一、SYNERGISTIC EFFICACY OF ADENOVIRUS-MEDIATED BCL-XS GENE TRANSFER AND TOPOTECAN IN OVARIAN CANCER CELL（论文文献综述）
李艳青[1]（2021）在《PGC1α通过HSP70/HK2/VDAC1途径参与卵巢癌顺铂耐药机制的研究》文中指出背景:顺铂耐药仍然是卵巢癌治疗的瓶颈。随着凋亡研究的逐步深入,人们认识到化疗药物除了通过同各自的靶点直接作用外,也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。因此肿瘤细胞凋亡受到抑制时,可导致顺铂耐药性的产生。此外,线粒体不仅是肿瘤细胞调控凋亡的关键,也是肿瘤细胞发生化疗耐药的核心环节。20世纪20年代,Otto Warburg认为肿瘤细胞“抛弃”线粒体更倾向于利用有氧糖酵解满足其能量需求。但是越来越多的研究表明肿瘤细胞为了应对化疗药物等的应激,可以通过线粒体生物合成等线粒体适应性机制抵抗线粒体途径凋亡,促进细胞的存活。因此,线粒体生物合成相关分子在调控线粒体途径凋亡中的作用机制急需被探索。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）辅激活因子-1α（PPARG coactivator 1 alpha,PGC1α）作为线粒体生物合成的主要调控者,与肿瘤细胞线粒体能量代谢、细胞凋亡密切相关。Sancho P等人发现PGC1α可以通过增加抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（BCL2 apoptosis regulator,BCL2）等表达,减少促凋亡蛋白 BCL2 相关 X 蛋白（BCL2 associated X,apoptosis regulator,BAX）等表达来抵抗胰腺癌细胞凋亡。课题组早期结果也发现,与卵巢癌SKOV3细胞相比,卵巢癌顺铂耐药的SKOV3/CDDP细胞线粒体生物合成水平较高。此外,PGC1α在SKOV3/CDDP细胞中表达上调,特异性敲减PGC1α发现SKOV3/CDDP细胞的抗凋亡蛋白BCL2表达下降,促凋亡蛋白BAX表达增加,线粒体途径凋亡增加。然而,线粒体途径凋亡机制复杂,简单的表达差异并不能清楚地解释PGC1α调控SKOV3/CDDP细胞凋亡的具体机制,仍需要我们进一步探究。线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeablity transition pore,MPTP）的开放是线粒体途径凋亡级联效应的开始,随后凋亡诱导因子、细胞色素C等因子释放到细胞质,进而激活半胱氨酸天冬蛋白酶等凋亡下游因子促进细胞凋亡。因此,MPTP开放是线粒体途径凋亡的关键步骤之一。此外,己糖激酶2（hexokinase 2,HK2）作为MPTP重要的组成成员之一,在线粒体中可以通过与电压依赖性阴离子通道蛋白1（voltage-dependent anion channel,VDAC1）结合,维持 MPTP 的关闭,抑制细胞凋亡。Angelova等人研究发现线粒体分裂蛋白（mitochondrial fission factor,Mff）可以减少HK2与VDAC1的结合并促进MPTP的开放,导致细胞凋亡。此外,线粒体糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3B）也可以通过减少 HK2 与 VDAC1 的结合以开放MPTP,导致黑色素瘤细胞的凋亡。由于HK2与VDAC1的结合受线粒体相关蛋白的调节,而PGC1α作为线粒体生物合成的主要调控分子,与这些线粒体相关蛋白密切相关。因此,探讨HK2/VDAC1信号通路可能为PGC1α调控耐药细胞线粒体途径凋亡的机制提供新的思路。热休克蛋白/伴侣蛋白家族（heat shock protein,HSPs）具有将蛋白质运输到线粒体的功能。其中,HSP70是HSPs家族最主要的成员之一,它可以协助J蛋白等蛋白转运至线粒体。此外,Henry Aceros等人发现HSP70保护剂可以减少心肌缺血再灌注时MPTP的开放进而减少心肌细胞的凋亡。Liang-Jun Yan等人在调控HSP70的转录的HSF1基因敲除小鼠中发现肾脏细胞MPTP的开放,诱导了线粒体膜电位下降。已知HK2-VDAC1是MPTP开放的核心机制。因此,HSP70可能通过HK2/VDAC1信号通路调控MPTP的开放。进一步有研究发现PGC1α可以通过促进HSP70等蛋白的表达,减少小鼠肝脏、肾脏和成纤维细胞中的热应激损伤。然而,在顺铂化疗药物的应激下,HSP70和PGC1α的复杂作用机制并不清楚。提示通过研究HSP70和HK2在线粒体途径凋亡中的机制可能为PGC1α调控卵巢癌顺铂耐药细胞凋亡提供新的策略。综上我们提出假设:在顺铂的应激下,PGC1α通过调节HSP70的表达,其可以促进HK2与VDAC1的结合,减少MPTP的开放,增强了卵巢癌顺铂化疗耐药。通过抑制PGC1α,可以减少HSP70的表达,进而减少HK2与VDAC1的结合,增加了 MPTP的开放,逆转了卵巢癌顺铂化疗耐药。目的:本实验从抑制PGC1α调控线粒体途径凋亡增加顺铂敏感性的角度入手,探讨影响线粒体途径凋亡MPTP开放的因素,以阐明线粒体生物合成与凋亡的调控机制,为靶向PGC1α治疗卵巢癌顺铂耐药提供依据。方法:（1）以人卵巢癌获得性顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP与其亲本细胞SKOV3、卵巢癌获得性顺铂耐药细胞A2780/CDDP细胞与其亲本细胞A2780细胞为研究对象,Western Blot检测PGC1α的蛋白表达。（2）构建PGC1α-shRNA特异性敲减质粒,在卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP和A2780/CDDP中特异性敲减PGC1α,MTT检测在不同浓度顺铂作用下细胞的活力;Western Blot检测抗凋亡蛋白BCL2、促凋亡蛋白BAX、凋亡下游效应分子c-caspase3的蛋白表达;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1染色）联合流式细胞术检测SKOV3/CDDP细胞线粒体膜电位。（3）在 SKOV3/CDDP 和 A2780/CDDP 细胞中特异性敲减 PGC1α,Western Blot检测MPTP相关分子蛋白水平的改变;RT-qPCR检测细胞中MPTP相关分子mRNA水平的改变。（4）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α,并给予顺铂刺激,线粒体提取实验检测细胞中HK2在线粒体的蛋白表达水平;Mitotracker着色线粒体,免疫荧光检测HK2与线粒体的共定位。（5）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α,并给予顺铂刺激,免疫共沉淀检测HK2与VDAC1的结合;免疫荧光检测HK2与VDAC1的共定位。（6）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α,转录组测序检测具有蛋白转运功能家族分子的mRNA;Western Blot检测热休克蛋白家族的蛋白表达。（7）构建调控HSP70的转录的HSF1基因荧光素酶报告基因质粒,荧光素酶报告基因实验检测PGC1α能否在转录水平上调控HSP70的表达。（8）构建HSP70过表达质粒,在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC1α小分子抑制剂SR-18292,同时过表达HSP70。线粒体提取实验检测HK2在线粒体上的蛋白水平表达;免疫共沉淀检测HK2与VDAC1的结合;JC-1染色联合流式细胞术检测线粒体膜电位;AnnexinV/PI染色联合流式细胞术检测细胞凋亡。（9）构建HSP70 SBD结构域400氨基酸位点突变过表达质粒（HSP70 S400K）,在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC1α小分子抑制剂SR-18292,同时过表达HSP70或HSP70S400K。线粒体提取实验检测HK2在线粒体上的蛋白水平表达;免疫共沉淀检测HK2与VDAC1的结合。结果:（1）与卵巢癌亲本SKOV3和A2780细胞相比,Western Blot检测发现卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/CDDP和A2780/CDDP具有较高的PGC1α表达水平。特异性敲减PGC1α之后,MTT检测发现SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞对顺铂的敏感性增加;Western Blot检测发现SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞抗凋亡相关蛋白BCL2减少,促凋亡蛋白BAX增加,凋亡下游因子c-caspase3增加;JC-1染色联合流式细胞术检测发现SKOV3/CDDP细胞线粒体膜电位下降。（2）在 SKOV3/CDDP 和 A2780/CDDP 细胞中特异性敲减 PGC1α后,Western Blot和RT-qPCR检测发现MPTP相关分子蛋白水平和mRNA水平没有显着性改变。（3）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α并给予顺铂刺激后,线粒体提取和免疫荧光实验检测发现HK2在线粒体上的表达减少;免疫共沉淀和免疫荧光实验检测发现HK2与VDAC1的结合减少。（4）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中特异性敲减PGC1α后,转录组测序发现热休克相关蛋白具有表达差异;Western Blot检测发现HSP70蛋白表达水平下降。荧光素酶报告基因实验发现,PGC1α可以促进调控HSP70表达的HSF1基因的转录。（5）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC1 α小分子抑制剂SR-18292,并同时过表达HSP70质粒后,线粒体提取实验检测发现HK2在线粒体的表达增加;免疫共沉淀检测发现HK2与VDAC1的结合增加;AnnexinV/PI染色联合流式细胞术检测发现细胞凋亡减少。（6）在SKOV3/CDDP和A2780/CDDP细胞中使用PGC 1 α小分子抑制剂SR-18292,并同时过表达HSP70或HSP70 S400K质粒后,线粒体提取实验检测发现与过表达HSP70相比,过表达HSP70 S400K后,HK2在线粒体上表达减少;免疫共沉淀检测发现与过表达HSP70相比,过表达HSP70 S400K后,HK2与VDAC1的结合减少。结论:（1）PGC1α可能通过调控线粒体途径凋亡参与了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。（2）PGC1α可能通过调控HSP70介导了 HK2在线粒体中的表达以及与VDAC1的结合,减少了 MPTP的开放和线粒体凋亡,进而参与了卵巢癌顺铂耐药。（3）HSP70 SBD结构域400氨基酸位点促进了PGC1α介导的HK2在线粒体上的表达以及与VDAC1的结合。
黄暨生[2]（2016）在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中认为恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段（如手术治疗、放疗、化疗等）后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能（GJIC）的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯（GJIC）功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP（tk+）细胞混合A375（tk-）细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高（P<0.05）,说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能（即缝隙连接机制）发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。
陈昌贤[3]（2013）在《卵巢上皮癌多药耐药分子机制生物信息学研究》文中研究说明第一章卵巢上皮癌多药耐药分子机制研究现况（文献综述）近年来,卵巢上皮癌复发率高、生存率低等问题一直未得到根本性的解决,这一问题严重威胁了妇女的健康和生命。化疗是卵巢上皮癌重要治疗手段。尽管卵巢上皮癌患者对化疗的初始反应率较高,但多数患者仍会复发和死亡。卵巢上皮癌多药耐药的产生是导致化疗失败的中心环节。卵巢上皮癌多药耐药的产生可能涉及到细胞内化疗药物外排、细胞内化疗药物代谢解毒增加、DNA损伤与修复、信号传导通路障碍和细胞凋亡异常等分子机制。但其耐药机制非常复杂,通过使用循证医学、生物信息学等多样化研究手段搭建基础到临床的研究桥梁,或许能更好阐明卵巢上皮癌多药耐药分子机制,并为临床实践寻找卵巢上皮癌药物治疗靶点提供理论基础。第二章卵巢上皮癌多药耐药相关基因的生物信息学分析目的：筛选与挖掘卵巢上皮癌多药耐药相关基因及其生物信息。方法：基于4套来源不同的卵巢上皮癌化疗耐药与敏感基因芯片表达谱数据,采用重叠一致对比的研究方法,筛选和挖掘4套芯片数据集重叠性和一致性较高的通路及相应的基因,进而结合文本挖掘的方法,从文献水平上和疾病水平上挖掘出卵巢上皮癌多药耐药相关基因。结果：4套卵巢癌芯片数据集中,重叠性和一致性较高的通路有18条,包括MAPK信号通路、泛素介导的蛋白质水解、轴突导向、焦点粘连、生成信号通路、肿瘤通路、肾细胞癌、柠檬酸循环、类萜骨干生物合成、错配修复和亨廷顿氏舞蹈病等上调通路（P<0.05）以及甘油脂、戊醣酸途径、果糖和甘露糖代谢、谷胱甘肽代谢、蛋白酶体、p53信号通路和溶酶体等下调通路（P<0.05）。对这些通路中重叠一致的基因进行文本挖掘,挖掘出ACO1、BDNF、CXCR4、HMGCR和NRP1等5个上调表达基因（P<0.05）和CDKN2C、FAS和SKP2等3个下调表达基因（P<0.05）可能参与卵巢上皮癌多药耐药机制的形成。结论：卵巢上皮癌多药耐药机制的形成可能涉及到多种不同的途径和基因。ACO1、 BDNF、CXCR4、HMGCR、NRP1、CDKN2C、FAS和SKP2等基因可能在其中发挥着关键作用,后续研究将对进行基因进行临床验证。第三章卵巢上皮癌多药耐药相关基因表达的临床病理和预后意义目的：探讨卵巢上皮癌多药耐药相关基因表达的临床病理和预后意义。方法：利用现有临床资料和基因芯片数据,在前期研究基础上，联合使用倍数分析、成组t检验、Spearman相关系数、Kaplan-Meier法生存分析和Cox回归模型对ACO1、 BDNF、CXCR4、HMGCR、NRP1、CDKN2C、FAS和SKP2等8个基因表达情况进行分析,并探讨其与卵巢上皮癌铂类药物化疗反应、临床病理因素和预后意义。结果：8个基因中,NRP1在卵巢上皮癌耐药组织中处于显着上调表达（P<0.05）,而CXCR4显着下调表达（P<0.05）。FAS表达水平与患者年龄存在极弱的负性相关关系（Spearman相关系数为-0.138,P<0.05）；HMGCR表达水平与患者FIGO分期存在极弱的负性相关关系（Spearman相关系数为-0.109,P<0.05）。Cox逐步回归分析结果显示,NRP1表达水平与患者无进展生存时间显着相关（RHR:3.166,95%CI:1.284-7.808, P<0.05）, SKP2与患者总生存时间显着相关（RHR:1.963,95%CI:1.208-3.191, P<0.05）。结论：NRP1可能是卵巢上皮癌化疗耐药关键基因,是卵巢上皮癌潜在的化疗反应和预后预测指标和潜在的药物治疗靶点。需要进一步研究探讨NRP1在卵巢上皮癌化疗反应和预后方面的预测价值。第四章基于microRNA调控网络预测卵巢上皮癌多药耐药相关基因目的：利用已知microRNAs预测卵巢上皮癌多药耐药相关基因。方法：通过文献挖掘方法查找出2013年5月以前公开报道的并经实验验证与卵巢癌化疗耐药有关的microRNAs,分别对Targe tScan和PicTar数据库进行microRNA-靶基因数据挖掘,并将这些数据与ACO1、BDNF、CXCR4、HMGCR、NRP1、CDKN2C、FAS和SKP2等进行对接,单独利用TargetScan中的microRNA-靶基因数据进行microRNA调控网络构建,最后利用PicTar数据库中microRNA-靶基因数据对microRNA调控网络进行测试。结果：文献挖掘出11个与卵巢癌化疗耐药相关的microRNAs,利用TargetScan数据库中micro RNA-靶基因数据进行microRNA调控网络构建,只有ACO1、BDNF、 HMGCR、NRP1和FAS等5个基因处于microRNA调控网络中,其中NRP1是microRNA调控网络中最重要的Hub-基因,并且只有NRP1被PicTur数据库中microRNA调控网络测试到。结论：利用已知microRNAs构建microRNA调控网络进而预测卵巢上皮癌多药耐药相关基因是一种行之有效的方法。本章节研究同样表明,NRP1在卵巢上皮癌化疗耐药形成中扮演着重要的角色,是卵巢上皮癌潜在的药物靶点。
刘轶平[4]（2013）在《蛋白质组学技术筛选弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关蛋白的初步研究》文中进行了进一步梳理淋巴瘤是我国常见恶性肿瘤,可分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma, HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）两大类,我国淋巴瘤患者中约90%为非霍奇金淋巴瘤,而弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是NHL中最常见的亚型,约占全部NHL的30-40%。目前化疗仍然是治疗DLBCL的主要措施,但其整体5年生存率仍不足50%,临床上DLBCL难治的原因主要是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药,故研究DLBCL耐药机制是提高DLBCL患者疗效的关键。对化疗敏感性不同的DLBCL组织进行差异蛋白质组学分析,高通量地筛选凋亡及耐药相关蛋白,可望发现与化疗耐药相关的蛋白,为筛选肿瘤耐药的分子标志物及逆转耐药的靶向治疗提供新的思路。第一章化疗敏感性不同的DLBCL组织差异表达蛋白的蛋白质组学研究目的：本研究通过蛋白质组学方法分离鉴定CHOP方案化疗高敏感组和低敏感组的DLBCL组织的差异表达蛋白,为确定在淋巴瘤化疗增敏中其关键作用的分子以及化疗敏感性预测的标志物提供重要依据。方法：收集DLBCL新鲜组织标本,根据CHOP化疗药物敏感性试验分为化疗低敏感组和高敏感组,采用2-DE+MALDI-TOF-TOF-MS方法进行两组间差异蛋白质鉴定,获得了DLBCL化疗耐药相关蛋白差异表达谱,并对鉴定的差异表达分子进行生物信息学分析。对其中部分差异表达蛋白（EZR、PLEK、GSTP1和HSPB1）的表达水平进行Western Blot验证,观察这四种蛋白的表达与DLBCL的化疗敏感性的关系。结果：蛋白质组学方法获得了CHOP方案化疗高敏感组和低敏感组的DLBCL组织的差异蛋白表达谱,并鉴定了其中19个差异表达蛋白,包括：S100A9、醛脱氢酶1、膜联蛋白A5、埃兹蛋白（ezrin）、plecstrin （PLEK）、组蛋白H2A.2、4-kDa组氨酸磷酸酶、14-3-3ε、61-KD肿瘤相关抗原蛋白、胶原蛋白α1、血清铁蛋白、6-磷酸化葡糖酸内酯酶、Rab GDP解离抑制因子、冠蛋白样蛋白、人异质性胞核核糖核蛋白H3同工型a、前体RNA处理因子19、3-羟酰基辅酶A脱氢酶、谷胱甘肽S-转硫酶及热休克蛋白27。生物信息学分析显示这些蛋白功能涉及代谢相关酶,细胞通讯,细胞周期,免疫反应,应激反应,细胞结构,分子伴侣,基因稳定性,蛋白合成及转运等相关信号通路等,并且部分分子可能通过信号转导网络相互作用。进一步应用Western Blot对两组中四个蛋白EZR、 PLEK、GSTP1和HSPB1差异表达情况进行验证,结果显示EZR和PLEK在化疗高敏感组中的表达高于化疗低敏感组,而GSTP1和HSPB1在化疗高敏感组中的表达低于化疗低敏感组。证明蛋白质组研究结果有较好的重复性,所检测的四种蛋白在化疗敏感性方面具有重要意义。结论：1.2-DE结合质谱获得了DLBCL组织CHOP方案化疗耐药相关差异蛋白表达谱；2.获得了19个与DLBCL组织CHOP方案化疗耐药相关差异蛋白,这些蛋白功能涉及代谢相关酶,细胞通讯,细胞周期,应激反应,细胞结构,分子伴侣,基因稳定性,蛋白合成及转运等相关信号通路等,部分分子可能通过信号转导网络相互作用；3. EZR、PLEK、GSTP1和HSPB1经Western Blot验证与DLBCL化疗敏感性有关。第二章部分差异蛋白在化疗敏感性不同的DLBCL组织中表达的临床病理研究及HSP27表达对DLBCL化疗敏感性的影响目的：本研究进一步用免疫组织化学方法检测这四种蛋白在临床样本中表达的意义,并从体外细胞分子生物学水平探讨HSP27表达在弥漫性大B细胞淋巴瘤化疗敏感性中的作用及机制。方法：对蛋白质组学鉴定的部分差异表达蛋白（EZR、PLEK、 GSTP1和HSPB1）的表达水平进行IHC验证,观察这四种蛋白的表达与DLBCL的化疗敏感性的关系。进一步采用shRNA阻断HSP27表达后,Western Blot验证阻断效果并检测14-3-3ε的表达；检测Farage-LV-HSP27-shRNA细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的IC50值和耐药指数；流式细胞术检测阻断Farage细胞中HSP27的表达水平后,阿霉素、环磷酰胺、长春新碱对瘤细胞促凋亡相关作用效应的改变。结果：进一步用免疫组织化学方法检测这四种蛋白在临床样本中表达的意义,临床组织标本也根据化疗疗效分为化疗高敏感组和低敏感组,结果与蛋白质组学结果和Western Blot结果基本一致。证明蛋白质组学研究结果有较好的重复性,所检测的四种蛋白在化疗敏感性方面具有重要意义。采用shRNA阻断HSP27表达后,Western Blot验证其阻断有效；Farage-LV-HSP27-shRNA细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的IC50较对照细胞显着下降,表明HSP27表达下调可增加弥漫大B淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性；阻断HSP27表达的瘤细胞中凋亡率增加,而在加化疗药阿霉素、环磷酰胺、长春新碱后凋亡率增加更为明显,进一步证明了HSP27的下调能增加Farage细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的敏感性；本研究也发现阻断HSP27可引起14-3-3ε表达下调,提示HSP27介导化疗敏感性相关分子机制可能与14-3-3ε有关。结论：1.阻断HSP27表达可增加DLBCL细胞对阿霉素、环磷酰胺、长春新碱的敏感性；2.14-3-3ε与HSP27的相互作用在弥漫性大B细胞淋巴瘤化疗敏感性中具有意义。
陈文铎[5]（2013）在《10-羟基喜树碱—腺病毒衍生物的合成及抗肿瘤活性研究》文中进行了进一步梳理腺病毒（Adenovirus，Ad）是临床基因治疗中最常见的病毒载体之一，大概占到其中的四分之一。腺病毒载体与其他病毒载体相比，复制能力不高，具有低免疫原、低毒反应、自身基因不整合到宿主基因组等优点；与非病毒载体相比，腺病毒也有高效的转染率。随着近几年纳米材料技术的快速发展，腺病毒载体作为一种新型的纳米材料，不仅仅可以携带外源目的基因，还可以成为药物小分子和抗原、多肽等大分子的载体，从而实现活体成像，药物靶向以及缓慢释放等功能。而喜树碱类药物是临床上治疗肿瘤的有效药物之一，但大部分该类药物因自身复杂的大共轭结构使得其溶解性不好，并且缺乏组织靶向性，对机体也有较大的副作用。作者通过在10-羟基喜树碱（10-Hydroxycamptothecin，HCPT）的10位、20位羟基引入丁二酸基团来改善HCPT的水溶性，提高内酯环的稳定性；并以丁二酸为链接，与腺病毒衣壳蛋白表面的氨基共价偶联，合成一种新型的喜树碱前体药物—10羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒，并用结肠癌细胞检测其对细胞生长的影响。首先，将丁二酸酐与10-羟基喜树碱的10位、20位羟基酯化得到喜树碱衍生物—10，20（S）-O-二琥珀酰羟基喜树碱（10,20（S）-O-disuccinyl-Hydroxycamptothecin，DSH），所得衍生物经核磁共振氢谱进行表征；用水浴搅拌法测定DSH在水中的溶解度；采用MTT比色法检测衍生物对结肠癌细胞SW480的生长抑制；琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段，Hoechst33342染色检测样品是否能诱导细胞凋亡。结果表明，丁二酸酐的羧基成功与10-羟基喜树碱的10位、20位羟基酯化；DSH在水中的溶解度（25℃）为2.3mg，溶解度要比10-羟基喜树碱提高约22倍；肿瘤细胞的生长抑制作用呈剂量/时间依赖性，其半抑制浓度（IC50值）为700nM，效果不如10-羟基喜树碱，推测可能是由于20位的丁二酸基团干扰喜树碱内酯环与拓扑异构酶的作用；而琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯状图谱，Hoechst33342染色表明喜树碱类衍生物可诱导凋亡。其次，通过293A细胞大量扩增含有增强荧光蛋白基因的腺病毒Ad5-EGFP，用CsCl梯度离心法纯化该病毒，TCID50法测得腺病毒的滴度，并且在倒置荧光显微镜下观察腺病毒感染结肠癌细胞SW480后荧光蛋白的表达。结果表明，腺病毒的滴度为1×1010pfu，纯化后的腺病毒Ad5-EGFP可以正常的感染肿瘤细胞，而且感染效率较高。最后，活化DSH的羧基，与腺病毒4℃反应12h，经Sephadex G-25纯化后获得产物10-羟基喜树碱-丁二酸-腺病毒（DSH-Ad）；利用连续波长紫外扫描鉴定复合物，并用DSH回收率法测定DSH与Ad的共价结合分子数；MTT比色法比较DSH-Ad及相应浓度的DSH、HCPT、Ad对结肠癌细胞SW480的生长抑制作用；并在倒置荧光显微镜下观察实验各组分对腺病毒在细胞中荧光蛋白的表达的影响；Hoechst33342染色观察样品对结肠癌细胞株的凋亡诱导情况。结果表明DSH-Ad在腺病毒和10-羟基喜树碱的最大吸收峰260nm、375nm处都有吸收峰，初步表明DSH-Ad的合成成功；经回收率法测的腺病毒与DSH的共价分子结合数为363±24（n=4）；MTT比色法说明DSH-Ad对细胞有较明显的生长抑制作用，并且与相对应的10-羟基喜树碱浓度呈相关性，而相同浓度下的DSH对细胞的生长并没有太大影响，推测可能由于DSH-Ad在进入细胞后，DSH中新生成的酯键被水解为10-羟基喜树碱；荧光显微镜下发现DSH-Ad会严重影响荧光蛋白的表达，而单独的各个实验组分对腺病毒的表达没有太大的影响，表明DSH在与腺病毒同时进入细胞后会干扰荧光蛋白基因与宿主细胞基因组的整合。Hoechst33342染色后发现细胞出现明显的凋亡小体。本实验中构建的共价偶联物即有喜树碱对细胞的有效杀伤作用，又有腺病毒的双靶向性的优点，又改善喜树碱的溶解性和内酯环的稳定性，增加抗肿瘤效果，为开发这一类共价偶联物应用于肿瘤治疗提供必要的实验依据。
李状[6]（2012）在《二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究》文中进行了进一步梳理第一章卵巢癌多药耐药的研究进展（文献综述）卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一。卵巢隐匿于盆腔的深部,早期病变时不易被发现,一旦出现症状时大多属于晚期,治疗后容易复发,死亡率亦一直位居妇科恶性肿瘤之首。目前卵巢癌的治疗目的是早期争取治愈、晚期控制复发、延长生存期及提高患者生活质量。治疗原则是以手术为主,联合化疗及放疗的综合治疗。大多数的情况下,手术是很难将卵巢癌的转移灶彻底的切除干净。对于那些残留的细小的转移和种植结节.都需要化学药物来进行治疗。因此,化疗在卵巢癌治疗的过程中具有极其重大的意义。晚期卵巢癌的治疗方法主要以肿瘤细胞减灭术及术后辅助化疗为主。但化疗失败常会导致卵巢癌的复发,其主要原因在于肿瘤细胞产生的多药耐药（multidrug resistance,MDR）。以顺铂为主的联合化疗对卵巢癌的有效率达40%-60%,由于疾病进展和机体对化疗产生耐药,晚期卵巢癌患者的5年生存率低于20%。所以,多药耐药是肿瘤化疗失败的主要因素之一。因此,肿瘤产生耐药机制的研究以及在临床上预防耐药、对抗耐药并尝试逆转耐药就成为了当前卵巢癌治疗中的热点和难点,成为提高卵巢癌的治疗效果及改善卵巢癌患者生存的重要目标之一。第二章卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义目的探讨卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（?）的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR法测定80例卵巢癌组织、50例良性卵巢组织及30例正常卵巢组织中的DHFR mRNA表达情况,分析其与卵巢癌临床病理及多药耐药的相关性。结果（1）DHFR mRNA表达量在止常卵巢,良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中分别为0.584±0.234,0.895±0.783和0.197±0.412,相比较差异有统计学意义（P<0.001,P=0.027,P<O.001）。（2）卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者临床分期及病理分级无相关（P>O.05）,但在上皮性癌中浆液性癌组织中DHFR mRNA表达量则明显高于粘液性和内膜样癌,相比较差异有统计学意义（P<0.001）。（3）卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者的腹水量,淋巴结转移和远处器官转移无明显相关（P>O.05）,但大网膜转移者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量则低于无转移者（P=0.044）。（4）在卵巢癌患者中治疗后缓解者组织中DHFR mRNA表达量低于肿瘤进展者（P<O.001）；而铂类药物敏感型患者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量也低于铂类药物耐药者（0.130±0.103vs0.341±0.701P=0.011）。（5）DHFR mRNA表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden旨数最大值所对应的数值为0.331, DHFR mRNA表达量高于0.331的患者中位生存时间为16.4个月,而低于0.331的患者中位生存时间为44.5个月,着异有统计学意义（P<0.001）,且COX模型多因素分析亦显示DHFR mRNA表达量为影响预后的独立因素（P=0.018）。结论DHFR mRNA在正常和良性卵巢组织中表达量高于卵巢癌组织,提示DHFR参与正常组织细胞生理代谢；而在卵巢癌中DHFR mRNA在铂类耐药组织中高表达（O.341±0.701）,在铂类敏感组织低表达（0.130±0.103）,提示DHFR与卵巢癌多药耐药相关,可能为判断卵巢癌多药耐药潜在标志之一。第三章二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞系生物学特性影响的体外实验研究目的构建携带人二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的慢病毒表达载体pWPI。方法采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindⅢ及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pWPI-SKOV3细胞、空载pWPI-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下（2.5ug/ml,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1）不同时间段（24h、48h及72h）的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）下三种细胞的周期变化,高效液相法（HPLC法）检测不同顺铂浓度（4.0ug/ml,6.0ug/ml,8.0ug/ml）不同时间段（24h、48h及72h）药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的过表达对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果（1）成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达,将其病毒液感染SKOV3细胞。（2）通过流式细胞仪检测转染DHFR基因的细胞的凋亡变化,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度（2.5ug/ml、5.0ug/m1）刺激下,其24h、48h及72h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度（10.0ug/ml、20.0ug/ml）刺激下,其24h及48h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞,但在72h时,凋亡率却高于SKOV3细胞株。表明DHFR-pWPI-SKOV3细胞在浓度小于5.0ug/ml时,不管时间的改变（72小时内）,其对顺铂的抵抗力高于其他两种细胞。（3）通过流式细胞仪检测不同时间段IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）对三种不同处理卵巢癌细胞的周期变化,结果提示1C50（6.0ug/m1）顺铂浓度给药时,DHFR-pWPI-SKOV3、pWPI-SKOV3及SKOV3三种细胞在24h、48h时其G1期含量明显低于G2+S细胞：而在72h时,DHFR-pWPI-SKOV3细胞的G2+S期明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。（4）采用HPLC法检测细胞内顺铂浓度,结果显示细胞培养液中顺铂浓度（4.0ug/m1）给药24h、48h后及顺铂浓度（6.0ug/m1）给药24h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量均明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；顺铂浓度（6.0ug/m1）给药48h及顺铂浓度（8.0ug/ml）给药24h、48h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量明显高于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。（5）通过电镜观察1C50顺铂浓度在不同时间段刺激三种不同处理的细胞的超微结构改变,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在给药24h及48h其微丝聚集,线粒体从数量上及结构上改变明显,而pWPI-SKOV3细胞微丝少见,线粒体数目减少,但结构改变不明显,SKOV3细胞亦很少见到微丝,但其线粒体的结构改变亦明显,扩张与固缩同时存在；三者均出现扩张的内质网；三者均少见正常的细胞器；在给药72h后,pWPI-SKOV3及SKOV3细胞可见微丝排列紊乱,核膜部分消失,核糖体大量的聚集,进入了明显的坏死阶段,而DHFR-pWPI-SKOV3细胞未见微丝,核膜几乎完全消失,胞质内有白色囊状物质,线粒体结构基本消失,大部分细胞濒临死亡。结论成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,耐药性功能实验表明DHFR表达量增高时卵巢癌细胞系耐药性增加,可以认为DHFR与卵巢癌顺铂的耐药性相关,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。第一节RNA干扰质粒载体的构建及鉴定目的构建二氢叶酸还原酶（DHFR, dyhidrofolate reductase）基因RNAi慢病毒载体,为探讨抑伟DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入p GSCIL载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。结果将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGPU6/GFP/Neo载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,PCR鉴定干扰效果。G418筛选稳定细胞株。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。第二节DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中生物学特性影响目的构建二氢叶酸还原酶（DHFR, dyhidrofolate reductase）基因RNA干扰慢病毒载体,研究其耐药性功能影响,为探讨抑制DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入pGSCIL/GFP载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。Western blot验证构建成功通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pGSCIL-SKOV3细胞、空载pGSCIL-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下（2.5ug/m1,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1）不同时间段（24h、48h及72h）的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度（4.4ug/ml）下三种细胞的周期变化,高效液相法（HPLC法）检测不同顺铂浓度（2.5ug/ml,5.0ug/ml,7.5ug/ml）不同时间段（24h、48h及72h）药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度（4.4ug/m1）下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的沉默对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果（1）将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGSCIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,Western blot鉴定十扰效果。（2）在给药24h、48h及72h,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞的凋亡率随着顺铂浓度（2.5ug/ml、5.0ug/ml、10.0ug/ml、20.0ug/m1）的增大而升高,且DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48h及72h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。（3）在IC50（4.4ug/ml）顺铂浓度给药24h、48h后,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞均以G1期为主。DHFR-pGCSIL-SKOV3在48h时G1期的细胞比例明显减少,S期和G2/M期比例增多,72h后三种细胞G1期的含量均明显降低,S期和G2/M期的含量均增高。（4）采用高效液相检测细胞内顺铂浓度时,当2.5ug/m1、5.0ug/ml顺铂浓度作用三种不同处理的卵巢癌细胞时,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在给药后24h、48h其细胞内顺铂浓度均明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。而DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在7.5ug/ml顺铂浓度给药后24h其细胞内顺铂浓度均明显低于PGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,而在48h却又高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。（5）在IC50（4.4ug/m1）给药24h、48h三种不同处理细胞的微丝均少见,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在24h时可见线粒体肿胀、脊消失、空泡化、萎缩,内质网扩张明显,有聚集的核糖体,末见高尔基体,48h时其有些线粒体溶解消失,且出现大量的白色囊泡；而pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞24h、48h内质网扩张少见,线粒体结构改变不明显,甚至有2-3个高尔基体存在；DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞至72h时,微丝明显的聚集、增多,线粒体结构亦消失。余两种细胞微丝排列紊乱,线粒体形态多样化。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA慢病毒载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。通过对DHFR下调后耐药性功能研究证实DHFR基因的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物敏感性有一定的联系,抑制DHFR基因表达能增加顺铂药物敏感性,因此,抑制卵巢癌细胞DHFR基因的表达可以考虑作为顺铂多药耐药的逆转机制。
黄明钜[7]（2012）在《叶酸结合蛋白与卵巢癌多药耐药关系的研究》文中进行了进一步梳理第一章卵巢癌多药耐药的研究进展卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统常见的肿瘤,它是妇科三大恶性肿瘤之一,仅次于宫颈癌,宫体癌,居第三位。卵巢癌约占卵巢恶性肿瘤的80%,目前主要的治疗手段是手术治疗和铂类为基础的联合化疗,患者5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。大多数卵巢患者发现时已为中晚期,有的甚至已经失去了手术机会而给予非手术治疗,75%～80%的卵巢癌开始对化疗敏感,其余则表现为原发耐药,最终所有化疗患者至少80%出现耐药,而多药耐药机制极为复杂,目前还没完全清楚,卵巢癌多药耐药产生后治疗效果明显降低。预防和减少卵巢癌多药耐药的发生,以及对卵巢癌多药耐药的逆转治疗,是现阶段迫切需要解决的问题。国外有学者曾报道叶酸结合蛋白与卵巢癌的发生发展密切相关,在多药耐药中也扮演了重要的角色,具体机制暂未明确,需要我们进一步的研究探索。第二章卵巢恶性肿瘤组织叶酸结合蛋白表达检测及其临床意义目的：探讨卵巢恶性肿瘤组织中叶酸结合蛋白（FOLR1）的表达及其临床意义。方法：采用Western Blot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及30例正常卵巢组织中的FOLR1表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性。结果：（1）FOLR1在正常卵巢组织,卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高（P<0.01）。（2）FOLR1在卵巢恶性肿瘤临床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表达量低于Ⅲ～Ⅳ期,在组织分级高分化中的表达量低于中低分化（P<0.05）。（3）FOLR1在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量低于铂类药物敏感型（P<0.01）；其在治疗后仍进展肿瘤中的表达量低于缓解者（P<0.01）。（4）FOLR1在粘液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤（P<0.05）,在有淋巴结和远处器官转移的卵巢恶性肿瘤中高于未有转移者（P<0.05）,与患者的不同肿瘤病理分类、是否有大网膜转移和腹水量多少无明显相关（P>0.05）。（5）取FOLR1表达量界值为3.115时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤FOLR1表达量的高低与中位生存时间差别无明显相关（P>0.05）,COX模型多因素分析显示FOLR1表达量不是影响患者生存预后的独立因素。结论：FOLR1在正常卵巢和卵巢良性肿瘤组织中的表达量低于卵巢恶性肿瘤,其可作为一种新型的卵巢恶性肿瘤早期诊断标志物。铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中FOLR1呈低表达,在铂类药物敏感型卵巢恶性肿瘤中高表达,提示FOLR1与卵巢恶性肿瘤多药耐药相关,可作为判断卵巢恶性肿瘤多药耐药潜在标志物之一。第三章FOLR1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定目的：构建携带叶酸结合蛋白基因（FOLR1）的慢病毒表达载体并进行表达鉴定。方法：PCR扩增FOLR1全长,克隆至pWPI载体质粒,重组阳性克隆行PCR和测序鉴定,重组质粒与其辅助质粒共同转染293T细胞包装病毒,病毒颗粒感染SKOV3细胞,流式分选,RT-PCR和Western Blot检测FOLR1的表达。结果：FOLR1正确克隆至pWPI载体质粒,PCR及测序证实重组表达载体构建成功,293T细胞成功包装慢病毒,pWPI-FOLR1慢病毒高效感染SKOV3细胞,RT-PCR和Western Blot检测出被感染后的SKOV3细胞中有FOLR1表达。结论：成功构建了FOLR1慢病毒表达载体,能高效感染SKOV3细胞,FOLR1基因转导后稳定表达,为下步探讨FOLR1在恶性卵巢肿瘤中的功能提供了实验基础。第四章FOLR1基因对顺铂作用卵巢癌上皮细胞生物学影响的体外实验研究目的：探索卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后对其生物学功能的影响以及作用途径。方法：MTT法测定三组细胞（SKOV3、pWPI-SKOV3、 pWPI-FOLR1-SKOV3）的生长增值情况、顺铂对三组细胞的IC50和不同顺铂浓度分别作用不同时间对三组细胞的抑制率；流式细胞术检测不同顺铂浓度分别作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率；流式细胞术检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响；高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时后细胞内顺铂的浓度。结果：实验组细胞（pWPI-FOLR1-SKOV3）与两组对照组相比较：（1）增殖速度明显升高、顺铂对其作用的IC50值降低。（2）顺铂对其生长抑制率增加（P<0.05）,呈剂量-时间依赖关系,其对顺铂的敏感性增加。（3）顺铂更容易诱导其凋亡发生（P<0.05）,呈时间-剂量依赖关系。（4）顺铂将其周期中的S期阻滞比例明显增加（P<0.05）。（5）细胞内的顺铂浓度增加近一倍。结论：FOLR1基因能增强卵巢癌SKOV3细胞的生长增殖能力；卵巢癌SKOV3细胞中FOLR1基因表达上调后顺铂对其抑制率增加,呈剂量-时间依赖关系,顺铂更容易诱导其凋亡发生,呈时间-剂量依赖关系,顺铂将其细胞周期中的S期阻滞明显增加,细胞内顺铂浓度升高。
芦进荣[8]（2012）在《上皮性卵巢癌组织中ATF-5及bcl-2基因的表达及其临床意义》文中研究指明目的：1.探讨上皮性卵巢癌组织中ATF-5基因的表达并分析其与临床病理特征之间的关系。2.探讨上皮性卵巢癌组织中bcl-2基因的表达及其与临床病理特征之间的关系。3.探讨ATF-5与bcl-2基因表达在上皮性卵巢癌中的相关性及其临床意义。方法：1.采用免疫组织化学染色法和逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）方法从蛋白和mRNA水平检测60例上皮性卵巢癌组织,15例良性卵巢肿瘤和9例正常卵巢组织标本中ATF-5及bcl-2的表达差异。2.结合临床病理资料,分析上皮性卵巢癌组织中ATF-5及bcl-2基因表达与卵巢癌临床病理特征（肿瘤病理类型、分化程度、临床分期等）之间的相关性。结果：1.上皮性卵巢癌组织中ATF-5基因的阳性表达率显着高于正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤组织（P<0.05）；ATF-5蛋白和mRNA表达强度与上皮性卵巢癌手术病理分期和组织分化程度有关,Ⅲ-Ⅳ期的阳性表达率及表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期（P<0.05）；低分化组高于高、中分化组（P<0.05）；其与上皮性卵巢癌的病理类型及患者发病年龄无明显相关性（P>0.05）。2.上皮性卵巢癌组织中bcl-2基因的阳性表达率显着高于正常卵巢组织及卵巢良性肿瘤组织（P<0.05）;bcl-2蛋白和mRNA表达强度与上皮性卵巢癌手术病理分期和组织分化程度有关,Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率及表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期（P<0.05）；低分化组高于中分化及高分化组（P<0.05）,但中分化及高分化组之间ATF5表达无明显差异（P>0.05）；其与上皮性卵巢癌的病理类型及患者的发病年龄无关（P>0.05）。3.上皮性卵巢癌组织中ATF-5和bcl-2的表达具有相关性（r=0.461,P<0.05）。结论：ATF-5和bcl-2基因在上皮性卵巢癌组织中呈现高表达,其表达强度与临床分期和组织分化程度密切相关,这为进一步研究其与肿瘤发生的关系及其在卵巢肿瘤生物学行为中所发挥的作用奠定了理论基础,为卵巢癌的治疗提供了新的靶点。
王桂玲[9]（2011）在《WWOX与P73a基因慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达》文中研究表明背景：卵巢恶性肿瘤是最常见的女性恶性肿瘤之一,也是死亡率最高的妇科恶性疾病。具有发病隐匿、进展迅速的特点,由于缺少高敏感度和特异性的早期诊断方法,约80%的患者发现时已成为晚期。目前,卵巢上皮性癌的治疗模式为肿瘤细胞减灭术,术后给予以铂类为主的联合化疗,但5年生存率仍徘徊在35%左右。70%卵巢癌患者的5年内死因是肿瘤盆腹腔复发,其主要原因是铂类耐药而导致治疗失败。目前认为耐药机理有多种,但具体为什么途径耐药还有待进一步研究。据国外相关报道,WWOX与P73相互作用能增强凋亡,我们考虑这种相互作用是否与卵巢癌的铂类药物敏感性有关。但二者的作用机理尚不清楚,因此我们研究WWOX与P73a基因的相互作用机理,望能分析解决卵巢癌铂类耐药的途径,恢复卵巢癌铂类药物的敏感性。目的：构建及鉴定WWOX、P73a基因慢病毒载体,观察WWOX和P73a基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX与P73a基因的相互作用机制及其功能奠定基础。方法：1.采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX与P73a基因,将WWOX与P73a基因亚克隆到慢病毒载体PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒WWOX-PCDH及P73a-PCDH。2.通过双酶切验证后,慢病：毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV, Pvsv-G共转染人293T细胞,获得携带WWOX,P73a基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX和Lenti P73a。3.转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT-PCR和Western Blot验证Lenti wwox及Lenti P73a在人卵巢癌细胞PEO1中的表达。结果：1.测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH-WWOX、PCDH-P73a。2.表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60%。3.经RT-PCR和Western Blot验证,被感染的PEO1细胞有WWOX与P73a基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX与P73a基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。
唐兆前[10]（2010）在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中提出卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）较其亲本（SKOV3）细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第三章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）法或亚硫酸盐测序法（bisulphite sequencing）检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因（VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD）中,有10个基因（VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD）启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系（SKOV3）为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）,应用单链构象多态性分析（SSCP）检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第三外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4（4/49）、3（3/49）、2（2/49）、32（32/49）例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义（P分别为0.00、0.00;0.00,0.00）。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外（P<0.05）,其余基因差异均无意义（P均>0.05）。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义（P分别为0.183、0.493、0.271）。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义（P=0.005）。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型（P分别为0.045、0.028）;淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型（P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304）。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
二、SYNERGISTIC EFFICACY OF ADENOVIRUS-MEDIATED BCL-XS GENE TRANSFER AND TOPOTECAN IN OVARIAN CANCER CELL（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SYNERGISTIC EFFICACY OF ADENOVIRUS-MEDIATED BCL-XS GENE TRANSFER AND TOPOTECAN IN OVARIAN CANCER CELL（论文提纲范文）
（1）PGC1α通过HSP70/HK2/VDAC1途径参与卵巢癌顺铂耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 卵巢癌与顺铂耐药 |
| 1.1.1 卵巢癌的概述 |
| 1.1.2 卵巢癌的治疗 |
| 1.1.3 卵巢癌顺铂耐药机制 |
| 1.2 线粒体生物合成与癌症 |
| 1.2.1 线粒体生物合成 |
| 1.2.2 PGC1α与线粒体生物合成 |
| 1.2.3 PGC1α与癌症 |
| 1.3 HK2与肿瘤生存 |
| 1.3.1 HK2与癌症 |
| 1.3.2 HK2与VDAC1的结合在癌症进展中的作用 |
| 1.4 热休克蛋白70 |
| 1.4.1 HSP70与线粒体 |
| 1.4.2 HSP70与癌症 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 特异性敲减PGC1α增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 小结 |
| 2.2 HK2是PGC1α调节MPTP促进卵巢癌顺铂耐药的关键分子 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 小结 |
| 2.3 HSP70是PGC1α介导线粒体HK2调节MPTP的分子伴侣 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料与方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 小结 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一章 肿瘤基因治疗概述 |
| 一、 基因沉默疗法 |
| 二、 抑癌基因疗法 |
| 三、 免疫基因疗法 |
| 四、 自杀基因治疗 |
| 五、 抗肿瘤血管生成基因疗法 |
| 六、 肿瘤多药耐药基因疗法 |
| 第二章 肿瘤自杀基因治疗研究进展 |
| 一、 自杀基因及自杀基因治疗系统 |
| 二、 自杀基因疗法的旁杀伤效应及机制 |
| 三、 肿瘤自杀基因疗法的增效方法 |
| 第三章 中医学对肿瘤的认识及治疗法则 |
| 第四章 木犀草素、芹菜素及槲皮素药理作用及抗肿瘤作用 |
| 一、 木犀草素与肿瘤的相关研究 |
| 二、 芹菜素与肿瘤的相关研究 |
| 三、 槲皮素与肿瘤的相关研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 人黑色素瘤细胞HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 RT-PCR扩增人tk读码框 |
| 二、 慢病毒载体质粒pLV-tk/GFP的构建和鉴定 |
| 三、 细胞培养、传代、冻存、复苏 |
| 四、 重组慢病毒的包装与感染 |
| 五、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 六、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 七、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 A375细胞感染及稳定表达株的筛选 |
| 三、 A375-tk/GFP活性检测 |
| 第四节 讨论 |
| 一、 绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建 |
| 二、 人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 |
| 第二章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞间缝隙连接通讯的作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 A375生长曲线绘制 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法和流式细胞技术观察GJIC功能 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 五、 统计方法 |
| 第三节 结果 |
| 一、 A375细胞的增殖测定 |
| 二、 木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375的生长的影响 |
| 三、 荧光示踪法及流式细胞术检测药物对A375细胞GJIC功能的影响 |
| 四、 Western Blot检测Cx43、Cx26表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用 |
| 第一节 材料 |
| 第二节 方法 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 四、 统计分析 |
| 第三节 结果 |
| 一、 确定tk混合比例 |
| 二、 检测木犀草素、芹菜素及槲皮素对自杀基因治疗系统的增效作用 |
| 三、 PI单染法检测细胞凋亡 |
| 第四节 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件Ⅰ：本论文中使用的缩略语 |
| 附件Ⅱ：pLXSN-tk质粒中tk基因测序图 |
| 附件Ⅲ：已在国内外学术期刊上发表的相关论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（3）卵巢上皮癌多药耐药分子机制生物信息学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 主要英文缩略语词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 卵巢上皮癌多药耐药分子机制研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢上皮癌化疗概述 |
| 1.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.2 一线化疗的前瞻性随机的多中心临床验证 |
| 1.3 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.4 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.5 卵巢上皮癌分子病理分型及对卵巢癌治疗和判断预后的意义 |
| 2 卵巢癌多药耐药的临床特点 |
| 3 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 3.1 细胞内化疗药物外排的机制 |
| 3.1.1 MDR1与P-gp |
| 3.1.2 MRP |
| 3.1.3 LRP |
| 3.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加的机制 |
| 3.3 DNA损伤与修复机制 |
| 3.4 信号传导通路障碍的机制 |
| 3.5 细胞凋亡异常的机制 |
| 3.5.1 Bcl-2基因家族 |
| 3.5.2 P53基因 |
| 3.5.3 Fas系统 |
| 3.6 其它机制 |
| 4 卵巢癌多药耐药的分子诊断 |
| 5 卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 5.1 卵巢癌多药耐药的分型及治疗原则和目的 |
| 5.2 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 5.3 多药耐药的化疗 |
| 5.3.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 5.3.2 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 5.4 多药耐药的的基因治疗 |
| 5.5 多药耐药的靶向治疗 |
| 6 循证医学在卵巢上皮癌多药耐药基础与临床研究中的应用 |
| 6.1 循证医学概况 |
| 6.2 循证医学与卵巢上皮癌多药耐药基础与临床研究的现况 |
| 7 生物信息学在卵巢上皮癌多药耐药基础与临床研究中的应用 |
| 7.1 生物信息学概况 |
| 7.2 卵巢上皮癌多药耐药生物信息学研究常用的数据库及方法 |
| 7.2.1 生物信息学研究相关数据库 |
| 7.2.1.1 GEO数据库 |
| 7.2.1.2 DAVID数据库和KEGG数据库 |
| 7.2.1.3 蛋白质数据库 |
| 7.2.1.4 microRNA数据库 |
| 7.2.2 生物信息学常用研究方法介绍 |
| 7.2.2.1 差异基因筛选方法 |
| 7.2.2.2 Meta分析和方法学评价 |
| 7.2.2.3 GSEA分析 |
| 7.2.2.4 GO功能分类 |
| 7.2.2.5 网络模型构建 |
| 7.2.2.6 文本挖掘 |
| 7.2.2.7 可视化网络构建工具 |
| 7.3 生物信息学与卵巢上皮癌多药耐药基础与临床研究的现况 |
| 7.3.1 基因水平 |
| 7.3.2 蛋白质水平 |
| 7.3.3 microRNA水平 |
| 8 卵巢上皮癌多药耐药研究存在的问题及本研究的目的和意义 |
| 8.1 卵巢上皮癌多药耐药研究存在的问题 |
| 8.2 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌多药耐药相关基因的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 数据来源及获取途径 |
| 1.1.2 纳入标准 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 方法学评价 |
| 1.2.2 筛选差异基因 |
| 1.2.3 基因通路富集 |
| 1.2.4 文本挖掘 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选差异基因 |
| 2.2 基因通路富集 |
| 2.3 4 套数据集通路重叠性和一致性对比 |
| 2.4 对通路中各套数据集差异表达基因重叠性和一致性对比 |
| 2.5 文本挖掘 |
| 2.5.1 从文献水平上挖掘差异基因与耐药的关系 |
| 2.5.2 从疾病水平上挖掘差异基因与卵巢上皮癌的关系 |
| 2.5.3 两者结果对比分析 |
| 3 讨论 |
| 附录 主要通路名中英文对照表 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌多药耐药相关基因表达的临床病理和预后意义 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 倍数分析和成组t检验 |
| 1.2.2 相关性分析 |
| 1.2.3 生存分析 |
| 1.2.3.1 Kaplan-Meier法 |
| 1.2.3.2 Cox回归模型分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选差异基因 |
| 2.2 基因表达与卵巢癌患者年龄、临床病理因素和初始治疗反应的相关性分析 |
| 2.3 临床病理因素和治疗反应与卵巢癌预后关系的单因素分析 |
| 2.4 影响卵巢癌预后相关因素的Cox回归模型分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于microRNA调控网络预测卵巢上皮癌多药耐药相关基因 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 microRNAs数据挖掘 |
| 1.2 microRNA-靶基因数据挖掘 |
| 1.3 microRNA调控网络构建 |
| 1.4 microRNA调控网络拓扑结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 microRNA调控网络构建 |
| 2.2 microRNA调控网络拓扑结构分析 |
| 2.3 microRNA调控网络测试 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 全文创新点 |
| 本研究存在的不足之处 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（4）蛋白质组学技术筛选弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关蛋白的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词简表 |
| 总前言 |
| 第一章 化疗敏感性不同的DLBCL组织差异表达蛋白的蛋白质组学研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二章 部分差异蛋白在化疗敏感性不同的DLBCL组织中表达的临床病理研究及HSP27表达对DLBCL化疗敏感性的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 淋巴瘤的耐药性研究进展 |
| 综述二 |
| 细胞凋亡调控介导的肿瘤化疗增敏研究进展 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间主要的研究成果 |
（5）10-羟基喜树碱—腺病毒衍生物的合成及抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 腺病毒载体简介 |
| 1.1.1 腺病毒载体的结构和特点 |
| 1.1.2 腺病毒进入细胞的机制 |
| 1.1.3 腺病毒作为新型纳米材料的的现状及应用 |
| 1.2 喜树碱的化学改造 |
| 1.2.1 喜树碱的基本特点及应用 |
| 1.2.2 喜树碱的化学修饰 |
| 1.3 腺病毒与喜树碱类药物的联用 |
| 1.4 本研究的目的、意义及创新点 |
| 1.5 技术路线 |
| 1.6 总化学合成路线 |
| 第二章 喜树碱前体药物的合成及性状研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱的合成 |
| 2.3.2 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱的表征 |
| 2.3.3 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱的物理性状 |
| 2.3.4 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱溶解度的测定 |
| 2.3.5 HCPT 和 DSH-Ad 细胞抑制率的测定 |
| 2.3.6 光学显微镜观察细胞形态变化 |
| 2.3.7 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱细胞凋亡特性检测 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱的表征 |
| 2.4.2 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱的基本性状 |
| 2.4.3 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱溶解度的测定 |
| 2.4.4 HCPT 和 DSH 细胞抑制率的测定 |
| 2.4.5 光学显微镜观察细胞形态变化 |
| 2.4.6 10,20(S)-O-二琥珀酰羟基喜树碱诱导凋亡特性的检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 10-羟基喜树碱-腺病毒衍生物的合成及抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 腺病毒 Ad5-EGFP 的大量扩增和纯化 |
| 3.3.2 DSH 的活化 |
| 3.3.3 DSH-Ad 的制备 |
| 3.3.4 DSH-Ad 的性能表征 |
| 3.3.5 DSH-Ad 的细胞实验 |
| 3.4 实验结果及分析 |
| 3.4.1 腺病毒扩增与纯化 |
| 3.4.2 DSH-Ad 的性能表征 |
| 3.4.3 细胞实验 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录：研究生期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（6）二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 卵巢癌多药耐药的研究进展(文献综述) |
| 1.卵巢上皮癌一线化疗模式及存在的问题 |
| 1.1 卵巢上皮癌一线化疗方案选择 |
| 1.2 一线化疗方案总体疗效评价 |
| 1.3 卵巢上皮癌一线化疗存在的问题 |
| 2.卵巢癌多药耐药的概念 |
| 3.卵巢癌多药耐药的临床表现 |
| 4.卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 4.1 血清CA125对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 4.2 血清HE4对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 4.3 其他肿瘤标志物 |
| 5.卵巢癌多药耐药发生的机理 |
| 5.1 卵巢癌多药耐药发生的相关临床病理因素 |
| 5.2 影响卵巢癌一线化疗疗效的相关临床病理因素 |
| 5.3 卵巢癌多药耐药发生的分子机理 |
| 5.3.1 细胞内化疗药物的外排机制 |
| 5.3.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 5.3.3 细胞内DNA修复增加 |
| 5.3.4 信号传导通路障碍的机制 |
| 5.3.5 细胞凋亡异常的机制 |
| 5.3.6 其它机制 |
| 6.卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 6.1 降低卵巢癌多药耐药发生的化疗对策探索 |
| 6.1.1 一线标准方案中加入其它化疗药物的RCT结果 |
| 6.1.2 一线标准方案用药途径改变的RCT结果 |
| 6.1.3 一线标准方案用药时间及强度改变的RCT结果 |
| 6.1.4 一线标准化疗完成后巩固化疗的RCT结果 |
| 6.1.5 术前新辅助化疗的RCT结果 |
| 6.2 卵巢癌多药耐药的预防 |
| 6.3 卵巢癌多药耐药的临床分型及治疗目的 |
| 6.4 卵巢癌多药耐药的手术治疗 |
| 6.4.1 卵巢癌多药耐药患者手术的适应征与禁忌征 |
| 6.4.2 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式与疗效评价 |
| 6.4.3 影响卵巢癌多药耐药患者手术疗效的临床病理因素 |
| 6.5 卵巢癌多药耐药的化疗 |
| 6.5.1 卵巢癌多药耐药患者化疗的适应征与禁忌征 |
| 6.5.2 单纯的CA125升高是否适合化疗 |
| 6.5.3 卵巢癌多药耐药患者化疗的方案选择与疗效评价 |
| 6.5.4 影响卵巢癌多药耐药患者化疗疗效的临床病理因素 |
| 6.6 卵巢癌多药耐药的靶向治疗 |
| 6.6.1 EGFR(表皮生长因子受体)拮抗剂 |
| 6.6.2 血管生长阻滞剂（贝伐单抗等） |
| 6.6.3 信号转导抑制剂 |
| 6.6.4 抗FRA人源化单克隆抗体 |
| 6.6.5 mTOR抑制剂 |
| 6.6.6 PARP抑制剂 |
| 6.6.7 DNA甲基转化酶抑制剂 |
| 6.7 卵巢癌多药耐药的其它治疗 |
| 6.7.1 抗肿瘤MDR基因治疗 |
| 6.7.2 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 7.二氢叶酸还原酶与肿瘤多药耐药关系的研究 |
| 7.1 二氢叶酸还原酶结构与生物学作用 |
| 7.2 二氢叶酸还原酶与肿瘤多药耐药的关系 |
| 7.3 二氢叶酸还原酶抑制剂的研究 |
| 8.本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义 |
| 1.材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 组织标本 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 实验主要的仪器设备 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 部分试剂的配置 |
| 1.1.6 用具处理 |
| 1.1.7 引物的设计 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.2.1 卵巢组织总RNA提取 |
| 1.2.2 cDNA合成 |
| 1.2.3 DHFR及GAPDH基因扩增(RT—PCR) |
| 1.2.4 PCR产物的纯化与回收 |
| 1.2.5 回收的PCR产物与EZ-Blunt载体连接 |
| 1.2.6 感受肽大肠杆菌DH-5α的制备 |
| 1.2.7 连接产物转化至感受态DH-5α |
| 1.2.8 挑选阳性克隆 |
| 1.2.9 质粒DNA小提 |
| 1.2.10 检测连接是否成功 |
| 1.2.10.1 PCR法 |
| 1.2.10.2 测序 |
| 1.2.11 测序结果序列分析 |
| 1.2.12 制备标准品 |
| 1.2.13 实时荧光定量PCR |
| 1.2.14 数据整理 |
| 1.2.15 统计分析 |
| 1.2.16 PCR检测基因突变 |
| 2.结果 |
| 2.1 DHFR基因和重组GAPDH基因质粒构建结果 |
| 2.2 实时荧光定量PCR检测卵巢癌DHFR mRNA的标准曲线与融解曲线的建立 |
| 2.3 DHFR测定的实时荧光扩增熔解曲线 |
| 2.4 各类卵巢组织中DHFR mRNA表达量的比较 |
| 2.5 卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与其临床病理因素的关系 |
| 2.6 卵巢癌患者组织中DHFR mRNA表达量与其转移关系 |
| 2.7 卵巢癌组织DHFR mRNA表达含量及其治疗疗效和耐药的相关性 |
| 2.8 卵巢癌组织中DHFR mRNA表达与其预后的关系 |
| 2.9 PCR检测耐药患者及敏感患者的基因突变 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞生物学特性的影响的体外实验研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1质粒与菌株、细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 仪器 |
| 1.1.4 试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 DHFR慢病毒表达系统的构建 |
| 1.2.1.1 DHFR全长的扩增及回收 |
| 1.2.1.2 PCR产物的纯化和回收 |
| 1.2.1.3 DHFR的定量 |
| 1.2.1.4 载体的准备 |
| 1.2.1.4.1 PmeI酶切pWPI |
| 1.2.1.4.2 pWPI去磷酸化 |
| 1.2.1.5 DHFR与pWPI的连接 |
| 1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH-5α |
| 1.2.1.7 挑选阳性克隆 |
| 1.2.1.8 重组质粒的初步鉴定 |
| 1.2.1.9 质粒DNA的提取 |
| 1.2.1.10 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.2.1.11 重组质粒的测序 |
| 1.2.1.12 测序结果的序列分析 |
| 1.2.2 DHFR-pWPI转染293T细胞 |
| 1.2.3 病毒滴度测定 |
| 1.2.4 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 1.2.5 病毒颗粒感染SKOV3细胞 |
| 1.2.6 转染效率的检测 |
| 1.2.7 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 1.2.7.1 荧光定量PCR(2~(-△△Ct)法)检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.7.2 Western Blot检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.8 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 1.2.8.1 MTT法检测IC50 |
| 1.2.8.2 不同药物浓度、不同时间段的凋亡变化 |
| 1.2.8.3 IC50顺铂浓度6.0(Vg/mO不同时间段的周期变化 |
| 1.2.8.4 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 1.2.8.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组质粒DHFR-pWPI PCR电泳结果 |
| 2.2 重组质粒DHFR-pWPI PCR测序结果 |
| 2.3 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 2.4 DHFR-pWPI转染293T细胞结果 |
| 2.5 病毒滴度测定结果 |
| 2.6 病毒颗粒转染SKOV3细胞 |
| 2.7 转染效率的检测 |
| 2.8 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 2.9 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 2.9.1 MTT法检测IC50 |
| 2.9.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化 |
| 2.9.3 IC50顺铂浓度(6.0μg/ml)不同时间段的周期变化 |
| 2.9.4 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 2.9.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 siRNA沉默DHFR基因对卵巢上皮癌生物学特性影响体外实验研究 |
| 第一节 RNA干扰质粒载体的构建及鉴定 |
| 1 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 干扰细胞系的选择 |
| 1.2.2 脂质体介导的DHFR-siRNA的转染 |
| 1.2.3 构建DHFR-pGPU6载体重组质粒 |
| 1.2.4 DHFR-pGPU6-768转染SKOV3细胞 |
| 1.2.5 携带干扰重组质粒的SKOV3细胞的筛选 |
| 1.2.6 携带干扰重组质粒的SKOV3细胞的克隆 |
| 1.2.7 RT-PCR及western-blot检测干扰效果的表达 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同种类卵巢癌细胞的DHFR基因表达情况 |
| 2.2 转染条件的确定 |
| 2.3 DHFR-pGPU6-768siRNA表达载体构建结果 |
| 2.4 DHFR-pGPU6-768载体转染SKOV3细胞结果 |
| 2.5 荧光PCR检测干扰后三种不同细胞株的DHFR表达量 |
| 2.6 DHFR-pGPU6-768-SKOV3和pGPU6-SKOV3细胞筛选 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中的生物学特性影响 |
| 1 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒与菌株、细胞 |
| 1.1.1.1 质粒 |
| 1.1.1.2 试剂 |
| 1.1.1.3 仪器 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.2.1 实验总流程 |
| 1.2.1.1 siRNA 靶点设计 |
| 1.2.1.2 合成单链DNA oligo |
| 1.2.1.3 引物退火形成带双链DNA oligo |
| 1.2.1.4 pGCSIL/GFP质粒载体的线性化 |
| 1.2.2 重组pGCSIL/GFP质粒载体的构建和扩增 |
| 1.2.3 DHFR-PGCSIL/GFP转染 |
| 1.2.4 病毒滴度测定 |
| 1.2.5 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 1.2.6 病毒颗粒感染SKOV3细胞 |
| 1.2.6.1 MOI值的预测 |
| 1.2.6.2 感染步骤 |
| 1.2.6.3 转染效率的检测 |
| 1.2.7 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 1.2.7.1 荧光定量PCR(2~(-△△Ct)法)检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.7.2 Western Blot检测三组细胞中DHFR的含量 |
| 1.2.8 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 1.2.8.1 MTT法检测IC50 |
| 1.2.8.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化 |
| 1.2.8.3 IC50顺铂浓度(4.4μg/ml)不同时间段的周期变化 |
| 1.2.8.4 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 1.2.8.5 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 pGCSIL/GFP质粒载体酶切图及构建图 |
| 2.2 RNAi重组质粒测序结果 |
| 2.3 慢病毒包装图及病毒滴度的测定 |
| 2.4 病毒颗粒感染SKOV3细胞 |
| 2.5 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量 |
| 2.6 转染效率的检测 |
| 2.7 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化 |
| 2.8 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验 |
| 2.8.1 MTT法检测不同时间段的IC50 |
| 2.8.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化 |
| 2.8.4 IC50顺铂浓度(4.4μg/ml)不同时间段的周期变化 |
| 2.8.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化 |
| 2.8.6 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 全文创新点 |
| 本研究存在的问题 |
| 第五章 二氢叶酸还原酶与卵巢癌多药耐药关系研究的进一步计划 |
| 1.立题依据 |
| 2.研究内容 |
| 3.技术路线 |
| 4.本项目的特色与创新之处 |
| 5.研究的基础与可行性 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）叶酸结合蛋白与卵巢癌多药耐药关系的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 主要中英缩语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 卵巢癌多药耐药的研究进展 |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢恶性肿瘤的发病率及生存率 |
| 1.2 卵巢恶性肿瘤可能的致病因素 |
| 1.2.1 生殖内分泌因素 |
| 1.2.2 家族遗传因素 |
| 1.2.3 行为因素 |
| 1.2.4 其他因素 |
| 1.3 卵巢恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.3.1 主要临床表现 |
| 1.3.2 卵巢上皮癌诊断的主要方法 |
| 1.3.2.1 影像学检查 |
| 1.3.2.2 血清肿瘤标记物 |
| 1.3.2.3 腹腔镜检查 |
| 1.3.2.4 细胞学检查 |
| 1.3.2.5 组织病理学检查 |
| 1.4 卵巢癌的分期 |
| 1.5 卵巢癌常规治疗现况 |
| 1.5.1 卵巢癌的手术治疗 |
| 1.5.1.1 卵巢癌全面分期手术 |
| 1.5.1.2 再分期手术 |
| 1.5.1.3 肿瘤细胞减灭术 |
| 1.5.1.4 中间型肿瘤细胞减灭术 |
| 1.5.1.5 二次探查术 |
| 1.5.1.6 再次肿瘤细胞减灭术 |
| 1.5.1.7 保留生育功能的手术 |
| 1.5.2 卵巢癌一线化疗模式及存在的问题 |
| 1.5.2.1 卵巢癌一线化疗方案选择 |
| 1.5.2.2 一线化疗方案总体疗效评价 |
| 1.5.2.3 卵巢癌一线化疗存在的问题 |
| 1.5.3 其他治疗 |
| 1.5.3.1 放射治疗 |
| 1.5.3.2 生物治疗 |
| 1.5.3.3 内分泌治疗 |
| 1.5.3.4 中医治疗 |
| 2 卵巢癌多药耐药 |
| 2.1 卵巢癌多药耐药的概念 |
| 2.2 卵巢癌多药耐药的临床表现 |
| 2.3 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.3.1 清CA125对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 2.3.2 清HE4对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 2.3.3 其它肿瘤标志物对卵巢癌多药耐药的诊断价值 |
| 2.3.4 新潜在的用于卵巢癌多药耐药诊断标志物筛选、鉴定和临床验证现况 |
| 3 卵巢癌多药耐药发生的机理 |
| 3.1 卵巢癌多药耐药发生的相关临床病理因素 |
| 3.1.1 卵巢癌病理类型与多药耐药 |
| 3.1.2 卵巢癌FIGO分期与多药耐药 |
| 3.1.3 其它临床病理因素与多药耐药 |
| 3.2 影响卵巢癌一线化疗疗效的相关临床病理因素 |
| 3.3 卵巢癌多药耐药发生的分子机理 |
| 3.3.1 细胞内化疗药物外排的机制 |
| 3.3.1.1 P-糖蛋白与卵巢癌多药耐药 |
| 3.3.1.2 多药耐药相关蛋白与卵巢癌多药耐药 |
| 3.3.1.3 乳腺癌耐药蛋白与卵巢癌多药耐药 |
| 3.3.1.4 肺耐药相关蛋白与卵巢癌多药耐药 |
| 3.3.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加的机制 |
| 3.3.3 DNA损伤修复能力增加的机制 |
| 3.3.4 信号传导通路障碍的机制 |
| 3.3.5 细胞凋亡异常的机制 |
| 3.3.6 其它机制 |
| 4 卵巢癌多药耐药的治疗 |
| 4.1 降低卵巢癌多药耐药发生的化疗对策探索 |
| 4.1.1 一线标准方案中加入其它化疗药物的RCT结果 |
| 4.1.2 一线标准方案用药途径改变的RCT结果 |
| 4.1.3 一线标准方案用药强度及时间改变的RCT结果 |
| 4.1.4 一线标准化疗完成后巩固化疗的RCT结果 |
| 4.1.5 术前新辅助化疗的RCT结果 |
| 4.2 卵巢癌多药耐药的预防 |
| 4.3 卵巢癌多药耐药的临床分型及治疗目的 |
| 4.3.1 卵巢癌多药耐药的临床分型 |
| 4.3.2 卵巢癌多药耐药治疗目的 |
| 4.4 卵巢癌多药耐药的手术治疗 |
| 4.4.1 卵巢癌多药耐药患者手术的适应征与禁忌征 |
| 4.4.2 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式与疗效评价 |
| 4.4.2.1 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式 |
| 4.4.2.2 卵巢癌多药耐药患者手术的疗效评价 |
| 4.4.3 影响卵巢癌多药耐药患者手术疗效的临床病理因素 |
| 4.5 卵巢癌多药耐药的化疗 |
| 4.5.1 卵巢癌多药耐药患者化疗的适应征与禁忌征 |
| 4.5.2 单纯的CA125升高是否适合化疗 |
| 4.5.3 卵巢癌多药耐药患者化疗的方案选择与疗效评价 |
| 4.5.3.1 卵巢癌多药耐药患者单药化疗及疗效评价 |
| 4.5.3.2 卵巢癌多药耐药患者联合化疗及疗效评价 |
| 4.5.4 影响卵巢癌多药耐药患者化疗疗效的临床病理因素 |
| 4.6 卵巢癌多药耐药的靶向治疗 |
| 4.6.1 EGFR拮抗剂 |
| 4.6.2 血管生长阻滞剂 |
| 4.6.3 信号转导抑制剂 |
| 4.6.4 抗FRA人源化单克隆抗体 |
| 4.6.5 mTOR抑制剂 |
| 4.6.6 PARP抑制剂 |
| 4.7 卵巢癌多药耐药的其它治疗 |
| 4.7.1 抗肿瘤MDR基因治疗 |
| 4.7.2 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 5 叶酸结合蛋白与肿瘤多药耐药关系的研究 |
| 5.1 叶酸结合蛋白结构与生物学作用 |
| 5.2 叶酸结合蛋白表达与肿瘤临床病理的相关性 |
| 5.3 叶酸结合蛋白与肿瘤多药耐药的关系 |
| 5.4 针对叶酸结合蛋白为靶点肿瘤多药耐药治疗 |
| 5.4.1 叶酸结合蛋白介导的叶酸偶联物的种类 |
| 5.4.2 叶酸结合蛋白介导的肿瘤靶向纳米递药系统 |
| 5.4.3 叶酸结合蛋白介导叶酸偶联物进入肿瘤细胞机制 |
| 5.5 叶酸结合蛋白与肿瘤多药耐药关系研究中存在的问题 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢恶性肿瘤组织叶酸结合蛋白表达检测及其临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 实验主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂及配制 |
| 2.1.4 器具处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验原理 |
| 2.2.2 实验方法及步骤 |
| 2.2.3 整理数据及统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 FOLR1在正常卵巢、卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤组织中的表达情况 |
| 3.2 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与临床病理因素的关系 |
| 3.3 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与肿瘤转移及腹水量关系 |
| 3.4 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与疗效和耐药的相关性 |
| 3.5 卵巢恶性肿瘤组织中的FOLR1表达量与患者预后的关系 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 FOLR1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 慢病毒系统 |
| 2.1.5 FOLR1基因cDNA克隆质粒pOTB7 |
| 2.1.6 引物及其序列 |
| 2.1.7 器具处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组表达载体质粒的构建 |
| 2.2.2 重组表达载体质粒的PCR和测序鉴定 |
| 2.2.3 慢病毒的包装及感染靶细胞 |
| 2.2.4 慢病毒表达载体的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 FOLR1基因和pWPI载体质粒重组前准备的结果 |
| 3.2 重组表达载体鉴定的结果 |
| 3.3 慢病毒的包装的结果 |
| 3.4 病毒滴度测定的结果 |
| 3.5 慢病毒感染靶细胞的结果 |
| 3.6 慢病毒感染SKOV3细胞后流式分选的结果 |
| 3.7 RT-PCR法检测慢病毒感染SKOV3细胞后FOLR1基因表达的结果 |
| 3.8 Western Blot检测慢病毒感染SKOV3细胞后FOLR1蛋白表达的结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 FOLR1基因对SKOV3细胞生物学影响的体外实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂及配制 |
| 2.1.3 器具处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 MTT法测定三组细胞生长曲线 |
| 2.2.3 MTT法测定顺铂对三组细胞的IC50 |
| 2.2.4 MTT法检测不同顺铂浓度及其作用不同时间对三组细胞的抑制率 |
| 2.2.5 流式检测不同顺铂浓度及其作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率 |
| 2.2.6 流式检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响 |
| 2.2.7 高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时后细胞内顺铂的浓度 |
| 2.2.8 整理数据及统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MTT法测定三组细胞的生长曲线结果 |
| 3.2 MTT法测定顺铂对三组细胞的IC50结果 |
| 3.3 MTT法检测不同顺铂浓度及其作用不同时间对三组细胞抑制率结果 |
| 3.4 流式检测不同顺铂浓度及其作用不同时间诱导三组细胞的凋亡率 |
| 3.5 流式检测不同顺铂浓度作用48小时对三组细胞周期分布的影响结果 |
| 3.6 高效液相检测同浓度顺铂作用三组细胞48小时胞内顺铂浓度的结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 全文创新点 |
| 本研究存在的问题 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 学习期间发表的论文 |
（8）上皮性卵巢癌组织中ATF-5及bcl-2基因的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验仪器及设备 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 第二章 方法 |
| 2.1 实验准备 |
| 2.2 RT-PCR法检测ATF-5及bcl-2 mRNA在上皮性卵巢癌组织中的表达 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA的鉴定 |
| 2.2.4 cDNA的合成 |
| 2.2.5 PCR反应 |
| 2.2.6 凝胶的配制、电泳及结果分析 |
| 2.3 免疫组织化学法检测ATF-5及bcl-2蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达 |
| 2.3.1 切片制备 |
| 2.3.2 HE染色步骤 |
| 2.3.3 结果判定 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中ATF-5基因的表达及其临床意义 |
| 3.1.1 ATF-5 mRNA及β-actin mRNA的电泳结果 |
| 3.1.2 ATF-5蛋白在卵巢癌组织中的表达 |
| 3.1.3 上皮性卵巢癌组织中ATF-5基因表达的临床意义 |
| 3.2 正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及上皮性卵巢癌组织中bcl-2基因的表达及其临床意义 |
| 3.2.1 bcl-2 mRNA及β-actin mRNA的电泳结果 |
| 3.2.2 bcl-2蛋白在卵巢癌组织中的表达 |
| 3.2.3 上皮性卵巢癌组织中bcl-2基因表达的临床意义 |
| 3.3 ATF-5及bcl-2基因在上皮性卵巢癌中表达的相关性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 ATF-5基因在上皮性卵巢癌中的表达及其意义 |
| 4.2 bcl-2基因在上皮性卵巢癌中的表达及其意义 |
| 4.3 ATF-5及bcl-2在上皮性卵巢癌中的相关性及临床意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）WWOX与P73a基因慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和质粒 |
| 1.2 主要试剂和引物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 部分试剂的配置 |
| 2 方法 |
| 2.1 获得WWOX,P73a基因 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 聚合酶链反应(PCR) |
| 2.1.3 鉴定PCR产物 |
| 2.2 WWOX-PEGM-T和P73a-PEGM-T质粒的构建 |
| 2.2.1 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.2.2 WWOX、P73a基因片段与PEGM-T easy载体的连接 |
| 2.2.3 连接产物的转化 |
| 2.2.4 TA克隆的酶切鉴定 |
| 2.3 WWOX、P73a基因片段的亚克隆 |
| 2.3.1 亚克隆原理 |
| 2.3.2 载体片段与WWOX、P73a基因片段的获得 |
| 2.3.3 慢病毒载体与目的基因片段连接 |
| 2.3.4 重组亚克隆的鉴定 |
| 2.4 重组慢病毒的包装、浓缩及滴度测定 |
| 2.4.1 WWOX-PCDH、P73a-PCDH分别转染293T细胞包装并浓缩慢病毒颗粒 |
| 2.4.2 病毒滴度测定 |
| 2.5 慢病毒介导的人卵巢癌细胞(PEO1)WWOX、P73a的表达 |
| 2.5.1 介导细胞系的选择 |
| 2.5.2 慢病毒介导的人卵巢癌细胞(PEO1)WWOX、P73a的表达 |
| 2.5.3 检测感染效率 |
| 2.5.4 慢病毒介导感染PEO1细胞后WWOX、P73a mRNA表达测定 |
| 2.5.5 慢病毒介导感染PEO1细胞后其WWOX、P73a蛋白表达测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 WWOX及P73a基因片段的扩增 |
| 3.2 TA克隆质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3 慢病毒重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.4 慢病毒重组质粒WWOX-PCDH、P73a-PCDH PCR测序及比对结果 |
| 3.5 四质粒包装系统转染293T细胞GFP表达及病毒滴度测定 |
| 3.5.1 WWOX-PCDH转染293T细胞结果 |
| 3.5.2 慢病毒滴度测定结果 |
| 3.6 重组慢病毒介导感染PEO1细胞后GFP的表达与感染效率 |
| 3.7 鉴定慢病毒颗粒Lenti WWOX与Lenti P73a感染卵巢癌PEO1细胞后表达 |
| 3.7.1 感染慢病毒颗粒后各组PEO1细胞mRNA表达结果 |
| 3.7.2 感染慢病毒颗粒后各组PEO1细胞Western Blotting表达情况 |
| 4 讨论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢癌的发病情况简述 |
| 1.1.1 卵巢癌的发病率及生存率 |
| 1.1.2 流行病学与致病因素 |
| 1.2 卵巢上皮恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.2.1 肿瘤标志物 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 细胞学检查 |
| 1.2.4 腹腔镜探查术 |
| 1.2.5 联合诊断 |
| 1.3 卵巢上皮性癌一线常规治疗现况 |
| 1.3.1 卵巢癌手术治疗的研究近况 |
| 1.3.1.1 早、中期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.1.1.1 全面分期手术的定义与价值 |
| 1.3.1.1.2 早期卵巢癌的手术切除范围及注意事项 |
| 1.3.1.1.3 阑尾切除在卵巢上皮性癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.4 大网膜切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.5 腹膜后淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.6 卵巢癌的保守性手术现状 |
| 1.3.1.1.6.1 保守性手术的适应症与禁忌症 |
| 1.3.1.1.6.2 保守性手术的手术范围 |
| 1.3.1.1.6.3 保守性手术的价值 |
| 1.3.2 晚期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.2.1 肿瘤细胞减灭术的原由及范围 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞减灭术的注意事项 |
| 1.3.2.3 影响肿瘤细胞减灭术的因素及在晚期卵巢癌临床治疗中的价值 |
| 1.3.2.4 复发卵巢癌的手术治疗 |
| 1.3.2.4.1 手术的目的与意义 |
| 1.3.2.4.2 手术的适应症,禁忌症及范围 |
| 1.3.2.4.3 影响手术效果的预后因素 |
| 1.3.3 化疗 |
| 1.3.3.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.3.3.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.3.3.1.2 一线化疗药物以及方案的选择 |
| 1.3.3.2 腹腔化疗 |
| 1.3.3.3 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.3.3.4 新辅助化疗 |
| 1.3.3.5 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.3.3.5.1 FIGO 分期 |
| 1.3.3.5.2 病理类型 |
| 1.3.3.5.3 残余灶的大小 |
| 1.3.3.5.4 化疗的用药剂量 |
| 1.3.3.5.5 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.3.3.5.6 其它因素 |
| 1.3.4 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3.5 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.4 生物治疗 |
| 1.4.1 免疫治疗 |
| 1.4.2 过继性免疫治疗 |
| 1.4.3 抗体 |
| 1.4.4 细胞因子 |
| 1.4.5 肿瘤疫苗 |
| 1.5 基因治疗 |
| 1.5.1 自杀基因治疗 |
| 1.5.2 癌基因与抑癌基因治疗 |
| 1.5.3 免疫基因治疗 |
| 1.5.4 耐药基因治疗 |
| 1.5.5 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
| 2 卵巢上皮恶性肿瘤的多药耐药 |
| 2.1 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的原因及机理 |
| 2.1.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.1.2 P-糖蛋白 |
| 2.1.1.3 多药耐药相关蛋白 |
| 2.1.1.4 肺耐药蛋白 |
| 2.1.1.5 乳腺耐药蛋白 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53 基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.1.7.1 细胞间连接 |
| 2.1.7.2 DNA 聚合酶 |
| 2.1.7.3 ATP7B |
| 2.2 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的诊断 |
| 2.2.1 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.2.1.1 MDR-1 基因 |
| 2.2.1.2 肺耐药蛋白 |
| 2.2.1.3 GST-π |
| 2.2.1.4 mtP53 |
| 2.2.1.5 c-erbB-2 基因(HER-2 基因) |
| 2.2.1.6 DNA 错配修复基因 |
| 2.2.1.7 ATP7B |
| 2.2.1.8 多药耐药基因 SNPs 的检测 |
| 2.2.1.9 细胞凋亡相关基因 |
| 2.2.1.10 多基因联合检测在诊断多药耐药的价值 |
| 2.3 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药咐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 顽固型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.3 耐药型和难治型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.4 影响二线化疗疗效的主要因素 |
| 2.3.2.5 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.6 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.3.1 反义核酸技术 |
| 2.3.3.2 反义 RNA 技术 |
| 2.3.3.3 RNA 干涉技术 |
| 2.3.3.4 核酶基因转移技术 |
| 2.3.3.5 细胞因子基因逆转技术 |
| 2.3.3.6 针对 P-gp 的增敏治疗 |
| 2.3.3.7 针对 MRP 的增敏治疗 |
| 2.3.3.8 针对 BCRP 的增敏剂 |
| 2.3.4 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.5.1 药物敏感基因 |
| 2.3.5.2 肿瘤免疫基因治疗 |
| 2.3.5.3 骨髓细胞修饰 |
| 2.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.3.6.1 单克隆抗体 |
| 2.3.6.2 腺病毒载体 |
| 2.3.6.3 中药治疗 |
| 2.3.6.4 亚致死量陡脉冲 |
| 3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因研究现况 |
| 3.1 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定技术 |
| 3.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.2 DDRT-PCT |
| 3.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.2 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况及临床价值 |
| 3.2.1 基因芯片应用 |
| 3.3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定存在问题 |
| 4 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.1 基因甲基化的定义及主要检测手段 |
| 4.1.1 基因甲基化定义 |
| 4.1.2 主要检测手段 |
| 4.1.2.1 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 |
| 4.1.2.2 SssI 甲基转移酶法 |
| 4.1.2.3 免疫化学法 |
| 4.1.2.4 氯乙醛法 |
| 4.1.2.5 特异性位点的 DNA 甲基化的检测 |
| 4.1.2.5.1 甲基化敏感性限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.2 直接测序法 |
| 4.1.2.5.3 甲基化特异性的 PCR |
| 4.1.2.5.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 |
| 4.1.2.5.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.6 甲基化敏感性单链构象分析 |
| 4.1.2.5.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 |
| 4.1.2.5.8 荧光法 |
| 4.1.2.5.9 DNA 微阵列法 |
| 4.1.2.5.10 甲基化敏感性斑点分析 |
| 4.1.2.5.11 甲基化特异性多连接依赖性探针扩增 |
| 4.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.3 卵巢上皮癌多药耐药基因甲基化检测的临床意义 |
| 4.3.1 治疗反应的标志物 |
| 4.3.2 化疗耐药和预后 |
| 5 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.1 基因突变的定义及主要检测手段 |
| 5.1.1 基因突变的定义 |
| 5.1.2 基因突变主要检测手段 |
| 5.1.2.1 直接 DNA 序列分析法 |
| 5.1.2.2 单链构象多态性分析技术 |
| 5.1.2.3 温度梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.4 变性梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.5 变性高效液相色谱 |
| 5.1.2.6 异源双链分析 |
| 5.1.2.7 核酸分子杂交 |
| 5.1.2.8 核糖核酸酶切法 |
| 5.1.2.9 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5.1.2.10 蛋白截短试验 |
| 5.1.2.11 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析 |
| 5.1.2.12 等位基因特异性扩增法 |
| 5.1.2.13 等位基因特异性寡核苷酸分析法 |
| 5.1.2.14 毛细管电技术 |
| 5.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.3 卵巢上皮癌多药耐药基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞筹异表达基因突变检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、SYNERGISTIC EFFICACY OF ADENOVIRUS-MEDIATED BCL-XS GENE TRANSFER AND TOPOTECAN IN OVARIAN CANCER CELL（论文参考文献）
- [1]PGC1α通过HSP70/HK2/VDAC1途径参与卵巢癌顺铂耐药机制的研究[D]. 李艳青. 吉林大学, 2021(01)
- [2]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
- [3]卵巢上皮癌多药耐药分子机制生物信息学研究[D]. 陈昌贤. 广西医科大学, 2013(S1)
- [4]蛋白质组学技术筛选弥漫大B细胞淋巴瘤耐药相关蛋白的初步研究[D]. 刘轶平. 中南大学, 2013(02)
- [5]10-羟基喜树碱—腺病毒衍生物的合成及抗肿瘤活性研究[D]. 陈文铎. 浙江理工大学, 2013(12)
- [6]二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究[D]. 李状. 广西医科大学, 2012(09)
- [7]叶酸结合蛋白与卵巢癌多药耐药关系的研究[D]. 黄明钜. 广西医科大学, 2012(09)
- [8]上皮性卵巢癌组织中ATF-5及bcl-2基因的表达及其临床意义[D]. 芦进荣. 青岛大学, 2012(01)
- [9]WWOX与P73a基因慢病毒表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达[D]. 王桂玲. 广西医科大学, 2011(08)
- [10]卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究[D]. 唐兆前. 广西医科大学, 2010(08)