一、棉花黄萎病菌单克隆抗体的制备（论文文献综述）
肖胜华[1]（2021）在《转录因子MYB4、WRKY41和TINY2调控棉花木质素代谢与免疫反应的功能解析》文中提出黄萎病是大丽轮枝菌引起的土传真菌性病害,严重制约着我国的棉花安全生产。抗病相关基因的挖掘及抗病分子机制的解析对棉花抗病品种的创制具有重要意义。本研究基于调控棉花木质素合成并介导广谱抗性的基因GhLac1,通过酵母单杂交文库筛选结合双荧光素酶报告基因实验鉴定到5个可直接激活或抑制GhLac1表达的调控基因。其中GhMYB4是GhLac1的负调控因子,GhWRKY30、GhWRKY41、GhMYB42和GhTINY2是GhLac1的正调控因子。进一步对GhMYB4、GhWRKY41和GhTINY2这3个基因在木质素代谢及棉花抗病反应中的功能进行了鉴定,取得的主要结果如下:1.木质素负调控因子GhMYB4通过DAMP触发的免疫反应增强对黄萎病菌的抗性研究显示GhMYB4编码MYB家族R2R3类第4亚组的核定位转录因子。GhMYB4受大丽轮枝菌和Me-JA诱导上调表达,是一个同时正调控棉花和拟南芥抗病性的重要基因。GhMYB4可通过直接结合并负调控GhC4H-1/2、Gh4CL-4、GhCAD-3和GhLac1等基因的表达阻碍细胞壁中木质素的沉积,但GhMYB4超表达棉花中木质素含量的减少导致细胞壁通透性增强,因此释放出更多寡聚半乳糖醛酸（Oligogalacturonides,OGs）作为损伤相关分子模式（Damage-associated molecular pattern,DAMP）激发植物防御响应,促使JA和JA-Ile的大量积累以及JA信号路径的组成性激活,最终提高植株对黄萎病菌的抗性。2.GhWRKY41与自身形成正反馈调节环调控苯丙烷代谢介导棉花抗病性研究发现GhWRKY41是一个WRKY家族Group III亚家族中具有强烈转录激活活性的核定位转录因子。GhWRKY41不仅在6个不同棉花品种中均受大丽轮枝菌的诱导表达,且受SA、Me-JA和H2O2的诱导。超表达GhWRKY41可提高棉花和拟南芥对黄萎病菌的抗性,而抑制GhWRKY41的表达则显着削弱棉花抗病性。蛋白互作分析显示:GhWRKY41与自身形成同源二聚体,并激活自身表达从而形成正反馈调节环放大GhWRKY41在棉花免疫反应中的功能。Ch IP-seq联合RNA-seq分析显示:GhWRKY41的1019个靶标基因中有52.3%的基因受黄萎病菌诱导明显上调表达,包括苯丙烷代谢路径开关、受体激酶、抗性相关蛋白等。进一步分析显示GhWRKY41可直接结合并激活GhC4H和Gh4CL的表达,并由GhWRKY41同源二聚体放大这一效应,从而促进木质素和黄酮的积累导致植株抗病性增强。3.GhTINY2通过WRKY51-SID2和BZR1-IAA19模块参与SA-BR介导的生长发育与免疫反应平衡研究发现GhTINY2编码一个AP2/ERF家族A4亚组的转录因子,GhTINY2不仅受大丽轮枝菌迅速且强烈地诱导上调表达,也受SA、Me-JA和H2O2抗病分子的诱导。超表达GhTINY2可提高棉花和拟南芥对黄萎病菌的抗性,而沉默GhTINY2则削弱棉花抗病性。通过RNA-seq分析,发现GhTINY2超表达材料中有大量的SA合成及信号转导基因的富集,进一步研究发现GhTINY2直接结合并激活WRKY51的表达,通过WRKY51-SID2模块促进SA积累继而启动并放大免疫反应。同时发现GhTINY2超表达材料表现出植株矮小、生长缓慢的表型,且对BR合成抑制剂BRZ更加敏感、BR诱导基因下调表达以及BR抑制基因上调表达,而GhTINY2干涉植株则表现出相反的表型。后续研究发现,GhTINY2与BZR1互作,并通过BZR1-IAA19模块拮抗调控BR路径相关基因,因此削弱了BR信号导致生长受阻。此外,GhTINY2还可激活苯丙烷代谢路径促进木质素和黄酮的积累,这可能也是GhTINY2超表达材料抗性增强的原因之一。以上研究解析了GhMYB4、GhWRKY41和GhTINY2在棉花黄萎病抗性中的作用机制,为棉花抗病育种提供了基因资源和理论基础;同时GhLac1调控因子的挖掘为棉花木质素代谢调控网络的构建提供了一定的理论参考。
祝开[2]（2020）在《宿根矮化病菌侵染甘蔗的生理与分子机制研究》文中研究表明甘蔗（Saccharum spp.L.）是广泛种植于热带及亚热带地区的多年生禾本科植物,是世界第一大糖料作物。由革兰氏阳性细菌Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）引起的甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting disease,RSD）在甘蔗产区普遍发生,严重影响甘蔗生长进而造成产量和经济损失。前人的研究多集中在RSD的发生与检测、病原菌Lxx的分离培养及RSD胁迫下甘蔗的超微结构观察,且目前有关甘蔗与RSD互作的分子机制研究多是对Lxx侵染下甘蔗差异表达基因的克隆与不同胁迫处理下的定量表达研究。由于Lxx难于实现体外分离培养和对其进行遗传操作,故而也限制了Lxx与甘蔗互作机理的研究。本研究通过对甘蔗接种诱导,观察和测定了Lxx侵染对甘蔗生长和生理生化代谢的影响;以高感RSD甘蔗品种Badila为材料,利用RNA-Seq与DIA技术分析了在响应RSD病原菌胁迫过程中,甘蔗叶片与茎的m RNA及蛋白表达水平的变化;利用i TRAQ技术,分析了甘蔗感染RSD后的磷酸化蛋白质表达变化;利用转基因技术对病原菌Lxx18460基因（anti-sigma K factor,Rsk A）的功能进行了初步探究。主要的研究内容与结果如下:1.以果蔗拔地拉（Badila）和桂糖11号（GT11）健康种茎为实验材料,通过接种Lxx纯培养菌液作为RSD染病处理。利用病原菌Lxx的特异性基因Lxx18460,基于实时荧光定量PCR和Western Blot技术分析了该基因在甘蔗感染RSD后50 d、180 d、210 d的表达情况。结果表明,接种Lxx后,随着甘蔗的生长,Lxx18460在转录水平和蛋白水平表达逐渐升高。在此期间,Lxx侵染下的甘蔗较对照植株的株高、茎径、单茎重、水势以及半胱氨酸和甲硫氨酸含量均下降,而膜透性和游离氨基酸、钙调素含量增加;同时,抗性基因PAL、ZFP和NBS-LRR在转录水平的相对表达量也在Lxx侵染后上调表达。2.用Lxx菌液接种Badila和GT11健康种茎,通过对两个甘蔗品种四个时期的细胞壁组分进行测定,结果显示,在Lxx侵染下,Badila染病植株叶片的纤维素、半纤维素和果胶含量分别较对照植株下降14.88%、13.74%和11.17%,胼胝质和木质素含量分别较对照植株上升13.13%和15.29%;在GT11中,染病叶片的纤维素、半纤维素和果胶含量分别较对照植株下降7.43%、5.43%和16.7%,胼胝质和木质素含量分别较对照植株上升17.45%和15.07%。受Lxx侵染后,Badila在其工艺成熟期时地上部分干物质积累总量、全氮积累总量、全磷积累总量、全钾积累总量较对照植株分别显着下降53.5%、12.8%、11.7%、7.4%,而GT11分别下降21.8%、33.8%、6.5%、5.7%,两个品种间具有显着性差异。3.以高感RSD甘蔗品种Badila为材料,对接种Lxx后90 d的叶片与蔗茎基部样品用Illumina RNA-Seq进行测序。结果表明,RSD染病叶片较对照叶片相比共有11,802个差异表达基因,其中7,721个上调表达基因,4,081个下调表达基因;染病蔗茎与对照蔗茎相比共有9,325个差异表达基因,其中4,426个上调表达,5,059个下调表达。这些差异表达基因在甘蔗叶片和茎中所起的生物学功能和参与的代谢途径不同,综合来看,主要在光合作用、植物与病原菌相互作用中的信号通路、植物激素与次生代谢及细胞壁相关途径响应RSD胁迫。4.在转录组学的基础上,利用DIA技术对同样处理的甘蔗品种Badila的实验材料进行蛋白质组学分析。结果表明:12个甘蔗样品中共鉴定到的蛋白数量为9,702个,RSD染病叶片与对照叶片的差异表达蛋白有98个,其中上调表达蛋白40个,下调表达蛋白58个;蔗茎中筛选到的差异表达蛋白有407个,其中上、下调表达蛋白分别为179个和228个,说明甘蔗茎较叶片在蛋白水平更为积极和敏感地响应Lxx的侵染。综合叶片与蔗茎中的差异表达蛋白分析结果,这些蛋白显着富集于植物激素信号转导、苯丙素和谷胱甘肽生物合成、植物与病原菌互作途径等,这些代谢通路直接或间接参与甘蔗对RSD的响应。甘蔗叶片蛋白质组与转录组的差异表达的关联性为0.1545,而蔗茎中的差异表达关联性为0.3076。甘蔗叶片和茎中分别有11个和38个差异表达蛋白与转录组中的差异表达基因相关联,其中有7个和27个差异表达蛋白分别与各自的差异基因表达趋势相同,且大部分的关联差异蛋白与植物激素信号转导、植物与病原菌互作和植物次生代谢物合成等相关。5.利用i TRAQ技术对甘蔗感染RSD后的Badila蔗茎基部进行了磷酸化蛋白组研究。结果表明:6个甘蔗样品中共鉴定到3,924个磷酸化肽段,有3,326个磷酸化位点定位在1,879个磷酸化蛋白上。甘蔗茎在Lxx侵染90 d后与对照植株有114个差异磷酸化肽段,其中有63个表达上调,51个表达下调。对差异磷酸化蛋白的Pathway进行富集分析,结果显示,富集到差异磷酸化蛋白数目较多的通路是代谢途径、次生代谢物合成和植物病原菌互作,其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢和精氨酸生物合成为显着富集通路。6.利用转基因烟草对甘蔗宿根矮化病菌膜蛋白基因Lxx18460（anti-sigma K factor）进行了研究,转化Lxx18460后的烟草植株较野生型相比,植株生长高度降低,叶面积变小,生物量下降。净光合速率降低、内源激素合成受到抑制。Lxx18460基因主要在烟草茎中高度表达,在植株生长过程中,该基因在转录和翻译水平的表达随着时间的推移而稳定增加,其表达减缓了烟草植株的生长。Lxx18460基因表达量越高,对烟草的影响越明显。构建了受Ubi启动子控制的单子叶植物表达载体p UBTC-Lxx18460,通过农杆菌介导转化法进行甘蔗的遗传转化,将目的载体导入甘蔗品种ROC22中。经过组织培养和后期筛选,经PCR检测和Western Blot检测确证获得了转Lxx18460基因甘蔗,蛋白质检测结果也说明该基因已经在转化植株中正确表达为相应的蛋白。总之,本研究通过分析Lxx侵染甘蔗导致的生理及病理变化,探讨了甘蔗对RSD响应的生理和分子机制,并且对Lxx18460基因功能进行了初步的探讨,这些工作使我们能够更深入地了解甘蔗对RSD的应答机制,为研究RSD与甘蔗互作提供参考。
宋云[3]（2020）在《BIN2调控植物抗黄萎病的分子机理研究》文中研究表明棉花是世界上最主要的经济作物之一,其纤维是纺织工业的重要原料。作为世界上四大产棉国之一,我国棉花的种植面积以及产量一直位居世界前列。然而,近年来棉花黄萎病病害严重影响了我国棉花的产量和纤维质量,在农业生产上导致巨大的经济损失,逐渐成为影响我国棉花生产可持续发展的主要障碍之一。研究报道棉花BIN2能够响应黄萎病菌侵染,但具体分子机制并不清楚。本文以陆地棉及拟南芥为研究对象,初步研究了BIN2基因在植物抵抗黄萎病菌方面发挥的功能,并筛选到与BIN2互作的JAZ蛋白。取得的主要研究结果如下:1、利用陆地棉基因组数据库,通过生物信息学分析,确定了陆地棉BIN2基因序列（GenBank:KM453729）。GhBIN2基因其CDS全长1143bp,编码381个氨基酸。陆地棉BIN2与雷蒙德氏棉、番茄、拟南芥和油菜的同系物相比具有较高的相似性,进化上高度保守。GhBIN2基因在棉花的各个组织中均有表达,在花瓣中的表达量最高。除此之外,与之前在海岛棉中的结果一致,陆地棉BIN2在黄萎病菌侵染的过程中表达量下调。2、明确了 BIN2在植物黄萎病菌抗性方面发挥着负调控作用。在棉花中,利用VIGS技术成功沉默该基因,黄萎病菌接种实验表明,沉默植株叶片变黄、萎蔫程度较对照植株相比明显较轻。成功获得BIN2基因过表达转基因棉花株系,接种实验表明BIN2过表达棉花植株表现出对黄萎病菌更敏感的表型。在模式植物拟南芥中,BIN2功能获得型突变体bin2-1表现出对黄萎病菌更敏感的表型,相反,BIN2功能缺失型突变体bin2-3及bin2-3 bill bil2表现出更强的抗性,与棉花中的结果一致。综上所述,BIN2在棉花和拟南芥抗黄萎病菌进程中均发挥负调控作用。3、通过酵母双杂筛选,发现BIN2能够与茉莉酸信号途径的负调控因子JAZ蛋白互作,Co-IP及Pull-down实验更进一步验证了两者之间的互作。JAZ蛋白的ZIM结构域介导了两者之间的相互作用。此外,BIN2能够磷酸化JAZ蛋白,且磷酸化位点为JAZ蛋白第196位苏氨酸。推测GhBIN2可能通过调节茉莉酸信号途径传导进而影响棉花黄萎病抗性。以上研究结果初步明确了 BIN2抗黄萎病的分子机制,确定了 BIN2与JAZ蛋白之间的互作,为深入阐明棉花抗黄萎病的调控网络奠定理论基础。
沈吉丽[4]（2020）在《GhMYB43调控棉花抗黄萎病菌的机制解析》文中研究指明植物在自然环境中生存,随时都要面临病原菌的侵害。在长期进化过程中,植物建立了自己的免疫系统去感知和响应生物胁迫,激活体内免疫应答反应来保护自身不受侵害。GhLac1是棉花中能够介导对黄萎病菌、棉铃虫、蚜虫产生广谱抗性的基因,其表达水平受相应生物胁迫的诱导表达;为进一步解析GhLac1调控棉花抗性响应的分子机制,本研究前期利用酵母单杂交（Yeast one hybird）筛选GhLac1上游调控因子,其中GhMYB43（GhD12G0544）能够显着激活GhLac1的表达。本研究以GhMYB43为研究对象,探讨其在响应棉花黄萎病菌入侵后的功能及其抗病分子机制,取得主要结果如下:1.克隆了GhMYB43基因全长序列并对其保守结构域和亚细胞定位进行分析。结果显示:GhMYB43位于陆地棉（Gossypium hirsutum）Dt亚组第12号染色体上,其开放阅读框长（Open Reading Frame,ORF）1131bp,包含2个内含子和3个外显子,编码1个含376个氨基酸的蛋白质,具有两个高度保守的MYB结构域,属于典型的R2R3-MYB类转录因子。因其与拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtMYB43最为同源,所以将其命名为GhMYB43。亚细胞定位试验表明GhMYB43定位于核内。2.组织表达模式分析表明GhMYB43在棉花所有组织中均有表达,但在茎中表达量最高;激素诱导表达模式分析发现GhMYB43表达水平受茉莉酸甲酯（Me-JA）处理下调,受水杨酸（SA）和过氧化氢（H2O2）处理上调;接菌诱导表达模式分析显示,GhMYB43在6 h、12 h、24h时受菌诱导下调表达,且12 h、24h下调显着,在48 h后受菌诱导上调表达。这表明GhMYB43参与了棉花的免疫响应调控。3.为了研究GhMYB43在棉花抗病中的功能,本研究构建了病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）载体。研究发现通过VIGS抑制GhMYB43的表达,棉花对黄萎病菌V991的抗病性增强。基因表达分析显示在水处理（Mock）和V991处理下,TRV:GhMYB43植株中JA和木质素合成路径相关基因的表达量相比于TRV:00均表现为上调。4.为了进一步验证GhMYB43在棉花抗病中的功能,本研究构建了35S启动子驱动的GhMYB43超表达（35S::GhMYB43）载体,转化棉花并获得了相应的超表达株系（OE-77、OE-81和OE-8）。进一步研究发现,GhMYB43超表达棉花材料中木质素含量相比于对照（WT）减少,接种黄萎病强致病菌株V991后,木质素含量显着高于未接种的棉株;基因表达分析发现在Mock处理和V991处理下,超表达转基因株系中JA和木质素路径相关基因的表达量相比于WT均表现为下调;抗性鉴定表明,超表达GhMYB43削弱了棉花对黄萎病菌的抗性。5.以上结果表明,GhMYB43是棉花抗黄萎病反应的负调控因子,影响棉花JA信号路径及木质素代谢途径。但其具体作用机制仍有待进一步研究。
罗湘胤[5]（2019）在《GbWRKY1在棉花磷稳态和多抗反应中的作用机制研究》文中研究说明植物在生长发育中面临多种逆境胁迫,并进化出了调控多重逆境胁迫与生长发育的信号网络。WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子家族,在植物的生长发育和胁迫响应中发挥重要功能。GbWRKY1是我们前期从棉花中鉴定到的一个响应黄萎病菌侵染的基因。已有的研究发现,将其异源转化拟南芥后能调控拟南芥低磷响应。进一步研究表明,GbWRKY1可以绑定JAZ1的启动子并激活其表达,从而实现同步调控抗病性和生长发育。本研究在前期已有的研究基础上,对GbWRKY1在棉花响应低磷胁迫中的功能进行了鉴定,并探讨了磷稳态对棉花抗病性的影响和机制;此外,我们也对GbWRKY1在盐和干旱胁迫中的调控功能进行了探究。本论文取得的主要研究结果如下:1、GbWRKY1在调控棉花低磷胁迫响应中的效应不明显我们对野生型和GbWRKY1转基因超表达和干涉棉花材料进行了盆栽实验和苗期的低磷处理实验,实验结果显示磷含量、鲜重、株高以及激素含量等生理生化指标在GbWRKY1转基因材料和野生型间并没有规律的变化趋势,这可能和棉花本身对低磷胁迫有较高的耐受性有关。2、低磷处理能激活茉莉酸信号路径和次生代谢并显着增强了棉花对黄萎病菌的抗性我们对正常和低磷处理下生长三周的棉花进行了黄萎病菌接种鉴定,结果表明低磷处理后棉花对黄萎病菌V991的抗性显着提升,病指的统计、真菌生物量的检测以及恢复培养等实验结果与表型一致。激素含量测定结果表明,低磷处理后棉花叶片中茉莉酸和茉莉酸异亮氨酸的含量显着上升,且茉莉酸信号路径相关基因的表达被显着激活我们对正常和低磷条件下生长三周的野生型棉花的叶片进行了转录组的测定,结果总共鉴定到约2700个差异基因,对低磷处理后显着上调的基因进行KEGG通路的富集分析后发现,苯丙烷代谢路径的重要组分-类黄酮合成路径在低磷处理后被显着激活。进一步对整个苯丙烷代谢路径中的差异基因进行分析表明位于主干路径上游的三个关键酶（PAL、C4H和4CL）都在低磷处理后显着上调,且木质素合成路径中的差异基因大部分也在低磷处理中呈上调表达的趋势。代谢组测定结果发现,在可以准确定性的240种代谢物中,我们鉴定到了69种在低磷处理下含量显着增加或减少的差异代谢物。进一步分类结果表明,类黄酮化合物占了所有差异代谢物的28%,且含量都在低磷处理后显着升高。对这69种差异代谢物进行代谢通路的富集分析,结果也显示类黄酮合成路径被显着富集;这些结果表明,低磷处理下棉花抗病性的提高可能是通过类黄酮和木质素等次生代谢物的合成增强来实现的。3、GbWRKY1超表达通过削弱ABA信号路径降低了盐和干旱的耐受性表达模式分析表明,GbWRKY1的转录水平在盐、PEG以及ABA处理后显着上调。拟南芥种子萌发的敏感性测试表明,GbWRKY1超表达系对盐和渗透胁迫更敏感;成株期的抗性鉴定表明,GbWRKY1超表达拟南芥对盐和干旱胁迫的耐受性显着降低;棉花中的干旱处理实验也表明,GbWRKY1超表达植株相比野生型对干旱更敏感。表达分析表明,在氯化钠、甘露醇和ABA处理后,ABA响应标志基因-RAB18和RD29A的诱导程度在GbWRKY1超表达系中显着降低。此外,拟南芥种子萌发和幼苗的ABA处理实验表明,相比对野生型GbWRKY1超表达系对ABA的敏感性显着降低。在GbWRKY1超表达系AOV9中敲除JAZ1后可以恢复其ABA不敏感的表型,而JAZ1超表达会表现出和GbWRKY1超表达系类似的ABA不敏感的表型。进一步通过酵母双杂筛选,我们鉴定到JAZ1与ABI1存在互作。以上结果说明GbWRKY1可能通过JAZ1-ABI1互作模块来负调控ABA信号路径,进而影响了盐和干旱的耐受性。
秦涛[6]（2019）在《GhPUB17在棉花抗黄萎病中的功能鉴定》文中研究指明黄萎病是造成世界棉花产量和品质降低的主要病害之一。研究棉花抗病机制,鉴定抗病基因可为棉花抗病分子育种提供理论基础和基因资源。在植物抗病过程中,多种蛋白质、酶的相互合作,共同完成了植物抗病信号的产生和传递。泛素化修饰系统是真核生物体内主要的蛋白质调控路径,广泛参与了对生物体内大多数蛋白质的修饰降解行为。近年来研究发现,众多E3泛素连接酶参与了不同物种对相应病原菌的抗性调节。本研究对棉花一个参与抗黄萎病调控的E3泛素连接酶基因的功能进行了研究,并对棉花中PUB基因家族进行了聚类分析,取得的主要结果如下:1.序列分析表明,我们获得的对棉花黄萎病有响应的E3泛素连接酶基因与拟南芥中具有免疫调节作用的PUB17具有较高的同源性,故命名为GhPUB17。表达分析发现利用棉花黄萎病菌株V991,植物抗生物逆境相关激素SA和MeJA体外处理棉花幼苗后,提取总RNA检测GhPUB17表达水平,结果发现GhPUB17均被诱导上调表达。鉴于此结果,我们对其在棉花中的表达量进行了调控,详细研究其抗黄萎病功能。2.通过病毒介导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）及RNAi干涉技术抑制GhPUB17在棉花中的表达,棉花植株对黄萎病菌的抗性得以增强。超量表达GhPUB17后,转基因棉花材料对黄萎病的抗性明显弱于野生型对照及抑制GhPUB17基因表达的材料。接种灰霉病原菌后发现,所有棉花材料对该病原的抗性无显着性差异,表明GhPUB17可能特异性参与了棉花对黄萎病的抗性调控。3.使用qRT-PCR方法检测GhPUB17各种转基因株系材料接种黄萎病菌后抗病相关基因的表达变化。结果发现JA和SA信号路径标志基因在各个取样时间点的表达趋势一致,不因GhPUB17株系不同而存在差异,这说明GhPUB17在棉花抗病信号网络中的作用位置可能独立于SA和JA信号路径。4.通过蛋白互作实验鉴定到棉花亲环素GhCyP3可以与GhPUB17互作。通过VIGS方法抑制GhCyP3表达后接种V991,发现棉苗的抗病性降低,表明其在棉花抗黄萎病过程中具有正向调控作用。进一步研究发现GhCyP3蛋白能够抑制GhPUB17的E3泛素连接酶活性。此外本研究还发现,GhCyP3蛋白本身具有抗菌肽活性,体外培养状态下可有效抑制黄萎病菌孢子的增殖。这些结果证明GhCyP3在棉花抗黄萎病方面存在多重调控作用。5.为了本课题后续对PUB基因家族成员的功能进行系统性分析,我们对棉花基因组中的PUB基因进行了检索。以拟南芥的PUB基因序列为参考,我们在陆地棉基因组中BLAST比对发现了77个PUB基因家族成员。聚类分析后发现,这77个基因可分为14类。通过对棉花组织表达与黄萎病菌诱导表达转录组数据的分析,我们发现这些基因在棉花各组织差异表达,且其表达量受黄萎病菌诱导。我们从已发表的267份棉花栽培品种的重测序数据中选取了124份,并调查了这些棉花材料对黄萎病的抗性数据。同时我们分析了这124份材料基因组中PUB基因的变异情况,并将其与材料的抗性相关联,发现部分PUB基因编码区与启动子区域的SNP与InDel位点可能与棉花对黄萎病的抗性相关联。以上研究结果证明棉花E3泛素连接酶GhPUB17负调控棉花抗黄萎病,但亲环素GhCyP3可以抑制GhPUB17活性,并抑制病原菌生长,同时PUB基因家族的其他成员可能也参与了棉花对黄萎病的免疫调控。这为棉花抗病分子育种提供了理论基础和基因资源。
张书芹[7]（2019）在《棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析》文中研究说明棉花黄萎病是影响我国棉花品质和产量提高的主要病害,因此挖掘棉花抗黄萎病的关键基因以及阐明其分子作用机理非常必要。半胱氨酸蛋白酶基因C1A家族木瓜类半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine proteases,PLCPs）在植物的广谱抗病中发挥着重要作用。本研究利用陆地棉TM-1分析了PLCPs的全基因组进化信息,并对家族成员GhRD21-7在棉花抗生物胁迫中的功能进行了分析,取得的主要研究结果如下:1.在陆地棉TM-1基因组中共鉴定到78个PLCPs成员。利用陆地棉和拟南芥PLCPs构建进化树,根据聚类结果所有的成员被分成了9个亚家族,分别命名为亚家族RD21、CEP、XCP、XBCP3、THI、SAG12、RD19、ALP和CTB。基因结构分析显示不同亚家族成员分别具有特异的结构和保守的motif,说明同一家族成员在进化上的保守性和功能上可能的相似性。2.PLCPs的组织表达模式分析表明PLCPs基因在花瓣和花药中表达量最高,其次是10 d纤维、种子萌发24 h的子叶、茎和开花10 d的胚珠。这些基因在柱头、子房和根中的表达量相对较低。表达模式分析表明共有35个PLCPs基因在棉花遭受高温、低温、盐和PEG处理后表达变化明显,其中在棉花遭受高温、低温、盐和PEG处理后分别有21、24、10和8个基因的表达变化明显。共有29个PLCP基因在棉花接种黄萎病菌处理后在接种材料和对照材料间表达差异明显,其中有16个PLCP基因在棉花受黄萎病菌侵染后上调表达。GhRD21-7在棉花接种黄萎病菌6 h下调表达,12 h上调表达并持续到24 h,并且它的表达量高于其它上调表达的基因。3.我们克隆了GhRD21-7,它编码长457个氨基酸的蛋白。组织表达模式表明GhRD21-7在花药中的表达量最高,其次是叶、根、茎和花瓣。为了研究GhRD21-7在棉花中的功能,我们构建了GhRD21-7的超量表达和抑制表达载体,获得了相应的超量表达GhRD21-7株系（OE154,OE173）和抑制GhRD21-7表达株系（Ri294,Ri381）。转基因株系接种黄萎病菌的结果表明超量表达GhRD21-7增强了棉花对黄萎病菌的抗性,抑制GhRD21-7表达削弱了棉花对黄萎病菌的抗性。4.转录组分析表明超量表达GhRD21-7株系OE154与野生型材料相比共有1522个差异表达基因,其中804个基因上调表达,718个基因下调表达。在接种黄萎病菌后,OE154中差异表达的基因较野生型材料多,达到2172个,其中1387个基因表达上调,785个基因表达水平下降。我们发现苯丙烷类代谢路径在差异表达基因中均富集。该代谢通路上共鉴定有17个基因,其中4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL1）,咖啡酸辅酶A甲基转移酶（CCoAOMT）,肉桂醇脱氢酶（CAD6）,肉桂酸-4-羟化酶（C4H）均与木质素合成途径相关,其中4CL和C4H是苯丙烷代谢路径的核心部分的关键酶,CCoAOMT和CAD是木质素G型和S型单体合成路径的关键酶。在接种前和接种后,4CL和C4H的表达量在超量表达GhRD21-7的转基因株系中和对照相比均上调,表明木质素代谢路径在超量表达GhRD21-7的转基因株系对黄萎病菌的抗性反应中发挥重要作用。该研究提了供棉花木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因家族成员的大量信息,为该家族成员的后续研究提供了参考。同时利用GhRD21-7的超量表达和抑制表达株系鉴定出该基因增强了棉花对黄萎病菌的抗性,利用转录组数据得出GhRD21-7介导的棉花对黄萎病菌的抗性与木质素合成路径激活有关。
苗玉焕[8]（2019）在《色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控》文中提出植物可以产生很多初生和次生代谢物以维持正常的生长发育和抵御外界环境胁迫,而这些具有防御性的代谢物质大多都来源于氨基酸合成和代谢路径。虽然棉花含有丰富的次生代谢物质,但是这些物质在棉花中的合成路径以及在棉花生长发育和防御反应中的作用并不清楚。本研究前期通过拟南芥芯片表达谱数据,并结合棉花响应黄萎病菌的RNA-Seq数据和抑制差减杂交文库,发现色氨酸合成路径基因GbTSA1受多种真菌诱导表达,推测该基因可能参与了植物广谱响应真菌侵染的抗病信号路径或免疫调控。本研究基于以上结果对色氨酸合成路径相关基因在棉花抗黄萎病中的功能进行了解析,取得主要结果如下:1.GbTSA1表达模式分析组织表达模式分析显示GbTSA1在棉花各个组织（根,茎秆,叶片,花瓣,0 d胚珠,5 d纤维）中均高量表达;诱导表达模式分析显示GbTSA1在棉花接种黄萎病菌初期表达显着下降,在接种24 h后表达显着上调,同时该基因也受水杨酸处理诱导上调表达;亚细胞定位结果显示GbTSA1基因编码的蛋白定位于叶绿体中。2.GbTSA1抑制表达材料增强棉花对黄萎病的抗性为了研究GbTSA1在棉花抗病中的功能,我们构建了GbTSA1超量表达载体,RNAi抑制表达载体以及病毒诱导的基因沉默载体,并获得超表达株系（OS-2,OS-3,OS-5,OS-8）和抑制表达株系si-1。研究发现,抑制GbTSA1表达的转基因株系si-1出现类病斑表型,同时伴随SA合成路径以及PR基因的显着激活。利用病毒载体TRV:TSA1抑制GbTSA1表达后植株表现出与si-1相似的类病斑表型。进一步研究发现,抑制GbTSA1表达后增强棉花对黄萎病菌的抗性,而超量表达GbTSA1后对棉花黄萎病的抗性影响不大。3.GbTSA1抑制表达材料表型形成依赖于水杨酸合成和信号路径为了研究si-1以及TRV:TSA1抑制表达植株类病斑的形成机制,本研究将水杨酸合成路径关键基因GbICS1以及信号路径关键基因GbNPR1分别与GbTSA1进行共抑制,结果表明共抑制GbICS1和GbNPR1后可以恢复TRV:TSA1抑制表达植株引发的类病斑及抗病的表型,说明水杨酸合成的组成型激活是导致TRV:TSA1抑制表达植株出现坏死的原因。4.吲哚激活棉花抗病免疫反应和SA合成由于色氨酸合成路径和水杨酸合成路径共用前体底物分支酸,为了解析si-1以及TRV:TSA1抑制表达植株引发水杨酸含量升高的机制,我们对整个色氨酸合成路径进行了系统的研究,结果显示类病斑表型的出现具有基因特异性,且不是由分支酸和色氨酸含量变化所致。此外,TRV:TSB1抑制表达植株也出现依赖于水杨酸信号路径的类病斑表型。酵母双杂交实验表明GbTSB1可以和GbTSA1互作形成复合体催化色氨酸合成的最后一步反应;代谢组分析发现TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株吲哚以及吲哚类代谢物显着积累;转录组分析发现吲哚可以激活抗病相关基因以及水杨酸合成相关基因GbSARD1,GbWRKY28等的表达;双荧光素酶实验证明GbSARD1和GbWRKY28可以结合在GbICS1的启动子上,激活GbICS1的表达;共抑制GbSARD1可以部分恢复TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株类病斑表型;吲哚外施处理显示吲哚可以增强棉花对黄萎病菌的抗性;以上结果表明,抑制GbTSA1和GbTSB1的表达能促进其代谢底物吲哚以及吲哚类物质在抑制表达植株中显着积累,吲哚类物质可以通过激活SA合成关键转录因子GbSARD1以及GbWRKY28的表达,最终导致TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表达植株中SA含量显着升高,PR基因组成型激活,植株出现类病斑和抗病表型。5.GbTRP1抑制表达植株积累邻氨基苯甲酸类物质本研究还发现色氨酸合成路径基因GbTRP1抑制表达植株以及GbTRP1-RNAi转基因株系也会产生类病斑表型,但在TRV:TRP1抑制表达植株中SA含量显着降低。代谢组分析发现邻氨基苯甲酸及其衍生物在TRV:TRP1抑制表达植株中显着积累。后续实验需要进一步探讨TRV:TRP1抑制表达植株和GbTRP1-RNAi转基因株系出现类病斑的机制以及邻氨基苯甲酸与水杨酸（邻羟基苯甲酸）在植物抗病反应中的联系。
管倩倩[9]（2019）在《棉花GhWRKY41在抗黄萎病及盐胁迫中的功能研究》文中研究指明黄萎病是土传维管束真菌病害,对棉花生产影响广,被称为棉花中的“癌症”。挖掘棉花响应黄萎病菌的基因可为理解抗病机制,创新抗病种质提供基础。本研究前期通过分析棉花接种黄萎病菌不同时间点RNA-seq数据,筛选到一个受黄萎病菌诱导上调表达的WRKY转录因子GhWRKY41,并针对其在棉花抗病和抗逆的作用进行了研究。研究结果结果表明,超量表达GhWRKY41能够提高棉花和拟南芥对黄萎病菌和盐胁迫的抗性,主要研究结果如下:1.亚细胞定位实验发现,GhWRKY41定位在细胞核中。组织表达模式发现,GhWRKY41在棉花各个组织中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,花瓣中次之,花药中表达量最低。诱导表达模式发现,在接种黄萎病菌处理后,GhWRKY41在接种3 h后表达显着上调;在水杨酸（SA）处理后,GhWRKY41在6h响应表达明显;而在茉莉酸甲酯（MeJA）和过氧化氢（H2O2）处理后,GhWRKY41在24 h时响应表达更明显。2.利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术抑制GhWRKY41表达后并接种黄萎病菌,发现TRV:GhWRKY41相比对照TRV:00更加感病。此外还发现TRV:GhWRKY41材料茎秆木质素含量减少,木质素合成相关基因表达量下降。将该基因异源转化拟南芥发现,超量表达该基因能够增强拟南芥对黄萎病菌的抗性;同时我们还构建GhWRKY41超表达载体和干涉载体,利用农杆菌介导的棉花遗传转化体系,获得了GhWRKY41超量表达和抑制表达棉花转基因材料。结果表明,转基因抑制表达株系表型与VIGS抑制表达植株结果一致,GhWRKY41可能通过影响木质素含量变化来影响棉花的抗感性。3.本研究还发现超表达GhWRKY41的拟南芥转基因株系表现出对NaCl更强的耐受性;棉花超表达株系也表现出类似的表型,而抑制表达转基因棉花株系对NaCl更加敏感。以上结果表明,GhWRKY41可能在棉花抗盐胁迫中发挥重要作用。
李俊娇[10]（2019）在《大丽轮枝菌跨膜蛋白VdSho1调控穿透能力及黑色素合成的分子机制研究》文中进行了进一步梳理大丽轮枝菌是引起黄萎病的重要病原真菌,其寄主范围广泛,可侵染包括棉花、番茄、莴苣等重要的经济作物在内的数百种双子叶植物。Sho1是一个具有四次跨膜结构域的膜感受器蛋白,参与影响真菌多种生物学功能,但在大丽轮枝菌中尚未发现其调控致病机理的报道。现有研究对大丽轮枝菌VdSho1致病性功能进行了鉴定,但其具体的调控机理并不明确。本论文针对VdSho1及下游MAPK信号通路元件在调节大丽轮枝菌穿透纤维素膜及黑色素合成方面的功能进行了分析,得到以下4个主要研究结果:1.基因敲除实验表明VdSho1具有调控大丽轮枝菌纤维素膜穿透能力的功能。转录组测序分析结果表明VdSho1正向调节黑色素合成相关基因表达。同时,黑色素合成抑制剂显着降低野生型菌丝穿透能力,表明黑色素促进大丽轮枝菌菌丝穿透过程。综上所述,VdSho1通过调控黑色素的水平,调节大丽轮枝菌对纤维素膜的穿透能力。2.酵母双杂交实验显示,VdSho1可通过C端胞内区与MAPK信号通路调节蛋白Vst50相互作用。RNA-seq结果显示Vst50与VdSho1调控基因群高度重合。分析Vst50和VdSho1的遗传调控关系,结果表明VdSho1位于Vst50上游,二者共同调节穿透能力及黑色素合成过程。另外,敲除MAPK信号通路元件Vst7、Vst11基因,均显着降低穿透能力及黑色素合成水平。酵母双杂交结果显示,Vst50分别与Vst7、Vst11相互作用,突变Vst50蛋白中与Vst7、Vst11互作的结构域,病原菌穿透能力及黑色素合成水平显着降低,表明Vst50-Vst7-Vst11组成的MAPK级联通路对于大丽轮枝菌侵染纤维素膜具有重要作用。3.纤维素膜穿透实验表明,敲除VdSho1任意跨膜结构域,均严重影响大丽轮枝菌穿透能力及黑色素合成水平,表明跨膜结构域是维持VdSho1功能所必须的。提高孢子悬浮液中甘油含量,大丽轮枝菌穿透纤维素膜能力显着降低,表明大丽轮枝菌穿透过程需要细胞维持一定的膨胀压力。1 M甘油处理,野生型菌株中黑色素合成相关基因表达量略微升高,而ΔSho1突变体中黑色素合成基因水平显着降低,表明VdSho1参与响应外部高渗透信号,调节黑色素合成。分析细胞膜通透性与穿透的关系,结果显示VdSho1参与响应细胞膜透性调节剂制霉菌素刺激,调节穿透水平及黑色素含量。分析VdSho1跨膜结构域响应细胞膜通透性功能,结果显示VdSho1跨膜结构域是响应膜透性变化、调控黑色素水平所必须的。以上结果表明VdSho1参与感受细胞膜通透性变化,调节穿透和黑色素水平。4.棉花接菌实验显示,VdSho1基因敲除突变体对棉花的致病力及定殖能力显着降低,表明VdSho1调节病原菌致病性。扫描电子电镜观察ΔSho1突变体侵染棉花根部表型,ΔSho1突变体较野生型进入寄主根内部水平显着降低。分析在大丽轮枝菌侵染进程中VdSho1基因表达情况,VdSho1基因在侵染早期诱导表达,表明VdSho1是重要的致病相关基因。综上所述,VdSho1作为膜感受器参与感应细胞内外渗透压变化,进而通过调节菌丝内部黑色素的水平而提高病原菌穿透能力,最终调节大丽轮枝菌致病性。
二、棉花黄萎病菌单克隆抗体的制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、棉花黄萎病菌单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
（1）转录因子MYB4、WRKY41和TINY2调控棉花木质素代谢与免疫反应的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物抗病机制 |
| 1.1.1 植物先天免疫系统 |
| 1.1.2 木质素代谢与植物免疫反应 |
| 1.1.3 植物激素介导的防御反应 |
| 1.2 植物激素介导的防御反应与生长发育的平衡 |
| 1.2.1 水杨酸介导的生长-防御权衡 |
| 1.2.2 茉莉酸介导的生长-防御权衡 |
| 1.3 棉花黄萎病及抗病机制 |
| 1.3.1 黄萎病菌致病机制 |
| 1.3.2 棉花的组织结构抗性与抗黄萎病反应 |
| 1.3.3 棉花的生理生化抗性与抗黄萎病反应 |
| 1.3.4 棉花中植物激素介导的对黄萎病菌的抗性 |
| 1.4 转录因子概述 |
| 1.4.1 转录因子的结构特征与分类 |
| 1.4.2 转录因子对木质素代谢的调控 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 木质素负调控因子GhMYB4 增强棉花抗病性 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体及菌株 |
| 2.1.3 启动子与转录因子的分离和克隆 |
| 2.1.4 酵母单杂交(Y1H)实验 |
| 2.1.5 棉花原生质体的分离与转化和双荧光素酶报告基因(DLR)实验 |
| 2.1.6 烟草双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.1.7 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 2.1.8 棉花和拟南芥DNA和 RNA提取 |
| 2.1.9 RNA反转录及RT-qPCR |
| 2.1.10 转基因材料Southern杂交检测 |
| 2.1.11 烟草表皮细胞亚细胞定位 |
| 2.1.12 黄萎病菌的活化及培养 |
| 2.1.13 棉花和拟南芥的接种鉴定 |
| 2.1.14 Me-JA、SA、聚半乳糖醛酸(PGA)及黄萎病菌处理棉花 |
| 2.1.15 木质素组织化学染色及含量测定 |
| 2.1.16 棉花内源植物激素和黄酮含量质谱测定 |
| 2.1.17 细胞壁水可溶性多糖提取与测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 利用GhLac1 启动子筛选拟南芥转录因子文库 |
| 2.2.2 同源法分离候选棉花转录因子 |
| 2.2.3 7 个候选转录因子与GhLac1 启动子互作 |
| 2.2.4 7 个候选转录因子对GhLac1 的激活作用 |
| 2.2.5 GhMYB4 进化树分析与序列比对 |
| 2.2.6 GhMYB4 定位于细胞核 |
| 2.2.7 GhMYB4 基因表达模式分析 |
| 2.2.8 GhMYB4 转基因材料的分子鉴定 |
| 2.2.9 GhMYB4 正调控棉花和拟南芥对黄萎病菌的抗性 |
| 2.2.10 GhMYB4 在棉花和拟南芥中负调控木质素合成 |
| 2.2.11 GhMYB4 直接绑定GhC4H-1/2、Gh4CL-4、GhCAD-3、GhLac1 的启动子并抑制其表达 |
| 2.2.12 超表达GhMYB4 促进水可溶性果胶片段的积累 |
| 2.2.13 外施PGA增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 2.2.14 超表达GhMYB4 激活棉花中JA合成及信号转导 |
| 2.2.15 超表达GhMYB4 不影响棉花中黄酮的积累 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 木质素代谢与植物免疫反应之间的复杂关系 |
| 2.3.2 GhMYB4 超表达造成的CWI变化可能触发了DTI反应 |
| 第三章 GhWRKY41 形成正反馈调节环调控棉花苯丙烷代谢 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 实验载体与菌株 |
| 3.1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.1.4 棉花和拟南芥RNA提取 |
| 3.1.5 RNA反转录及RT-qPCR |
| 3.1.6 转基因材料Southern杂交检测 |
| 3.1.7 烟草表皮细胞亚细胞定位 |
| 3.1.8 转录激活活性测定 |
| 3.1.9 VIGS(Virus-induced gene silencing)实验 |
| 3.1.10 棉花和拟南芥黄萎病接种处理与鉴定 |
| 3.1.11 ChIP和 Western实验 |
| 3.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.1.13 荧光素酶互补成像(LCI)实验 |
| 3.1.14 双分子荧光互补(BiFC)实验 |
| 3.1.15 酵母单杂交实验 |
| 3.1.16 酵母双杂交实验 |
| 3.1.17 木质素的组织化学染色及含量测定 |
| 3.1.18 黄酮类物质的组织化学染色及含量质谱测定 |
| 3.1.19 黄酮处理黄萎病菌 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 GhWRKY41 的系统进化树及序列比对分析 |
| 3.2.2 GhWRKY41 的诱导表达模式分析 |
| 3.2.3 GhWRKY41 转录激活活性测定 |
| 3.2.4 GhWRKY41 蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.5 利用VIGS沉默GhWRKY41 后可削弱棉花抗性 |
| 3.2.6 GhWRKY41 正调控棉花和拟南芥对黄萎病菌的抗性 |
| 3.2.7 GhWRKY41 互作蛋白的筛选及验证 |
| 3.2.8 全基因组范围鉴定GhWRKY41 的靶标基因 |
| 3.2.9 GhWRKY41 调控自身表达 |
| 3.2.10 GhWRKY41 促进棉花中木质素和黄酮积累 |
| 3.2.11 黄酮具有明显的抑菌活性 |
| 3.2.12 GhWRKY41 直接激活GhC4H和 Gh4CL的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 GhWRKY41 与其同源基因在植物中的功能多样性 |
| 3.3.2 GhWRKY41 与自身形成一个正反馈调节环 |
| 3.3.3 GhWRKY41 是一个新的苯丙烷代谢调控因子 |
| 第四章 GhTINY2 介导棉花生长发育与免疫反应平衡 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.0 植物材料 |
| 4.1.1 实验载体与菌株 |
| 4.1.2 根癌农杆菌介导的遗传转化 |
| 4.1.3 棉花和拟南芥RNA提取 |
| 4.1.4 RNA反转录及RT-qPCR |
| 4.1.5 拟南芥材料RNA-seq分析 |
| 4.1.6 烟草表皮细胞亚细胞定位 |
| 4.1.7 VIGS实验 |
| 4.1.8 棉花和拟南芥黄萎病接种处理与鉴定 |
| 4.1.9 油菜素内酯(BR)、芸苔素唑(BRZ)和赤霉素(GA)处理 |
| 4.1.10 棉花和拟南芥中 SA 含量质谱测定 |
| 4.1.11 半薄切片 |
| 4.1.12 烟草双荧光素酶报告基因实验 |
| 4.1.13 荧光素酶互补成像实验 |
| 4.1.14 酵母单杂交实验 |
| 4.1.15 酵母双杂交实验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 GhTINY2 的系统进化树及序列比对分析 |
| 4.2.2 GhTINY2 的诱导表达模式分析 |
| 4.2.3 GhTINY2 转录激活活性测定 |
| 4.2.4 GhTINY2 蛋白亚细胞定位 |
| 4.2.5 GhTINY2 正调控棉花和拟南芥对黄萎病菌的抗性 |
| 4.2.6 GhTINY2 抑制植株生长 |
| 4.2.7 GhTINY2 促进水杨酸合成 |
| 4.2.8 GhTINY2 直接激活At WRKY51 的表达 |
| 4.2.9 GhTINY2 负调控油菜素内酯信号 |
| 4.2.10 GhTINY2与At BZR1 互作 |
| 4.2.11 GhTINY2 抑制At BZR1对AtIAA19 的激活作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 GhTINY2 是一个新鉴定的免疫调控基因 |
| 4.3.2 GhTINY2 通过负调控BR信号抑制植株生长 |
| 4.3.3 GhTINY2 可能是一个通过不同激素的交互作用来权衡植物发育与防御反应的关键因子 |
| 4.3.4 GhTINY2 可能在植株受黄萎病菌侵染时介导其从生长发育转向免疫反应 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 初步构建以GhLac1 为出发点的木质素代谢调控网络 |
| 5.1.1 GhLac1 上游调控因子的互作验证 |
| 5.1.2 GhWRKY30和GhWRKY41 协同调控GhLac1 |
| 5.1.3 GhWRKY30和GhWRKY41 协同调控对黄萎病菌的抗性 |
| 5.2 主要结论 |
| 5.3 特色与创新 |
| 5.4 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:部分载体构建方法 |
| 1.1 超表达载体构建 |
| 1.2 RNAi载体构建 |
| 1.3 酵母双杂交载体构建 |
| 附录2:原生质体瞬时转化后的Ch IP实验 |
| 附录3:PDA及 Czapek’s培养基配方 |
| 攻读学位论文期间发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（2）宿根矮化病菌侵染甘蔗的生理与分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘蔗宿根矮化病 |
| 1.1.1 甘蔗宿根矮化病的发生、症状及危害 |
| 1.1.2 甘蔗宿根矮化病的病原菌 |
| 1.1.3 甘蔗宿根矮化病的传播及致病机理 |
| 1.1.4 甘蔗宿根矮化病的检测 |
| 1.1.5 甘蔗宿根矮化病的防治 |
| 1.1.6 甘蔗宿根矮化病病原菌的基因组学研究 |
| 1.2 植物与病原菌互作机制 |
| 1.2.1 植物与病原菌互作的形态及细胞学变化 |
| 1.2.2 植物与病原菌互作的生化及分子机制 |
| 1.3 植物应答病原菌侵染的转录组、蛋白组及蛋白质修饰组学研究 |
| 1.3.1 转录组学 |
| 1.3.2 蛋白质组学 |
| 1.3.3 转录组学与蛋白质组学的关联研究 |
| 1.3.4 蛋白修饰组学 |
| 1.4 立题依据与研究意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 宿根矮化病菌侵染对甘蔗生长代谢的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 制备Lxx接种菌液 |
| 2.1.2 种植材料与接种 |
| 2.1.3 测定项目与方法 |
| 2.1.3.1 基于实时荧光定量PCR和 Western Blot检测甘蔗宿根矮化病 |
| 2.1.3.2 甘蔗农艺性状测定 |
| 2.1.3.3 水势、膜透性、游离氨基酸含量测定 |
| 2.1.3.4 可溶性糖、水分含量测定 |
| 2.1.3.5 半胱氨酸、甲硫氨酸、钙调素含量测定 |
| 2.1.3.6 防御相关基因表达量测定方法 |
| 2.1.4 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甘蔗茎中RNA提取及荧光定量引物的筛选 |
| 2.2.2 Lxx接种后不同时期甘蔗体内的Lxx18460 基因表达 |
| 2.2.3 甘蔗茎中蛋白质质量 |
| 2.2.4 不同时期RSD染病甘蔗体内Lxx18460 蛋白表达 |
| 2.2.5 Lxx侵染对甘蔗农艺性状的影响 |
| 2.2.6 Lxx接种对甘蔗叶片水势、膜透性、游离氨基酸含量影响 |
| 2.2.7 Lxx接种对甘蔗可溶性糖和水分含量的影响 |
| 2.2.8 Lxx接种对甘蔗叶片半胱氨酸、甲硫氨酸、钙调素含量的影响 |
| 2.2.9 Lxx接种对甘蔗叶片PAL、ZFP和 NBS-LRR基因表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 宿根矮化病菌侵染对甘蔗叶片细胞壁组分的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 种植及处理 |
| 3.1.3 测定项目及方法 |
| 3.1.3.1 甘蔗RSD确诊及取样 |
| 3.1.3.2 细胞壁组分的测定 |
| 3.1.4 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 DNA提取结果 |
| 3.2.2 PCR检测结果 |
| 3.2.3 Lxx接种对甘蔗叶片纤维素含量的影响 |
| 3.2.4 Lxx接种对甘蔗叶片半纤维素含量的影响 |
| 3.2.5 Lxx接种对甘蔗叶片果胶含量的影响 |
| 3.2.6 Lxx接种对甘蔗叶片胼胝质含量的影响 |
| 3.2.7 Lxx接种对甘蔗叶片木质素含量的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 宿根矮化病菌侵染对甘蔗干物质及氮磷钾含量的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 样品采集及处理 |
| 4.1.3 测定项目及方法 |
| 4.1.3.1 甘蔗全氮含量测定 |
| 4.1.3.2 甘蔗全磷含量测定 |
| 4.1.3.3 甘蔗全钾含量测定 |
| 4.1.4 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Lxx接种对甘蔗地上部分干物质积累量的影响 |
| 4.2.2 Lxx接种对甘蔗全氮的影响 |
| 4.2.3 Lxx接种对甘蔗全磷的影响 |
| 4.2.4 Lxx接种对甘蔗全钾的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 甘蔗应答宿根矮化病菌的转录组分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 材料种植与处理 |
| 5.1.3 转录组测序文库的构建 |
| 5.1.4 高通量测序数据基本分析与处理 |
| 5.1.4.1 CDS预测与SSR分析 |
| 5.1.4.2 基因注释 |
| 5.1.5 转录本表达量分析与基因表达差异分析 |
| 5.1.6 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 5.1.7 qRT-PCR检测分析 |
| 5.1.8 数据获取 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 测序数据质控 |
| 5.2.2 转录组组装 |
| 5.2.3 CDS及 SSR分析 |
| 5.2.4 甘蔗转录组注释 |
| 5.2.5 差异表达基因分析 |
| 5.2.5.1 Lxx侵染后差异表达基因的数量分析 |
| 5.2.5.2 差异基因的GO功能富集 |
| 5.2.5.3 差异基因的KEGG Pathway功能富集 |
| 5.2.6 差异表达基因的个性化分析 |
| 5.2.6.1 Lxx侵染后差异表达基因的功能分析 |
| 5.2.6.2 甘蔗响应Lxx侵染的差异表达基因 |
| 5.2.7 荧光定量实验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 甘蔗应答宿根矮化病菌侵染的蛋白质组研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 蛋白质提取 |
| 6.1.3 蛋白质定量与SDS-PAGE单向电泳 |
| 6.1.4 蛋白质组测序实验流程 |
| 6.1.4.1 蛋白酶解 |
| 6.1.4.2 High pH RP分离和高效液相 |
| 6.1.4.3 DDA(data-dependent acquisition)质谱检测 |
| 6.1.4.4 DIA质谱检测 |
| 6.1.5 蛋白组数据信息分析流程 |
| 6.1.5.1 数据库选择 |
| 6.1.5.2 DDA数据分析 |
| 6.1.5.3 DIA数据分析 |
| 6.1.5.4 MSstats差异分析 |
| 6.1.5.5 各个数据库项目的注释 |
| 6.1.5.6 差异蛋白的功能注释 |
| 6.1.6 MRM分析 |
| 6.1.6.1 蛋白质提取、质控、酶解、高效液相分离 |
| 6.1.6.2 质谱检测 |
| 6.1.6.3 MRM实验数据及生信分析流程 |
| 6.1.7 蛋白质组与转录组关联分析 |
| 6.1.7.1 关联分析流程 |
| 6.1.7.2 蛋白质组与转录组关联分析参数设置 |
| 6.1.7.3 关联数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 蛋白质检测 |
| 6.2.2 蛋白质组数据鉴定 |
| 6.2.2.1 蛋白质组基本鉴定信息 |
| 6.2.2.2 肽段质量评估 |
| 6.2.2.3 蛋白质组的整体分布分析 |
| 6.2.3 蛋白注释 |
| 6.2.3.1 GO分析 |
| 6.2.3.2 KOG分析 |
| 6.2.3.3 Pathway分析 |
| 6.2.4 差异表达蛋白统计分析 |
| 6.2.4.1 差异表达蛋白GO富集分析 |
| 6.2.4.2 差异表达蛋白的Pathway富集分析 |
| 6.2.4.3 差异表达蛋白KOG注释 |
| 6.2.4.4 差异表达蛋白亚细胞定位 |
| 6.2.5 样本中目标差异蛋白的MRM验证 |
| 6.2.5.1 MRM定量信息 |
| 6.2.5.2 目标蛋白相对定量 |
| 6.2.6 蛋白质组与转录组的关联分析 |
| 6.2.6.1 二个组学关联的数量信息 |
| 6.2.6.2 蛋白组与转录组的相关性分析 |
| 6.2.6.3 关联差异蛋白分析 |
| 6.2.6.4 GO富集关联数量统计 |
| 6.2.6.5 GO富集关联相关性分析 |
| 6.2.6.6 Pathway富集关联数量统计 |
| 6.2.6.7 Pathway富集关联相关性分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 甘蔗应答宿根矮化病菌侵染的磷酸化蛋白组学分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 蛋白质提取 |
| 7.1.3 蛋白样品质控 |
| 7.1.4 实验流程 |
| 7.1.5 数据分析 |
| 7.1.5.1 iTRAQ定量磷酸化蛋白质组学的基本信息分析流程 |
| 7.1.5.2 磷酸化蛋白鉴定与定量 |
| 7.1.5.3 磷酸化蛋白组功能分析 |
| 7.1.5.4 差异磷酸化蛋白的富集分析 |
| 7.1.6 PRM验证 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 磷酸化蛋白组鉴定 |
| 7.2.1.1 磷酸化蛋白组鉴定统计 |
| 7.2.1.2 磷酸化蛋白组鉴定数据评估 |
| 7.2.1.3 磷酸化位点统计 |
| 7.2.1.4 定量重复性评估 |
| 7.2.2 磷酸化蛋白组功能分析 |
| 7.2.2.1 GO注释分析 |
| 7.2.2.2 KEGG代谢通路注释分析 |
| 7.2.2.3 COG注释分析 |
| 7.2.3 差异磷酸化蛋白组功能分析 |
| 7.2.3.1 差异磷酸化肽段统计 |
| 7.2.3.2 差异磷酸化蛋白的GO富集分析 |
| 7.2.3.3 差异磷酸化蛋白的Pathway富集分析 |
| 7.2.3.4 差异磷酸化蛋白互作网络分析 |
| 7.2.3.5 差异磷酸化蛋白的亚细胞定位分析 |
| 7.2.4 样本中目标差异磷酸化肽段的PRM验证 |
| 7.2.4.1 PRM定量信息 |
| 7.2.4.2 目标磷酸化肽段相对定量 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 转基因烟草的Lxx18460 基因功能分析 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验材料与试剂 |
| 8.1.2 种植和处理 |
| 8.1.3 转基因烟草的DNA提取与PCR检测 |
| 8.1.4 转基因烟草的蛋白质提取与Western Blot检测 |
| 8.1.5 农艺性状的测定 |
| 8.1.6 光合速率的测定 |
| 8.1.7 防御酶活性的测定 |
| 8.1.8 内源激素含量的测定 |
| 8.1.9 Lxx18460 基因在转基因烟草中的表达 |
| 8.1.10 Western Blot检测不同时间Lxx18460 蛋白质的表达 |
| 8.1.11 转Lxx18460 基因烟草基因差异表达分析 |
| 8.1.12 生理数据分析 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 转基因烟草TI代的PCR检测 |
| 8.2.2 转基因烟草TI代的Western Blot检测 |
| 8.2.3 转基因烟草植株与野生型烟草植株的表型观察 |
| 8.2.4 转基因烟草植株与野生型烟草植株的株高、叶面积和净光合速率 |
| 8.2.5 防御酶活性在转基因和野生型烟草植株中的变化 |
| 8.2.6 内源激素含量在转基因和野生型烟草植株中的变化 |
| 8.2.7 Lxx18460 基因在转基因植株中的表达情况 |
| 8.2.8 Lxx18460 蛋白在转基因植株中的表达情况 |
| 8.2.9 转Lxx18460 烟草与野生型烟草的差异表达基因分析 |
| 8.2.10 RT-PCR验证 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 转Lxx18460 甘蔗的遗传转化 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 植物材料 |
| 9.1.2 菌种及质粒 |
| 9.1.3 试剂 |
| 9.1.4 主要仪器设备 |
| 9.1.5 培养基及溶液的配置 |
| 9.1.6 目的基因获得 |
| 9.1.6.1 引物设计 |
| 9.1.6.2 目的基因的扩增 |
| 9.1.7 构建重组载体p UBTC–Lxx18460 |
| 9.1.7.1 连接p MD18-T载体及转化E.coli感受态细胞 |
| 9.1.7.2 检测阳性克隆菌株 |
| 9.1.7.3 质粒的提取 |
| 9.1.7.4 单子叶植物表达载体和目的基因的双酶切 |
| 9.1.7.5 目的基因Lxx18460 连接单子叶表达载体p UBTC |
| 9.1.7.6 转化E.coli感受态细胞及挑选阳性克隆菌株 |
| 9.1.7.7 农杆菌感受态细胞EHA105 的转化 |
| 9.1.7.8 重组子转化EHA105 后单菌落PCR验证 |
| 9.1.8 农杆菌介导法转化甘蔗 |
| 9.1.8.1 甘蔗转化材料的培养 |
| 9.1.8.2 农杆菌侵染液的制备 |
| 9.1.8.3 甘蔗愈伤侵染转化 |
| 9.1.8.4 甘蔗愈伤转化后的培养 |
| 9.1.9 转基因阳性植株的PCR检测 |
| 9.1.9.1 甘蔗DNA的提取 |
| 9.1.9.2 转基因甘蔗的PCR检测 |
| 9.1.9.3 转基因甘蔗的Western Blot检测 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 目的基因的获得 |
| 9.2.2 载体构建和重组质粒双酶切验证 |
| 9.2.3 重组质粒转化农杆菌检测 |
| 9.2.4 转基因甘蔗的获得 |
| 9.2.5 甘蔗DNA提取与转基因植株PCR检测 |
| 9.2.6 转基因甘蔗Western Blot检测 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 第十章 总结与展望 |
| 10.1 全文总结 |
| 10.2 全文讨论 |
| 10.3 论文创新点 |
| 10.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研、学术活动、发表论文情况 |
（3）BIN2调控植物抗黄萎病的分子机理研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 棉花黄萎病研究进展 |
| 1.1.1 棉花黄萎病危害 |
| 1.1.2 棉花黄萎病致病机理 |
| 1.1.3 棉花黄萎病防治措施 |
| 1.2 BIN2蛋白研究进展 |
| 1.3 JAZ蛋白研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 陆地棉BIN2基因的生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 培养基配方 |
| 2.1.3 序列比对分析 |
| 2.1.4 棉花幼苗的培育 |
| 2.1.5 黄萎病菌的培养及接菌处理 |
| 2.1.6 棉花BIN2基因表达模式分析 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 GhBIN2序列分析 |
| 2.2.2 GhBIN2基因表达模式分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 GhBIN2基因在棉花中的功能验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌株与质粒 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 GhBIN2基因VIGS载体的构建及注射 |
| 3.1.5 超表达GhBIN2的转基因棉花获得 |
| 3.1.6 接菌后表型观察及病指统计 |
| 3.1.7 叶片过氧化氢积累 |
| 3.1.8 大丽轮枝菌恢复实验 |
| 3.1.9 大丽轮枝菌的定量 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 VIGS实验结果 |
| 3.2.2 过表达GhBIN2转基因棉花的鉴定及抗病检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 拟南芥BIN2基因的功能验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 拟南芥种子消毒及培养 |
| 4.1.4 BIN2相关拟南芥突变体的功能验证 |
| 4.1.5 荧光定量PCR |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 抗黄萎病鉴定结果 |
| 4.2.2 茉莉酸标记基因表达量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BIN2互作蛋白的筛选及互作验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 菌株和载体 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 相关缓冲液配方 |
| 5.1.5 载体构建 |
| 5.1.6 酵母转化 |
| 5.1.7 蛋白质免疫印迹 |
| 5.1.8 原核蛋白的诱导表达 |
| 5.1.9 GST蛋白的纯化 |
| 5.1.10 His蛋白的纯化 |
| 5.1.11 双分子荧光互补实验(BiFC) |
| 5.1.12 GST pull-down实验 |
| 5.2 实验结果与分析 |
| 5.2.1 AtBIN2互作蛋白的筛选 |
| 5.2.2 AtBIN2和AtJAZ1互作的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 BIN2与JAZ蛋白之间的磷酸化作用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 体外磷酸化相关缓冲液 |
| 6.1.2 体外磷酸化实验步骤 |
| 6.1.3 DNA的定点突变 |
| 6.2 结果分析 |
| 6.2.1 AtBIN2在体外磷酸化AtJAZ1蛋白 |
| 6.2.2 AtBIN2磷酸化AtJAZ1蛋白的靶位点 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
| 博士后期间发表的论文 |
| 个人简历 |
| 永久通讯地址 |
（4）GhMYB43调控棉花抗黄萎病菌的机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 棉花与棉花黄萎病概述 |
| 1.1.1 棉花的地位及黄萎病的危害 |
| 1.1.2 大丽轮枝菌的侵入过程 |
| 1.2 植物与病原菌的互作 |
| 1.2.1 植物的先天免疫 |
| 1.2.2 水杨酸和茉莉酸介导的抗病信号路径 |
| 1.3 木质素代谢与植物免疫调控 |
| 1.3.1 木质素代谢在棉花抗黄萎病反应中作用 |
| 1.4 MYB类转录因子 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 第二章 棉花抗黄萎病相关转录因子GhMYB43 的克隆及表达分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 GhMYB43 基因的来源及克隆 |
| 2.1.2 试验菌株及质粒 |
| 2.1.3 试验主要仪器 |
| 2.1.4 实验试剂及生物信息分析软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 GhMYB43 序列分析 |
| 2.2.2 棉花DNA及 RNA的提取 |
| 2.2.3 RNA反转录及实时定量PCR分析(qRT-PCR) |
| 2.2.4 培养基的配置 |
| 2.2.5 GhMYB43 表达模式分析 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 GhMYB43的基因来源和结构分析 |
| 2.3.2 GhMYB43 的系统进化和序列分析 |
| 2.3.3 GhMYB43 启动子序列分析 |
| 2.3.4 GhMYB43 的组织表达模式分析 |
| 2.3.5 GhMYB43 诱导表达模式分析 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 第三章 GhMYB43 基因的功能初步鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试植物 |
| 3.1.2 供试菌株、质粒 |
| 3.1.3 实验试剂及相关设备 |
| 3.1.4 实验载体 |
| 3.1.5 培养基和抗生素 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 VIGS载体构建 |
| 3.2.2 黄萎病菌的活化和培养、接种、病情指数统计、恢复培养 |
| 3.2.3 棉花幼苗VIGS处理 |
| 3.2.4 超表达载体的构建 |
| 3.2.5 转基因棉花及转基因鉴定 |
| 3.2.6 木质素化学染色及含量测定 |
| 3.2.7 棉花原生质体分离及PEG转化 |
| 3.2.8 LUC报告基因表达及定量检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GhMYB43 亚细胞定位分析 |
| 3.3.2 GhMYB43 自激活分析 |
| 3.3.3 GhMYB43 VIGS干涉植株对黄萎病菌的抗性的表型鉴定 |
| 3.3.4 GhMYB43 VIGS干涉植株接种后菌含量观察 |
| 3.3.5 GhMYB43 稳定转化的转基因株系的获得与检测 |
| 3.3.6 超表达GhMYB43 削弱了棉花的抗病性 |
| 3.3.7 GhMYB43 抑制木质素合成 |
| 3.3.8 GhMYB43 负调控木质素生物合成路径 |
| 3.3.9 GhMYB43 负调控激素信号路径 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）GbWRKY1在棉花磷稳态和多抗反应中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物的磷饥饿反应及其信号转导 |
| 1.1.1 磷元素和磷饥饿响应概述 |
| 1.1.2 磷饥饿的局部反应 |
| 1.1.3 磷饥饿的系统性反应 |
| 1.1.4 SPX结构域是真核细胞中感知磷的受体 |
| 1.2 植物的先天免疫 |
| 1.3 磷饥饿反应和植物免疫反应间的互作研究进展 |
| 1.4 棉花抗黄萎病的机制 |
| 1.4.1 棉花黄萎病概述 |
| 1.4.2 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性 |
| 1.4.3 茉莉酸在棉花抗黄萎病中的作用 |
| 1.5 问题的由来与已有研究基础 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 盆栽实验 |
| 2.2.2 水培和砂培实验 |
| 2.2.3 无机磷和总磷含量的测定 |
| 2.2.4 总RNA的提取、反转录和荧光定量PCR |
| 2.2.5 黄萎病菌接种和病指统计方法 |
| 2.2.6 真菌生物量检测和恢复培养 |
| 2.2.7 棉花内源激素和黄酮化合物含量的测定 |
| 2.2.8 木质素和黄酮的组织化学染色 |
| 2.2.9 总酚、总黄酮以及木质素含量的测定 |
| 2.2.10 棉花叶片甲醇提取物的抑菌实验 |
| 2.2.11 转录组和代谢组测定流程和数据分析 |
| 2.2.12 丙二醛含量和相对电导率测定 |
| 2.2.13 酵母双杂交(Y2H)实验 |
| 2.2.14 双分子荧光互补实验 |
| 2.2.15 拟南芥JAZ1的CRISPR载体构建与靶点编辑检测 |
| 2.2.16 蛋白的原核表达 |
| 2.2.17 蛋白的烟草瞬时表达和Western检测 |
| 2.2.18 双荧光素酶报告基因(DLR)实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GbWRKY1 在棉花低磷胁迫中的功能分析 |
| 3.1.1 全生育期正常磷和低磷的盆栽实验 |
| 3.1.2 苗期不同磷水平下的砂培实验 |
| 3.1.3 苗期正常磷和低磷的水培实验 |
| 3.2 低磷胁迫对棉花黄萎病抗性的影响及其机制探讨 |
| 3.2.1 低磷下棉花对黄萎病菌的抗性显着增强 |
| 3.2.2 低磷胁迫下棉花叶片的转录组分析 |
| 3.2.3 低磷胁迫下棉花叶片的代谢组分析 |
| 3.2.4 低磷下木质素和黄酮含量显着增加 |
| 3.2.5 低磷下棉花积累抑菌次生代谢物 |
| 3.2.6 低磷下棉花的茉莉酸信号路径被激活 |
| 3.2.7 GbWRKY1 对低磷处理下抗病性增强的影响探讨 |
| 3.3 GbWRKY1 在盐和干旱胁迫中的功能鉴定 |
| 3.3.1 GbWRKY1 逆境处理的表达模式 |
| 3.3.2 GbWRKY1 超表达拟南芥对氯化钠和甘露醇的敏感性增加 |
| 3.3.3 GbWRKY1 超表达拟南芥对盐和干旱的耐受性降低 |
| 3.3.4 GbWRKY1 超表达降低了棉花对干旱的耐受性 |
| 3.3.5 GbWRKY1 超表达降低了拟南芥对ABA的敏感性 |
| 3.3.6 GbWRKY1 超表达拟南芥对ABA的敏感性降低依赖于JAZ1 |
| 3.3.7 JAZ1与ABA信号路径关键调控蛋白互作的酵母双杂筛选 |
| 3.3.8 JAZ1和互作蛋白的原核表达和烟草的瞬时表达 |
| 3.3.9 GbWRKY1 互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GbWRKY1 调控功能的多效性 |
| 4.2 低磷处理下棉花对抗黄萎病菌的抗性增强 |
| 4.3 JAZ蛋白介导激素信号间互作的研究 |
| 4.4 亚磷酸盐与植物抗病反应 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ:载体构建 |
| 附录 Ⅱ:异硫氰酸胍法提取棉花总RNA |
| 附录 Ⅲ:PDA及 Czapek’s培养基配方 |
| 附录 Ⅳ:PEG/Li Ac介导的酵母转化 |
| 附录 Ⅴ:棉花愈伤原生质体分离与转化 |
| 附录 Ⅵ:拟南芥JAZ1的CRISPR靶点编辑检测(部分) |
| 附录 Ⅶ:本论文中涉及到的引物序列 |
| 附录 Ⅷ:已发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（6）GhPUB17在棉花抗黄萎病中的功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 棉花生产与棉花黄萎病概述 |
| 1.2 植物先天免疫系统——PTI与 ETI |
| 1.2.1 PAMPs引起的宿主免疫反应 |
| 1.2.2 Effectors引起的宿主免疫反应 |
| 1.3 棉花与黄萎病菌互作 |
| 1.4 植病互作与泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.4.1 泛素-蛋白酶体系统 |
| 1.4.2 泛素化系统与植物抗病免疫 |
| 1.5 植物亲环素与植物抗病免疫 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和病原菌菌株 |
| 2.1.2 转化载体及菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉基因组中PUB基因家族的发掘 |
| 2.2.2 PCR扩增获得GhPUB17 基因序列 |
| 2.2.3 GhPUB17 基因稳定转化陆地棉品系“YZ1” |
| 2.2.3.0 载体构建 |
| 2.2.3.1 棉花转基因步骤 |
| 2.2.3.2 转基因棉株的鉴定 |
| 2.2.4 VIGS实验 |
| 2.2.4.1 载体构建 |
| 2.2.4.2 材料准备 |
| 2.2.4.3 VIGS操作 |
| 2.2.4.4 基因抑制效果的检测 |
| 2.2.5 实验材料接种 |
| 2.2.5.1 棉花材料的准备 |
| 2.2.5.2 黄萎病接种检测与灰霉接种检测 |
| 2.2.6 qRT-PCR检测棉花内源抗病相关基因变化 |
| 2.2.7 酵母双杂交实验 |
| 2.2.8 原核表达GhPUB17和GhCyP3 蛋白 |
| 2.2.9 GST-Pulldown实验 |
| 2.2.10 GFP-GhPUB17与GFP-GhCyP3 蛋白亚细胞定位 |
| 2.2.11 双分子黄色荧光互补实验BiFC |
| 2.2.12 分裂荧光素酶互补实验SLC |
| 2.2.13 GhPUB17的E3 泛素连接酶酶活鉴定 |
| 2.2.14 蛋白GhCyP3 抑制GhPUB17的E3 泛素连接酶活性试验 |
| 2.2.15 蛋白HIS-GhCyP3 抑菌试验 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 GhPUB17 基因的克隆及序列比较 |
| 3.2 GhPUB17受MeJA、SA及黄萎病菌诱导表达 |
| 3.3 瞬时抑制GhPUB17 表达增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.4 稳定抑制GhPUB17 表达和超量表达GhPUB17 转基因棉花株系的获得和检测 |
| 3.5 GhPUB17 负调控棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.6 GhPUB17 不参与棉花对灰霉病原菌的抗性调控 |
| 3.7 GhPUB17 介导的棉花抗黄萎病调控行为不依赖于JA和 SA信号路径 |
| 3.8 体外实验证明GhPUB17与GhCyP3 互作 |
| 3.9 体内实验证明GhPUB17与GhCyP3 互作 |
| 3.10 GhPUB17 蛋白具有E3 泛素连接酶活性 |
| 3.11 GhCyP3 可抑制GhPUB17的E3 泛素连接酶活性 |
| 3.12 GhCyP3 正调控棉花对黄萎病抗性 |
| 3.13 GhCyP3 具有抗菌肽活性 |
| 3.14 棉花PUB基因家族进化分析 |
| 3.14.1 棉花中PUB基因的预测与分类 |
| 3.14.2 PUB基因在棉花不同组织中的表达模式多样化 |
| 3.14.3 棉花中PUB基因受黄萎病菌诱导表达或抑制 |
| 3.14.4 PUB基因编码区及启动子区域变异位点的发掘 |
| 3.14.4.1 .PUB基因编码区区域的SNP位点 |
| 3.14.4.2 PUB基因编码区区域的InDel位点 |
| 3.14.4.3 PUB基因启动子区域的SNP位点 |
| 3.14.4.4 PUB基因启动子区域的InDel位点 |
| 3.14.5 陆地棉PUB基因与棉花栽培品种对黄萎病的抗性差异关联分析 |
| 3.14.5.1 124份棉花栽培种材料对棉花黄萎病的抗性调查 |
| 3.14.5.2 棉花PUB基因变异与栽培材料对黄萎病抗性关联分析 |
| 3.14.6 PUB17 基因参与棉花对黄萎病菌抗性调控 |
| 4 讨论 |
| 4.1 棉花中PUB17 基因的作用模式区别于其在茄科和十字花科植物中的作用模式 |
| 4.2 E3 泛素连接酶GhPUB17 具有特别的受调控模式 |
| 4.3 亲环素GhCyP3 与棉花抗黄萎病调控 |
| 4.4 棉花中PUB基因家族可能参与对黄萎病的免疫调控 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读期间已发表论文 |
| 致谢 |
（7）棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物与病原菌的相互作用 |
| 1.1.1 植物的先天免疫系统 |
| 1.1.2 水杨酸和茉莉酸介导的植物抗病反应机制 |
| 1.2 棉花与黄萎病菌的相互作用 |
| 1.2.1 黄萎病及黄萎病菌的致病机理 |
| 1.2.2 棉花抗黄萎病遗传机制 |
| 1.2.3 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性和生理生化抗性 |
| 1.2.4 Ve1在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.2.5 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.2.6 质外体免疫在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.3 植物与害虫的相互作用 |
| 1.4 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的研究进展 |
| 1.4.1 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的分类和结构 |
| 1.4.2 木瓜类半胱氨酸蛋白酶的功能 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 陆地棉PLCPs家族的全基因组鉴定 |
| 2.2.2 系统进化树、基因结构及定位、保守序列及蛋白特征分析 |
| 2.2.3 基因的表达模式分析 |
| 2.2.4 GhRD21-7基因的克隆 |
| 2.2.5 载体的构建 |
| 2.2.6 DNA提取和Southern杂交检测 |
| 2.2.7 RNA提取、反转录和实时定量PCR分析(qRT-PCR) |
| 2.2.8 黄萎病菌的接种检测 |
| 2.2.9 病情指数统计 |
| 2.2.10 病株剖杆和病原菌恢复培养 |
| 2.2.11 灰霉接种检测 |
| 2.2.12 斜纹夜蛾和棉铃虫的接虫实验 |
| 2.2.13 酵母双杂实验 |
| 2.2.14 转录组分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 陆地棉PLCPs家族的鉴定 |
| 3.2 陆地棉PLCPs家族的进化分析、保守基序和结构分析 |
| 3.3 陆地棉PLCP基因家族的表达量分析 |
| 3.3.1 陆地棉中PLCP基因家族的组织表达模式 |
| 3.3.2 陆地棉中PLCP基因家族的逆境表达变化分析 |
| 3.3.3 陆地棉中PLCP基因家族在接种黄萎病菌后的表达变化分析 |
| 3.3.4 陆地棉中PLCP同源基因对的表达变化分析 |
| 3.4 陆地棉GhRD21-7基因及其启动子的序列分析 |
| 3.5 陆地棉GhRD21-7基因的组织表达模式和激素、黄萎病菌处理表达模式 |
| 3.6 GhRD21-7稳定转基因株系的获得和检测 |
| 3.7 超量表达GhRD21-7增强了棉花对黄萎病菌抗性 |
| 3.8 GhRD21-7转基因材料对灰霉抗性不显着 |
| 3.9 GhRD21-7转基因材料对鳞翅目害虫抗性不显着 |
| 3.10 超量表达GhRD21-7的株系对黄萎病菌抗性增强不依赖于茉莉酸信号路径和水杨酸信号路径 |
| 3.11 GhRD21-7有自激活效应 |
| 3.12 超量表达GhRD21-7后的转录组分析 |
| 3.12.1 测序质控总览 |
| 3.12.2 样本的相关性分析 |
| 3.12.3 差异表达基因筛选 |
| 3.12.4 OE154_Mock vs WT_Mock中差异表达基因的分析 |
| 3.12.5 OE154_V991 vs WT_V991中差异表达基因的分析 |
| 3.12.6 OE154(V991 vs Mock)vs WT(V991 vs Mock)中差异表达基因的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 陆地棉PLCPs基因家族的鉴定和分析 |
| 4.2 陆地棉PLCPs基因家族响应逆境和黄萎病菌的表达分析 |
| 4.3 PLCPs在植物抗病中的作用 |
| 4.4 超量表达GhRD21-7株系抗黄萎病菌的分子机理 |
| 4.5 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:表达载体构建 |
| 附录2:质粒的提取 |
| 附录3:PCR产物纯化和酶切产物回收 |
| 附录4:热激转化和电击转化 |
| 附录5:植物基因组DNA提取 |
| 附录6:Southern blotting |
| 附录7:RNA提取 |
| 附录8:PDA、Czapek's配方 |
| 附表 |
| 博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物抗病机制 |
| 1.1.1 植物先天免疫系统 |
| 1.1.2 植物超敏反应和类病斑突变体参与的抗病反应 |
| 1.1.3 植物氨基酸代谢参与的抗病反应 |
| 1.1.4 植物激素水杨酸介导的抗病反应 |
| 1.2 棉花黄萎病及抗病机制解析 |
| 1.2.1 棉花黄萎病菌致病机制 |
| 1.2.2 棉花对黄萎病菌的组织结构抗性 |
| 1.2.3 棉花中R基因介导的抗性及机制解析 |
| 1.2.4 激素信号路径在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.2.5 次生代谢物质在棉花抗黄萎病菌中的作用 |
| 1.3 色氨酸合成和代谢路径在植物抗病中的作用 |
| 1.3.1 色氨酸合成路径研究进展 |
| 1.3.2 色氨酸代谢路径在抗病和抗虫反应中的作用 |
| 1.4 研究问题的由来与意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料,载体和菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GbTSA1 基因的分离和克隆 |
| 2.2.2 载体构建 |
| 2.2.3 棉花遗传转化 |
| 2.2.4 棉花核酸提取和Southern杂交 |
| 2.2.5 反转录以及RT-qPCR基因表达量分析 |
| 2.2.6 黄萎病菌的活化和培养、接种、病指统计、恢复培养 |
| 2.2.7 水杨酸,色氨酸,吲哚处理棉花 |
| 2.2.8 病毒诱导的基因沉默(VIGS) |
| 2.2.9 HPLC-MS法测量棉花内源激素,色氨酸,以及分支酸含量 |
| 2.2.10 GC-MS法测量吲哚含量 |
| 2.2.11 GbTSA1 基因亚细胞定位 |
| 2.2.12 酵母双杂交和双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.13 吲哚处理转录组分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 GbTSA1 基因的克隆及分子检测 |
| 3.1.1 棉花中Gb TSA1 基因的分离和克隆 |
| 3.1.2 GbTSA1 基因蛋白亚细胞定位,组织表达模式和诱导表达模式 |
| 3.2 GbTSA1 转基因材料的表型鉴定 |
| 3.2.1 GbTSA1 转基因株系的获得及表型鉴定 |
| 3.2.2 TRV:TSA1 抑制表达植株表型鉴定 |
| 3.3 GbTSA1 超表达转基因植株和抑制表达植株抗病性鉴定 |
| 3.4 GbTSA1-RNAi以及TRV:TSA1 植株类病斑形成依赖于SA合成和信号转导路径 |
| 3.4.1 共沉默Gb ICS1或GbNPR1 抑制TRV:TSA1 植株类病斑表型 |
| 3.4.2 共沉默GbICS1或Gb NPR1 抑制TRV:TSA1 植株抗病表型 |
| 3.4.3 外施SA可以显着增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.5 类病斑表型在色氨酸合成路径中具有基因特异性且不依赖于色氨酸 |
| 3.5.1 色氨酸合成路径基因在棉花中的克隆和挖掘 |
| 3.5.2 TRV:Trp-synthesis related genes抑制表达植株的表型鉴定 |
| 3.5.3 外施色氨酸不能抑制TRV:TRP1,TRV:TSA1,TRV:TSB1 植株类病斑表型 |
| 3.6 TRV:TSB1 抑制表达植株类病斑表型依赖于SA信号路径 |
| 3.7 外源施加吲哚可以增强植物抗病反应以及SA信号路径 |
| 3.7.1 TRV:TSA1和TRV:TSB1 抑制表达植株吲哚以及吲哚类衍生物含量测定.. |
| 3.7.2 外源施加吲哚增强棉花对黄萎病菌的抗性 |
| 3.7.3 吲哚处理转录组分析 |
| 3.7.4 吲哚激活SA合成相关转录因子GbSARD以及GbWRKY28 的表达 |
| 3.7.5 外源施加吲哚不能抑制黄萎病菌的生长 |
| 3.8 GbTRP1-RNAi和 TRV:TRP1 抑制表达植株增强棉花对黄萎病菌以及灰霉的抗性 |
| 3.9 TRV:TRP1 抑制表达植株中积累大量邻氨基苯甲酸类物质 |
| 3.10 TRV:Trp-synthesis related genes植株类病斑表型以及抗病表型形成机制总结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 VIGS技术在候选基因功能验证中的作用 |
| 4.2 色氨酸合成和代谢路径与SA信号路径之间的关系 |
| 4.3 植物类病斑突变体与SA信号路径之间的关系 |
| 4.4 邻氨基苯甲酸类物质具有抑菌作用 |
| 4.5 吲哚类代谢物质在棉花抗黄萎病中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 载体构建 |
| 附录2 DNA提取 |
| 附录3 Sourthern杂交(地高辛标记法) |
| 附录4 棉花RNA提取 |
| 附录5 培养基配方 |
| 附录6 酵母双杂交实验 |
| 附录7 原生质体分离和转化以及双荧光素酶报告基因检测 |
| 附表 |
| 攻读学位期间已发表的论文和待发表的论文 |
| 申请专利 |
| 致谢 |
（9）棉花GhWRKY41在抗黄萎病及盐胁迫中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1.文献综述 |
| 1.1 植物与病原菌互作及黄萎病研究 |
| 1.1.1 植物与病原菌的互作 |
| 1.1.2 棉花黄萎病研究概述 |
| 1.2 植物在盐胁迫中的研究 |
| 1.3 苯丙烷代谢及其调控 |
| 1.3.1 木质素代谢与抗病 |
| 1.3.2 木质素代谢与盐胁迫 |
| 1.4 转录因子在植物中研究 |
| 1.4.1 转录因子概述 |
| 1.4.2 WRKY转录因子结构 |
| 1.4.3 WRKY转录因子在植物中的作用 |
| 1.4.4 WRKY转录因子与木质素调控 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 GhWRKY41 基因的来源及克隆 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 试验菌株和载体 |
| 2.1.4 试验试剂及酶类 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 GhWYKY41 的序列分析 |
| 2.2.2 RT-PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 |
| 2.2.3 VIGS载体构建 |
| 2.2.4 GhWRKY41 的超量表达及干涉载体构建 |
| 2.2.5 棉花幼苗VIGS处理 |
| 2.2.6 黄萎病菌V991 的活化及培养 |
| 2.2.7 接菌处理及病指统计 |
| 2.2.8 木质素含量测定 |
| 2.2.9 木质素徒手切片 |
| 2.2.10 转基因棉花及转基因拷贝数鉴定 |
| 2.2.11 转基因拟南芥检测及转表达量鉴定 |
| 2.2.12 转基因拟南芥抗逆处理 |
| 2.2.13 丙二醛含量测定 |
| 2.2.14 脯氨酸含量测定 |
| 2.2.15 叶绿素含量测定 |
| 2.2.16 棉花原生质体分离与PEG转化 |
| 2.2.17 转基因植株拷贝数鉴定 |
| 2.2.18 LUC报告基因表达及定量检测 |
| 3.结果分析 |
| 3.1 GhWRKY41 的基因来源 |
| 3.2 GhWRKY41 的同源序列相似度和进化树分析 |
| 3.3 GhWRKY41 的表达模式分析 |
| 3.4 GhWRKY41 亚细胞定位 |
| 3.5 抑制GhWRKY41 表达后接菌表型鉴定和病指统计 |
| 3.6 抑制GhWRKY41 表达后茎秆木质素含量测定 |
| 3.7 茎秆木质素路径差异基因表达分析 |
| 3.8 棉花转基因系表达表达量分析 |
| 3.9 棉花GhWRKY41 转基因系接菌表型鉴定 |
| 3.10 棉花GhWRKY41 转基因系木质素测定 |
| 3.11 棉花 GhWRKY41 转基因系茎秆木质素组织化学染色 |
| 3.12 棉花GhWRKY41 转基因系木质素路径基因表达分析 |
| 3.13 拟南芥超表达系接菌表型鉴定和木质素含量测定 |
| 3.14 拟南芥超表达系接菌后木质素路径基因表达量分析 |
| 3.15 拟南芥GhWRKY41 超表达系氯化钠处理表型鉴定及指标测定 |
| 3.16 拟南芥超表达系Na Cl处理木质素基因表达分析 |
| 3.17 棉花GhWRKY41 转基因系Na Cl处理表型鉴定及指标测定 |
| 3.18 GhWRKY41 结合在GhLac1 启动子上 |
| 4 讨论 |
| 4.1 木质素代谢在抗病中的作用 |
| 4.2 GhWRKY41 参与的抗病路径 |
| 4.3 盐胁迫能促进木质素积累 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:主要引物序列 |
| 附录2:棉花DNA抽提方法 |
| 附录3 棉花RNA的提取及反转录 |
| 附录4:酵母单杂交实验 |
| 附录5:Southern杂交步骤 |
| 致谢 |
（10）大丽轮枝菌跨膜蛋白VdSho1调控穿透能力及黑色素合成的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 大丽轮枝菌致病机理研究进展 |
| 1.3 病原真菌细胞表面感受器研究进展 |
| 1.3.1 信号黏性蛋白及其信号传导通路 |
| 1.3.2 跨膜蛋白Sho1及信号传导通路 |
| 1.3.3 G蛋白偶联受体及其信号传导通路 |
| 1.4 病原真菌MAPK信号通路研究进展 |
| 1.5 病原真菌黑色素 |
| 1.5.1 DHN-黑色素生物合成及调节机制研究 |
| 1.5.2 DHN黑色素合成抑制剂 |
| 1.5.3 病原真菌黑色素的功能 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 大丽轮枝菌VdSho1调控纤维素膜穿透的功能分析 |
| 2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大丽轮枝菌的培养 |
| 2.2.2 基因敲除转化子构建 |
| 2.2.3 VdSho1基因回补转化子构建 |
| 2.2.4 纤维素膜穿透分析 |
| 2.2.5 纤维素膜穿透过程转录组分析 |
| 2.2.6 黑色素合成水平分析 |
| 2.2.7 黑色素合成抑制剂处理分析 |
| 2.2.8 透射电镜观察纤维素穿透进程 |
| 2.2.9 生长表型观察 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 VdSho1基因敲除及其功能回补菌株获得 |
| 2.3.2 VdSho1调控纤维素膜穿透功能鉴定 |
| 2.3.3 纤维素膜穿透过程VdSho1调控基因分析 |
| 2.3.4 VdSho1调控纤维素膜穿透过程黑色素合成基因分析 |
| 2.3.5 黑色素调节纤维素膜穿透过程分析 |
| 2.3.6 Mo Sho1与VdSho1 功能同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 VdSho1下游互作元件的发掘和功能分析 |
| 3.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 酵母双杂交 |
| 3.2.2 转录组测序分析互作蛋白Vst50功能 |
| 3.2.3 Vst50/ΔSho1 回补转化子构建 |
| 3.2.4 VdSho1/ΔVst50 回补转化子构建 |
| 3.2.5 纤维素膜穿透分析 |
| 3.2.6 黑色素合成水平分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 酵母双杂交分析VdSho1与下游元件互作情况 |
| 3.3.2 VdSho1与VdVst50 互作区域分析 |
| 3.3.3 转录组测序分析纤维素膜穿透过程VdVst50功能 |
| 3.3.4 大丽轮枝菌VdVst50和VdSho1 调节黑色素及穿透的遗传关系分析 |
| 3.3.5 酵母双杂交分析VdVst7、VdVst11、VdVst50 间的互作关系 |
| 3.3.6 VdVst7、VdVst11 调控纤维素膜及黑色素合成的功能分析 |
| 3.3.7 VdSho1 调控MAPK元件转录水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 VdSho1调控纤维素膜穿透功能结构域分析 |
| 4.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 VdSho1功能片段缺陷突变体构建 |
| 4.2.2 纤维素膜穿透分析 |
| 4.2.3 黑色素合成水平分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 VdSho1结构域缺失突变体转化子鉴定 |
| 4.3.2 VdSho1调控纤维素膜穿透功能结构域分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 VdSho1信号响应分析 |
| 5.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 纤维素膜穿透分析 |
| 5.2.2 黑色素合成水平分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 VdSho1响应甘油信号的功能分析 |
| 5.3.2 VdSho1响应细胞内部渗透压变化的功能分析 |
| 5.3.3 VdSho1跨膜结构域响应细胞膜透性变化功能分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 大丽轮枝菌跨膜蛋白VdSho1致病性功能分析 |
| 6.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 大丽轮枝菌接种棉花的致病表型鉴定 |
| 6.2.2 无菌棉侵染实验 |
| 6.2.3 扫描电镜观察实验 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 大丽轮枝菌侵染棉花过程VdSho1表达模式分析 |
| 6.3.2 VdSho1基因敲除及功能回补菌株侵染棉花致病性表型鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、棉花黄萎病菌单克隆抗体的制备（论文参考文献）
- [1]转录因子MYB4、WRKY41和TINY2调控棉花木质素代谢与免疫反应的功能解析[D]. 肖胜华. 华中农业大学, 2021
- [2]宿根矮化病菌侵染甘蔗的生理与分子机制研究[D]. 祝开. 广西大学, 2020
- [3]BIN2调控植物抗黄萎病的分子机理研究[D]. 宋云. 中国农业科学院, 2020
- [4]GhMYB43调控棉花抗黄萎病菌的机制解析[D]. 沈吉丽. 石河子大学, 2020(08)
- [5]GbWRKY1在棉花磷稳态和多抗反应中的作用机制研究[D]. 罗湘胤. 华中农业大学, 2019(01)
- [6]GhPUB17在棉花抗黄萎病中的功能鉴定[D]. 秦涛. 华中农业大学, 2019(01)
- [7]棉花PLCP基因的全基因组鉴定和GhRD21-7在抗黄萎病反应中的功能解析[D]. 张书芹. 华中农业大学, 2019(01)
- [8]色氨酸代谢与棉花抗黄萎病免疫调控[D]. 苗玉焕. 华中农业大学, 2019(01)
- [9]棉花GhWRKY41在抗黄萎病及盐胁迫中的功能研究[D]. 管倩倩. 华中农业大学, 2019(02)
- [10]大丽轮枝菌跨膜蛋白VdSho1调控穿透能力及黑色素合成的分子机制研究[D]. 李俊娇. 中国农业科学院, 2019(01)