一、mTOR信号通路及其与肿瘤的联系（论文文献综述）
曾毅[1]（2021）在《电针对FD模型大鼠mTOR信号通路调节Ghrelin机制研究》文中认为目的胃肠动力障碍是功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）最主要的病理生理基础。本研究以FD模型大鼠、mTOR基因敲除大鼠为研究对象,将电针（Electroacupuncture,EA）以及mTOR抑制剂作为干预措施,探讨电针对FD大鼠胃肠动力的影响,研究通过电针激活mTOR通路以调节FD大鼠Ghrelin的可能机制。方法随机挑选Sprague Dawley大鼠60只,雌雄各半,10周龄,体质量约200g。mTOR（-/-）KO大鼠F0代,SPF级,1雄,2雌,合笼扩繁,后繁殖用于正式实验的纯合子10只。60只SD大鼠随机分为6组:正常组、FD模型组、FD+药物组、FD+EA组、FD+EA+mTOR激动剂组和FD+EA+mTOR抑制剂组。20只mTOR（-/-）KO小鼠随机分为mTOR（-/-）KO+FD模型组和mTOR（-/-）KO+FD+EA治疗组。构建FD大鼠模型采用夹尾激惹刺激法+不规则饮食法,连续干预14d。药物组采用0.02g/m L西沙必利（2 m L/100g）灌胃治疗;电针干预组大鼠取“足三里”,用华佗牌无菌针灸针（25mm*0.25mm）垂直针刺入3-5mm,快速提插捻转至针下有如鱼上钩之沉涩感后接SDZ-IV型电针仪,一对电极分别连接双侧“足三里”针柄上,波型:连续波,频率:4 Hz,强度:2 m A,以大鼠肢体无明显不适及排斥感为度,每次刺激20min。激动剂组:腹腔注射L-leucine（0.45g/kg）后采用电针刺激“足三里”穴;抑制剂组:腹腔注射rapamycin（1mg/kg）后采用电针刺激“足三里”治疗。与此同时,正常组大鼠也同电针组进行束缚固定,但不给予电针干预。每组干预方式均日1次,每周6次,连续治疗2周共14d。观察各组大鼠干预前后一般情况并评分;测定各组大鼠胃内残留率和小肠推进率;HE染色观察各组大鼠下丘脑、胃窦及小肠组织形态结构;采用Real-time RT-PCR、Western Blot技术检测各组大鼠大鼠下丘脑、胃窦及小肠组织Ghrelin、GOAT、pre-Ghrelin、p-P70S6K、mTOR m RNA、mTOR、P70S6K、p4E-BP1、pe IF4E的m RNA蛋白表达及磷酸化表达变化;免疫荧光法观察mTOR/Ghrelin、P70S6K/Ghrelin的定位。结果1.14天造模完成后,大部分大鼠出现情绪低落、神疲体倦、食少体瘦、毛发枯槁、大便溏臭等消化不良的症状。2.日常行为学状况:电针组和药物组,FD大鼠进食、活动量明显增加,毛发恢复光泽,且电针组大鼠状态得到更为明显的改善。3.胃肠动力学改变:与正常组大鼠相比,模型组大鼠胃内残留率明显增加（P<0.01）,小肠推进率明显减低（P<0.05）;与模型组大鼠相比,药物组、电针组、激动剂组及抑制剂组FD大鼠胃内残留率明显减低（P<0.05）,小肠推进率明显升高（P<0.05）;与电针组相比,激动剂组胃内残留率明显增加,小肠推进率明显减低（P<0.05）,但电针组和抑制剂组的胃内残留率和小肠推进率之间的差异无统计学意义（P>0.05）。电针组、药物组大鼠的小肠推进率明显升高（P<0.01）,且电针组比药物组大鼠的小肠推进率更高,但两者之间的差异无统计学意义（P>0.05）。4.组织形态学改变（HE）:从下丘脑的病理变化来看,与正常组相比,FD模型组神经元数量减少,细胞大小形态改变,细胞核深染,呈空泡样改变。电针治疗可明显改善FD模型大鼠的上述病理改变。然而,在电针治疗的基础上,mTOR激动剂和抑制剂的使用分别导致下丘脑病变的加重和减轻。电针治疗对mTOR（-/-）KO FD模型大鼠下丘脑病理改变无明显缓解作用。在胃窦、小肠的病理改变方面,FD模型组胃黏膜变薄、破裂,胃基质充血。肠上皮细胞水肿,局灶性坏死,脱落,大量炎性细胞浸润。各组大鼠（EA或EA+药物）胃肠黏膜基本正常,仅出现轻度充血和炎症细胞浸润。同样,上皮细胞结构或多或少正常。而EA对mTOR（-/-）KO FD模型大鼠胃肠病理改变的缓解作用不明显。5.RT-PCR检查结果显示:与正常组大鼠相比,模型组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin和GOAT m RNA的表达水平明显下调（P<0.01,P<0.01）;与模型组大鼠相比,电针组及药物组大鼠胃窦、小肠中Ghrelin和GOAT m RNA的表达水平明显上调（P<0.01,P<0.01）;与药物组相比,电针组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin和GOAT m RNA表达水平均出现上调,但两组大鼠胃窦、小肠中Ghrelin m RNA表达水平差异具有统计学意义（P<0.01）,而两组大鼠胃窦、小肠中GOAT m RNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组大鼠相比,模型组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin m RNA的表达水平显着下调（P<0.05）,mTOR m RNA的表达水平显着上调（P<0.05）。与模型组大鼠相比,电针组和抑制剂组大鼠胃窦、小肠中Ghrelin m RNA的表达水平显着上调（P<0.05）,而其mTOR m RNA的表达水平显着下调（P<0.05）。与电针组相比,激动剂组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin m RNA的表达水平显着下降（P<0.05）,而mTOR m RNA的表达水平显着上调（P<0.05）;抑制剂组大鼠胃窦及小肠中mTOR m RNA的表达水平显着下降（P<0.05）。与正常组相比,FD模型大鼠下丘脑中mTOR、p70S6K m RNA水平显着升高,ghrelin、4EBP1、e IF4E m RNA水平显着降低（P均<0.01）。而电针处理显着降低了mTOR和p70S6K的m RNA水平,增加了ghrelin、4EBP1和e IF4E的m RNA水平（均P<0.01）。与FD+EA组相比,mTOR抑制剂在一定程度上进一步促进了电针治疗效果,而mTOR激动剂则相反（P均<0.01）。令人惊讶的是,电针处理可显着提高mTOR（-/-）KO FD模型大鼠Ghrelin m RNA表达（P<0.01）,但对mTOR信号通路下游靶点表达无影响。与正常组相比,FD模型大鼠胃窦和小肠中mTOR及其下游靶点（4EBP1、e IF4E、p70S6K）m RNA水平显着升高,Ghrelin m RNA水平显着降低（P均<0.01）。电针治疗可显着降低FD模型大鼠mTOR及其下游靶点（4EBP1、e IF4E、p70S6K）m RNA水平,而胃饥饿素（Ghrelin）m RNA水平升高（P均<0.01）。与FD+EA组相比,mTOR抑制剂在一定程度上进一步促进了电针治疗对各指标（ghrelin除外）的作用,而mTOR激动剂则相反（均P<0.01）。同样,电针治疗可显着提高mTOR（-/-）KO FD模型大鼠胃窦和小肠Ghrelin m RNA的表达（P<0.01）,但对mTOR信号通路下游靶点（4EBP1、e IF4E和p70S6K）无影响。6.Western blot检查结果显示:与正常组大鼠相比,模型组大鼠胃窦、小肠中Ghrelin和GOAT蛋白的表达量明显下降（P<0.01,P<0.01）;与模型组大鼠相比,电针组和药物组大鼠胃及小肠中Ghrelin和GOAT蛋白的表达量明显升高（P<0.01,P<0.01）;与药物组相比,电针组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin和GOAT蛋白的表达量均升高,但两组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）,两组大鼠胃窦及小肠中GOAT蛋白表达差异具有统计学意义（P<0.01）。与正常组大鼠相比,模型组大鼠胃中pre-Ghrelin蛋白的表达量显着下降（P<0.05）,p-P70S6K蛋白表达量显着升高（P<0.05）;与模型组大鼠相比、电针组、激动剂组及抑制剂组FD大鼠胃窦中pre-Ghrelin蛋白的表达量明显升高（P<0.05）,激动剂组大鼠胃窦中p-P70S6K蛋白表达量显着升高（P<0.05）,而抑制剂组大鼠胃窦中p-P70S6K蛋白的表达量显着下降（P<0.05）。与电针组相比,激动剂组大鼠胃窦中pre-Ghrelin蛋白表达显着下降（P<0.05）,而p-P70S6K蛋白的表达量显着上调（P<0.05）;抑制剂组大鼠胃窦中pre-Ghrelin蛋白表达量显着升高（P<0.05）,而p-P70S6K蛋白表达量显着下降（P<0.05）。与正常组相比,典型mTOR信号通路激活和低Ghrelin蛋白表达中观察到三种类型的组织在FD模型大鼠,主要表示的高表达p-mTOR和磷酸化的下游目标（p-4EBP1、p-e IF4E p-p70S6K）（P<0.01）。相应的,电针的干预显着提高了Ghrelin蛋白水平,而降低了mTOR信号的激活及其下游靶点的表达水平（P<0.01）。与FD+EA组相比,mTOR抑制剂在一定程度上进一步促进了电针治疗效果,而mTOR激动剂则相反（P均<0.01）。令人惊讶的是,电针干预可显着提高mTOR（-/-）KO FD模型大鼠胃饥饿素蛋白表达（P<0.01）,但对mTOR信号通路下游靶点（P-4ebp1、P-eif4e、P-p70s6k）的激活无影响。7.免疫荧光双标结果显示:大鼠胃窦及小肠窦组织mTOR/Ghrelin免疫荧光双标的结果,模型组大鼠胃窦及小肠组织中的mTOR阳性细胞数比例高于正常组大鼠,Ghrelin阳性细胞数比例低于正常组大鼠,说明造模可以促进大鼠胃窦及小肠组织中mTOR蛋白的表达,Ghrelin蛋白的表达受到抑制。电针组大鼠胃窦及小肠组织中的mTOR阳性细胞数比例低于模型组大鼠,Ghrelin阳性细胞数比例高于模型组大鼠,说明电针可以抑制大鼠胃窦及小肠组织中mTOR蛋白的表达,促进Ghrelin蛋白的表达。mTOR抑制剂+电针组大鼠胃窦及小肠组织中的mTOR阳性细胞数比例高于正常组大鼠低于模型组,Ghrelin阳性细胞数比例远低于模型组大鼠,说明mTOR抑制剂可以促进大鼠胃窦及小肠组织中mTOR蛋白的表达,抑制Ghrelin蛋白的表达,mTOR激动剂+电针组取得与其相反发作用;mTOR抑制剂+电针组大鼠胃窦及小肠组织中的mTOR阳性细胞数比例高于电针组大鼠,Ghrelin阳性细胞数比例低于电针组大鼠,说明电针对大鼠胃窦及小肠组织中mTOR蛋白表达的抑制作用及对Ghrelin蛋白表达的促进作用可以被mTOR抑制剂阻断;mTOR（-/-）KO+FD+EA较mTOR（-/-）KO+FD组相比大鼠胃窦及小肠组织中Ghrelin阳性细胞数明显增高,表明电针治疗可增加大鼠胃窦及小肠组织中Ghrelin分泌。大鼠胃及小肠组织P70S6K/Ghrelin免疫荧光双标的结果,模型组大鼠胃窦及小肠组织中的P70S6K阳性细胞数比例高于正常组大鼠,Ghrelin阳性细胞数比例低于正常组大鼠,说明造模可以促进大鼠胃窦及小肠组织中P70S6K蛋白的表达,抑制Ghrelin蛋白的表达。电针组大鼠胃窦及小肠组织中的P70S6K阳性细胞数比例低于模型组大鼠,Ghrelin阳性细胞数比例高于模型组大鼠,说明电针可以抑制大鼠胃窦及小肠组织中P70S6K蛋白的表达,促进Ghrelin蛋白的表达。mTOR抑制剂+电针组大鼠胃窦及小肠组织中的P70S6K阳性细胞数比例高于模型组大鼠,Ghrelin阳性细胞数比例低于模型组大鼠,说明mTOR抑制剂可以促进大鼠胃窦及小肠组织中P70S6K蛋白的表达,但Ghrelin蛋白的表达无影响;mTOR激动剂与mTOR抑制剂相反作用;mTOR（-/-）KO+FD+EA较mTOR（-/-）KO+FD组相比大鼠胃窦及小肠组织中Ghrelin阳性细胞明显增加,但P70S6K阳性细胞数无明显差异,说明电针治疗可显着提高mTOR（-/-）KO FD模型大鼠胃窦和小肠Ghrelin的表达,但对mTOR信号通路下游靶点p70S6K无影响。结论1.通过对大鼠日常行为、胃肠动力及胃肠组织形态学观察分析,夹尾激惹刺激法+不规则饮食法,能够成功构建FD大鼠模型。2.电针干预能够有效改善FD大鼠的日常行为学和促进胃肠动力,并且电针干预是安全可靠的。3.电针可以促进FD大鼠胃窦及小肠组织中Ghrelin、GOAT、P70S6K、4EBP1、e IF4E蛋白及m RNA的表达,可以抑制胃窦及小肠组织中mTOR蛋白及m RNA的表达,这可能是电针对FD治疗的作用机制。4.电针对FD大鼠日常行为及胃肠动力的改善作用被mTOR激动剂阻断,电针对FD大鼠胃窦及小肠组织中Ghrelin蛋白及m RNA表达的促进作用被mTOR激动剂阻断,说明电针对FD大鼠的干预作用可能是通过mTOR通路来发挥作用,mTOR（-/-）KO大鼠实验组进一步印证此推论。
张初琴[2]（2021）在《慢性间歇性低氧状态mTOR/NF-κB通路参与BDNF介导的大鼠海马原代神经元突触可塑性调控及机制》文中指出阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS）是指睡眠时由于上气道反复塌陷阻塞导致呼吸暂停或低通气,引起间歇性低氧血症、夜间觉醒、白天嗜睡以及认知功能障碍等症状和体征[1]。一项大规模的Mete分析显示,OSAHS在男女的发病率分别为4～29%和2～9%[2],其中重度OSAHS分别为49.7%和23.4%,且发病率与日俱增[3]。国内外很多文献报道,OSAHS可引起认知障碍,主要表现在注意力、记忆力和执行力下降等[4-6]。Friedman等研究发现,伴认知损害的OSAHS儿童在扁桃体腺样体术后可恢复正常,提示儿童的认知损害是可逆的[7];而成人,即使得到持续、正规的CPAP治疗或手术后仍不能完全逆转认知障碍[7,8]。因此,OSAHS相关认知功能障碍的机制研究是当下的研究热点。OSAHS的发病可能与慢性的间歇性缺氧（intermittenthypoxia,IH）有关,IH是一种反复的低氧/复氧模式,类似于大脑的缺血/再灌注（ischemia reperfusion,IR）,可导致海马、大脑皮层等处神经元的凋亡及大脑损害[9]。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是一种神经营养因子,在神经生长和分化过程中起关键作用,能够敏锐地调节突触传递和可塑性[10]。早先的研究发现在大脑和脊髓的IR状态下,BDNF表达升高,以保护神经元[11];小鼠经短时间缺氧处理后的其海马中BDNF水平显着降低[12];然而一项周期较长的IH研究中,海马BDNF的表达增强了[13];在另一项较不严重的每日间歇性缺氧范式也增加了 BDNF在脊髓中的表达[14]。这些结果表明,缺氧/再氧循环的数量和频率可能是影响BDNF表达的主要因素。那么,IH条件下,是什么信号通路来调节BDNF的表达和释放从而调控突触的可塑性?这些需要更为深入的探讨。既往研究表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路及其下游因子核转录因子（nuclearfactorkappa-B,NF-κB）对维持神经系统正常生理功能,尤其是对学习和认知功能起着至关重要的作用[15]。NF-κB作为一种重要的转录因子,可调节许多参与免疫及炎症反应的因子表达,包括:肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 β,IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、环氧合酶 2（cyclooxygenase-2,COX-2）、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等。其调节的促炎症因子与BDNF的表达密切相关。有文献报告,IL-1β可减少BDNF的表达[16],也可导致BDNF信号传导受损[17]。在这项研究中,我们应用了循环的低氧三元气体（1.5%O2+5%CO2+93.5%N2）和正常氧三元气体（21%O2+5%CO2+74%N2）建立大鼠海马神经元（hippocampus neurons,HN）的IH细胞模型和动物模型,分别在细胞和动物水平上,以mTOR/NF-κB信号通路为切入点,检测IH环境下该通路关键信号分子NF-κB、NF-κB的抑制蛋白亚基α（inhibitor of NF-κB α,IκBα）、IκB的抑制蛋白亚基β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β,IKKβ）及促炎症因子（TNF-α,IL-1β）、突触相关蛋白（突触后致密蛋白 95,postsynaptic density Protein 95,PSD-95;突触小泡蛋白,synaptophysin,SYN）的表达;然后采用mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin,Rapa）和NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）分别抑制 mTOR 和 NF-κB,观察以上信号分子的变化,阐明IH中mTOR/NF-κB信号通路参与突触可塑性的调控,为OSAHS导致认知障碍的发病机制研究提供一个新思路。研究目的（1）建立IH的细胞和动物模型,分别从细胞和动物水平阐明IH对HN的影响。（2）采用Rapa和PDTC分别抑制mTOR和NF-κB,阐明mTOR/NF-κB信号通路对BDNF介导的HN突触可塑性的调节作用,明确在慢性IH环境态下突触的可塑性损伤机制。（3）基于mTOR/NF-κB信号通路对BDNF表达的调控,阐明褪黑素改善慢性IH所致海马突触可塑性损伤的作用机制,为OSAHS的防治提供新的思路。研究方法第一部分细胞水平（1）采用免疫荧光染色鉴定原代HN,光镜及电镜观察不同状态下的突触超微结构的变化。（2）原代HN分别在IH和持续性低氧（congtinue hypoxia,CH）培养,光镜观察不同状态下的突触变化,用免疫印迹法（western blotting,WB）检测BDNF、SYN和PSD-95的蛋白水平。（3）经PDTC预处理后,原代HN在IH环境中培养18小时,采用实时定量 PCR（realtime PCR,RT-PCR）检测 NF-κB、IL-1β、TNF-α以及 BDNF、突触相关蛋白SYN和PSD-95的mRNA水平,用WB检测神经元细胞中NF-κB、IL-1β及TNF-α蛋白以及BDNF、SYN和PSD-95的表达情况。（4）经Rapa预处理后,HN原代HN在IH环境中继续培养18小时,用RT-PCR检测检测IKβ、IκBα和NF-κB的mRNA水平;用WB检测HN细胞中BDNF、IKKβ、IκBα和NF-κB蛋白的表达情况。第二部分动物水平（1）莫里斯（Morris）水迷宫实验评估Rapa和PDTC对大鼠学习和记忆能力的影响,并利用H&E染色检测Rapa和PDTC对海马的保护作用;（2）随机分组,药物组分别给予一定浓度的Rapa和PDTC,IH环境饲养8周,WB法检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB等蛋白的表达情况;采用RT-PCR检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB的mRNA水平。（3）给予一定浓度的褪黑素（melatonim,MT）,IH环境饲养8周,WB法检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB等蛋白的表达情况;采用RT-PCR检测大鼠海马组织中IKKβ、IκBα、BDNF和NF-κB的mRNA水平。结果第一部分细胞水平（1）原代培养的HN经免疫荧光染色鉴定纯度达90%以上。（2）暴露在IH环境后,原代HN明显皱缩,胞核严重变形,预处理Rapa和PDTC可以改善这些现象。（3）CH和IH处理后BDNF、PSD-95和SYN蛋白水平的明显降低,这一影响在IH条件下比CH条件下更明显。（4）IH 组中 NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平升高,BDNF、PSD-95、SYN表达水平降低,而Rapa、PDTC预处理后可以对抗这种变化。（5）IH引起IκBα和IKKβ表达被抑制,PDTC预处理组无明显变化,而Rapa预处理组明显升高。第二部分动物水平（1）Morris水迷宫实验结果表明暴露在IH条件下,在训练的第2、3、4、5d,大鼠平台穿越的潜伏期和通路长度均增加,平台穿越时间降低,在Rapa或PDTC干预后,这种趋势被抑制。（2）IH暴露导致神经元萎缩、坏死,排列紊乱,而IH+Rapa组和IH+PDTC组较单纯IH组海马损伤明显减轻。（3）IH 组中 NF-κB、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平升高,BDNF、PSD-95、SYN表达水平降低,而Rapa、PDTC预处理后可以对抗这种变化。（4）IH引起IκBα和IKKβ表达被抑制,PDTC预处理组无明显变化,而Rapa预处理组明显升高。（5）MT预处理后,IH状态下NF-κB蛋白和mRNA水平升高和BDNF、PSD-95和SYN下降的的趋势明显降低。结论1、IH较CH更易导致大鼠原代海马神经元的突触可塑性受损。2、IH导致海马组织受到损害而影响大鼠的学习与记忆。3、PDTC和Rapa预处理后可以改善IH诱导的海马神经元损伤,表明mTOR/NF-κB信号通路通过调控BDNF参与慢性IH状态下海马神经元突触可塑性的调节。4、PDTC、Rapa和MT可逆转IH诱导的海马神经元损伤,可为今后以mTOR、NF-κB、BDNF为作用靶点,设计、合成新型MT衍生物,为OSAHS的认知功能损害防治提供新的思路。意义1、在慢性IH环境下,通过分别抑制mTOR和抑制NF-κB,从细胞及动物水平阐明mTOR/NF-κB信号通路参与BDNF介导的突触可塑性下降,最终导致认知功能损伤的作用机制。2、基于mTOR调控的IKKβ/IκB/NF-κB信号通路对BDNF表达的调控,阐明MT改善慢性IH导致突触可塑性损伤的作用机制。
李妍[3]（2021）在《S100A10调控胃癌转移和增殖的机制研究》文中指出研究背景:胃癌是世界上发病率最高的癌症之一,胃癌的复发率高,预后较差。近年来,随着人们健康意识的增强和内镜技术的发展,早期胃癌的诊断率大大提高。没有发生淋巴结转移的早期胃癌患者可通过内镜下切除达到治愈性治疗,而胃癌一旦发生淋巴结转移,则只能通过外科手术进行切除,病人的预后和生存质量均较差。胃癌发生淋巴转移的前提条件是胃癌细胞不断增殖突破基底膜限制,向下浸润性生长,诱导淋巴管内皮细胞迁移至肿瘤细胞周围,形成新的毛细淋巴管,然后胃癌细胞与淋巴管内皮细胞紧密黏附,侵入淋巴管腔,到达淋巴结,进而形成远处转移。因此,深入揭示胃癌淋巴转移的分子机制,鉴定新的治疗靶点,是当前转化医学研究的热点。胃癌作为一种实体肿瘤,随着瘤体的不断增大,为了满足自身快速增殖的需求,肿瘤细胞常改变其能量代谢方式,由正常的氧化磷酸化转变为有氧糖酵解。糖酵解的中间产物也为肿瘤细胞快速合成腺苷酸和脂质等生物大分子提供了必要的物质基础,进而促进肿瘤细胞的无限增殖。此外,糖酵解产生的大量乳酸能够促使肿瘤微环境酸化,促进肿瘤细胞浸润转移和免疫逃逸。深入了解肿瘤细胞有氧糖酵解的调控机制,选取合适的靶点进行新药开发,具有深远的应用背景。近年来,随着人类基因组学和转录组学的不断发展,很多异常表达的癌基因被发现与肿瘤的转移密切相关。对胃癌早期发生发展过程中的某些异常表达的分子进行挖掘,进而开发新的具有重要临床价值的分子标志物,是肿瘤研究领域的热点。S100A10,作为钙结合蛋白家族S100的一员,参与体内多种生理病理过程,例如胞吞胞吐、纤溶酶生成、信号转导和细胞增殖等。近来也有研究表明S100A10的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关,如胰腺癌、卵巢癌和肝癌等。在胃癌的淋巴结转移灶中,S100A10也存在异常高表达。但是它在胃癌淋巴转移和恶性增殖中的具体作用及调控机制尚无详细研究。因此,本研究分为三个部分,对S100A10在早期胃癌组织中的异常表达、S100A10促进胃癌转移的机制以及S100A10通过调控糖酵解促进胃癌增殖的机制进行研究。第一部分S100A10在早期胃癌组织中的表达及其临床意义研究目的:1.分析S100A10在Oncomine、TCGA数据库以及临床收集的样本组织中的表达情况。2.分析S100A10在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达情况。3.分析S100A10与早期胃癌临床病理学参数的相关性。研究方法:1.通过Oncomine数据库、TCGA数据库、UALCAN网站分析S100A10在大规模癌症样本组织中的表达情况,并通过Kaplan-Meierplotter数据库分析S100A10在胃癌中的预后价值。2.使用实时定量PCR（RT-qPCR）检测S100A10在17例正常胃粘膜组织、23例萎缩性胃炎组织、17例早期胃癌组织以及24例进展期胃癌组织中的表达情况。3.使用免疫组化检测S100A10在92例早期胃癌组织石蜡切片的表达情况,并收集患者的临床病理资料,分析S100A10与临床病理学参数的相关性。研究结果:1.生物信息学分析显示S100A10在胃癌组织中的表达量显着高于正常胃黏膜组织。Kaplan-Meierplotter数据库显示S100A10高表达的胃癌患者预后不良。2.RT-qPCR结果显示S100A10在胃癌组织中的表达量显着高于其在正常胃黏膜组织和萎缩性胃炎组织中的表达量,而S100A10在早期胃癌组织和进展期胃癌组织中的表达量无统计学差异。3.免疫组化结果显示,S100A10在正常胃黏膜组织、未发生淋巴结转移的早期胃癌组织、发生淋巴结转移的早期胃癌组织中呈递增式表达。S100A10与早期胃癌的肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期和脉管浸润密切相关。结论:S100A10在早期胃癌组织中即存在着较高水平的表达,尤其是在发生淋巴结转移的早癌组织。S100A10的高表达与早期胃癌的淋巴结转移、肿瘤直径和肿瘤分期等密切相关。S100A10是一个有价值的生物标志物,对预测早期胃癌的淋巴结转移有重要的提示作用。第二部分S100A10促进胃癌转移的机制研究研究目的:1.探究S100A10在胃癌中的生物学功能。2.探究S100A10上游调控机制。3.探究S100A10参与调控的下游信号通路。4.探究体内条件下靶向抑制S100A10的表达对胃癌生长和转移的影响。研究方法:1.S100A10在胃癌中的生物学功能在胃癌细胞中过表达或敲低S100A10后,利用Transwell实验检测S100A10对胃癌细胞转移和浸润能力的影响,并利用Western blot实验检测S100A10对胃癌细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响;利用CCK8、EdU和平板克隆实验检测S100A10对胃癌细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测S100A10对胃癌细胞凋亡能力的影响。收集细胞上清培养人淋巴管内皮细胞（human lymphatic vessel endothelial cell,HLEC）,观察S100A10对HLEC小管形成能力和转移能力的影响,并通过Western blot实验和酶联免疫标记实验（ELISA）检测细胞上清中人血管生成因子C（VEGF C）的蛋白表达及分泌水平;通过内皮细胞黏附实验检测S100A10对胃癌细胞与HLEC黏附能力的影响。2.S100A10的上游调控机制研究（1）为研究S100A10的上游调控机制,利用Ensembl数据库查询S100A10转录起始位点上游2000bp的启动子区域序列,并通过双荧光素酶实验确定核心启动子区。利用生物信息学软件预测可能与S100A10核心启动子区结合的转录因子,并通过双荧光素酶实验、Western blot实验和染色质免疫共沉淀（ChIP）实验验证转录因子对S100A10的调控作用。（2）通过Transwell实验和CCK8实验检测c-Jun过表达对胃癌细胞迁移浸润和增殖能力的影响,免疫组化实验检测胃癌组织中c-Jun的表达情况。3.S100A10的下游调控信号通路的研究（1）Western blot实验检测S100A10对下游信号通路Src/ANXA2/AKT/mTOR信号通路的调控作用,以及对下游效应分子VEGF C、E-Cadherin和c-Jun的影响。（2）在过表达S100A10的胃癌细胞中,加入AKT通路抑制剂MK-2206,观察MK-2206是否能逆转S100A10介导的胃癌细胞的恶性表型。4.靶向抑制S100A10的表达对胃癌细胞在体内生长和转移的影响（1）将胃癌细胞种植到裸鼠皮下,随后定期向瘤体内多点注射干扰慢病毒LV-shS100A10及对照慢病毒LV-NC,定期记录瘤体的生长曲线以及实验终点时瘤体重量的差异。（2）提取瘤体组织的蛋白,Western blot实验检测S100A10下游信号通路相关分子的表达情况。（3）利用慢病毒系统构建S100A10稳定敲低细胞系,进行尾静脉注射,观察裸鼠肺转移灶的形成。研究结果:1.S100A10促进胃癌细胞的恶性生物学行为胃癌细胞过表达S100A10后,胃癌细胞的转移、浸润、增殖能力明显提高,细胞凋亡能力被抑制,诱导EMT的发生。而干扰S100A10表达后,胃癌细胞的迁移、浸润、增殖能力明显下降,细胞凋亡数增多。过表达S100A10的胃癌细胞通过诱导VEGF C的分泌,从而促进HLEC的迁移和淋巴管新生。过表达S100A10的胃癌细胞与HLEC的黏附能力也增强。2.c-Jun与S100A10的核心启动子区域结合并激活S100A10转录双荧光素酶实验证明转录因子c-Jun可与S100A10的核心启动子区结合,并促进S100A10的转录。胃癌细胞过表达c-Jun后,细胞的迁移、浸润和增殖能力明显增强。3.S100A10通过激活Src/ANXA2/AKT/c-Jun正反馈环路发挥作用（1）S100A10的异常高表达会激活Src激酶,诱导ANXA2磷酸化,进而激活AKT/mTOR信号通路,c-Jun作为AKT信号通路的下游分子促进胃癌细胞的迁移浸润,由此构成正反馈环路加速胃癌细胞的转移和增殖。（2）AKT通路抑制剂MK-2206可以逆转S100A10介导的胃癌细胞的恶性表型,抵消S100A10对胃癌细胞迁移、浸润和增殖的促进作用。4.靶向抑制S100A10的表达阻碍胃癌细胞在体内的生长和转移（1）裸鼠荷瘤实验结果显示瘤体内多点注射LV-shS100A10慢病毒抑制Src/ANXA2/AKT信号通路的激活,进而抑制瘤体的生长和局部浸润。（2）S100A10稳定敲低组裸鼠肺转移灶的数量及大小均显着低于对照组。结论:C-Jun可激活S100A10转录,从而上调S100A10在胃癌细胞中的表达。S100A10激活Src/ANXA2/AKT/mTOR信号通路,促进下游c-Jun和VEGF C表达,形成正反馈环路诱导胃癌的淋巴转移。第三部分S100A10通过调控糖酵解促进胃癌增殖的机制研究研究目的:1.探究S100A10对胃癌细胞有氧糖酵解的调控作用。2.探究S100A10调控胃癌细胞有氧糖酵解的分子机制。研究方法:1.S100A10对胃癌细胞有氧糖酵解的调控作用（1）通过GEPIA数据库分析和RT-qPCR实验检测S100A10对糖酵解相关分子表达水平的影响。（2）有氧糖酵解测定包括:检测葡萄糖消耗量和葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达;检测乳酸生成量和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性及表达水平;检测腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）的生成量;检测细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。2.S100A10调控糖酵解参与的信号通路研究利用Western blot实验检测S100A10过表达或敲低后mTOR信号通路的变化。并进一步检测加入mTOR通路抑制剂雷帕霉素和LDHA抑制剂GSK-2837808A是否可以阻断S100A10介导的糖酵解恶性表型。3.体内荷瘤实验验证过表达S100A10对于胃癌细胞生长的影响以及雷帕霉素的抑制作用构建S100A10过表达及空白对照的胃癌稳筛细胞系并注射到裸鼠腋窝皮下,待瘤体长出后,定期注射雷帕霉素或PBS,记录肿瘤大小变化。剥离瘤体提取蛋白,Western blot实验验证瘤体组织中S100A10及下游信号通路相关分子的蛋白表达情况。研究结果:1.GEPIA分析及RT-qPCR结果显示S100A10的表达与糖酵解关键分子的表达密切相关。2.S100A10促进GLUT1的表达从而增加葡萄糖消耗,并能增加乳酸脱氢酶的活性和LDHA的表达从而促进乳酸的生成。干扰S100A10的表达能恢复氧化磷酸化从而增加ATP的生成。3.S100A10通过激活mTOR通路促进胃癌细胞糖酵解,在S100A10过表达的胃癌细胞中加入雷帕霉素和GSK-2837808A,胃癌细胞的增殖能力下降,葡萄糖消耗和乳酸生成量明显降低,ATP生成增多。4.皮下荷瘤实验证明S100A10过表达组的肿瘤体积和瘤体重量高于对照组,而定期注射雷帕霉素可以有效抑制S100A10介导的胃癌恶性生长。结论:S100A10通过激活mTOR通路促进有氧糖酵解,加速胃癌细胞的快速增殖,这一促进作用可被雷帕霉素抑制,从而阻碍胃癌细胞的恶性增殖。
孙满强[4]（2021）在《基于网络药理学的丹参提取物对非小细胞肺癌的作用及其机制研究》文中研究指明研究背景:2020年中国的癌症新发病例中,肺癌发病率和死亡率均排第一名,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的最主要类型。大量的中药被用于肿瘤治疗,丹参首载于《神农本草经》,具有益气活血的功效,常用来治疗症瘕积聚等疾病。临床研究表明,丹参及其相关制剂具有联合放化疗增效减毒的作用,但是其具体作用机制仍不明确,限制丹参的临床应用和药品研发。研究目的:本课题组前期国家自然科学基金项目（No.81403250）研究发现丹参酮ⅡA磺化钠注射液可通过下调Twist基因表达抑制Lewis肺癌细胞的上皮间质转化过程。但由于丹参酮ⅡA磺化钠注射液杂质过多、毒性较强等综合因素,难以明确发挥作用的物质成分和作用机制,而且Lewis肺癌细胞来源于C57BL小鼠,并非人源性肺癌细胞。因此本研究采用网络药理学的方法分析并筛选丹参抗肿瘤的活性成分和可能的作用机制,并以人源肺腺癌细胞作为研究对象进行细胞实验和动物实验。研究内容与方法:本文研究内容分为三部分,第一部分是通过网络药理学筛选活性成分和抗NSCLC的分子靶点。方法为:通过TCMSP数据库查询丹参的活性成分,依据ADME（OB≥30%,DL≥0.18,Caco-2≥-0.4,BBB≥-0.3）原则进行筛选,结果表明丹参酮 ⅡA（Tanshinone ⅡA,Tan ⅡA）的度值（degree）最高。采用 Swiss Target Prediction 和 PharmMapper 数据库预测 Tan ⅡA 的作用靶点,采用 DisGeNET、GeneCards、OMIM、DrugBank数据库预测NSCLC疾病靶点。将两个数据集进行映射处理,筛选重复靶点,构建“TanⅡA—NSCLC—靶点”数据集,并导入String数据库,构建蛋白互作（Protein-Protein Interreaction,PPI）网络,将 PPI 网络导入 Cytoscape 3.5.1 软件中,通过Network Analyzer（Cytoscape内置插件）进行网络拓扑参数分析计算。获取网络信息,包括节点度、中介中心性、接近中心性,采取以上三个信息的中位数作为卡值筛选核心靶点。采用Metascape作为核心靶点的注释分析工具,分析TanⅡA抗NSCLC的主要生物过程和信号通路。第二部分是通过细胞实验对网络药理学分析出的生物过程和信号通路进行验证。方法为:细胞实验以A549细胞作为NSCLC的模型,通过CCK-8实验、葡萄糖摄入实验、ATP含量实验、乳酸含量实验、划痕实验、Transwell实验、透射电镜、流式细胞术、荧光探针检测,观察Tan ⅡA对细胞增殖、有氧糖酵解代谢、细胞侵袭转移、细胞凋亡的影响。通过Western Blot、PCR、ELISA实验观察TanⅡA对网络药理学分析出的生物过程和信号通路的分子调控。第三部分是通过动物实验探究TanⅡA的抗肿瘤作用。方法为:以Balb/c裸鼠A549细胞皮下移植瘤作为模型,分为模型组、顺铂组、TanⅡA低剂量组（TanⅡA-L）和TanⅡA高剂量组（TanⅡA-H）,药物干预方式均为腹腔注射。药物干预28天后,观察对裸鼠体重变化、肿瘤体积变化和肿瘤重量的影响,通过HE染色观察肿瘤的病理组织情况和肺部转移情况,通过免疫组化染色观察药物对上述分子机制的调控。研究结果:1.网络药理学研究结果表明,Tan ⅡA抗NSCLC的主要作用机制有葡萄糖摄入调控、葡萄糖代谢过程、细胞凋亡过程、细胞迁移过程、缺氧刺激反应的生物过程和PI3K/AKT/mTOR、HIF-1α、VEGF 和 Bcl-2/Bax/Cleaved-Caspase 3 等信号通路。2.细胞实验中CCK-8实验结果表明,TanⅡA对A549细胞的毒性呈剂量依赖关系,随着药物浓度增高,细胞活力逐渐下降,Tan ⅡA作用于A549细胞48h的IC50=4.19μg/ml。3.细胞实验中有氧糖酵解代谢相关实验表明,与0.1%DMSO组相比,TanⅡA 1μg/ml组、Tan ⅡA2μg/ml组、Tan ⅡA 4μg/ml组的葡萄糖摄入量、ATP产量和乳酸产量均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.01）。4.细胞实验中划痕实验和Transwell实验结果表明,与0.1%DMSO组相比,TanⅡA 1μg/ml组、Tan ⅡA 2μg/ml组和Tan ⅡA 4μg/ml组的细胞迁移距离和转移至小室下壁的细胞数目均显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。5.细胞实验中透射电镜结果表明,与0.1%DMSO组相比,Tan ⅡA使A549细胞发生了不同程度的凋亡,可见染色质出现破碎,并聚集浓缩成块状、团状;细胞质出现浓缩、体积变小;细胞膜表面出现大量小空泡或小泡样突起。6.细胞实验中线粒体膜电位JC-1流式细胞术实验结果表明,与0.1%DMSO组相比,Tan ⅡA 1 μg/ml 组、Tan ⅡA 2μg/ml 组和 Tan ⅡA4μg/ml 组的 FL2/FL1 均显着减少,差异有统计学意义（P<0.01）。7.细胞实验中线粒体通透性转化孔MPTP荧光检测实验结果表明,与0.1%DMSO组相比,Tan ⅡA 1μg/ml组、Tan ⅡA 2μg/ml组和Tan ⅡA 4μg/ml组的平均光密度值均显着减少,差异有统计学意义（P<0.01）。8.细胞实验中Western Blot和ELISA实验结果表明,与0.1%DMSO组相比,TanⅡA 1μg/ml 组、Tan ⅡA 2μg/ml 组和 Tan ⅡA 4μg/ml 组的PI3K、P-AKT/AKT、P-mTOR/mTOR、HIF-1α、GLUT1、HK2、PKM2、LDHA、MMP-9、VEGF-A、Bcl-2 的蛋白表达显着减少,Bax和Cleaved Caspase 3的蛋白表达显着增多,差异有统计学意义（P<0.01）。9.细胞实验中PCR结果表明,与0.1%DMSO组相比,Tan ⅡA 1μg/ml组、TanⅡA 2μg/ml 组和 Tan ⅡA 4μg/ml 组的 GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 的 mRNA 表达显着减少,差异有统计学意义（P<0.01）。10.动物实验中裸鼠体重结果表明,与模型组相比,顺铂组裸鼠的体重显着减小,差异有统计学意义（P<0.01）,而Tan ⅡA-L组和Tan ⅡA-H组未见体重减轻,无统计学差异（P>0.05）。11.动物实验中裸鼠皮下移植瘤体积结果表明,与模型组相比,顺铂组、Tan ⅡA-L组和Tan ⅡA-H组裸鼠的肿瘤体积显着减小,差异有统计学意义（P<0.05）。12.动物实验中肿瘤抑瘤率结果表明,顺铂组的抑瘤率为50.18%,Tan ⅡA-L组的抑瘤率为22.26%,Tan ⅡA-H组的抑瘤率为37.40%。比较各组裸鼠的肿瘤重量,与模型组相比,顺铂组、Tan ⅡA-L组和Tan ⅡA-H组的肿瘤重量显着减少,差异有统计学意义（P<0.01）。13.动物实验中肺脏HE染色结果表明,模型组的肺脏出现肿瘤细胞转移的情况,肿瘤细胞结构紧密但是排列无序,其周围的纤维组织遭到破坏。实验组并未发现癌细胞转移的情况,镜下观察主要为正常肺脏组织,其结构疏松且肺泡细胞排列有序。14.动物实验中肿瘤HE染色结果表明,模型组肿瘤细胞生长状态良好,大小不一,呈类圆形或圆形,细胞核染色较深,分布均匀,排列紧密,呈条索状或腺状结构。实验组的细胞呈不同程度的弥散分布,部分组织出现碎片状干酪样坏死或模糊不清的现象。15.动物实验中肿瘤免疫组化结果表明,与模型组相比,顺铂组、Tan ⅡA-L组和TanⅡA-H 组的 PI3K、P-AKT、P-mTOR、HIF-1α、GLUT1、HK2、PKM2、LDHA、MMP-9、VEGF-A、Bcl-2蛋白表达量显着减少,Bax和Cleaved Caspase 3的蛋白表达显着增多,差异有统计学意义（P<0.05）。研究结论:网络药理学为中医药现代化研究提供了新的研究方法,丹参酮ⅡA作用于人肺腺癌A549细胞的体外试验和体内实验结果,验证了网络药理学对丹参酮ⅡA作用于非小细胞肺癌的生物过程和信号通路的预测结果。丹参酮ⅡA主要通过抑制非小细胞肺癌的有氧糖酵解过程,进一步抑制肿瘤的增殖、侵袭和转移,同时诱导细胞的凋亡发生。其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路和HIF-1α转录因子,进而下调有氧糖酵解过程葡萄糖转运蛋白GLUT1和糖酵解限速酶HK2、PKM2、LDHA的表达,进一步下调肿瘤转移相关分子VEGF-A、MMP-9和抗凋亡因子Bcl-2的表达,上调促凋亡因子Bax 和 Cleaved-Caspase 3 的表达有关。除此之外,部分文献报道活血化瘀药物具有促进肿瘤转移的作用,动物实验部分的肺部HE染色结果表明,丹参酮ⅡA可抑制皮下移植瘤的肺部转移,结合免疫组化结果,丹参酮ⅡA可抑制肿瘤的VEGF-A和MMP-9蛋白表达。本研究表明了丹参酮ⅡA作为活血化瘀药物丹参的提取物具有抑制肿瘤转移的作用。
陈琼锋[5]（2021）在《磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究》文中研究指明背景与目的:原发性肝癌是临床常见的一种恶性肿瘤,其中75%至85%的原发性肝癌为肝细胞癌。肝细胞癌的主要危险因素是肝炎病毒感染,由于全球对肝炎病毒的传染控制力度加大,使其发病率保持稳定,但肝癌的死亡率却在逐年上升,主要原因是分子机制多样性和不确定性,难以实施靶向治疗。Akt作为肿瘤生长的重要分子,受促癌因子和癌基因的调控,他的生物学功能与mTORC1和mTORC2的参与密不可分。一方面,Akt的许多生物学功能由mTORC1介导,后者磷酸化S6K1,调节蛋白质合成;另一方面,Akt与血清葡萄糖激酶（SGK）和蛋白激酶C（PKC）一样作为底物,其活性受mTORC2调节。研究发现,PEBP4在许多癌组织中上调,并发挥促癌作用;另外,有报道显示PEBP4与Akt结合并参与其活性调节。然而,PEBP4与Akt-mTOR在肝癌中的相互作用尚未见报道,故成为本课题的研究重点,结果将为肝细胞癌的治疗提供分子靶点。实验方法:1.观察PEBP4对肝癌细胞生物行为学的影响（1）免疫组化:检测肝癌患者癌组织和癌旁组织中PEBP4的表达;（2）Western blot（WB）和qPCR:比较正常肝细胞（LO2）和恶性程度相对不同的肝癌细胞系,包括低恶性程度:MHCC97L,中度恶性程度:He PG2,SMMC-7721,高恶性程度:MHCC97H和HCCLM3中PEBP4的表达情况;（3）构建稳定细胞系:用sh RNA-PEBP4和PCMV6-PEBP4分别敲低MHCC97H细胞和过表达MHCC97L细胞中的PEBP4,WB和qPCR验证细胞系的成功构建;（4）通过CCK8,克隆形成实验,检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞生长能力的影响;（5）采用划痕实验,Transwell检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响;（6）皮下植瘤实验:在裸鼠皮下（腋窝）接种肝癌细胞,体内观察敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞生长能力的影响;（7）肺转移模型构建:通过裸鼠尾静脉接种肝癌细胞,检测敲低和过表达PEBP4对肝癌细胞转移能力的影响。2.观察PEBP4对Akt/mTOR信号通路的影响（1）WB检测敲低和过表达PEBP4细胞中Akt/mTOR信号通路的变化;（2）IGF-1刺激敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化;（3）Akt腺病毒（Akt-S473D）感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化;（4）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,WB检测Akt/mTOR信号通路的变化。3.探讨PEBP4、Akt/mTOR信号通路在肝癌细胞生物行为学中的作用（1）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,采用CCK8、Transwell分别检测肝癌细胞的生长、迁移和侵袭能力;（2）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,CCK8、Transwell分别检测肝癌细胞的生长、迁移和侵袭能力。4.观察PEBP4对EMT的影响（1）WB检测敲低和过表达PEBP4细胞系中EMT的变化;（2）免疫荧光检测敲低和过表达PEBP4细胞系中E-cadherin和N-cadherin的变化;（3）IGF-1刺激敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB检测EMT的变化;（4）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞,WB和免疫荧光检测EMT的变化;（5）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞,WB和免疫荧光检测EMT的变化。5.探讨PEBP4、Akt、mTOR之间的关系（1）免疫共沉淀检测MHCC97H细胞中PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（2）用N-myc-PEBP4转染HEK293T细胞,免疫共沉淀方法检测PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（3）在敲低PEBP4细胞系中,采用免疫共沉淀检测PEBP4、Akt、mTOR之间的关系;（4）siRNA-mTOR转染HEK293T细胞后,采用免疫共沉淀检测Akt、mTOR、PEBP4之间的关系。结果:1.PEBP4对肝癌细胞生物行为学的影响（1）免疫组化结果显示,癌旁组织中PEBP4表达偏低,癌组织中PEBP4表达偏高;（2）WB和qPCR结果表明,与正常肝细胞（LO2）和恶性程度低的肝癌细胞（MHCC97L）比较,PEBP4在恶性程度高的肝癌细胞（MHCC97H,HCCLM3）中的表达要高;（3）CCK8和克隆形成实验表明,敲低PEBP4使肝癌细胞较对照组的生长能力减弱,而过表达PEBP4使肝癌细胞生长能力增强;（4）敲低PEBP4后,划痕实验和Transwell结果显示肝癌细胞的迁移和侵袭能力减弱,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;（5）皮下移植实验结果表明敲低PEBP4的肝癌细胞在裸鼠体内的生长能力较对照组下降,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;（6）肺转移结果显示:敲低PEBP4的肝癌细胞较对照组在裸鼠肺中形成的结节减少,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反。2.PEBP4对Akt/mTOR信号通路的影响（1）与对照组相比,WB结果显示,敲低PEBP4后（a）mTORC2 Ser2481的磷酸化以及mTORC2的底物SGK1、PKCα的磷酸化降低;（b）Akt Ser473和Thr308磷酸化被抑制;（c）Akt调节直接底物RSK2和mTORC1 Ser2448的磷酸化下降;（d）mTORC1介导的p-S6K1表达下降;（e）过表达PEBP4对以上指标的影响结果与敲低PEBP4完全相反;（2）WB结果显示,（a）IGF-1不影响PEBP4的表达;（b）IGF-1不能逆转敲低PEBP4对结果（1）中各指标的影响;（3）Akt-S473D感染敲低PEBP4的MHCC97H细胞后,WB结果发现:（a）Akt-S473D不影响PEBP4的表达;（b）Akt-S473D对PEBP4敲低引起的mTORC2Ser2481磷酸化下调没有影响;（c）Akt-S473D逆转敲低PEBP4对Akt Thr308磷酸化的下调作用;（d）Akt-S473D抵消敲低PEBP4对RSK2和mTOR Ser2448磷酸化的抑制作用;（e）Akt-S473D逆转敲低PEBP4对p-S6K1表达的下调作用。（4）Akt抑制剂MK-2206处理过表达PEBP4的MHCC97L细胞后,WB结果显示:（a）MK-2206对PEBP4的表达没有影响;（b）MK-2206对过表达PEBP4上调mTOR Ser2481、SGK1、PKCα磷酸化没有影响;（c）MK-2206抑制过表达PEBP4对Akt Ser473和Thr308磷酸化的上调作用;（d）MK-2206抑制过表达PEBP4对RSK2和mTOR Ser2448磷酸化的促进作用;（e）MK-2206下调过表达PEBP4对p-S6K1表达的上调作用。3.PEBP4、Akt/mTOR信号通路对肝癌细胞生物行为学的作用（1）CCK8结果显示,Akt-S473D可以部分逆转敲低PEBP4对肝癌细胞生长能力的抑制作用,而MK-2206可以抑制过表达PEBP4对肝癌细胞生长的促进作用;（2）Transwell结果显示,Akt-S473D可以部分逆转敲低PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用,而MK-2206可以抑制过表达PEBP4对肝癌细胞迁移和侵袭的促进作用。4.PEBP4对EMT的影响（1）WB结果显示,敲低PEBP4上调E-cadherin的表达,且下调N-cadherin,vimentin和integrin的表达,而过表达PEBP4的结果与其敲低相反;免疫荧光检测结果与WB一致;（2）WB结果证明,IGF-1刺激PEBP4敲低的细胞并不能影响EMT等指的变化;（3）WB和免疫荧光结果显示Akt-S473D可逆转敲低PEBP4对EMT的作用,且MK-2206可抵消过表达PEBP4对EMT的作用。5.PEBP4、Akt、mTOR之间的关系（1）免疫共沉淀结果显示,无论是在MHCC97H细胞中还是在N-myc-PEBP4转染HEK293T细胞中,都能证明PEBP4,Akt,mTOR之间存在相互作用;（2）在敲低PEBP4细胞系中,免疫共沉淀结果显示,PEBP4与Akt和mTOR之间的相互作用消失,但Akt和mTOR之间的关系仍然存在;（3）siRNA敲除mTOR后,免疫共沉淀结果显示,Akt与PEBP4之间的关系存在,而PEBP4与mTOR之间的关系消失。结论:本实验主要研究PEBP4对肝细胞癌的作用。结果表明,1.PEBP4促进肝癌细胞生物学行为;2.PEBP4促进Akt/mTOR信号通路的活化,籍此调节肝癌细胞的生物行为学;3.PEBP4除了通过Akt发挥功能外,还参与调节其它信号分子,其可能的靶点是mTORC2;4.PEBP4,Akt,mTOR之间存在相互作用,发挥生物学功能。
林稼樱[6]（2021）在《理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎伴肠化的疗效与机制研究》文中研究表明目的慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生被称作胃癌前状态,目前,经由慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生逐步进展的肠型胃癌发展模式已得到广泛认可,因此,能够在该病理阶段进行早期干预,是降低胃癌发病率的有效途径。当前西医对于本病的治疗多集中于去除病因以及对症治疗,缺乏具有针对性的特效药。在此前提下,国内外均有研究证实中医药在治疗胃癌前状态甚至胃癌前病变方面具有独特优势,不仅能够改善患者临床症状,而且能够延缓、逆转胃癌前病变的发展。本课题组通过前期临床观察,发现理气活血解毒法干预慢性萎缩性胃炎伴肠化疗效确切,进一步探索显示其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路相关,但由于中药靶点众多,因此其具体机制仍未明确。基于此,本课题拟通过分析理气活血解毒法治疗的30例慢性萎缩性胃炎伴肠化患者治疗前后的症状、病理及生物学指标,来明确理气活血解毒法的临床疗效,同时利用免疫组化技术从分子水平探讨其具体作用机制。方法本研究主要采用自身前后对照试验。研究涉及的30例病例来源于2018年9月至2020年12月就诊于北京中医药大学东直门医院,符合肝胃郁热、气虚血瘀型的慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生的患者,给予理气活血解毒法进行干预3个月,观察患者治疗前后临床症状、胃镜及病理像改变情况,同时通过免疫组织化学技术检测患者胃黏膜中HIF-1α,VEGF,mTOR,NF-κB表达水平的影响,以期探索理气活血解毒法治疗CAG伴IM的作用机制。结果（1）一般情况:本研究纳入的30例患者,其中年龄最大者为68岁,年龄最小者为37岁,平均年龄53.87±7.51岁,不同性别年龄分布无统计学差异;本病的就诊季节以冬季居多（46.67%）,其后依次为秋季（33.33%）和无明显季节性（33.33%）;在精神因素上焦虑忧虑（60.00%）、急躁易怒（53.55%）与本病的发生关系最为密切;患者的饮食偏嗜多为油腻（53.33%）、甜食（43.33%）、辛辣（40.00%）;在烟酒史方面,本病患者吸烟比例较高,达50.00%。（2）中医症状疗效评价:在30例患者中,治愈2例,占6.67%,显效3例,占10.00%,有效23例,占76.67%,无效2例,占6.67%,总有效率93.34%。将症状积分进行治疗前后对比可见,胃脘痞塞、胃中嘈杂、心烦易怒、反酸、烧心、口苦、口干、嗳气、身重倦怠、精神疲乏、纳差、气短、大便溏薄在治疗后差异具有显着统计学意义（P＜0.01）;胃脘疼痛的减轻具有统计学意义（P<0.05）,懒言、大便干结的改善未显示出统计学意义（P>0.05）。（3）病理组织学疗效评价:将病理组织学积分进行统计,结果显示:治疗纳入的患者病理组织总积分下降,且差异具有显着的统计学意义（P<0.01）,同时肠化、异型增生病理积分差异具有显着统计学意义（P＜0.01）,萎缩、慢性炎症及活动性积分差异无统计学意义（P>0.05）。（4）治疗前后mTOR、NF-κB、HIF-1α、VEGF表达及阳性率差异:比较疗前疗后各指标的平均光密度值,结果显示治疗后mTOR、NF-κB、HIF-1α表达下降,且差异具有统计学意义（P<0.05）,而VEGF在治疗前后差异无统计学意义（P>0.05）。在面积阳性率方面mTOR治疗前以中度比例较高（70.0%）,治疗后以轻度比例较高（70.0%）;NF-κB治疗前后的阳性率均以中度比例较高,治疗前为80.0%,治疗后为70%;HIF-1α治疗前以中度比例较高（73.33%）,治疗后则以中度（60.0%）和轻度（36.67%）比例较高;VEGF治疗前后的阳性率均以轻度比例较高,治疗前为73.33%,治疗后为46.67%。结论（1）纳入的慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生患者年龄多在45-65岁之间,且患者的就诊季节以冬季居多,在情志因素方面焦虑忧虑、急躁易怒与本病的发生关系较为密切,油腻、甜食等饮食偏嗜也可能是诱发本病的相关因素。（2）通过纳入患者的临床症状积分、胃镜病理积分进行自身前后对照,可见理气活血解毒法治疗CAG伴IM患者疗效可靠。（3）免疫组化研究结果显示,经治疗后mTOR、NF-κB、HIF-1α表达较疗前下降,而VEGF的表达在治疗前后差异无明显变化。
陈雪[7]（2021）在《基于PI3K/AKT/mTOR通路探讨固正消癌方调节PTEN治疗大肠癌的作用机制》文中研究指明研究目的:本团队在前期临床实验中已发现固正消癌方在提升大肠癌患者的生存质量、改善患者功能状态以及缓解患者病痛等方面发挥出极大优势,在较好的疗效基础上,本实验利用生物分子学技术,观察固正消癌方对PI3K/AKT/mTOR信号通路以及PTEN的影响,为固正消癌方治疗肠癌,抑制癌细胞的转移增殖提供更直面客观的理论依据,为制定大肠癌的诊疗共识提供新视点。研究内容:1.采用江苏省中医院病理科提供的2018-2019年间的20对病理组织（结直肠癌组织及相应癌旁组织各20例）和2020年6月1日一10月31日五个月内于我院肛肠科行肠癌手术后留存的标本组织5对（结直肠癌组织以及相应癌旁组织各5例）,分别应用免疫组化方法以及q-PCR技术检测PTEN、PI3K、AKT、mTOR蛋白分子在各样本组织和标本组织中的含量,统计各蛋白因子在结直肠癌组织及相应癌旁组织中的表达量并计算差异情况,由此间接反映各因子是否参与人结直肠癌的发展。2.建立裸鼠皮下瘤模型,处死裸鼠完成荷瘤组织剥离并称重,记录各组裸鼠肿瘤重量变化并分析其差异性,采用Western Blot方法及免疫组化方法检测各组样本中PTEN、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达含量并统计各组间差异。研究结果:1.临床实验中,免疫组化法结果示:癌旁组织中PTEN的表达量显着高于肠癌组（P<0.05）;癌旁组织中PI3K、AKT、mTOR的表达量显着低于癌症组织（P<0.05）。q-PCR结果示:结直肠癌组PTEN、PI3K、AKT、mTOR蛋白含量,与癌旁组织对比,PTEN表达量降低,PI3K、AKT、mTOR表达量升高,均有显着性差异（P<0.05）。2.裸鼠荷瘤重量检测结果示:固正消癌方低剂量组平均瘤重较模型组平均瘤重无明显差异（P>0.05）;固正消癌方中剂量组及高剂量组两组瘤重较模型组均降低（P<0.05）3.动物实验中,Western Blot结果示:与模型组相比,PTEN表达量在固正消癌方低、中、高剂量组均显着增高（P<0.05）;固正消癌方低、中、高剂量组的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达量与模型组相比均显着降低（P<0.05）。免疫组化结果示:与模型组相比,固正消癌方低剂量组中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量有下调趋势,但无统计学意义（P>0.05）,固正消癌方中、高剂量组中的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达量显着低于模型组（P<0.05）;与模型组相比,固正消癌方低、中剂量组中PTEN表达量没有统计学差异（P>0.05）,高剂量组中PTEN表达量显着高于模型组（P<0.05）;与模型组相比,加入固正消癌方后低、中、高剂量三组中PI3K、AKT、mTOR总表达量有下调趋势均无统计学意义,（P>0.05）。研究结论:（1）PTEN蛋白在人结直肠癌组织中的低表达以及PI3K、AKT、mTOR等蛋白在人结直肠癌组织中的高表达共同说明了 PI3K/AKT/mTOR信号通路在人肠癌的发生发展中呈激活状态,是我们一直所探索的影响肠癌发病机制的关键信号轴之一。（2）固正消癌方可抑制裸鼠皮下种植瘤的增长同时抑制HT-29细胞的异常分化增殖。（3）固正消癌方可上调裸鼠种植瘤中PTEN表达量,降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量,且与药物剂量呈相关性,高剂量的固正消癌方作用效果更显。（4）固正消癌方可通过调控PTEN基因抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性状态来发挥治疗大肠癌的作用。
胡晓青[8]（2020）在《双靶向抑制PI3K/mTOR通过p62降解Mcl-1诱导卵巢癌细胞凋亡机制的研究》文中研究说明在卵巢癌的药物治疗中,化疗耐药仍然是困扰抗肿瘤治疗的瓶颈问题之一。人们期待分子靶向药物的发现为克服肿瘤耐药提供新的可能。目前认为,抑制PI3K/AKT/mTOR通路一方面拮抗促存活,另外又发现抑制PI3K/AKT/mTOR通路还可以直接磷酸化Bax、Bim等蛋白引起蛋白构象改变而发挥促凋亡作用。由于PI3K/AKT/mTOR通路关键分子间存在交叉调控机制,导致单独靶向PI3K或mTOR的抑制剂抗肿瘤效果不佳。为了增加靶向PI3K/AKT/mTOR通路的抗肿瘤效果,又研发了 PI3K/mTOR的双靶向抑制剂,在一些肿瘤中具有更强的抗肿瘤效果。因此,利用PI3K/mTOR的双靶向抑制剂,通过探讨抑制PI3K/AKT/mTOR凋亡相关蛋白的作用,可能为逆转化疗耐药提供新的线索。随着研究的深入,已经发现抑制PI3K/mTOR可以诱导自噬,但自噬发挥的作用及其机制尚不清楚。目前已经发现,mTOR的下游底物ULK1等激酶可以磷酸化p62,进而促进p62的泛素相关结构域（UBA）与底物蛋白结合,实现其对特定底物蛋白的自噬降解途径的精准调控,决定了自噬的作用。以往的实验已经发现通过蛋白酶体途径能够降解抗凋亡蛋白Mcl-1,而对于自噬是否参与Mcl-1的降解尚不清楚。而作为自噬受体的多功能枢纽蛋白p62/SQSTM1在自噬降解蛋白过程中发挥重要作用,而多种激酶对p62/SQSTM1磷酸化作用能够更加精细调控与降解底物蛋白的结合,从而决定了细胞自噬在细胞凋亡等过程中的作用。因此,探讨作为自噬受体的多功能枢纽蛋白p62/SQSTM1在双靶向抑制PI3K/mTOR诱导的自噬降解Mcl-1等抗凋亡蛋白促进细胞凋亡的作用,可能为提高靶向PI3K/mTOR通路的抗肿瘤药物作用提供新的理论支撑。在本研究中,以PIK3CA基因突变且对顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞为研究对象,通过双靶向抑制PI3K/mTOR途径,研究p62磷酸化调控的自噬对抗凋亡蛋白Mcl-1的降解,探讨抑制PI3K/AKT/mTOR通路诱导线粒体途径凋亡的机制,为分子靶向逆转卵巢癌耐药提供实验依据。方法:（1）基因测序并分析人浆液性上皮性卵巢癌SKOV3及A2780细胞PIK3CA基因的突变位点。（2）MTT法检测单、双靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对卵巢癌SKOV3及A2780细胞生存率的影响;检测PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402联合顺铂对SKOV3和A2780细胞生存率的影响;CompuSyn软件分析PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402联合顺铂对SKOV3和A2780细胞的协同效应。（3）检测单、双靶向PI3K/mTOR抑制剂对PI3K/AKT/mTOR信号通路活性及卵巢癌细胞凋亡的影响。Western blot法检测单、双靶向PI3K/mTOR抑制剂对信号通路关键下游分子p-AKT、p-p70s6k、p-4EBP1表达的影响;检测Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9及Bcl-2家族蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率。（4）检测单、双靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对SKOV3细胞线粒体功能影响;JC-1染色检测细胞线粒体膜电位;DCFH-DA染色检测细胞内ROS水平;Mitosox染色观察线粒体内ROS水平;ATP试剂盒检测细胞内ATP相对含量。（5）分离卵巢癌细胞线粒体,检测单、双靶向PI3K/mTOR抑制剂对线粒体Mcl-1、Bak等蛋白表达的影响。Western blot法检测PI3K/mTOR双靶向抑制剂单独或联合顺铂处理SKOV3细胞引起Mcl-1蛋白的表达变化。（6）检测单、双靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对SKOV3细胞自噬流量的影响。检测p62、LC3等自噬相关蛋白表达变化的影响,以及使用溶酶体抑制剂氯喹干扰溶酶体降解功能后,观察p62、LC3II/I蛋白表达。阻断自噬或蛋白酶体降解途径,检测Mcl-1蛋白的表达变化。（7）间接免疫荧光法检测p62蛋白与Mcl-1蛋白的共定位。利用p62 UBA结构域截短突变的质粒转染细胞,间接免疫共沉淀法检测p62通过泛素相关结构域（UBA）与Mcl-1蛋白的结合情况。（8）使用特异性p-p62（Ser403）抗体,western blot法检测PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402对SKOV3细胞p62 Ser403位点磷酸化水平的影响。利用p62 Ser403位点磷酸化失活突变的质粒转染细胞,免疫共沉淀法观察p62与Mcl-1的结合;MTT法观察细胞生存率变化。结果:（1）人浆液性上皮性卵巢癌SKOV3细胞突变位点为H1047R（A→G）,位于编码蛋白的激酶结构域,A2780细胞突变位点为E365K（G→A）,位于编码蛋白的C2结构域,两个结构域的功能不同。（2）MTT结果显示,PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402能够降低SKOV3细胞及A2780细胞生存率。CompuSyn软件分析PKI-402与顺铂的协同效应,在卵巢癌耐药细胞系SKOV3中,PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402与顺铂产生协同效应（CI:0.41）,在卵巢癌敏感细胞系A2780细胞中,PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402与顺铂没有显着的协同效应（CI:0.99）,这可能与两种细胞PIK3CA基因的突变位点不同有关。（3）PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402与单靶向抑制剂相比,显着降低p-AKT、p-p70s6k、p-4EBP1表达水平,抑制卵巢癌细胞存活和细胞克隆形成,提高 Bax/Bcl-2 蛋白比率,增加凋亡蛋白 Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 表达水平,诱导SKOV3细胞发生凋亡。（4）PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402与单靶向抑制剂相比,能够显着降低线粒体膜电位,增加线粒体内及细胞内ROS水平,降低细胞内ATP相对含量,提示PKI-402引起线粒体功能受损。（5）PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402使SKOV3细胞中Mcl-1蛋白的表达呈时间依赖性下降。与单独使用顺铂处理相比,PKI-402联合顺铂能更显着降低SKOV3细胞Mcl-1蛋白的表达;细胞线粒体中Bak/Mcl-1比例增加,提示PKI-402通过降低抗凋亡蛋白Mcl-1的表达诱导SKOV3细胞发生凋亡。（6）PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402诱导SKOV3细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比例增加,p62蛋白表达快速增加后随自噬发生逐渐降低。应用溶酶体抑制剂CQ与PKI-402联合处理细胞后,LC3Ⅱ/Ⅰ比例及p62蛋白的表达均较单独使用PKI-402 处理细胞后增加。当干扰蛋白酶体及溶酶体功能后,均引起 Mcl-1 蛋白的表达较对照组有所增多,提示PKI-402能够通过自噬途径和蛋白酶体途径降解Mcl-1。（7）免疫荧光检测结果显示,PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402引起SKOV3细胞p62及Mcl-1共定位于细胞核周围;分别抑制自噬和蛋白酶体途径,p62与Mcl-1点状聚集增多且二者存在共定位现象。在转染p62蛋白UBA结构域截短突变质粒的细胞中,Mcl-1与p62蛋白的结合显着下降,说明p62通过UBA结构域与Mcl-1结合进而通过自噬和蛋白酶体途径降解。（8）PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402可以增加p62 Ser403位点磷酸化水平,随药物处理时间延长,自噬水平增高,p62Ser403位点磷酸化水平下降。在转染p62蛋白Ser403位点磷酸化失活突变质粒的细胞中,p62与Mcl-1的结合能力下降,细胞生存率部分增加,提示PKI-402可以通过促进p62Ser403位点磷酸化从而提高p62与Mcl-1的结合能力。结论:（1）PIK3CA基因1047位点A→G突变（编码PI3Kα亚基的激酶结构域）的卵巢癌SKOV3细胞对PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402更加敏感。（2）PI3K/mTOR双向抑制剂PKI-402可以更有效抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性,促进卵巢癌细胞凋亡。（3）当PI3K/mTOR同时被抑制时,自噬起始复合物关键激酶ULK1被激活,自噬流量增强,同时促进p62蛋白S403位点磷酸化,导致抗凋亡蛋白Mcl-1降解是双靶向抑制PI3K/mTOR诱导细胞凋亡的机制之一。综上,本研究发现PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402通过改变多功能蛋白p62 Ser403磷酸化水平,调节自噬降解Mcl-1蛋白,诱导线粒体途径凋亡并增加耐药细胞对顺铂敏感性。这为临床上针对顺铂耐药,且存在卵巢癌PI3K/AKT/mTOR信号通路突变患者的治疗带来了曙光,为靶向药物的开发提供了新的方向。
崔鹏[9]（2020）在《PD-L1在下咽鳞癌中的表达及其在调控FaDu细胞侵袭转移中的作用机制研究》文中指出第一部分PD-L1在下咽鳞癌中的表达及其与临床病理学特征的相关性研究实验目的下咽鳞状细胞癌（HSCC）为恶性程度较高的一类头颈部鳞状细胞癌（可简称鳞癌）,近年来,尽管手术、放化疗与靶向疗法等综合疗法已获得了显着成果,然进展期HSCC病人的预后依然不佳,5年生存率不足40%。远端转移是造成HSCC病人死亡的关键因素,特别是对于接受综合治疗后的患者,远处转移始终是下咽鳞癌诊疗方面不易预测且难以治疗的问题。因此,深入研究下咽鳞癌发生发展的机制、寻找可以预测疾病进展及预后的标志物、探索新的治疗靶点是改善进展期下咽鳞癌患者生存及生活质量的关键。PD-L1（程序性死亡配体-1）属于一类免疫抑制分子,其结合程序性死亡分子-1（PD-1）,能够对T细胞介导的抗肿瘤免疫作用施以有效抑制,显着影响肿瘤免疫逃逸。既往研究表明在多种人类实体肿瘤中均有PD-L1阳性表达,且具有重要的临床及预后意义。同时PD-L1也是目前免疫治疗的重要靶点。但是在下咽鳞癌中,还没有充分明确PD-L1的确切表达以及此分子影响临床病理学表现与预后状况。实验方法收集2005年01月至2014年11月此阶段内就医于我科的95例HSCC病人临床与病理学资料,包括病人年龄、性别、T分期、临床分期、N分期、远端转移、分化状况与预后状况等。收集95例下咽鳞癌患者的肿瘤组织及其配对的癌旁粘膜组织,借助免疫组化（IHC）染色法对肿瘤与黏膜组织内PD-L1表达水平进行测定。应用卡方检验或Fisher精确概率法分析肿瘤组织中PD-L1表达量同病人临床病理学表现间的联系。借助Kaplan-Meier法来分析PD-L1表达同预后间的联系,并完成生存曲线的绘制,针对生存率指标,借助Log-rank检验法开展对比分析,最后借助Cox回归模型来揭示同预后相关的诸多因素。实验结果在95名HSCC病人的肿瘤组织内,PD-L1阳性表达者为42例,达44.21%阳性表达率;但于癌旁粘膜组织内无PD-L1阳性表达现象。PD-L1表达量显着相关于病人的远端转移、N分期与临床分期（χ2=20.850、14.317、7.878,P值皆在0.05以下）。生存分析结果表明,相较于PD-L1表达阴性病人,在预后方面,PD-L1阳性表达病人为较差表现（χ2=37.01且P值在0.001以下）。经多因素Cox回归分析发现,PD-L1阳性表达是同HSCC病人预后相关的独立危险因素（P=0.002,HR=2.703,95%CI:1.455-5.022）。结论PD-L1在下咽鳞癌中可呈阳性表达,其表达水平与疾病进展及预后有着显着关联,PD-L1是同HSCC病人预后相关的独立危险因素,可作为预测下咽鳞癌患者疾病进展及评估预后的生物标记物。第二部分PD-L1调控下咽癌FaDu细胞侵袭转移的潜在作用机制研究实验目的既往研究证实,多种人类肿瘤均可出现PD-L1的阳性表达,并且其表达水平与患者的临床病理学特征及治疗后转归具有显着的相关性。此项课题第一部分研究结果显示,在HSCC中PD-L1阳性表达皆显着相关于临床分期、不良预后、远端转移与颈部淋巴结转移,PD-L1是同HSCC病人预后相关的独立危险因素,这提示PD-L1可能参与了下咽鳞癌的发生发展。另外,许多临床研究也证实,PD-L1阻断疗法能够使晚期肿瘤病人的疾病进展大幅减慢,同时对预后具改善作用。通常认为,在提升肿瘤侵袭性方面,PD-L1的作用机制为,对T细胞介导的免疫反应进行抑制,从而建立免疫抑制微环境,由此对肿瘤细胞免疫逃逸的出现与肿瘤进展起促进作用。但是最近的研究表明,PD-L1同时也具有调节肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭与放化疗抵抗的效能,且和肿瘤细胞上皮-间质转化（EMT）的发生有密切的关系。但是在下咽鳞癌进展过程中,PD-L1这些内在的、自主的生物学功能并未得到充分的阐明。本课题旨在研究PD-L1在调控下咽癌FaDu细胞侵袭转移中的作用,同时对潜在的作用机制展开讨论。实验方法通过siRNA与过表达质粒对人HSCC FaDu细胞行转染处理,下调及上调PD-L1表达水平,应用Western blot实验检测不同处理组FaDu细胞中PD-L1的表达变化。证实PD-L1的表达水平上调或下调后,借助CCK-8实验对FaDu细胞增殖能力展开测定;借助Transwell实验,对FaDu细胞侵袭与迁移能力展开测定。借助Western blot（WB）法来测定FaDu细胞内PD-L1表达量改变后,相关EMT相关蛋白（包括E-cadherin、Vimentin与N-cadherin等）的表达量。为了更为深入地揭示PD-L1在调控EMT中的潜在机制,通过WB实验对FaDu细胞PD-L1表达量波动后信号通路AKT-mTOR的活化状况展开测定。采用过表达质粒与Akt蛋白抑制剂共同处理FaDu细胞,Western blot实验检测FaDu中EMT相关蛋白的表达水平变化。实验结果:抑制PD-L1蛋白表达后,体外细胞实验结果表明,FaDu细胞的侵袭、迁移与增殖活性皆大幅减弱,WB实验表明,E-cadherin于FaDu细胞内蛋白表达上调,Vimentin与N-cadherin蛋白表达则下调。提升PD-L1于FaDu细胞内蛋白表达量,则其增殖、迁移及侵袭能力均显着上升,FaDu细胞内E-cadherin蛋白表达下调,Vimentin与N-cadherin蛋白表达上调。PD-L1于FaDu细胞内的蛋白表达水平与信号通路AKT-mTOR显着相关,若前者水平上调,p-mTOR与p-Akt蛋白表达量提高;若前者水平降低,p-mTOR与p-Akt蛋白表达量降低;而Akt蛋白抑制剂可逆转PD-L1表达上调对Fadu细胞上皮-间质转化的促进作用,说明PD-L1可通过AKT-mTOR信号通路调节FaDu细胞的上皮-间质转化。结论:PD-L1可影响FaDu细胞的增殖、迁移及侵袭能力,其潜在作用机制为PD-L1调控信号通路AKT-mTOR活化,同时对EMT施以进一步调控。PD-L1具有独立于免疫调节之外的自主功能,可作为调控HSCC转移的关键因子,同时在临床治疗HSCC方面可作为新靶点应用。
卢敏[10]（2020）在《ARNTL2基因在人结肠癌侵袭和迁移中的作用及分子机制研究》文中指出研究背景和研究目的时钟基因与多种疾病的发生有关,近年来研究发现时钟基因与肿瘤的发生、发展密切相关。然而,时钟基因调控结肠癌的发生发展的具体作用机制仍然未明确。本课题拟通过研究时钟基因ARNTL2在人结肠癌中的表达、功能及分子机制,深入探索其参与调控结肠癌的侵袭、迁移等重要作用机制。研究方法该研究首先通过生物信息学筛选、预测时钟基因ARNTL2在人结肠癌中的表达变化及与结肠癌生存预后的关系,并结合免疫组织化学（IHC）方法检测ARNTL2在结肠癌组织、癌旁组织的表达,分析ARNTL2表达与临床病理参数的关系。同时,采用Western blot检测其在结肠癌细胞株中的表达,利用细胞免疫荧光分析其在细胞内的定位与分布情况。然后,通过RNA干扰抑制ARNTL2在结肠癌细胞中的表达,应用CCK-8实验、平板克隆形成实验、细胞划痕愈合实验、Transwell迁移及侵袭实验、裸鼠皮下瘤模型检测ARNTL2对结肠癌细胞体内外生长、迁移和侵袭的影响。最后,通过RNA干扰结肠癌细胞株ARNTL2表达,并结合Western Blot检测分析时钟基因调控肿瘤相关信号通路变化。研究结果生物信息学预测人结肠癌时钟基因ARNTL2呈高表达,并与结肠癌的生存预后紧密相关。检测结果表明,ARNTL2在人结肠癌组织及细胞株中的表达明显高于癌旁组织及正常结肠粘膜上皮细胞株,且其表达与结肠肿瘤T、M分期密切相关,并通过细胞免疫荧光检测证明ARNTL2主要位于结肠癌细胞的细胞核内。细胞功能实验表明ARNTL2干扰后可显着抑制结肠癌细胞体内、外的生长、侵袭和迁移。Western Blot分析表明,RNA干扰沉默ARNTL2的表达可抑制ARNTL2靶基因SMOC2的表达,并抑制EMT和PI3K/AKT信号通路相关因子的表达,从而抑制结肠癌增殖、侵袭和迁移。结论通过在结肠癌癌组织和细胞中对ARNTL2的生物信息学、表达及功能研究,首次揭示了 ARNTL2基因在结肠癌的发生、侵袭和迁移过程中的作用机制。结果表明,在结肠癌细胞中,ARNTL2基因敲除后可抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭的发生,同时还证明通过下调ARNTL2基因表达可抑制PI3K/AKT信号通路与SMOC2-EMT活性,从而抑制癌细胞的增殖和迁移。这些发现揭示了 ARNTL2基因敲除对抑制结肠癌细胞生长的作用机制,并为ARNTL2基因敲除在结肠癌中发挥抑癌作用提供了可靠的理论依据。
二、mTOR信号通路及其与肿瘤的联系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、mTOR信号通路及其与肿瘤的联系（论文提纲范文）
（1）电针对FD模型大鼠mTOR信号通路调节Ghrelin机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 电针对功能性消化不良大鼠胃及小肠Ghrelin和GOAT的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 慢性功能性不良大鼠模型的建立 |
| 1.1.4 动物分组 |
| 1.2 干预方法 |
| 1.2.1 药物治疗 |
| 1.2.2 电针治疗 |
| 1.2.3 注意事项 |
| 1.3 检测指标 |
| 1.3.1 一般情况检测 |
| 1.3.2 胃排空和小肠推进率 |
| 1.3.3 qRT-PCR检测Ghrelin和GOAT mRNA的表达 |
| 1.3.4 Western blot检测Ghrelin和GOAT蛋白的表达蛋白提取 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠一般情况 |
| 2.2 各组大鼠胃排空和小肠推进率 |
| 2.3 qRT-PCR检测各组大鼠胃窦及小肠中Ghrelin和GOAT mRNA的表达 |
| 2.4 Western blot检测各组大鼠胃窦中Ghrelin和GOAT蛋白的表达 |
| 2.5 Western blot检测各组大鼠小肠中Ghrelin和GOAT蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验结果分析 |
| 3.1.1 电针能显着改善胃肠消化功能 |
| 3.1.2 电针能有效调控FD大鼠胃窦及小肠中Ghrelin和GOAT的表达 |
| 3.2 电针通过调控Ghrelin和GOAT的分泌改善慢性功能性消化不良症状 |
| 实验二 mTOR激动剂及其抑制剂在电针治疗功能性消化不良中的作用 |
| 1 实验与方法 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 慢性功能性不良大鼠模型的建立 |
| 1.1.4 动物分组 |
| 1.2 干预方法 |
| 1.2.1 激动剂抑制剂干预 |
| 1.2.2 电针治疗 |
| 1.2.3 注意事项 |
| 1.3 各项指标检测 |
| 1.3.1 一般情况检测 |
| 1.3.2 胃内残留率和小肠推进率 |
| 1.3.3 采用qRT-PCR检测Ghrelin和 mTOR mRNA的表达 |
| 1.3.4 采用Western blot检测pre-Ghrelin和p-P70S6K蛋白的表达 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠一般情况 |
| 2.2 各组大鼠胃内残留率和小肠推进率 |
| 2.3 qRT-PCR检测各组大鼠胃窦及小肠组织中Ghrelin和mTOR mRNA的表达 |
| 2.4 Western blot检测各组大鼠胃窦中pre-Ghrelin和p-P70S6K蛋白的表达 |
| 2.5 Western blot检测各组大鼠小肠中pre-Ghrelin和p-P70S6K蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验结果分析 |
| 3.1.1 mTOR激动剂抑制剂在电针治疗FD的作用 |
| 3.1.2 mTOR信号通路对pre-Ghrelin蛋白及p-P70S6K蛋白的表达量的调控 |
| 3.1.3 mTOR信号通路可能为FD临床治疗的靶点 |
| 实验三 电针对FD模型大鼠mTOR信号通路调节Ghrelin合成与分泌的机制研究 |
| 1 实验与方法 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 慢性功能性不良大鼠模型的建立 |
| 1.1.4 动物分组 |
| 1.2 干预方法 |
| 1.2.1 激动剂抑制剂干预 |
| 1.2.2 电针治疗 |
| 1.2.3 注意事项 |
| 1.2.4 组织制备 |
| 1.3 各项指标检测 |
| 1.3.1 组织形态学检查 |
| 1.3.2 采用qRT-PCR检测大鼠下丘脑、胃窦与小肠中Ghrelin、mTOR、P70 S6K、4EBP1、eIF4E |
| 1.3.3 采用Western blot检测mTOR对 Ghrelin作用的指标mTOR、P70 S6K、4EBP1、eIF4E的磷酸化蛋白表达 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 下丘脑、胃窦和小肠组织的病理改变 |
| 2.2 采用qRT-PCR检测大鼠下丘脑、胃窦与小肠中Ghrelin、mTOR、P70 S6K、4EBP1、eIF4E的mRNA的表达水平 |
| 2.3 采用Western blot检测mTOR对Ghrelin作用的指标mTOR、P70 S6K、4EBP1、eIF4E的磷酸化蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 实验四 电针对功能性消化不良大鼠胃窦、小肠组织mTOR/Ghrelin、P70 S6K/Ghrelin的共表达及作用机制研究 |
| 1 实验与方法 |
| 1.1 实验动物与分组 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 慢性功能性不良大鼠模型的建立 |
| 1.1.4 动物分组 |
| 1.2 干预方法 |
| 1.3 免疫荧光检测(双标) |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 电针对功能性消化不良大鼠胃窦组织中mTOR/Ghrelin蛋白表达部位相互关系的影响 |
| 2.2 电针对功能性消化不良大鼠十二指肠组织中mTOR/Ghrelin蛋白表达部位及相互关系的影响 |
| 2.3 电针对功能性消化不良大鼠胃窦组织中P70S6K/Ghrelin蛋白表达部位及相互关系的影响 |
| 2.4 电针对功能性消化不良大鼠十二指肠组织中P70S6K/Ghrelin蛋白表达部位及相互关系的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 电针及mTOR抑制剂对功能性消化不良大鼠胃窦及小肠组织中mTOR/Ghrelin蛋白表达部位的调节作用 |
| 3.2 电针及mTOR抑制剂对功能性消化不良大鼠胃窦及小肠组织中P70S6K/Ghrelin蛋白表达部位的调节作用 |
| 3.3 电针对功能性消化不良大鼠胃窦、小肠组织中mTOR/Ghrelin、P70S6K/Ghrelin的共表达及作用机制 |
| 全文讨论 |
| 1 中医学对FD功能性消化不良的认识 |
| 1.1 病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 中医辨证分析 |
| 2 现代医学对FD的认识 |
| 2.1 FD的概念及诊断标准 |
| 2.2 FD的流行病学 |
| 2.3 现代医学对FD发病机制的认识 |
| 2.4 FD的治疗现状 |
| 3 穴位的选择 |
| 4 Ghrelin与 FD |
| 5 mTOR通路与Ghrelin |
| 6 电针通过mTOR调节FD大鼠Ghrelin的机制研究 |
| 7 本研究创新点 |
| 8 问题与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 文献综述 mTOR信号通路在胃肠疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二:论文发表情况 |
| 致谢 |
（2）慢性间歇性低氧状态mTOR/NF-κB通路参与BDNF介导的大鼠海马原代神经元突触可塑性调控及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 mTOR通路在睡眠呼吸暂停低通气综合征认知研究中的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表的学术论文目录 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）S100A10调控胃癌转移和增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 S100A10在早期胃癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 S100A10促进胃癌转移的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 S100A10通过调控糖酵解促进胃癌增殖的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 S100A10与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英语论文1 |
| 英语论文2 |
（4）基于网络药理学的丹参提取物对非小细胞肺癌的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献研究 |
| 综述一 非小细胞肺癌的诊断与治疗进展 |
| 1. 流行病学 |
| 2. 危险因素 |
| 3. 肺癌筛查 |
| 4. 诊断和分期 |
| 5. 治疗方法 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 丹参抗肿瘤研究进展 |
| 1. 丹参抗肿瘤作用的本草考证 |
| 2. 丹参的活性成分 |
| 3. 丹参抗肿瘤作用的临床研究 |
| 4. 丹参抗肿瘤的机制研究 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 代谢重编程与肿瘤的关系 |
| 1. 代谢重编程的内容 |
| 2. 代谢重编程与基因突变的关系 |
| 3. 代谢重编程过程中大分子的生物合成 |
| 4. 代谢重编程在癌症诊断中的应用 |
| 5. 代谢重编程与肿瘤治疗 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 采用网络药理学概述丹参主要成分对NSCLC的作用研究 |
| 前言 |
| 第一节 丹参化学成分检索和筛选 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 第二节 丹参酮ⅡA药物-靶点和非小细胞肺癌疾病-靶点的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 第三节 丹参酮ⅡA -NSCLC-核心靶点网络的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 第四节 核心靶点生物功能注释分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 细胞实验 |
| 前言 |
| 实验一 TanⅡA对A549细胞增殖的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 小结 |
| 实验二 Tan ⅡA对A549细胞葡萄糖摄入量的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验三 Tan ⅡA对A549细胞ATP产量的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验四: 丹参酮ⅡA对A549细胞乳酸产量的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验五 Tan ⅡA对A549细胞迁移的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验六 Tan ⅡA对A549细胞侵袭转移的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验七 Tan ⅡA对A549细胞超微结构的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 小结 |
| 实验八 Tan ⅡA对A549细胞线粒体膜电位的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验九 Tan ⅡA对A549细胞线粒体通透性转化孔的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验十 Tan ⅡA对A549细胞有氧糖酵解相关分子蛋白表达的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验十一 Tan ⅡA对A549细胞有氧糖酵解相关分子机制mRNA表达的影响 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 实验十二 Tan ⅡA对A549细胞VEGF-A表达的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 第四章 动物实验 |
| 实验一 裸鼠A549细胞皮下移植瘤模型的建立 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 小结 |
| 实验二 Tan ⅡA对荷瘤裸鼠体重和肿瘤大小的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 分组和给药 |
| 3. 取材与固定 |
| 4. 统计分析 |
| 5. 结果 |
| 6. 小结 |
| 实验三 通过HE染色观察TanⅡA对荷瘤裸鼠肺脏组织和肿瘤组织病理变化的影响 |
| 1. 组织切片 |
| 2. HE染色 |
| 3. 结果 |
| 4. 小结 |
| 实验四 免疫组化检测Tan ⅡA对肿瘤有氧糖酵解相关分子机制的影响 |
| 1. 材料和试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 结果 |
| 5. 小结 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 引言 |
| 1.1 肝癌基本概况 |
| 1.2 PEBP4 概况 |
| 1.2.1 PEBP4 的结构,分布和功能 |
| 1.2.2 PEBP4 在肿瘤中的作用 |
| 1.2.3 PEBP4 参与的信号通路 |
| 1.3 Akt概况 |
| 1.3.1 Akt的结构,生物学功能和调节 |
| 1.3.2 Akt与肿瘤 |
| 1.4 mTOR概况 |
| 1.4.1 mTOR复合物 |
| 1.4.2 mTOR信号通路 |
| 1.4.3 mTOR与肿瘤 |
| 1.5 EMT概况 |
| 1.5.1 EMT特征和功能 |
| 1.5.2 诱导EMT因素和相关信号通路 |
| 1.5.3 EMT与肿瘤 |
| 1.6 本课题研究内容与创新之处 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 主要创新之处 |
| 第二部分 PEBP4 对肝癌细胞生物行为学的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组化 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 WB |
| 2.2.4 qPCR检测组织PEBP4的m RNA表达水平 |
| 2.2.5 质粒扩增: |
| 2.2.6 sh-PEBP4 敲低 MHCC97H中 PEBP4,构建敲低 PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.2.7 用PCMV6-PEBP4 过表达MHCC97L中的PEBP4,构建过表达PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.2.8 细胞活力测定 |
| 2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.10 克隆形成实验 |
| 2.2.11 Transwell实验 |
| 2.2.12 增殖模型构建(皮下移植模型) |
| 2.2.13 肺转移模型构建 |
| 2.2.14 形态学观察(肺部组织HE染色) |
| 2.2.15 统计学分析:采用SPSS软件对实验结果行统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PEBP4 在肝癌组织和细胞中高表达 |
| 2.3.2 构建敲低和过表达PEBP4 的稳定细胞系 |
| 2.3.3 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞的生长 |
| 2.3.4 过表达 PEBP4 促进肝癌细胞的生长 |
| 2.3.5 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 2.3.6 过表达PEBP4 促进肝癌细胞的迁移和侵袭 |
| 2.3.7 敲低PEBP4 抑制异体移植瘤的生长 |
| 2.3.8 过表达PEBP4 促进异体移植瘤的生长 |
| 2.3.9 敲低PEBP4 抑制肝癌细胞肺转移 |
| 2.3.10 过表达PEBP4 促进肝癌细胞肺转移 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 WB检测敲低和过表达PEBP4 细胞系中Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.3 免疫荧光检测敲低和过表达PEBP4 细胞系中E-cadherin和N-cadherin的表达 |
| 3.2.4 IGF-1 刺激敲低PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.5 Akt抑制剂MK-2206 处理过表达PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.6 Akt-S473D感染敲低PEBP4 细胞系,WB检测Akt/mTOR信号通路以及EMT的改变 |
| 3.2.7 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达PEBP4细胞系,CCK8 检测细胞增殖能力 |
| 3.2.8 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达PEBP4细胞系,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.2.9 Akt-S473D和 Akt抑制剂MK-2206 分别处理敲低和过表达 PEBP4细胞系,免疫荧光检测E-cadherin和 N-cadherin的表达 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 敲低PEBP4 下调Akt/mTOR信号通路 |
| 3.3.2 过表达PEBP4 上调Akt/mTOR信号通路 |
| 3.3.3 PEBP4 参与Akt/mTOR信号通路活化 |
| 3.3.4 PEBP4 促进Akt/mTOR信号通路活化 |
| 3.3.5 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 3.3.6 敲低PEBP4 抑制EMT进展 |
| 3.3.7 过表达PEBP4 促进EMT进展 |
| 3.3.8 PEBP4 可能通过Akt/mTOR信号通路调节EMT的进展 |
| 3.3.9 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路调节E-cadherin和 N-cadherin的表达 |
| 3.3.10 PEBP4 通过Akt/mTOR信号通路促进EMT的进展 |
| 3.4 讨论 |
| 第四部分 探讨PEBP4、Akt、mTOR之间的关系 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 免疫共沉淀 |
| 4.2.3 N-myc-PEBP4 质粒扩增 |
| 4.2.4 N-myc-PEBP4 转染HEK293T用于免疫共沉淀 |
| 4.2.5 siRNA-mTOR转染HEK293T细胞用于验证siRNA敲低效果 |
| 4.2.6 siRNA-mTOR转染HEK293T细胞用于免疫共沉淀 |
| 4.2.7 Western blot |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PEBP4、Akt、mTOR之间具有相互作用 |
| 4.3.2 mTOR可能通过Akt与 PEBP4 发生作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第五部分 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 NF-κB 信号通路在肝细胞癌作用中的研究进展 |
| References |
（6）理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎伴肠化的疗效与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生的中医学认识 |
| 1 中医病名认识 |
| 2 古代医家对慢性萎缩性胃炎的认识 |
| 3 现代医家对慢性萎缩性胃炎的认识 |
| 4 现代医家辨证论治特点 |
| 5 辨病专方治疗 |
| 6 中成药治疗 |
| 7 中医药治疗慢性萎缩性胃炎的机制 |
| 8 理气活血解毒法 |
| 9 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生的现代医学研究现状 |
| 1 病因 |
| 2 HIF-1α信号通路在CAG伴IM及胃癌中的研究进展 |
| 3 VEGF、mTOR、NF-κB在HIF-1α信号通路及CAG伴IM中的研究进展 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床疗效及机制研究 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 中止病例标准 |
| 1.6 安全性指标 |
| 2 研究内容与方法 |
| 2.1 临床疗效研究 |
| 2.2 免疫组化实验 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 一般情况 |
| 3.2 慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生临床症状疗效评价 |
| 3.3 慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生治疗前后病理组织学疗效评价 |
| 3.4 各免疫组化指标治疗前后平均光密度值及阳性率情况 |
| 4 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 一般情况 |
| 5.2 症状及病理改善情况分析 |
| 5.3 组方药物现代药理学研究 |
| 5.4 理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生的作用 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）基于PI3K/AKT/mTOR通路探讨固正消癌方调节PTEN治疗大肠癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及PTEN在肠癌组织中的含量 |
| 1. 免疫组化法检测临床标本中PTEN、PI3K、mTOR、Akt蛋白的含量 |
| 1.1 临床标本采集 |
| 1.2 免疫组化试剂 |
| 1.3 免疫组化仪器设备 |
| 1.4 免疫组化试验方法 |
| 1.5 免疫组化结果判读 |
| 2. q-PCR检测临床标本中PTEN、PI3K、mTOR、Akt mRNA的含量 |
| 2.1 材料与分组 |
| 2.2 实验仪器及材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 免疫组化法检测pTEN及PI3K/AKT/mTORt通路蛋白在肿瘤及癌旁组织表达量 |
| 4.2 q-PCR检测PTEN及PI3K/AKT/mTORt通路相关蛋白在肿瘤及癌旁组织中表达量 |
| 5. 本章小结 |
| 第二章 固正消癌方对PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及PTEN基因的影响 |
| 1. 实验准备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 裸鼠皮下大肠癌模型建立 |
| 2.2 分组 |
| 2.3 给药 |
| 2.4 实验观察项目 |
| 2.5 瘤体采集 |
| 2.6. Western Blot法 |
| 2.7. 免疫组化法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 固本消癌方对裸鼠肠癌皮下种植瘤的影响 |
| 4.2 固本消癌方对荷瘤鼠模型下PI3K-AKT-mTOR通路相关蛋白及PTEN的影响 |
| 5. 本章小结 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 总结 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 不足与展望 |
| 2.1 不足 |
| 2.2 展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 综述 PI3K/AKT/mTOR通路及PTEN与肠癌的相关性 |
| 参考文献 |
| 附录 中英对照表 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）双靶向抑制PI3K/mTOR通过p62降解Mcl-1诱导卵巢癌细胞凋亡机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路与卵巢癌 |
| 1.1.1 卵巢癌概述 |
| 1.1.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 1.1.3 PI3K/AKT/mTOR信号通路与卵巢癌发生、发展及耐药 |
| 1.1.4 靶向PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂在卵巢癌中的应用 |
| 1.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路参与调控细胞线粒体功能及自噬网络 |
| 1.2.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路与线粒体 |
| 1.2.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路与自噬 |
| 1.3 多功能蛋白p62与自噬 |
| 1.3.1 多功能蛋白p62 |
| 1.3.2 翻译后修饰影响p62介导的自噬 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 双靶向抑制PI3K/mTOR通路诱导卵巢癌细胞线粒体途径凋亡的机制研究 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 双靶向抑制PI3K/mTOR通过p62磷酸化介导的自噬途径降解Mcl-1的机制研究 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）PD-L1在下咽鳞癌中的表达及其在调控FaDu细胞侵袭转移中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 PD-L1在下咽鳞癌中的表达及其与临床病理学特征的相关性研究 |
| 研究背景 |
| 材料方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 PD-L1调控下咽癌FaDu细胞侵袭转移的潜在作用机制研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文附文一 |
| 英文附文二 |
（10）ARNTL2基因在人结肠癌侵袭和迁移中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 结肠癌流行病学 |
| 1.2 结肠癌的增殖、侵袭与转移 |
| 1.3 结肠癌的治疗和预后 |
| 1.4 时钟基因ARNTL与结肠癌 |
| 第一章 生物信息学分析ARNTL2在结肠癌中的表达及与生存预后的关系 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. ARNTL2基因在GEO、Oncomine、TCGA数据库结肠癌数据分析 |
| 2. 差异基因的功能富集分析 |
| 3. 数据库中ARNTL2的共表达基因相关性分析 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第二章 结肠癌病理组织和结肠癌细胞中ARNTL2表达的检测 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 人结肠癌组织中ARNTL2中的表达及与临床病理参数分析 |
| 2. Westem Blot检测ARNTL2在人结肠癌细胞中的表达 |
| 3. 细胞免疫荧光检测ARNTL2在人结肠癌细胞株中的表达 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第三章 ARNTL2基因敲除对结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. ARNTL2-siRNA荧光标记观察转染效率 |
| 2. Real-Time PCR及Western Blot检测ARNTL2 siRNA干扰效果 |
| 3. ARNTL2 siRNA对结肠癌细胞体外增殖及迁移的影响 |
| 4. ARNTL2基因敲除对结肠癌细胞体内生长的影响 |
| 5. ARNTL2基因敲除对裸鼠成瘤ARNTL2和Ki-67表达的影响 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第四章 沉默ARNTL2抑制结肠癌细胞生长及迁移的机制 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. Western Blot检测ARNTL2基因干扰后SMOC2-EMT表达变化 |
| 2. Western Blot检测ARNTL2基因干扰后PI3K/AKT表达变化 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 第五章 SC-79对ARNTL2-siRNA转染结肠癌细胞后的沉默效应的影响 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 1. SC-79对结肠癌细胞ARNTL2-siRNA细胞生长时间影响 |
| 2. SC-79对结肠癌细胞ARNTL2-siRNA克隆形成影响 |
| 3. SC-79对结肠癌细胞ARNTL2-siRNA基因沉默后PI3K/AKT信号通路影响 |
| 三、结论 |
| 四、讨论 |
| 全文讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词注解 |
| 攻读博士期间所发表论文 |
| 致谢 |
四、mTOR信号通路及其与肿瘤的联系（论文参考文献）
- [1]电针对FD模型大鼠mTOR信号通路调节Ghrelin机制研究[D]. 曾毅. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]慢性间歇性低氧状态mTOR/NF-κB通路参与BDNF介导的大鼠海马原代神经元突触可塑性调控及机制[D]. 张初琴. 山东大学, 2021(12)
- [3]S100A10调控胃癌转移和增殖的机制研究[D]. 李妍. 山东大学, 2021(11)
- [4]基于网络药理学的丹参提取物对非小细胞肺癌的作用及其机制研究[D]. 孙满强. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]磷脂酰乙醇胺结合蛋白4对肝癌细胞生物行为学的影响及其机制研究[D]. 陈琼锋. 南昌大学, 2021(01)
- [6]理气活血解毒法治疗慢性萎缩性胃炎伴肠化的疗效与机制研究[D]. 林稼樱. 北京中医药大学, 2021(08)
- [7]基于PI3K/AKT/mTOR通路探讨固正消癌方调节PTEN治疗大肠癌的作用机制[D]. 陈雪. 南京中医药大学, 2021(01)
- [8]双靶向抑制PI3K/mTOR通过p62降解Mcl-1诱导卵巢癌细胞凋亡机制的研究[D]. 胡晓青. 吉林大学, 2020(02)
- [9]PD-L1在下咽鳞癌中的表达及其在调控FaDu细胞侵袭转移中的作用机制研究[D]. 崔鹏. 山东大学, 2020(04)
- [10]ARNTL2基因在人结肠癌侵袭和迁移中的作用及分子机制研究[D]. 卢敏. 南方医科大学, 2020(06)