IP组）；（5）损伤+黄体酮+米非司酮注射（IPM组）。黄体酮每次注射剂量为10mg／kg，分别于伤后1h，6h，12h和24h注射。IPM组于损伤前12h接受米非司酮预注射一次，注射剂量为25mg／kg，损伤后每次于黄体酮注射前30min注射米非司酮。各项指标的检查均于致伤后48h进行。采用SP法检测凋亡调节基因Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。采用TUNEL染色检测损伤区神经细胞凋亡情况。各组另取5只大鼠，以前囟中心为中心，垂直将脑切成4部分，然后水平切成腹侧和背侧部分。取右后方背侧部分，即是包括损伤区的脑组织。RT-PCR法扩增Bcl-2、bax和GFAP mRNA，测定各组PCR产物密度值与内参照GAPDH的PCR产物密度值，并计算相对表达量。同时，将脑组织置于蛋白提取裂解液中提取总蛋白，western blot法检测Bcl-2、Bax和GFAP三种蛋白的表达情况。另外，我们还采用ELISA法检测损伤区炎症因子TNF-α和IL-1β的含量。采用MDA试剂盒检测损伤区脑组织中TBARS含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定局部组织中SOD活性；检测样品中总谷胱甘肽和GSSG的含量，根据测定得到的总谷胱甘肽的含量和GSSG的含量计算出GSH的含量。伤后48h，各组取5只大鼠，通过尾静脉注射伊文氏蓝。1h后断头处死，测定单位质量脑组织中伊文氏蓝的含量。通过干、湿重称量法，计算各组伤后脑组织水含量。根据mNSS评分表，在伤后24h、1周、2周和3周对大鼠运动、感觉、平衡和反射四方面进行评测。结果HE染色发现，在假手术组中，无论是SV组，还是SP组，脑组织光镜下组织结构正常，细胞排列有序。IV组HE染色显示，伤后48h，组织结构紊乱，局部出血、水肿、充血，可见胞核固缩甚至溶解，胞浆内容物减少，伴有细胞坏死、溶解后形成的空泡，创伤区可见炎细胞浸润。而注射黄体酮的IP和IPM组，在伤后48h，亦出现组织结构紊乱，胞核固缩和炎细胞浸润等现象，但较IV组有一定程度的减轻。IP组和IPM组比较，二者损伤程度相似。免疫组化方法显示，Bcl-2蛋白在假手术脑组织中有轻度表达（SV组阳性率为7.19±1.07％；SP组阳性率6.02±1.21％）。损伤后48h其表达水平没有显着变化（6.34±1.21％）。IP组平均阳性率为4.12±1.66％；IPM组平均阳性率为6.28±2.02％，均未能显着改变Bcl-2表达的平均阳性率。Bax蛋白在假手术脑组织中无阳性表达，TBI损伤后48h其表达水平明显升高，达9.65±2.15％。IP组平均阳性率为10.83±2.00％，IPM组平均阳性率为7.32±0.98％，两组与损伤对照组比较均无明显差异。假手术组大鼠脑组织中仅有极少量TUNEL阳性细胞（SV组：1.36±1.03％，SP组：0.44±0.20％）。TBI损伤后48h其阳性率明显升高，为12.21±2.00％。IP组平均阳性率为9.98±1.67％，IPM组平均阳性率为11.23±2.89％，两组与损伤对照组比较均无统计学意义。RT-PCR检测结果显示，假手术组中GFAP mRNA表达水平较低，SV和SP两组比较无显着差异。无论是否注射黄体酮或米非司酮，损伤组的表达均高于假手术组。IV组、IP组和IPM组的GFAP mRNA表达量相近，无统计学差异。Bcl-2 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义。假手术组中，SV和SP两组未检测到Bax mRNA表达。损伤后，Bax mRNA的表达水平显着升高。注射黄体酮或米非司酮对这种mRNA水平的升高无影响。通过western blot法检测发现，假手术组中GFAP表达水平较低。无论是否注射黄体酮或米非司酮，损伤组的表达均高于假手术组。IV组、IP组和IPM组的GFAP表达量相近。Bcl-2蛋白在各组中的表达差异无统计学意义。假手术组中，SV和SP两组未检测到Bax表达。损伤后，Bax的表达水平显着升高。注射黄体酮或米非司酮对这种蛋白表达水平的升高无影响。假手术组大鼠脑组织中具有一定浓度的TNF-α表达，损伤后48h损伤区脑组织TNF-α表达水平明显增高。注射黄体酮可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。假手术组大鼠脑组织中具有较低浓度的IL-1β表达，损伤后48h损伤区脑组织IL-1β表达水平明显增高。注射黄体酮可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。假手术组大鼠损伤区脑组织中TBARS含量较低。损伤48h后TBARS含量明显增高。注射黄体酮可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。损伤后脑组织SOD和GSH活性含量明显减低。注射黄体酮可以抑制其减低的程度，但仍低于正常水平。同时应用米非司酮对黄体酮的这种抑制作用无影响。损伤组的脑组织中伊文氏蓝的含量明显高于假手术组。然而，IP组的伊文氏蓝含量与IV组比较无显着性差异。合用米非司酮也不能改变TBI后脑损伤区伊文氏蓝的含量。在损伤灶同侧，各组间病灶周围脑组织水含量比较具有显着性差异。损伤组的病灶周围脑组织水含量高于假手术组，其中IP组的脑组织水含量明显低于IV组，合用米非司酮（IPM组）未能阻断黄体酮的这种抑制作用。假手术组中的SP和SV组大鼠的mNSS评分均为正常（0分）。损伤组中，IP组的mNSS分数在2周和3周时显着低于IV组。结论（1）黄体酮可以对创伤性脑损伤发挥神经保护作用，改善脑损伤区的组织结构形态；（2）黄体酮不能减少创伤性脑损伤后细胞凋亡的数目，也不能影响凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达水平；（3）黄体酮可以降低创伤性脑损伤后炎症因子TNF-α和IL-1β的表达水平，但不能减轻创伤性脑损伤后脑组织GFAP水平的升高；（4）黄体酮可以增高创伤性脑损伤后SOD和GSH的含量，降低脂质过氧化的水平，但不能减轻创伤性脑损伤后血脑屏障的破坏；（5）黄体酮可以减轻创伤性脑损伤后脑水肿的程度，改善创伤性脑损伤后神经功能症状；（6）黄体酮受体拮抗剂米非司酮不能够抑制黄体酮的神经保护作用。第二部分黄体酮及其代谢产物对机械性神经元损伤的保护作用及其机制研究研究背景TBI后的继发性脑损害机制非常复杂，中性粒细胞浸润，神经胶质细胞的活化，血管的病理性反应等诸多因素都会加重脑损伤的程度。以往关于黄体酮对TBI后神经保护作用的研究绝大部分是以啮齿类颅脑损伤模型为基础的。为了进一步研究黄体酮及其代谢产物对单纯神经元损伤是否具有神经保护作用，我们建立了机械切割伤的神经元体外培养模型，观察黄体酮和ALLO对神经元损伤的作用，并通过检测凋亡、自由基损伤等指标，研究其作用机制。材料和方法12h内新生SD乳鼠，取皮层神经元，接种于L-多聚赖氨酸铺底的6孔培养板。培养液为含2％B27的Neurobasal-A Medium。培养第三天加入终浓度为5mg／ml的阿糖胞苷以抑制神经胶质细胞的过度增殖。神经元连续培养10d后行NF-200和GFAP免疫组化染色进行神经元鉴定。原代培养10天后，使用固定有20G针头的自制损伤装置划伤各培养板内培养之神经元。实验分为无损伤对照组（CTRL）、载体对照组（VEH），损伤组（INJ）、黄体酮组（PROG）和别孕烯醇酮组（ALLO）。CTRL组不行划伤；VEH组不行划伤，每孔培养液中加入1％酒精20μl；INJ组行划伤，伤后30min每孔培养液中加入1％酒精20μl；PROG组行划伤，伤后30min每孔培养液中加入20μl 1mg／ml的黄体酮酒精溶液；ALLO组行划伤，伤后30min每孔培养液中加入0.375mg／ml的ALLO酒精溶液20μl。随后按预定时间点进行检测。除Annexin V-PI双标记流式细胞仪检测在切割伤后24h进行外，其它各指标检测均于损伤后12h进行。用台盼蓝拒染法进行损伤后细胞活性检测。用Hoechst和PI双染色，观察Heochst 33342阳性细胞的细胞核形态，并计数PI阳性细胞占总细胞数。采用LDH检测试剂盒，分别检测各孔培养液上清中和神经元细胞内的LDH含量，计算LDH漏出率。采用MDA试剂盒检测切割伤后神经元细胞内TBARS含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性；检测样品中总谷胱甘肽和GSSG的含量，根据测定得到的总谷胱甘肽的含量和GSSG的含量计算出GSH的含量。TRIzol法提取神经元总RNA。两步法RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的含量。同时应用Western blot法检测bcl-2和bax蛋白表达的水平。切割伤24h后，CTRL、INJ和PROG组各取一板细胞做Annexin V-FITC-PI流式细胞仪凋亡检测。结果大鼠脑皮层神经元损伤后，倒置显微镜下观察，伤后即见针头划伤区域神经元胞体及突起结构完全消失，见较多细胞碎屑，损伤区周围神经元突起受损，远隔部位神经元镜下结构无明显改变。随着损伤后时间延长，损伤区周围部分神经元胞质透亮度降低，甚至胞膜破裂，胞体及突起结构崩解，呈碎屑状。在加入黄体酮或ALLO的培养板中，仍可见到损伤对照组的损伤性表现，但程度较INJ组减轻，划伤区周围神经元结构完整性提高。神经元原代培养10天后，NF-200免疫组化染色显示，大部分细胞胞浆染成棕色，细胞阳性率不低于85％。GFAP染色，绝大部分细胞为阴性。证实培养之神经元纯度较高，可应用于下一步实验。机械性切割伤后12h，台盼蓝染色显示，损伤组的细胞存活率下降到55.21±8.17％。加入黄体酮或ALLO可以增高细胞的存活率，其中黄体酮组的存活率为74.17±8.69％，ALLO组的存活率为70.08±11.96％，两者与损伤组比较均有显着差异。切割损伤后伤后12h，LDH漏出率明显升高，达41.13±8.65％，而对照组（CTRL和VEH）的LDH漏出率仅为6.32±1.41％和8.65±2.12％。加入黄体酮使LDH漏出率降低为31.22±5.87％，加入ALLO使LDH漏出率降低为32.87±4.61％，两者与损伤组比较差异均有统计学意义。Hoechst和PI双染检测发现，CTRL和VEH组绝大多数细胞被hoechst 33342标记，表现为细胞核呈均匀、朦胧蓝色，PI阳性标记细胞少见。INJ组于切割伤12h后，划伤区周围出现大量PI阳性标记的死亡细胞，发红色荧光，PI阳性率为25.1±11.2％；hoechst 33342标记阳性的细胞中，出现染色质呈簇状、颗粒大小不一、蓝色高亮的凋亡细胞；在加入黄体酮和ALLO的损伤组中，仍可见到颗粒大小不一、蓝色高亮的凋亡细胞，但PI阳性率分别下降为17.2±8.9％和19.3±7.8％，与INJ组比较差异具有统计学意义。CTRL和VEH组细胞中具有一定水平的的SOD和GSH活性，机械划伤后12h损伤区脑组织SOD和GSH的活性明显减低。培养液中添加黄体酮或ALLO都可以抑制SOD和GSH减低的程度，但仍低于正常水平。CTRL和VEH组神经元细胞内TBARS含量较低。切割伤后12h，TBARS含量明显增高。加入黄体酮或ALLO可以降低其增高的程度，但仍高于正常水平。Bcl-2 mRNA在各组中的表达差异无统计学意义，说明神经元切割伤后12h，Bcl-2 mRNA的表达水平没有发生明显变化，而且其表达水平也未受到黄体酮或ALLO的影响。无损伤对照组中，CTRL和VEH两组未检测到Bax mRNA表达。损伤后，Bax mRNA的表达水平显着升高。培养基中加入黄体酮或ALLO对这种mRNA水平的升高无影响。Western blot检测显示，Bcl-2蛋白在各组中的表达无显着差异。Bax蛋白的表达在各组间差异有统计学意义。损伤后，Bax蛋白的表达水平显着升高。培养液中加入黄体酮或ALLO对这种蛋白表达水平的升高无影响。Annexin V-PI双标凋亡检测发现，对照组绝大部分细胞为FITC和PI阴性。机械切割伤后24h，FITC+／PI+细胞比率上升到31.21±4.45％，FITC+／PI-细胞比率也升高到12.7±3.75％，与CTRL组比较差异显着。应用黄体酮组的FITC+／PI+细胞比率较损伤组显着降低，为24.57±6.43％，但FITC+／PI-细胞比率为14.33±6.44％，与损伤对照组差异无统计学意义。结论（1）体外培养大鼠皮层神经元机械性损伤操作简便，重复性好，能在一定程度上模拟颅脑损伤后神经元损伤机制；（2）黄体酮及其代谢产物ALLO可以减少神经元机械性损伤后LDH漏出，提高细胞存活率；（3）黄体酮以及ALLO不能抑制神经元机械性损伤后凋亡的发生，也不能影响损伤后凋亡相关基因Bcl-2和Bax的转录与表达的变化；（4）黄体酮和ALLO可以增高神经元损伤后SOD和GSH的活性，降低脂质过氧化的水平。
夏静娴[10]（2007）在《针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织损伤及细胞凋亡的影响》文中研究表明颅脑损伤是危及人类生命的常见疾病。中医学认为“血瘀”为脑损伤的基本病机，针灸作为中医学独特的治疗方法，其在治疗颅脑损伤中的作用已得到证实。文献研究表明其机制可能与抑制细胞凋亡，提高超氧化物岐化酶水平，减轻自由基反应，减轻脑组织细胞内钙离子超载，降低细胞因子含量等有关。现今的实验研究围绕损伤后继发性损伤机制展开。颅脑损伤后除了直接的细胞死亡、坏死，还会有脑神经细胞的凋亡，其发生是细胞内外因子和凋亡调节基因共同作用的结果。目前防治脑损伤后的继发性损害，最大程度减轻脑功能损害，是医学工作者的研究重点。目的：本研究参照Feeney自由落体冲击造模法建立脑外伤大鼠模型，采用活血化瘀、开窍通络的治疗原则，选取与脑联系密切、临床疗效显着的穴位组方：百会、人中、风府透哑门、合谷，从损伤脑组织病理变化、损伤程度、神经细胞凋亡情况等方面观察针刺对脑损伤影响，探讨针刺治疗颅脑损伤的作用机制，为临床针灸治疗颅脑损伤提供有力证据。方法：SPF级雄性SD大鼠32只，随机分为4组，A组为假手术组；B组为模型组；C组为药物组；D组为针刺组。B组、C组和D组麻醉成功后参照Feeney自由落体冲击造模法建立脑挫伤大鼠模型，C组和D组造模后24h开始治疗。D组将针刺入穴位2mm，采用捻转手法，每穴操作2分钟；C组腹腔注射1％纳洛酮，治疗均24小时一次，治疗7次。治疗结束当天取大鼠脑组织作冠状切片，组织切片HE染色，采用光学显微镜及生物医学图像分析系统观察各组大鼠脑组织病理变化并计算坏死面积。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法，原位检测脑外伤脑细胞凋亡。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肿瘤坏死因子与白细胞介素。结果：1．病理观察见：B组大脑皮质内见血肿，损伤区神经组织坏死、液化、形成软化灶，软化灶内可见出血、炎性细胞浸润，严重者可见损伤区脑组织缺如，其范围大于创伤面积；C组和D组脑组织损伤减轻，C组大脑皮质水肿，部分神经元变性坏死、出现核固缩现象；D组大脑皮质水肿，偶见出血，部分神经元坏死、液化，可见少量核固缩；A组大脑皮质神经元未见组织水肿及神经元变性坏死。2．脑损伤大鼠脑组织坏死面积提示：B组损伤区脑组织坏死面积为8.39±0.67，大于创伤面积（3.14×1.52=7.065）（P＜0.01）；C组、D组坏死面积分别为5.25±0.60、4.47±0.40，均明显小于B组（均P＜0.01），且均小于损伤面积（均P＜0.01）。D组坏死面积较C组有下降趋势，但无统计学意义（P＞0.05）。3．脑损伤大鼠脑细胞凋亡的提示：B组损伤区神经细胞凋亡数为28.41±4.37，与A组（5.31±1.36）相比具有统计学意义（P＜0.01）；C组、D组神经细胞凋亡数分别为12.18±3.52、11.54±2.07，均明显低于B组（均P＜0.01），且与A组比较均有统计学意义。D组凋亡细胞数较C组下降，且有统计学意义（P＜0.01）。4．脑损伤大鼠细胞因子（TNF、IL-2）的提示：脑损伤模型B组大鼠血清中IL-2、TNFα含量明显高于A组（P＜0.01），D组及C组IL-2、TNFα明显降低，但仍然高于A组（P＜0.05），而与B组比较则显着降低（P＜0.01）。结论：针刺治疗方法具有减轻创伤性脑损伤模型大鼠脑组织病理损伤程度，缩小坏死面积，抑制细胞凋亡，降低升高的细胞因子含量的作用，可能可以通过对IL-2、TNFα等细胞因子的调控，发挥其抗细胞凋亡的作用，保护神经细胞，减轻脑损伤继发性损害。
二、大鼠脑创伤后皮质Bax蛋白表达及神经细胞凋亡对运动功能影响的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠脑创伤后皮质Bax蛋白表达及神经细胞凋亡对运动功能影响的实验研究（论文提纲范文）
（1）下丘脑多巴胺受体参与手十二井穴刺络放血促进重型颅脑创伤大鼠苏醒的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 复制井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应平台 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验二 腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7 受体介导井穴放血促醒研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验三 井穴放血对下丘脑多巴胺受体表达的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 实验四 井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2 神经元兴奋性的调控研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 针刺促进急性中枢神经损伤后昏迷苏醒机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于PI3K/AKT信号通路研究电针对TBI大鼠脑神经细胞凋亡的调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语对照表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究内容及方法 |
| 3 研究技术路线 |
| 第一部分 电针对TBI大鼠行为学及病理形态学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及训练 |
| 2.2 TBI模型制备及PI3K/AKT通路的阻断 |
| 2.3 模型评价 |
| 2.4 电针治疗方案 |
| 2.5 实验取材 |
| 2.6 ELISA法检测血清中NSE含量变化 |
| 2.7 病理切片及HE染色 |
| 2.8 细胞凋亡检测(TUNEL一步法) |
| 2.9 数据统计与图像分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大鼠生命体征情况 |
| 3.2 行为学评价 |
| 3.3 脑组织病理形态学变化 |
| 3.4 血清中NSE变化 |
| 3.5 细胞凋亡变化的检测 |
| 4 小结 |
| 第二部分 电针对TBI大鼠脑细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及训练 |
| 2.2 TBI大鼠模型制备及评价 |
| 2.3 针刺治疗方案及动物取材 |
| 2.5 免疫荧光检测 |
| 2.6 Western-blot检测 |
| 2.7 图像处理与数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电针对TBI大鼠脑组织中促凋亡因子的影响 |
| 3.2 电针对TBI大鼠脑组织中抗凋亡因子的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 电针对TBI大鼠损伤脑组织中PI3K/AKT通路关键蛋白的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及训练 |
| 2.2 TBI模型制备及PI3K/AKT通路的阻断 |
| 2.3 电针治疗方案 |
| 2.4 实验取材 |
| 2.5 免疫荧光检测 |
| 2.6 Western-blot检测 |
| 2.8 实时定量PCR检测 |
| 2.9 图像处理与数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电针对TBI大鼠模型脑组织中PI3K表达的影响 |
| 3.2 电针对TBI大鼠模型脑组织中PDK1 表达的影响 |
| 3.3 电针对TBI大鼠模型脑组织中AKT表达的影响 |
| 3.4 电针对TBI大鼠模型脑组织中p-AKT表达的影响 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 颅脑损伤的研究 |
| 2 电针对TBI大鼠的治疗效应 |
| 3.电针对脑神经细胞凋亡相关蛋白的调控 |
| 4 电针对PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件1:综述一 PI3K/AKT信号通路介导细胞凋亡的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件2:综述二 电针治疗颅脑损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件3:TBI大鼠造模及治疗情况评估记录表 |
| 附件4:在读期间公开发表论文论着及所获课题科研成果 |
（3）右美托咪定通过SIRT1信号通路抑制创伤性脑损伤大鼠神经细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）甲酯化脂氧素A4对脑出血的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 甲酯化脂氧素A4对大鼠脑出血的神经保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 甲酯化脂氧素A4 对脑出血后NF-κB依赖的炎症和MMP-9 通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 甲酯化脂氧素A4对大鼠脑出血后线粒体凋亡途径的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 脂氧素在脑出血中神经保护作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 线粒体功能障碍在神经损伤中的作用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）富氢水对大鼠创伤性脑损伤神经保护相关机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 富氢水处理对大鼠创伤性脑损伤半暗带区脑组织的保护作用 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 富氢水对大鼠创伤性脑损伤损伤半暗带区脑组织TLR4 / MyD88 / NF-KB信号通路介导的炎症反应的影响 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 富氢水对大鼠创伤性脑损伤损伤半暗带区脑组织线粒体途径凋亡的影响 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的成绩 |
| 致谢 |
（6）不同时机针刺介入对TBI模型大鼠脑神经元的保护作用及机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语对照表 |
| 引言 |
| 研究路线图 |
| 第一部分 TBI大鼠模型动物制备的实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物及分组 |
| 2.2 动物模型制备步骤 |
| 2.3 模型评价手段 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 术后大鼠生命体征、神经功能及运动功能评价 |
| 3.2 光镜检测 |
| 3.3 电镜检测 |
| 3.4 血清中S100B、NSE变化的检测 |
| 3.5 免疫组化法检测脑组织中NGF、BDNF的表达变化 |
| 3.6 免疫组化法检测脑组织中BAX、BCL-2的表达变化 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 针刺不同时间点介入对TBI模型大鼠脑神经元NGF、BDNF蛋白及其相关MRNA的调节 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组及模型制备 |
| 2.2 针刺治疗方案 |
| 2.3 免疫组化检测 |
| 2.4 蛋白免疫印迹检测 |
| 2.5 荧光定量PCR检测 |
| 2.6 数据结果分析统计 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 病理切片结果与分析 |
| 3.2 免疫组化结果与分析 |
| 3.3 WESTERN-BLOT结果与分析 |
| 3.4 荧光定量PCR结果与分析 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 针刺不同时间点介入对TBI模型大鼠脑神经元BAX、BCL-2蛋白及其相关MRNA的调节 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组及模型制备 |
| 2.2 针刺治疗方案 |
| 2.3 免疫组化检测 |
| 2.4 蛋白免疫印迹检测 |
| 2.5 荧光定量PCR检测 |
| 2.6 数据结果分析统计 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 BAX、BCL-2蛋白免疫组化检测结果与分析 |
| 3.2 BAX、BCL-2蛋白WESTERN-BLOT结果与分析 |
| 3.3 BAX、BCL-2基因荧光定量PCR检测结果与分析 |
| 4. 小结 |
| 讨论 |
| 1. 中医学对TBI的认识 |
| 2. TBI动物模型的研究 |
| 3. S100B、NSE在脑损伤研究中的意义 |
| 4. 针刺治疗TBI的腧穴的选择依据 |
| 5. 针刺对TBI模型大鼠脑神经元生长的促进作用 |
| 6. 针刺对TBI模型大鼠脑神经元凋亡的调控作用 |
| 7. TBI后脑组织形态学改变及针刺对其影响 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件材料 |
| 附件1：综述一 |
| 参考文献 |
| 附件2：综述二 |
| 参考文献 |
| 附件3：在读期间公开发表论文论着及所获课题科研成果 |
（7）rhEPO对创伤性脑损伤保护作用的实验研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠重型颅脑损伤后EPO 及EPOR 变化趋势的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 rhEPO 促进颅脑创伤大鼠神经功能障碍改善的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 rhEPO 对大鼠创伤性脑损伤后神经细胞凋亡抑制的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）骨桥蛋白在大鼠脑创伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 OPN添加对大鼠脑创伤影响的实验研究 |
| 一、OPN对体外培养大鼠脑皮质细胞离心损伤影响的实验研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、OPN脑室内注射对LFP脑创伤大鼠影响的实验研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第二部分 OPN基因沉默对大鼠脑创伤影响的实验研究 |
| 一、OPN基因沉默对体外培养大鼠脑皮质细胞离心损伤影响的实验研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、OPN基因沉默对LFP脑创伤大鼠影响的实验研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 骨桥蛋白研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）黄体酮及其代谢产物对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 摘要 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 第一部分 黄体酮对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄体酮及其代谢产物对机械性神经元损伤的保护作用及其机制研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述正文 |
| 参考文献 |
| 在读期间的论文、专着、项目和奖励 |
| 致谢 |
（10）针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织损伤及细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 颅脑损伤机制的研究现状 |
| 一、钙代谢异常及其病理损害作用 |
| 二、神经递质及其受体系统异常改变 |
| 三、氧自由基反应参与损伤病理过程 |
| 四、颅脑损伤后炎症反应 |
| 五、血小板激活因子与外伤后继发损害 |
| 六、热休克蛋白与颅脑损伤 |
| 七、亚低温脑保护机制研究 |
| 第二节 颅脑损伤神经细胞凋亡及相关基因表达研究 |
| 一、颅脑损伤神经细胞凋亡研究 |
| 二、颅脑损伤细胞凋亡基因研究 |
| 第三节 中医学对脑损伤的认识 |
| 一、“脑”之论述 |
| 二、脑损伤认识 |
| 第四节 中医药治疗脑损伤研究现状 |
| 一、证治分型 |
| 二、药物治疗研究 |
| 第五节 针灸治疗脑损伤的研究现状与优势 |
| 一、抑制神经细胞凋亡 |
| 二、调控炎性细胞因子 |
| 三、保护损伤区域幸存神经元 |
| 四、促进神经修复及神经营养作用 |
| 五、改善机体功能 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织损伤的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二节 针刺对创伤性脑损伤大鼠脑细胞凋亡的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三节 针刺对创伤性脑损伤大鼠细胞因子(TNF、IL-2)的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、大鼠脑创伤后皮质Bax蛋白表达及神经细胞凋亡对运动功能影响的实验研究（论文参考文献）
- [1]下丘脑多巴胺受体参与手十二井穴刺络放血促进重型颅脑创伤大鼠苏醒的作用和机制研究[D]. 李威. 天津中医药大学, 2021(01)
- [2]基于PI3K/AKT信号通路研究电针对TBI大鼠脑神经细胞凋亡的调控机制[D]. 张容超. 成都中医药大学, 2020(01)
- [3]右美托咪定通过SIRT1信号通路抑制创伤性脑损伤大鼠神经细胞凋亡的研究[D]. 王艳雪. 昆明医科大学, 2019(06)
- [4]甲酯化脂氧素A4对脑出血的神经保护作用及其机制研究[D]. 宋亚琪. 河北医科大学, 2019(01)
- [5]富氢水对大鼠创伤性脑损伤神经保护相关机制的研究[D]. 付江泉. 苏州大学, 2018(04)
- [6]不同时机针刺介入对TBI模型大鼠脑神经元的保护作用及机理研究[D]. 郭新荣. 成都中医药大学, 2013(06)
- [7]rhEPO对创伤性脑损伤保护作用的实验研究[D]. 廖正步. 重庆医科大学, 2008(12)
- [8]骨桥蛋白在大鼠脑创伤中的作用研究[D]. 梁海乾. 天津医科大学, 2008(12)
- [9]黄体酮及其代谢产物对创伤性脑损伤后神经保护作用的机制研究[D]. 潘德生. 浙江大学, 2007(02)
- [10]针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织损伤及细胞凋亡的影响[D]. 夏静娴. 广州中医药大学, 2007(06)