一、检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立（论文文献综述）
刘淼[1]（2020）在《利用类器官研究肝胆胰导管上皮祖细胞特性》文中研究说明肝脏和胰腺是人体两大重要外分泌腺,分泌食物消化所必需的消化液,这些消化液由充当管道系统的导管网络收集,分配到胆囊进行储存或消化道对食物进行消化加工。在胚胎发育过程中,肝脏、胆管及胰腺谱系的细胞均来源于共同的内胚层祖细胞。近年研究表明,在人的胆周腺中存在多能干细胞群,具有多向分化潜能,能分化为肝实质细胞、胆管细胞以及胰腺内分泌细胞;另有研究发现,在胰管腺中也存在功能类似的祖细胞。成体组织中的干/祖细胞制备的类器官是一种三维上皮结构培养物,已有研究证明,肝脏类器官具有向功能肝细胞分化的能力;小鼠胰腺类器官在移植到体内后可以分化为肝细胞和胰腺内分泌细胞。结合以上研究结果,我们推测肝胆胰导管上皮祖细胞具有相似的功能,都能向肝脏细胞、胆管细胞及胰腺内分泌细胞分化。因此本研究利用3D培养技术,分别建立小鼠的肝内胆管类器官（mouse hepatic duct organoid,mHDO）、胆总管类器官（mouse bile tree organoid,mBTO）和胰腺主导管类器官（mouse pancreatic duct organoid,mPDO）培养物,通过检测细胞分化能力、细胞谱系追踪和高通量转录组测序等方法验证肝胆胰上皮祖细胞的基因表达及功能的相似性;并成功建立了人胆管上皮类器官（human bile tree organoid,hBTO）,在体外利用3D培养,发现其可以向肝细胞,胆管细胞及胰腺β细胞分化,证明了 hBTO向肝胆胰多谱系方向的分化潜能,为疾病治疗及药物筛选开辟了新途径,为器官损伤后的再生与与修复,特别是肝脏/胰岛移植发掘更广泛的细胞资源。本研究的主要研究方法及结果:1.利用机械法在解剖镜下直接分离获得肝内胆管（肝管）、胆总管及胰腺主导管（胰管）,通过胶原酶消化法获得肝胆胰导管上皮细胞,利用Matrigel作为基质,成功建立小鼠肝胆胰导管上皮祖细胞类器官细胞系mPDO、mBTO和mHDO,三种类器官具有连续的自我更新能力,经历冻存复苏后仍可连续传代至6个月以上。利用反转录PCR及免疫染色初步证明,三种类器官具有向多谱系分化的潜能。2.分别制备三组肝胆胰导管类器官mPDO、mBTO和mHDO,利用转录组测序分析,比较三种类器官与组织中肝胆胰导管上皮细胞,及三种类器官之间的基因表达差异变化,结果证明与不同组织来源的导管细胞相比,培养后的三种类器官基因表达的差异变化及程度都显着降低,具有相似的基因表达水平。3.利用Matrigel基质胶,结合特定的细胞培养条件,成功建立mPDO、mBTO和mHDO向肝实质样细胞（ALB表达细胞）、胆管细胞、胰腺β样细胞（Insulin分泌细胞）分化方法,利用体内移植及体外分化方法,证明三种类器官分化功能具有相似性。4.利用细胞遗传谱系追踪方法,通过对转基因小鼠组织的连续切片观察,以及利用转基因小鼠制备mPDO、mBTO和mHDO,证明了肝胆胰导管上皮祖细胞均来源于PDX1表达细胞,尽管制备的三种类器官都广泛表达Lgr5,正常小鼠体内肝胆胰上皮细胞在胚胎发育、新生阶段及发育成熟后均无Lgr5的表达。5.在证明了肝胆胰上皮祖细胞相似性的基础上,我们选取了最易获得的人胆管上皮组织建立人胆管类器官hBTO,并且建立了 hBTO向肝实质样细胞（ALB表达细胞）、胆管细胞、胰腺β样细胞（Insulin分泌细胞）分化方法,为研究器官损伤后的再生与修复奠定基础。结论:小鼠肝胆胰导管上皮细胞制备的类器官mPDO、mBTO和mHDO具有较高的相似性,包括具有相似的基因表达模式;具有向肝胆胰多谱系方向分化的潜能;具有相似的细胞谱系特征。进一步的,建立了人胆管类器官hBTO向肝胆胰分化的方法,为建立药物筛选模型、研究组织再生与修复以及器官移植开辟了新的途径。
李欣忆[2]（2019）在《单链退火（SSA）介导的动物基因组精确编辑系统的构建、优化及应用》文中进行了进一步梳理随着测序技术的不断发展,由碱基序列组成的生命画卷逐渐呈现在世人面前。基于日渐完善的基因组序列信息,特定基因的功能研究、遗传疾病的碱基突变检测及畜禽优良性状的基因定位和改良等系列研究也逐步推进。以上研究主要通过基因组编辑技术对靶基因序列实现定点插入、序列删除或碱基突变实现。基因组编辑技术依赖人工特异性核酸酶在基因组上制造双链断裂及由此引发的DNA修复途径实现基因编辑。现阶段两种主要的DNA修复途径导致的编辑结果分为:通过非同源末端链接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）修复途径产生碱基插入或缺失造成基因敲除,和通过带有断口两端同源序列的供体DNA参与的同源介导的修复（Homology-directed repair,HDR）途径实现特定碱基序列的插入、删除或替换。在疾病治疗和畜禽性状改良的实际应用中,要求在对基因组序列进行改造的过程中保证基因组编辑的精确性,即除了目的碱基的删除、插入或替换外,不引入任何额外的碱基序列,这一技术被称为基因组精确编辑。目前存在的基因组精确编辑技术根据基因组编辑次数划分,可以分为一步法和两步法。一步法使用核酸酶在基因组上造成双链断裂之后,以环状质粒、双链DNA或者单链DNA为模板,通过HDR直接向基因组中引入点突变、碱基缺失或序列插入。两步法在第一步通过HDR引入点突变、碱基缺失或序列插入的同时,引入用于阳性筛选的整合序列;第二步通过Cre-Loxp、piggyBac或二次HDR的方式,将第一步引入的筛选序列删除,最终得到基因组精确编辑结果。一步法的修复结果只能通过测序对编辑之后的细胞单克隆进行逐个检测,耗时耗力且效率低,因此一般通过药物或者荧光筛选系统,帮助得到核酸酶转染阳性或者核酸酶打靶阳性的克隆,此方法一般用于胚胎干细胞、诱导多能干细胞或者原核注射等试验。而在现存的两步法技术中,Cre-Loxp系统敲出筛选序列之后会在基因组上残留一个Loxp序列,可能导致基因沉默、染色体结构改变等隐患;piggyBac转座子在实现序列高效删除的同时,可能会引起基因组其他TTAA位点处筛选序列随机插入;二次HDR的方法则面临因整合至基因组的筛选基因沉默而导致的假阳性结果。本研究提供了一种新的两步法基因组精确编辑技术——基于单链退火（Single strand annealing,SSA）修复机制的基因组精确编辑技术。该策略的供体DNA包含正、负药物及荧光筛选基因的筛选表达盒序列,和序列两侧同向同源的SSA同源臂序列。该技术第一步依赖CRISPR/Cas9产生双链断裂,经由带有点突变的同源臂介导的HDR,向基因组中带入精确编辑序列的同时,插入筛选表达盒及SSA同源臂序列;第二步靶向筛选表达盒外侧、SSA同源臂内侧的靶位点,造成两个双链断裂,在删除筛选序列同时引发SSA修复机制,完成基因组精确编辑。基于以上理论设计,本研究主要结果如下:1.构建了单链退火（SSA）介导的基因组编辑技术,并利用该系统在293T细胞的CCR5位点、APP位点和α-syn位点分别获得45.83%,68%和50%的精确编辑效率。2.针对基因组编辑系统的第一步HDR供体载体形式和第二步SSA同源臂长度两个方面,对试验一获得系统的效率进行优化,发现双切质粒供体具有更高的整合效率,且基因组上的SSA效率与同源臂长度呈正相关。3.基于试验二优化结果对供体载体进行改良,并利用改良载体在PK15细胞的IGF2位点和RELA位点进行应用,分别获得30%和53.33%的精确编辑效率。4.由于在基于单链退火的基因组精确编辑技术的开发中（试验一、二、三）,没有观察到双等位编辑的结果;但在遗传疾病治疗、基因功能研究及畜禽品种改良中,双等位基因编辑具有重要应用价值。故基于试验一、二、三中使用的正负筛选表达盒序列设计原则,进一步开发出了用于双等位基因编辑的TK-PuroR-eGFP/TK-ZeoR-mRFP双等位基因敲入系统,且在293T细胞的APP位点和PSEN1位点分别得到52.94%和54.90%的双等位编辑效率。在TK-PuroR-eGFP/Tk-ZeoR-mRFP双等位编辑系统基础之上优化筛选表达盒长度,构建了PuroR-eGFP-TK/ZeoR-mRFP-TK和PuroR-TK/ZeoR-TK两套效率更高的双等位敲入系统,在APP位点得到了更为高效的双等位基因编辑效率,敲入效率分别为82%和70%。本研究开发了一套简洁高效,具有普遍适应性的单链退火（SSA）介导的基因组精确编辑系统,为基因功能研究、遗传疾病治疗和家畜生产性状改良提供了新的方案。基于此开发的三套高效的双等位编辑系统为双等位基因操作提供了新的思路,并为后续双等位基因精确编辑奠定了基础。
于淼[3]（2019）在《CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型》文中提出基因编辑是指借助细胞自身的基因组损伤修复机制对目标基因的核苷酸序列进行碱基删除、插入、定点突变和组合编辑等基因操作技术。近年出现的CRISPR/Cas9定点基因编辑技术极大提高了基因编辑效率、推进了基因功能的研究,并在构建人类疾病模型、推动基因治疗、加快农作物和动物的遗传改良等领域有着巨大的应用潜力。在传统的呼吸道干细胞功能研究中,需要使用基因型相同的细胞群作为研究对象。如何运用CRISPR技术对呼吸道干细胞群进行基因编辑,并高效的筛选阳性编辑的细胞成为了一个急需攻克的难题。本研究首次将荧光报告基因的优势与CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术的特点相结合,建立了有效的基因编辑细胞富集平台,突破了 CRISPR技术在干细胞研究领域的应用瓶颈。首先,采用经体外酶切筛选出高效靶向Loxp位点的sgRNA（LoxP-sgRNA）转染表达Cas9的ROSA26-LoxP-tdTomato-stop-LoxP-EGFP（ROSA-TG）报告基因小鼠气道上皮细胞,结果发现CRISPR/Cas9高效介导LoxP位点中间的tdTomato基因剪切,红色荧光细胞向绿色和无色荧光的转变率达到72.7%。扩增并亚克隆转染细胞基因组内2个Loxp中间的序列,测序分析证实绝大部分克隆发生了双酶切（96.6%）。其次,使用该LoxP-sgRNA同2条靶向小鼠FoxJl基因2号外显子的sgRNA共转染上述ROSA-TG细胞,用流式细胞术筛选绿色荧光转换细胞作为FoxJl基因敲除富集细胞。对亚克隆绿色细胞FoxJl基因两个识别位点内的序列分析来评估该平台的富集效果,发现所有来自绿色荧光细胞的克隆子在FoxJl基因内100%发生了靶向双位点酶切（26/26）,而红色细胞内只有25%发生了双酶切（7/28）。基因表达分析进一步证实绿色荧光细胞内未检测到FoxJl的mRNA转录。上皮细胞分化试验结果显示,绿色荧光细胞分化的气道上皮中纤毛细胞占4.32%,而红色细胞中的纤毛细胞占38.5%。对囊性纤维化跨膜转运调节体（CFTR）介导的上皮细胞电生理功能分析进一步表明,无Loxp剪切的红色荧光细胞来源上皮中CFTR介导的诱导微电流和抑制微电流分别为33.6μA/cm3和64.5μA/cm3,分别是绿色荧光细胞诱导微电流7.21μA/cm3和抑制微电流13.4μA/cm3的4.66倍和4.81倍。说明FoxJl基因的敲除对细胞分化后的CFTR氯离子通道产生了明显的抑制作用。同时,为扩展该基因编辑细胞富集平台的应用,本研究额外筛选了靶向敲除EGFP和tdTomato基因的sgRNA,可用红、绿色荧光的淬灭作为替代筛选标签。与小鼠呼吸道比较,雪貂的呼吸道无论在生理学还是细胞组成与生物学方面都更接近于人类。表达平滑肌肌动蛋白（αSMA）的气道肌上皮细胞最近被确定为气道上皮内的重要干细胞亚群,在气道上皮的损伤修复和维护气道稳态方面发挥主要作用。为深入研究肌上皮干细胞的发育来源和慢性呼吸道疾病的病理发生,本项目在前期建立CRISPR/Cas9基因编辑细胞富集平台工作的基础上,进一步构建了雪貂ROSA-TG和αSMA-CreERT2品系报告基因模型。在技术上,为探索一种利用CRISPR技术快速、高效构建雪貂模型的新方法,本研究在构建这些转基因雪貂模型时分别尝试利用细胞内的两种不同的DNA损伤修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）来介导敲入。在雪貂ROSA-TG品系构建过程中,首先在雪貂基因组中设计了 3条靶向ROSA基因的sgRNA,并用体外酶切法筛选出最优的1条用于试验。将克隆构建好的供体质粒消化为单链DNA后与sgRNA共同显微注射到179枚雪貂受精卵中。将151枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,产生了 23只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern blot验证,获得了 4只健康的ROSA位点敲入荧光报告系统TG的转基因杂合体雪貂。使用表达Cre重组酶的腺病毒感染转基因雪貂的纤维细胞的试验和Southern印迹法均证实了敲入的Cre/LoxP荧光报告系统的有效性和准确性。同样,在αSMA-CreERT2品系雪貂构建中,使用设计并筛选出的最佳的1条靶向雪貂基因组ACTA2基因的sgRNA,与构建好的单链DNA供体质粒共同显微注射到155枚雪貂受精卵内。将得到的110枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,共产生16只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern印迹法验证,共获得4只健康的具有转基因靶向敲入的杂合体雪貂。通过对αSMA-CreERT2转基因雪貂纤维细胞的Cre报告基因慢病毒感染、TGFβ激活αSMA的表达和他莫昔芬协助Cre入核转运试验,证实了基因组整合的各个功能元件均具有完全功能。综上所述,本论文充分利用了 CRISPR/Cas9技术的无种属限制、特异性强和高效快捷的优势,将试验内容从小鼠原代细胞基因敲除株的建立逐步深入到转基因雪貂模型的构建,研究对象从体外小鼠气道上皮基底干细胞逐步扩展到体内雪貂受精卵和组织特异性的肌上皮干细胞,研究方式从荧光基因敲除延伸到分别利用NHEJ和HDR通路进行报告基因敲入。为CRISPR技术以及转基因雪貂模型在干细胞研究领域的广泛应用打下基础。本项目建立的雪貂模型可用于针对肌上皮干细胞的谱系追踪研究,以揭示呼吸道干细胞功能、修复再生以及细胞异常增生的发生机制。本研究内容将为利用CRISPR/Cas9技术制备基因修饰原代细胞模型,以及利用雪貂模型研究呼吸道干细胞生物学提供技术方法和有效可靠的模型。
刘飞,孟军,范立强[4]（2019）在《Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶在转基因小鼠睾丸组织中特异性表达》文中进行了进一步梳理为了验证杂合启动子Kap147/Kpn的体内、外功能,构建了Kap147/Kpn引导的Cre重组酶转基因鼠。体外细胞转染和激素诱导证实Kap147/Kpn启动子具有细胞特异性,且受雄激素诱导。通过RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）和荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）证实Kap147/Kpn启动子引导Cre重组酶在转基因鼠（Cre-F0-2）睾丸组织中特异表达。荧光定量PCR检测发现,Cre mRNA在转基因鼠睾丸中的表达量与小鼠年龄相关,经15 mg/（kg·d）二氢睾酮（DHT）处理后睾丸中Cre mRNA表达量增加1.7倍,经100 mg/（kg·d）醋酸环丙孕酮（CAP）处理后Cre mRNA表达量降低约50%,证实Kap147/Kpn启动子在转基因鼠体内受雄激素调控。荧光组化显示,转基因鼠Cre-F0-2与双荧光Cre重组酶报告鼠杂交后,能成功介导子代鼠睾丸组织特异性的基因敲除。杂合启动子Kap147/Kpn引导的Cre重组酶转基因鼠（Cre-F0-2）具有雄激素调节性和睾丸靶向性,是一个潜在的研究睾丸基因功能的有力工具。
吴倜珺[5]（2018）在《Ets-1降低胰岛素基因表达并引起胰岛β细胞功能缺陷的表观遗传机制研究》文中认为胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发生发展的核心环节。本实验室前期发现,转录因子Ets-1在β细胞功能缺陷中起到重要作用,表现为:糖尿病模型鼠和β细胞特异性Ets-1转基因小鼠随着Ets-1表达的升高,出现胰岛素分泌功能障碍、空腹血糖升高以及糖耐量受损;体内外过表达Ets-1均造成β细胞功能缺陷,在原代胰岛和β细胞系中干扰Ets-1可避免长期高糖造成的β细胞功能障碍。然而,降低Ets-1表达通过何种具体机制保护β细胞并避免2型糖尿病的发生或延缓其发展,目前并不十分清楚。针对上述问题,我们成功制备了 β细胞特异性Ets-1基因敲除小鼠（βEts-1KO）;通过特异性敲除β细胞Ets-1基因,我们发现正常饮食的βEts-1KO小鼠空腹血糖降低、血胰岛素增高、对血糖的调节能力提升,而胰岛素敏感性无明显变化。同时,βEts-1KO小鼠胰岛面积虽未见明显差异,但其胰岛中胰岛素含量显着增高,提示敲除Ets-1基因增加β细胞胰岛素合成。通过高脂喂养建立2型糖尿病模型,我们发现敲除β细胞Ets-1基因可改善糖耐量受损,高血糖钳夹实验进一步发现,敲除Ets-1使β细胞1、2相胰岛素分泌量回升,说明βEts-1KO小鼠可能通过增加胰岛素分泌改善糖耐量受损。此外,高脂喂养小鼠β细胞、长期高糖/高脂处理的β细胞系Ets-1表达明显增加,提示Ets-1高表达可能是造成β细胞胰岛素表达减少的原因。分子水平研究发现,过表达Ets-1显着降低β细胞胰岛素mRNA和蛋白表达水平。此外,人和小鼠β细胞中,Ets-1均可与胰岛素启动子结合,且长期高糖/高脂促进二者结合。我们还发现,长期高糖/高脂通过Ets-1造成胰岛素启动子组蛋白乙酰化程度降低,进一步发现,Ets-1通过ETS结构域与组蛋白去乙酰化酶HDAC-1、2结合,增加胰岛素启动子的组蛋白去乙酰化修饰,降低组蛋白乙酰化程度,进而下调胰岛素转录,并且长期高糖/高脂可促使Ets-1和HDAC-1、2与胰岛素启动子结合增加。此外,Ets-1虽然不能与组蛋白乙酰转移酶p300结合,但干扰Ets-1可部分逆转长期高糖处理引起的p300与胰岛素启动子结合减少,提示Ets-1间接造成了 p300与胰岛素启动子结合程度的改变。因此,我们认为Ets-1通过影响胰岛素启动子组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰,以表观遗传机制下调β细胞胰岛素基因表达,进而造成β细胞功能缺陷,而降低β细胞Ets-1表达可改善胰岛素分泌不足,从而缓解2型糖尿病。本研究进一步阐明了 Ets-1造成β细胞功能障碍的新机制,不仅能在理论上丰富2型糖尿病的发病机制,而且可能为临床上采用新的方式治疗2型糖尿病提供实验证据。
丁锦君[6]（2018）在《食品源性双酚A发育期暴露对突触传递和大脑环路损伤及可能机理研究》文中指出塑料包装材料广泛应用于现代食品包装,在生产塑料的过程中,会添加稳定剂、抗氧化剂等辅助合成材料,其中使用最为广泛的是双酚A（Bisphenol A,BPA）。塑料产品在长期使用或者高温情况下,双酚A会从食品包装材料中迁移到食品或者饮料中,影响食品安全和人类健康。双酚A是一种公认的内分泌干扰剂（Endocine Disrupting Chemicals,EDCs）,通过影响机体的内分泌系统从而干扰正常机体的生理活动。本文主要研究双酚A暴露后对神经系统的影响及可能机理。目的:1.探究发育期双酚A暴露是否影响突触传递,并从细胞层面上研究其造成这一影响的可能机制。2.研究发育期双酚A暴露是否影响动物行为,主要从空间学习记忆上进行研究,并探究造成这一现象的可能机制。3.利用病毒示踪技术和免疫组化技术,研究发育期双酚A暴露对空间学习记忆环路的影响,并探究受双酚A影响的具体神经元类型,为阐述双酚A的神经毒性提供神经环路证据。方法:1.以离体培养的海马锥体神经元为模型,研究双酚A对突触传递的影响。全细胞膜片钳技术记录微小的兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC）和微小的抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC）,探究双酚A是否影响突触传递;免疫细胞化学方法探究离体培养的海马锥体神经元双酚A的暴露后兴奋性突触传递和抑制性突触传递的关键性蛋白marker的含量变化。2.构建GAD65的雌激素反应元件（GAD65 estrogen receptor element,GAD65-ERE）的双荧光素酶报告基因系统,探究双酚A是否通过雌激素受体经典通路影响突触传递。3.以SD大鼠为模型,双酚A暴露后,Golgi-cox染色技术观察海马CA1区和DG区的树突棘形态和数目;Morris水迷宫实验检测SD大鼠空间学习记忆能力是否变化;Western-blot检测海马CA1区和DG区关键蛋白表达。4.以Thy1-Cre转基因鼠为模型,双酚A暴露后,利用逆向单级病毒示踪的技术,探究海马CA1区或DG区的上游脑区投射到该区的神经投射有没有发生变化;利用免疫组织化学的方法,进一步探究是上游何种神经元类型投射发生影响。结果:1.双酚A暴露后,离体培养海马锥体神经元的mIPSC的幅度有了明显的提高,并且突触后膜上Surface GABAA受体含量有了明显的增加。2.双酚A和雌激素暴露后均能激活GAD65-ERE区域的表达,但是当双酚A和雌激素同时存在时,这一激活作用却受到了抑制。3.双酚A发育期暴露后,SD大鼠的空间学习记忆能力有明显的下降趋势,并伴随有海马CA1区和DG区树突棘密度,特别是成熟的蘑菇状树突棘密度的降低。4.双酚A发育期暴露后,SD大鼠海马CA1区和DG区的Arc蛋白表达发生了明显的减少。5.双酚A发育期暴露后,Thy1-Cre转基因鼠的逆向单级病毒示踪数据发现,海马内部CA3到CA1的投射明显减少,而海马外部投射内嗅皮层（Entorhinal cortex,EC）到CA1区的投射也发生了明显的减少。免疫组织化学实验结果表明,内嗅皮层到CA1区投射的减少主要表现在内嗅皮层兴奋性神经元到CA1区投射性神经元上。结论:1.双酚A暴露能影响突触传递功能,且这一影响是雌激素受体ERα/β经典通路依赖的。2.双酚A发育期暴露能够减少SD大鼠海马区树突棘密度,从而降低其空间学习记忆能力。3.双酚A发育期暴露会减弱CA3-CA1以及EC-CA1的直接神经投射,且它们投射的减少都表现在了 EC和CA3的兴奋性神经元到CA1区的投射性神经元上。
杨翌[7]（2014）在《应用类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）定点修饰猪基因组》文中研究表明20世纪80年代基因打靶技术的兴起极大地推动了发育生物学的研究和生物医药的开发，基因研究从最初的测序和图谱绘制逐渐发展为基因功能研究与基因致病机制解析，使现代生物学及医学研究取得了突破性进展。长期以来基因打靶技术主要在小鼠上完成，这是因为小鼠的胚胎干细胞能在体外培养并无限增殖，同时保持生殖系嵌合能力。但是利用小鼠制备的人类疾病模型往往不能真实反映人类疾病的发生和发展，甚至在诸多疾病中其症状与人类截然不同，人们一直在寻找与人的解剖和生理更为接近的大动物作为人类疾病的动物模型。在大动物中,猪在生理结构、生化特征以及营养代谢等方面与人更为接近，被认为是目前比较理想的大动物基因修饰模型。自2000年PPL公司成功利用体细胞核移植技术制备克隆猪以来，基因修饰猪在异种器官移植研究、人类疾病模型以及农业品种改良中取得了一系列突破性成果。但是由于猪胚胎干细胞的缺乏，目前只能对体细胞进行基因打靶修饰结合核移植技术来制备基因修饰猪。而体细胞在体外培养增殖速度慢而且增殖能力有限，常规同源重组进行基因打靶的效率极低。目前，只有少量文章报道了基因修饰猪的研究。因此，基因打靶技术的研发和改进是加快基因修饰猪研究发展的关键。近年来ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9技术的出现，极大的推动了基因靶向修饰技术的广泛应用，也为基因修饰猪的研究提供了更高效的工具。但在实际研究中发现，ZFN制备复杂、打靶效率低、成本高昂限制了其在基因修饰猪研究中的应用。CRISPR/Cas9虽然打靶效率高，却存在脱靶效应，不利于通过体细胞核移植制备基因修饰猪。而TALEN成本低、制备简单、打靶效率高且低脱靶效应，是目前比较理想的基因组靶向修饰工具。TALEN是由TALE蛋白DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而成的人工核酸酶，通过单元组装法可以快速的构建针对任何靶序列的TALEN，并高效地实现对基因组特定位点的识别和切割，诱导靶序列产生双链断裂，细胞通过同源重组修复或非同源重组的末端连接实现基因靶向敲除、敲入、以及定点突变等，从而大幅度地提高基因靶向修饰的效率。目前TALEN技术已经广泛应用于真核细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、猪、牛等多种模式生物中，为使TALEN技术成功应用于基因修饰猪的研发，开展以下实验研究。根据哺乳动物密码子偏好性构建哺乳动物细胞TALEN表达载体，结合已报道的Golden Gate构建体系建立适用于哺乳动物细胞的TALEN构建体系。利用DNA单链复性技术构建基于EGFP荧光蛋白的TALEN体外活性检测SSA体系，可简单、快速的对已构建TALEN的活性进行验证。利用T7内切酶可识别并切割异源二聚体DNA的特性建立了细胞内活性验证体系。为验证TALEN构建体系，选择猪pROSA26的一个靶位点设计并构建6条TALEN质粒，两两组合对TALEN在体外和细胞内的活性进行了验证。在此基础上，利用建立的TALEN体系对中国小型猪基因组进行高效且精确的定点修饰，包括基因靶向敲除、靶向敲入以及定点突变。在基因靶向敲除实验中，针对猪DMD基因第7号外显子和猪WRN基因第3号外显子分别设计了位点特异性TALENs，转染猪胎儿成纤维细胞后经过G418筛选，成功获得猪DMD基因和WRN基因的敲除细胞株，为建立杜氏肌萎缩症和早衰症基因修饰猪模型奠定了基础；在基因靶向敲入实验中，针对猪ISL1基因设计了位点特异性TALENs，构建了基因打靶载体pFlexibleDT-ISL1-CreTd，共转染猪胎儿成纤维细胞后经过嘌呤霉素筛选，成功获得猪ISL1基因定点敲入细胞株，效率高达24%；在基因定点突变实验中，由于人胰岛素与猪胰岛素只有一个氨基酸的差别，针对猪胰岛素基因第二外显子设计了位点特异性TALENs，合成了一条具有同源性的89bp单链DNA，共转染猪胎儿成纤维细胞后经过G418筛选，成功获得将猪胰岛素B链的丙氨酸替换成苏氨酸的细胞株，并通过核移植的方式得到人源化胰岛素猪模型。本实验首次采用TALEN技术对猪基因组内源性基因进行定点修饰，成功且高效率地实现了基因敲除、基因敲入以及定点突变等精确修饰，为大动物实现高效的基因靶向修饰提供了有力工具，也为建立各种具有重要经济价值、农业育种和医学模型的基因定点修饰猪奠定了基础。
林晓琳[8]（2014）在《利用miR-155转基因小鼠解析miR-155在肝癌发生和糖脂代谢中的功能及机制》文中研究表明第一章 建立过表达miR-155的转基因小鼠目的:运用Cre/lox P系统建立条件性过表达miR-155的转基因小鼠。方法:以pEμ-mmu-miR155质粒（含318bp的小鼠miR-155前体序列）为模板,PCR扩增318bp的miR-155的前体片段,然后定向克隆入pCAG-RLG质粒的MluⅠ和Sac Ⅰ位点间,以构建转基因载体pRm155LG,所构建的载体经酶切和测序鉴定。使用C57BL/6小鼠单细胞受精卵,采用DNA原核显微注射法制备Rm155LG转基因小鼠,借助红色荧光可视化筛选和鉴定Rm155LG转基因小鼠,并通过鼠尾提取DNA进行PCR验证。将Rm155LG转基因小鼠与不同的Cre转基因小鼠（EⅡa-Cre、Ub-Cre-ERT2和Alb-Cre）进行交配,观察Cre重组酶介导DNA重组激活下游转基因miR-155和Luc等表达。利用活体荧光成像可快速有效鉴别区分纯合子转基因小鼠。通过Rm155LG转基因小鼠与EⅡa-Cre转基因小鼠进行交配,经过多轮杂交,建立广泛过表达miR-155的转基因小鼠（命名为RL-m155转基因小鼠）。结果:1)采用DNA原核显微注射法成功获得3只Rm155LG转基因首建鼠,且外源转基因能向后代稳定遗传,且mRFP能够稳定表达;2)Rm155LG转基因小鼠的主要脏器均可见红色荧光,但不同脏器间荧光强度有差异,其中心、肾、胃、肠和睾丸mRFP表达水平较高,肝、脾、肺和胸腺mRFP表达水平较低;3)Rm155LG转基因小鼠与不同的Cre转基因小鼠（即Alb-Cre转基因小鼠、EⅡa-Cre转基因小鼠或Ub-Cre-ERT2转基因小鼠）交配所获后代中,Luc转基因的表达在Rm155LG/Alb-Cre双转基因小鼠的肝脏被特异激活,或Luc转基因的表达在Rm155LG/EⅡa-Cre双转基因小鼠和Rm155LG/Ub-Cre-ERT2双转基因小鼠上被广泛激活。可见,运用Cre/lox P系统在Rm155LG/Cre双转基因小鼠实现了 Luc转基因的肝脏特异激活或广泛的激活;4)本研究所提供的数据充分证实,活体荧光成像法是一种简单、快速、可视、准确的用来鉴别纯合的转基因小鼠的筛选工具,该方法是传统方法（即小鼠交配法和实时定量PCR法）的一种替代方式和补充。我们利用该方法简单、迅速而准确地鉴别出几种转基因小鼠（如RLG转基因小鼠、RCLG转基因小鼠、Rm17LG转基因小鼠、Rm21LG转基因小鼠和Rm155LG转基因小鼠）的纯合子,该方法的可靠性、可重复性和实用性在本研究中得到充分证实;5)利用小鼠杂交法成功获得RL-m155转基因小鼠及L-m155转基因小鼠,且外源转基因能向后代稳定遗传,同时mRFP和/或Luc能够稳定表达;6)RL-m155转基因小鼠的主要脏器（如心脏、肺、脑、肾脏、肝脏、脾脏、胸腺、胃、小肠、睾丸、胰腺等）均可见红色荧光,但不同脏器间荧光强度有差异,其中脑、心、胃、胰腺、肌肉mRFP表达水平较高,脾、白色脂肪、棕色脂肪mRFP表达水平较低。小动物活体成像仪检测Luc表达发现,除小肠、胸腺、棕色脂肪和肌肉的Luc信号较弱,其它脏器均能检测到较强的Luc信号。7)qRT-PCR结果显示,miR-155在RL-m155转基因小鼠的脑、睾丸、心脏、肝、白色脂肪、棕色脂肪和胰腺的表达均显着高于野生型小鼠。RL-m155转基因小鼠体重与野生型小鼠的比较无明显差异;RL-m155转基因小鼠棕色脂肪重量显低于野生型小鼠的,而其它脏器的质量在两者间无显着差异。结论:1)运用Cre/lox P系统建立条件性过表达miR-155的转基因小鼠（命名为Rm155LG转基因小鼠）;2)首次创建了利用动物活体荧光成像法鉴别纯合子转基因小鼠的方法,该方法是一种简单、快速、可视、准确的用来鉴别纯合的转基因小鼠的筛选工具;3)利用小鼠杂交法成功创建广泛过表达miR-155的转基因小鼠,RL-m155转基因小鼠和L-m1 55转基因小鼠。第二章利用肝脏特异过表达miR-155的转基因小鼠解析miR-155在肝癌发生和肝脂代谢中的功能目的:探讨miR-155对肝癌发生和小鼠脂肪代谢的影响。方法:利用Rm155LG转基因小鼠与Alb-Cre转基因小鼠交配构建肝脏特异性过表达miR-155小鼠（Rm155LG/Alb-Cre）,通过表达谱芯片和qRT-PCR比较Rm155LG/Alb-Cre小鼠与野生型小鼠肝脏组织与肿瘤发生相关基因表达变化;如凋亡、DNA损伤与修复、基因组稳定性等。另外检测小鼠血脂水平,并通过表达谱芯片和qRT-PCR比较Rm155LG/Alb-Cre小鼠与野生型小鼠肝脏组织脂质代谢相关基因表达水平的差异。结果:1)成功构建肝脏过表达miR-155的转基因小鼠（Rm155LG/Alb-Cre）。2)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝脏形态变化选取3m、6m和9m小鼠进行离体肝脏大体形态观察,Rm155LG/Alb-Cre小鼠与对照小鼠比较形态无明显差异;肝脏HE结果同样显示,两者间无明显差异。3)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝细胞增殖能力增强免疫组织化学结果显示,Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝脏Ki67阳性细胞数量显着高于对照小鼠,表明miR-155能够促进小鼠肝细胞增殖。4)miR-155于鼠肝脏过表达引起肿瘤发生相关基因表达变化;miR-155于鼠肝脏过表达造成凋亡、DNA损伤与修复、基因组稳定性等相关基因表达变化,这些生物学过程有待相关功能实验确认,并阐明相关机制。5)Rm155LG/Alb-Cre小鼠血清甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均显着低于对照小鼠。6)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝脏甘油三酯合成相关基因（Dgat2、Pcsk9、Ppap2a等）和胆固醇合成相关基因（Cnbp、Cyb5r3、Dhcr24等）的表达水平显着下调,且PPAR通路相关基因表达上调（Cyp4al4、Acaalb、Fabp2等）。结论:1)Rm155LG/Alb-Cre小鼠肝细胞增殖能力增强,但在观察时间范围内在小鼠肝脏上未见肝癌发生;2)miR-155于鼠肝脏过表达引起肿瘤发生相关基因表达变化,造成凋亡、DNA损伤与修复、基因组稳定性等相关基因表达变化,这些基因改变与癌前病变相关,可探讨miR-155在该事件中的作用,有利于做好肿瘤的一级预防。3)miR-155调节小鼠肝脏脂质合成与代谢,能够减低血脂水平,可探讨miR-155在调控高脂血症中的应用价值。第三章利用miR-155转基因小鼠解析miR-155对糖代谢的影响及机制目的:本章分别利用第一章创建的广泛过表达miR-155的转基因小鼠（命名为RL-m155转基因小鼠）和肝脏特异过表达miR-155的转基因小鼠（命名为Rm155LG/Alb-Cre转基因小鼠,简写为Rm155LG/Cre转基因小鼠）,解析miR-155对小鼠血糖水平的影响及其机制。方法:1)比较RL-m155转基因小鼠与野生型小鼠腹腔糖耐量（GTT）、胰岛素耐量（ITT）和丙酮酸耐受试验（PTT）的差异;2)比较Rm155LG/Cre转基因小鼠与对照小鼠腹腔糖耐量（IPGTT）、胰岛素耐量（ITT）和丙酮酸耐受试验（PTT）的差异;3)观察miR-155对SZT诱导模型小鼠血糖的影响;4)利用mRNA表达谱芯片、qRT-PCR或Western blot检测miR-155转基因小鼠胰岛素作用的靶器官（肝脏、骨骼肌、白色脂肪或棕色脂肪）中糖代谢和胰岛素敏感性相关基因表达水平的变化;5)RL-m155转基因小鼠胰岛形态学观察与免疫组织化学检测。结果:1)RL-m155转基因小鼠各脏器组织miR-155转基因的表达水平小动物活体成像仪检测RL-m155转基因小鼠离体器官Luc和mRFP表达显示,在RL-m155转基因小鼠的肝、骨骼肌、白色脂肪、棕色脂肪和胰腺上均可见Luc信号;从RL-m155转基因小鼠胰腺分离出的胰岛中检测较强的mRFP表达。qRT-PCR结果显示,miR-155在RL-m155转基因小鼠肝、骨骼肌、白色脂肪、棕色脂肪、胰腺和胰岛中的表达均显着高于野生型小鼠。RL-m155转基因小鼠体重与野生型小鼠比较无明显差异;RL-m155转基因小鼠棕色脂肪质量明显低于野生型小鼠。2)雄性RL-m155转基因小鼠糖耐量和胰岛素敏感性雄性RL-m155转基因小鼠非空腹血糖、12小时空腹血糖和24小时空腹血糖均低于野生型小鼠;两组小鼠间非空腹和12小时空腹后血清胰岛素水平均无显着差异。糖耐量实验显示2月龄雄性RL-m155转基因小鼠在15 min、90 min、120 min血糖上升幅度和GTT曲线下面积均显着低于野生型小鼠,GTT后0和30 min两组血清胰岛素水平均无显着差异;5月龄雄性miR-155转基因小鼠GTT实验的结果与2月龄雄性相同。腹腔注射胰岛素后,2月龄雄性和5月龄雄性RL-m155转基因小鼠血糖下降幅度显着高于野生型小鼠;曲线下面积亦低于野生型小鼠。3)雌性RL-m155转基因小鼠糖耐量和胰岛素敏感性3月龄和5月龄雌性RL-m155转基因小鼠非空腹血糖和24小时空腹血糖均低于野生型小鼠,而12小时空腹血糖未见有显着差异;miR-155转基因小鼠与野生型小鼠比较,非空腹和12小时空腹后血清胰岛素水平均无显着差异。糖耐量显示3月龄雌性RL-m155转基因小鼠在15 min、30 min、60 min血糖上升幅度和GTT曲线下面积均显着低于野生型小鼠,GTT后0和30 min两组血清胰岛素水平均无显着差异。腹腔注射胰岛素后,3月龄和5月龄雌性RL-m155转基因小鼠血糖30 min、45 min、60min下降幅度显着高于野生型小鼠;曲线下面积亦低于野生型小鼠。4)RL-m155转基因小鼠胰岛形态和细胞增殖观察HE染色显示RL-m155转基因小鼠胰岛形态无明显变化,免疫组化显示RL-m155转基因小鼠胰岛素和胰高血糖素含量与野生型小鼠比较无明显差异。通过Brdu和Ki67染色观察胰岛细胞增值情况,RL-m155转基因小鼠与野生型小鼠比较胰岛细胞增殖无显着差异。5)RL-m155转基因小鼠丙酮酸耐量实验丙酮酸耐量实验显示,2月龄雄性、3月龄雌性和5月龄雌性RL-m155转基因小鼠血糖上升幅度和曲线下面积均低于野生型小鼠,表明RL-m155转基因小鼠葡萄糖异生低于野生型小鼠。6)大剂量STZ诱导对RL-m155转基因小鼠血糖的影响大剂量STZ诱导后,RL-m155转基因小鼠和野生型小鼠随机血糖逐渐增高,但RL-m155转基因小鼠空腹血糖水平增加幅度低于野生型小鼠,在第7 d、第21 d、第28 d、第35 d和第42 d差异显着,且血糖曲线下面积低于野生型小鼠;同时RL-m155转基因小鼠空腹血糖亦低于野生型小鼠,但两者的血清胰岛素水平无明显差异。7)小剂量STZ连续诱导对RL-m155转基因小鼠血糖的影响小剂量STZ连续诱导后,RL-m155转基因小鼠随机血糖水平增加幅度低于野生型小鼠,在第7d和第10d差异显着;且血糖曲线下面积低于野生型小鼠。此外,GTT实验结果也显示腹腔注射葡萄糖后,RL-m155转基因小鼠血糖水平增加幅度低于野生型小鼠,在第15 min、第90 min和第120 min差异显着,且血糖曲线下面积低于野生型小鼠;同时STZ诱导后的RL-m155转基因小鼠空腹血糖亦低于野生型小鼠,但两者的血清胰岛素水平无明显差异。8)miR-155转基因小鼠胰岛素敏感性和糖代谢相关基因表达变化提取胰岛素主要作用靶器官组织肝脏、脂肪和骨骼肌RNA进行qRT-PCR检测,结果显示RL-m155转基因小鼠肝脏、白色脂肪和棕色脂肪中胰岛素敏感性相关基因如 Phka1、Phkg1、PDK1、PDK4、Acss2、Cebpb 和 PTEN 等表达下降;而在肌肉中葡萄糖代谢相关基因,如Gbe1、Gys1、Gys2、Pkm2和Mdh2表达显着增加。白色脂肪、棕色脂肪和肌肉组织中葡萄糖利用的关键蛋白GLUT1均显着增高。9)肝脏特异性过表达miR-155的转基因小鼠（Rm155LG/Cre）血糖的变化2月龄和4月龄雄性肝脏特异性过表达miR-155的转基因小鼠（Rm155LG/Cre）非空腹血糖、12小时空腹血糖和24小时空腹血糖均显着低于野生型小鼠;同样雌性肝脏特异性过高表达miR-155的转基因小鼠（Rm155LG/Cre）非空腹血糖、12小时空腹血糖和24小时空腹血糖亦均低于野生型小鼠,但两组小鼠间非空腹和12小时空腹后血清胰岛素水平均无显着差异。糖耐量结果显示雄性Rm155LG/Cre小鼠血糖上升幅度和GTT曲线下面积均显着低于野生型小鼠;雌性Rm155LG/Cre小鼠GTT实验的结果与雄性的相同。腹腔注射胰岛素后,雄性和雌性Rm155LG/Cre小鼠血糖上升幅度均显着低于野生型小鼠;曲线下面积亦低于野生型小鼠。丙酮酸耐量实验显示,雄性Rm155LG/Cre小鼠血糖上升幅度和曲线下面积均低于野生型小鼠,提示其糖异生下降。qRT-PCR结果显示,与葡萄糖合成相关基因如磷酸葡糖变位酶1（phosphoglucomutase 1,Pgm1）、磷酸化酶激酶α1（phosphorylase kinase Alpha 1,Phkα1）、6 磷酸葡萄糖酶催化亚基（glucose 6 phosphatase catalytic subunit,G6PC）和丙酮酸脱氢酶激酶4（Pyruvate dehydrogenase Kinase 4;PDK4）表达水平明显下降。10)肝脏特异性过表达miR-155的转基因小鼠（Rm155LG/Cre）肝脏葡萄糖代谢相关基因的变化Rm155LG/Cre双转基因小鼠肝脏葡萄糖代谢相关基因的类比较和层次聚类分析和qRT-PCR验证,结果显示肝脏糖代谢相关基因:糖原磷酸化酶（liver glycogen phosphorylase,Pygl）、2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸变位酶（phosphoglycerate mutase 2,Pgam2）、二氢硫辛酰胺 S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase,Dlat）、丙酮酸去氢酶（肪胺）激酶（pyruvate dehydrogenase（lipoamide）beta,Pdhb）、磷酸甘油醛异构酶（triosephosphate isomerase 1,Tpi1）、葡萄糖激酶（glucokinase,GcK）、辅酶A合成酶短链家族2acyl-CoA synthetase short-chain family member 2 Acss2 和葡萄糖-6-磷酸酶glucose-6-phosphatase G6Pc基因表达均显着下调（Table 3-3）;此外促进肝脏糖原合成基因:磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,Pck1）、核糖体蛋白 S19 结合蛋白 1（ribosomal protein S19 binding protein 1,Rps19bp1）、糖原合成酶2（glycogen synthase 2,Gys）和肝糖酵解基因苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase 2,Mdh2）等基因表达上调。通过Western-blot对Rm155LG/Cre小鼠肝脏、白色脂肪和棕色脂肪组织蛋白检测发现,miR-155靶蛋白C/EBPB、HDAC4、PTEN和SOCS1在这些Rm155LG/Cre双转基因小鼠组织中出现显着的下调（Fig.3-11）,这些均是与胰岛素敏感性相关蛋白,结果表明miR-155能够影响小鼠外周组织对胰岛素的敏感性。11)体外验证miR-155对胰岛素敏感相关靶基因的调控作用选用人肝癌细胞株BEL-7402,利用慢病毒载体构建稳定表达LV-miR-155的BEL-7402细胞。qRT-PCR发现miR-155能够显着下调细胞SOCS1和SOCS3基因的表达,与小鼠体内的结果相同。结论:miR-155在调节小鼠体内血糖水平和胰岛素敏感中发挥了重要作用,miR-155可能是糖尿病防治的一个潜在靶点。
兰海云[9]（2012）在《严格调控表达HCVNS3/4A蛋白三转基因小鼠的建立》文中指出丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是引起慢性肝病的主要病原体，目前全球约有1.7亿HCV感染者。由于HCV的高度变异性，至今尚无特异有效的疫苗和治疗药物，因而其感染已成为全球性的严重的公共卫生问题之一。自1989年首次分离和鉴定出HCV至今，对HCV的防治研究一直进展缓慢。其原因主要是由于HCV感染高度严格的种属嗜性导致有效、稳定的实验动物模型的缺乏。这不仅严重阻碍了对HCV感染和致病机制的研究，而且也极大地限制了抗病毒药物和疫苗的开发。HCV基因组RNA编码的NS3/4A蛋白具有丝氨酸蛋白酶和解旋酶活性。体外实验研究表明，HCV NS3/4A蛋白在蛋白前体的加工成熟、RNA复制以及病毒装配等过程中发挥着关键作用。因此，NS3/4A蛋白已成为目前抗HCV药物研发中最为重要的靶点之一。不仅如此，NS3/4A丝氨酸蛋白酶靶向作用于感染细胞内非病毒复制相关的宿主蛋白，通过阻碍干扰素合成信号的传递等介导病毒的免疫逃逸与感染慢性化。这提示，靶向NS3/4A丝氨酸蛋白酶的抑制剂可能具备阻断感染细胞内病毒的复制和恢复感染细胞内固有免疫防御应答的双重作用。为了进一步在动物水平深入研究NS3/4A蛋白与宿主相互作用的机制及为NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的筛选提供可靠有效的动物模型，本课题联合应用Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统，通过在体生物发光成像技术筛选和建立了稳定、可调控表达HCV NS3/4A蛋白的转基因小鼠模型，试验证实该转基因小鼠模型体内NS3/4A蛋白的表达具有良好的组织特异性和可调控性。主要内容和结果如下：1.构建受Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统双重调控表达NS3/4A蛋白的重组载体pBI-G//LoxP-FLuc-BGH PolyA-LoxP-NS3/4A采用分子克隆技术在真核表达质粒pBI-G双向启动子一侧多克隆位点处依次插入LoxP、Fluc、BGH PolyA、LoxP及NS3/4A序列，成功构建了含Tet-On调控系统元件和Cre/LoxP基因剔除系统元件、报告基因Fluc及HCVNS3/4A蛋白基因的重组质粒pBI-G//LoxP-FLuc-BGH PolyA-LoxP-NS3/4A。该重组质粒与pTet-On及pBI-G//Cre质粒共转染CHO细胞，生物发光成像及蛋白表达检测显示，当且仅当细胞经Dox持续诱导，同时表达反向四环素调控转录激活因子（rtTA）与Cre重组酶时，该重组质粒才表达NS3/4A蛋白，体外证实了该重组载体构建成功且表达NS3/4A蛋白的调控性良好。另外，在该重组质粒中报告基因Fluc的合理引入，为后期利用在体生物发光成像系统鉴定、筛选转基因小鼠奠定了基础。2. NS3/4A转基因小鼠建系，并与肝脏组成型表达rtTA的纯合型Lap转基因小鼠杂交，筛选调控表达报告基因Fluc的NS3/4A/Lap双转基因小鼠重组质粒pBI--G//LoxP-FLuc-BGH PolyA-LoxP-NS3/4A经酶切后，得到线性化的NS3/4A转基因载体，经受精卵显微注射制备获得了NS3/4A转基因首建鼠。6只首建鼠经PCR与Southern Blot鉴定后，与已稳定建系的肝脏组成型表达rtTA的纯合型Lap转基因小鼠杂交。所有子代小鼠（F1）首先通过提取基因组DNA并经PCR扩增转基因片段进行基因型的鉴定，NS3/4A转基因与Lap转基因均阳性的子代小鼠（F1）经Dox持续诱导后通过在体生物发光成像系统（in vivo Bioluminescent Imaging，BLI）检测FLuc的表达进行表型的鉴定。生物发光信号强烈的小鼠即基因型与表型一致的NS3/4A/Lap双转基因小鼠（F1），再与纯合型Lap转基因小鼠杂交，所有子代小鼠（F2）经PCR和BLI进行鉴定和筛选基因型与表型一致的NS3/4A/Lap双转基因小鼠（F2）。同法反复杂交、筛选、建系，获得了稳定遗传、高效表达FLuc的NS3/4A/Lap双转基因小鼠。Western Blot检测结果显示FLuc仅表达于经诱导后的NS3/4A/Lap双转基因小鼠肝脏组织，具有良好的特异性和调控性，为下一步筛选严格调控表达NS3/A蛋白的三转基因小鼠奠定了基础。3.将稳定建系的NS3/4A/Lap双转基因小鼠与已建立的Lap/LC-1双转基因小鼠杂交，筛选严格调控表达NS3/4A蛋白的NS3/4A/Lap/LC-1三转基因小鼠选择经鉴定的NS3/4A/Lap双转基因小鼠与Tet-On系统调控下肝脏特异性表达Cre重组酶的Lap/LC-1双转基因小鼠交配，子代小鼠分别经基因型鉴定（PCR）、表型鉴定（BLI）后筛选获得NS3/4A/Lap/LC-1三转基因小鼠。然后通过免疫组织化学染色及Western Blot检测三转基因小鼠体内Cre重组酶、NS3/4A蛋白的表达。BLI结果显示仅在Dox持续诱导后三转基因小鼠肝脏部位检测到强烈的生物发光信号，表明三转基因小鼠肝细胞内报告基因FLuc特异高效表达；免疫组化及Western Blot结果证实Cre重组酶、NS3/4A蛋白仅在经Dox持续诱导后的三转基因小鼠肝细胞特异性表达，与BLI鉴定结果一致。与Lap/NS3/4A双转基因小鼠在Dox持续诱导后肝脏仅特异性表达Fluc的情况不同的是，该三转基因小鼠仅在Tet-On调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统同时发挥作用时肝脏特异性表达NS3/4A蛋白，表明该三转基因小鼠具有良好的特异性和调控性。综上，本研究建立了Tet-On系统和Cre/LoxP系统双重调控下表达HCVNS3/4A蛋白的三转基因小鼠模型，为进一步研究HCV NS3/4A蛋白与宿主相互作用的机制及抗NS3/4A丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂的筛选和评价奠定了基础。
范雄伟[10]（2012）在《心肌肥厚中的第一道防线 ——抵御心脏疾病发生的第一类抑制因子》文中研究表明众所周知,心肌细胞在病理肥大过程中,存在着胚胎型转化。但是在心肌肥大的过程当中,人们从来没有把细胞类型转化上升到一个理论的高度去理解疾病的发生。虽然过去人们对心肌肥厚中胚胎期基因的重新激活十分重视,并认为这些基因的重新激活是导致心肌肥大直接原因,但是对胚胎基因为什么会激活的问题尚不清楚,而且对一些在心肌肥厚中表达降低的分子往往不如上调的分子那样倍加关注。效应于肥大刺激,心肌细胞中至少存在两类抑制分子,第一类分子在正常生理状态下高表达,肥大刺激通过下调其表达实现去抑制而导致心肌肥厚的发生;第二类分子在正常的状态下表达很弱,肥大刺激诱发其上调同时对肥大反应起负调控作用。我们认为,在心肌肥厚中,胚胎型基因的重新激活并导致心肌细胞胚胎型转化至少部分源自于第一类分子的表达降低,突破了心脏中这一类分子的防御应该是心肌肥厚中更为原发性的因素。由此可见,在心肌肥厚中表达下调的分子在疾病的发生发展中其作用是十分重大的,尤其是第一类分子对肥大诱导因子发挥着监控作用,它们构成心脏病理转换的第一道防线。为了证明以上观点,我们根据信号传递的各个环节,分别对膜蛋白、膜锚定蛋白、胞浆蛋白三种不同的在心肌肥厚中表达下调分子进行了系统地研究。（1） Pop1是一个在心肌细胞中高表达的膜蛋白,我们发现心肌细胞中过表达Pop1能抑制细胞肥大生长,Pop1转基因小鼠表现为抵抗病理心肌肥厚。膜蛋白是介导信号转导的第一个环节,不但可以介导信号的向下传导而且可以游走于不同的受体之间,介导不同信号通路之间的“串话”。我们鉴定了 Pop1为抑制心肌肥厚的膜蛋白,它在肥大反应中的下调将加剧肥大信号在膜层次中的传递。我们的进一步研究发现Pop1抑制心肌肥厚可能与P-Akt的活性抑制相关。（2）小G蛋白转换因子Geft能改变Rho GTPase GTP/GDP结合状态而特异性的激活RhoGTPase。它在心脏和骨骼肌中高表达,能与膜蛋白Pop1发生相互作用从而调控骨骼肌细胞的运动。膜锚定蛋白在信号传递至膜内的环节发挥重要作用。我们发现Geft基因敲除的小鼠易于心肌肥大,伴随着P-Akt分子的激活。证明Geft是一种在心肌肥厚中内源性的抑制因子。在病理刺激下Geft的下调,有可能通过释放抑制而增加对于肥大刺激敏感性。我们对于Geft的研究是首次对其在体内功能的报道。（3）肥大刺激传递至胞浆最终将导致部分胚胎基因的活化,而在胚胎基因的活化的环节同样存在一类分子的抵制,Lrrc10是心脏特异性高表达的分子,我们发现心肌细胞中过表达Lrrc10能抑制细胞肥大生长,转基因小鼠能抵抗心肌肥厚。从机制上看,Lrrc10能与SRF发生相互作用,通过调节其核质分布,进而抑制其转录活性。所以,我们的结果表明在病理肥大刺激下Lrrc10下调,释放SRF的转录活性导致了心肌肥厚。反过来说,在正常生理状态下,SRF被一种内源性高表达的因子囚禁住,从而避免了心脏的病理转变。Lrrc10在肥大病理肥大中作为SRF的监控者。这种机制很可能是某些胚胎基因在心脏疾病中重新激活的原因。总之,通过上述系统的研究,我们第一次阐述了膜蛋白Pop1、膜锚定蛋白Geft和胞浆蛋白Lrrc10在小鼠成体心脏中生物学功能。我们的研究说明第一类心脏中内源性心肌肥大抑制分子在信号通路的各个环节广泛存在,它们的表达下调,诱发了胚胎基因的激活,导致心脏对于肥大刺激的反应性加强。支持了心脏中第一类负调控因子是心脏应对肥大刺激的第一道防线的假说。本论文的研究结果为临床治疗和预防心肌病提供了新的靶标分子和线索。此外,我们鉴定了Rmnd5a作为TGF-β信号通路的新的成员,通过与Smad7相互作用抑制TGF-β信号通路,在TGF-β信号相关的细胞生物学及其心肌肥大中发挥重要作用。我们的研究表明,Rmnd5a很可能是肿瘤转移的抑制因子和心肌肥大的诱发者。我们克隆和分析了 Lrrc10不同长度的启动子,发现G4T44、MEF2对于Lrrc10具有转录调控作用,但是二者不具有协同性。GATA4真实的结合位点很有可能是位于启动子上游100bp左右。我们的研究探讨了 Lrrc10上游可能的调控机制,对于其组织表达的特异性具有一定的解释作用。
二、检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立（论文提纲范文）
（1）利用类器官研究肝胆胰导管上皮祖细胞特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肝胆胰的器官发生 |
| 1.2 肝脏、胆管及胰腺干/祖细胞 |
| 1.2.1 肝脏干/祖细胞 |
| 1.2.2 胆道系统的干/祖细胞 |
| 1.2.3 胰腺干/祖细胞 |
| 1.3 类器官培养技术 |
| 1.3.1 类器官培养体系的建立 |
| 1.3.2 利用ESC和iPSC制备类器官 |
| 1.3.3 利用基本组织制备类器官 |
| 1.4 细胞谱系追踪 |
| 1.4.1 Cre-loxP系统原理 |
| 1.4.2 诱导型Cre-loxP系统 |
| 1.4.3 Rosa26-mTmG转基因小鼠应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 小鼠肝、胆、胰导管类器官制备及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 溶液及培养基的配制与保存 |
| 2.1.5 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.1.6 PCR鉴定 |
| 2.1.7 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 2.1.8 小鼠肝管、胆总管和胰腺导管类器官的制备 |
| 2.1.9 类器官的传代、冻存与复苏 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 mPDO、mBTO和mHDO的制备 |
| 2.2.2 三种类器官维持导管细胞特异性基因的表达 |
| 2.2.3 三种类器官均表达肝、胆,胰谱系基因 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 转录组测序分析三种类器官相似性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用组织与细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 培养基的配制与保存 |
| 3.1.5 总mRNA的提取 |
| 3.1.6 总RNA质量评估 |
| 3.1.7 转录组实验流程 |
| 3.1.8 基因表达量分析 |
| 3.1.9 差异基因表达分析 |
| 3.1.10 基因表达量验证 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA质量评估结果 |
| 3.2.2 差异表达分析统计结果 |
| 3.2.3 差异表达聚类分析结果 |
| 3.2.4 肝胆胰谱系基因聚类分析结果图 |
| 3.2.5 基因表达验证结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 mPDO、mBTO和mHDO分化潜能鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物和细胞系 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 培养基的配制与保存 |
| 4.1.5 总mRNA的提取及cDNA的合成 |
| 4.1.6 real-time PCR |
| 4.1.7 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 4.1.8 流式细胞术 |
| 4.1.9 Wnt-3A条件培养基的制备 |
| 4.1.10 Rosa26-mTmG小鼠三种类器官的制备 |
| 4.1.11 胆上皮细胞分化方法 |
| 4.1.12 肝实质细胞分化方法 |
| 4.1.13 胰腺β细胞体外分化方法 |
| 4.1.14 胰腺β细胞体内分化方法(肾包囊下移植) |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 mPDO、mBTO和mHDO向胆管细胞分化能力分析 |
| 4.2.2 mPDO、mBTO和mHDO向肝细胞分化能力分析 |
| 4.2.3 mPDO、mBTO和mHDO在体外向胰腺β细胞分化能力分析 |
| 4.2.4 mPDO、mBTO和mHDO在体内向胰腺β细胞分化能力分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 利用细胞谱系追踪分析三种类器官相似性 |
| 5.1 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基的配制与保存 |
| 5.1.5 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 5.1.6 转基因鼠肝胆胰导管上皮细胞类器官的制备 |
| 5.1.7 转基因鼠类器官的传代、冻存与复苏 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 mPDO、mBTO和mHDO来源于PDX1表达的细胞 |
| 5.2.2 成体小鼠肝胆胰导管无显着Lgr5表达 |
| 5.2.3 新生小鼠肝胆胰导管无显着Lgr5表达 |
| 5.2.4 E15.5胎鼠肝胆胰无显着Lgr5表达 |
| 5.2.5 E17.5胎鼠肝胆胰无显着Lgr5表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 人胆总管类器官制备及分化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基的配制与保存 |
| 6.1.5 总mRNA的提取及cDNA的合成 |
| 6.1.6 real-time PCR |
| 6.1.7 冰冻切片及免疫荧光染色 |
| 6.1.8 流式细胞术 |
| 6.1.9 人胆总管类器官的制备 |
| 6.1.10 hBTO的传代、冻存与复苏 |
| 6.1.11 hBTO向胆上皮细胞分化方法 |
| 6.1.12 hBTO向肝实质细胞分化方法 |
| 6.1.13 hBTO向胰腺β细胞体外分化方法 |
| 6.1.14 hBTO向胰腺β细胞体内分化方法(肾包囊移植) |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 hBTO的制备及鉴定 |
| 6.2.2 hBTO向胆管细胞分化能力分析 |
| 6.2.3 hBTO向肝细胞分化能力分析 |
| 6.2.4 hBTO体外向胰腺β细胞分化能力分析 |
| 6.2.5 hBTO体内向胰腺β细胞分化能力分析(肾包囊移植) |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）单链退火（SSA）介导的动物基因组精确编辑系统的构建、优化及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 基因组精确编辑概述 |
| 1.1 基因组定点整合 |
| 1.1.1 重组酶 |
| 1.1.2 转座子 |
| 1.1.3 腺病毒、腺相关病毒和慢病毒 |
| 1.1.4 位点特异性核酸酶 |
| 1.1.5 基因组定点整合效率提高 |
| 1.2 阳性克隆的富集 |
| 1.2.1 筛选基因载体水平瞬时表达 |
| 1.2.2 筛选基因的基因组整合表达 |
| 1.3 基因组中筛选标记基因的删除 |
| 1.3.1 重组酶系统 |
| 1.3.2 转座子系统 |
| 1.3.3 基于同源介导的重组删除办法 |
| 1.3.4 单链退火(Single strand annealing,SSA)介导的序列删除 |
| 1.4 双等位基因精确编辑现状 |
| 1.5 基因组点编辑实例 |
| 1.5.1 畜禽生产 |
| 1.5.2 疾病研究 |
| 1.6 研究拟解决的科学问题以及研究内容 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 第二章 基因组精确编辑系统建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌种、质粒与细胞株 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 筛选表达盒序列优化 |
| 2.2.2 供体优化后的CCR5 位点的精确编辑 |
| 2.2.3 APP位点的精确编辑 |
| 2.2.4 α-syn位点的精确编辑 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 筛选表达盒序列优化 |
| 2.3.2 供体优化后的CCR5 位点的精确编辑 |
| 2.3.3 APP位点的精确编辑 |
| 2.3.4 α-syn位点的精确编辑 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 基因组精确编辑系统优化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌种、质粒与细胞株 |
| 3.1.2 仪器、试剂与试剂配制 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 不同供体形式对HDR修复效率的影响 |
| 3.2.2 不同长度SSA同源臂对单链退火修复效率的影响 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 不同供体形式对HDR修复效率的影响 |
| 3.3.2 不同长度SSA同源臂对单链退火修复效率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪PK15 细胞基因组位点的精确编辑 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌种、质粒与细胞株 |
| 4.1.2 仪器、试剂与试剂配制 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 IGF2 位点的精确编辑 |
| 4.2.2 RELA位点的精确编辑 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 IGF2 位点的精确编辑 |
| 4.3.2 RELA位点的精确编辑 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 双等位敲入系统的建立与优化 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 菌种、质粒与细胞株 |
| 5.1.2 仪器、试剂与试剂配制 |
| 5.1.3 引物 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 Zeo~R-mRFP筛选表达盒载体的构建 |
| 5.2.2 APP位点双等位精确编辑 |
| 5.2.3 PSEN1 位点双等位精确编辑 |
| 5.2.4 筛选表达盒序列长度减小对双等位基因敲入效率的影响 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 Zeo~R-mRFP筛选表达盒的构建 |
| 5.3.2 APP位点双等位精确编辑 |
| 5.3.3 PSEN1 位点双等位精确编辑 |
| 5.3.4 筛选表达盒序列长度减小对双等位基因敲入效率的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论、创新点与建议 |
| 6.1 本研究的主要结论 |
| 6.2 本研究的创新点 |
| 6.3 后续有待进行的工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 CRISPR/CAS9基因编辑技术在动物模型制备中的应用 |
| 1.2 气道上皮干细胞研究进展 |
| 第二章 CRISPR/CAS9介导基因编辑联合靶向报告基因富集FoxJ1基因敲除小鼠原代呼吸道上皮细胞 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论与结论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 CRISPR/CAS9介导非同源末端连接构建ROSA26“着陆点”荧光报告基因雪貂模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论与结论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 CRISPR/CAS9介导同源重组建立αSMA-CreERT2敲入转基因雪貂模型 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论与结论 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶在转基因小鼠睾丸组织中特异性表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒的构建 |
| 1.2 细胞培养与转染 |
| 1.3 Kap147/Kpn-Cre转基因鼠的培育 |
| 1.4 RNA提取，RT-PCR检测和荧光定量PCR检测 |
| 1.5 雄激素对Cre基因的调控 |
| 1.6 双荧光基因表达检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Kap147/Kpn杂合启动子的细胞特异性和雄激素可调节性 |
| 2.2 Cre重组酶在Kap147/Kpn-Cre转基因小鼠睾丸组织中的特异性表达 |
| 2.3 Cre-F0-2转基因小鼠睾丸组织中Cre基因表达的激素调控 |
| 2.4 Cre-F0-2转基因小鼠体内Cre重组酶活性的评估 |
| 3 讨论 |
（5）Ets-1降低胰岛素基因表达并引起胰岛β细胞功能缺陷的表观遗传机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 仪器设备 |
| 1.2 试剂、抗体及耗材 |
| 1.3 其他 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 小鼠基因组DNA提取及鉴定 |
| 2.2 2型糖尿病小鼠动物模型的建立 |
| 2.3 小鼠空腹血糖水平监测 |
| 2.4 小鼠葡萄糖耐量实验(IPGTT)和胰岛素耐受实验(IPITT) |
| 2.5 小鼠正胰岛素-高葡萄糖钳夹实验 |
| 2.6 胰腺组织免疫荧光染色 |
| 2.7 小鼠原代胰岛提取 |
| 2.8 葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS) |
| 2.9 细胞培养及处理 |
| 2.10 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) |
| 2.11 总RNA的提取及实时-定量PCR实验 |
| 2.12 总蛋白质的提取及分析 |
| 2.13 蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP) |
| 2.14 细胞免疫荧光染色 |
| 2.15 质粒的构建 |
| 2.16 双报告荧光素酶基因实验 |
| 2.17 统计学分析 |
| 结果 |
| 1. β细胞特异性Ets-1敲除小鼠(βEts-1KO)基因型鉴定及敲除效率验证 |
| 1.1 Ins2-cre,Ets-1 loxp~(fl/fl)小鼠的配繁和基因型鉴定 |
| 1.2 βEts-1KO小鼠β细胞Ets-1敲除效率验证 |
| 2. 正常饮食的βEts-1KO小鼠代谢表型分析 |
| 2.1 正常饮食的βEts-1KO小鼠空腹血糖降低 |
| 2.2 正常饮食的βEts-1KO小鼠,胰岛素敏感性无显着变化 |
| 2.3 正常饮食的βEts-1KO小鼠β细胞胰岛素分泌能力增强 |
| 2.4 正常饮食的βEts-1KO小鼠胰岛胰岛素含量增加 |
| 3. 敲除Ets-1改善高脂喂养引起的小鼠β细胞功能障碍 |
| 3.1 敲除Ets-1缓解高脂喂养引起的糖耐量受损 |
| 3.2 敲除Ets-1缓解高脂喂养导致的胰岛β细胞功能缺陷 |
| 3.3 高脂诱导的2型糖尿病模型小鼠β细胞Ets-1表达增高 |
| 4. 糖/脂毒性促进β细胞Ets-1表达 |
| 5. 高表达Ets-1降低β细胞胰岛素基因的转录水平和蛋白含量 |
| 6. Ets-1通过降低胰岛素启动子组蛋白乙酰化程度下调胰岛素基因表达 |
| 6.1 E与胰岛素启动子区结合 |
| 6.2 高脂诱导的2型糖尿病模型小鼠Ets-1与胰岛素启动子的结合增多 |
| 6.3 糖/脂毒性促进E-1与胰岛素启动子的结合 |
| 6.4 高表达Ets-1降低胰岛素启动子组蛋白H4乙酰化水平 |
| 7. 糖/脂毒性通过Ets-1导致胰岛素启动子组蛋白乙酰化程度下降 |
| 7.1 糖毒性降低胰岛素启动子组蛋白H4乙酰化程度 |
| 7.2 脂毒性降低胰岛素启动子组蛋白H4乙酰化程度 |
| 7.3 干扰Ets-1逆转糖/脂毒性引起的胰岛素启动子组蛋白乙酰化程度降低 |
| 8. 糖/脂毒性诱导和HDAC-1/2与胰岛素启动子结合 |
| 8.1 胰岛β细胞中E与HDAC-1、2相互结合 |
| 8.2 -1与组蛋白去乙酰化酶相互作用抑制胰岛素启动子转录活性 |
| 8.3 糖/脂毒性通过E促进HDAC-1/2与胰岛素启动子结合 |
| 8.4 糖/脂毒性促进E-1-HDAC-12复合体与胰岛素启动子结合增多 |
| 9. Ets-1间接介导糖毒性引起的p300与胰岛素启动子区结合下降 |
| 10. IL-1β不影响胰岛素启动子组蛋白H4乙酰化 |
| 分析与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 组蛋白去乙酰化酶与胰岛β细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）食品源性双酚A发育期暴露对突触传递和大脑环路损伤及可能机理研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食品安全 |
| 1.2 双酚A的理化性质 |
| 1.3 双酚A: 一种内分泌干扰物 |
| 1.4 双酚A在环境中的分布 |
| 1.5 双酚A与食品安全 |
| 1.6 国内以及国际上双酚A的限量标准及相关法律法规 |
| 1.7 双酚A对人体的危害 |
| 1.7.1 双酚A对生殖系统的损害 |
| 1.7.2 双酚A和表观遗传学 |
| 1.7.3 双酚A和癌症 |
| 1.8 双酚A暴露对神经系统的影响 |
| 1.9 神经系统中的双酚A和雌激素 |
| 1.10 双酚A影响突触传递的可能机制研究 |
| 1.11 双酚A对神经环路的影响的研究 |
| 1.12 神经环路研究的方法和手段 |
| 1.12.1 传统的神经环路研究方法 |
| 1.12.2 以嗜神经病毒为工具的神经环路研究方法[167] |
| 1.13 课题研究的背景和意义 |
| 1.14 课题研究的主要内容 |
| 1.15 技术路线图 |
| 1.16 主要创新点 |
| 第二章 双酚A暴露对离体培养海马神经元突触传递的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂和药品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 离体原代海马锥体神经元培养 |
| 2.2.2 全细胞电生理记录系统 |
| 2.2.3 免疫细胞化学 |
| 2.3 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 双酚A暴露对离体培养原代海马锥体神经元兴奋性突触传递的影响 |
| 2.4.2 双酚A暴露对离体培养原代海马锥体神经元抑制性突触传递的影响 |
| 2.4.3 双酚A暴露对离体培养原代海马锥体神经元兴奋性突触传递相关蛋白的影响 |
| 2.4.4 双酚A暴露对离体培养原代海马锥体神经元抑制性性突触传递相关蛋白的影响 |
| 2.5 本章小结与讨论 |
| 第三章 双酚A影响突触传递是雌激素经典信号通路ERα/β依赖的 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂和药品 |
| 3.1.3 质粒构建引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 离体原代海马锥体神经元培养 |
| 3.2.2 全细胞电生理记录系统 |
| 3.2.3 菌种培养方法 |
| 3.2.4 脑组织全基因组DNA提取 |
| 3.2.5 半定量聚合酶链式反应(PCR) |
| 3.2.6 质粒提取方法 |
| 3.2.7 质粒DNA转化 |
| 3.2.8 DNA切胶回收方法 |
| 3.2.9 GAD65-ERE Dual-Luciferase质粒的构建 |
| 3.2.10 Lipofectamine 3000脂质体质粒转染 |
| 3.2.11 荧光素酶报告基因系统实验 |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 双酚A能促进GAD65雌激素反应元件的表达 |
| 3.4.2 双酚A和雌二醇E2对抑制性突触传递的影响 |
| 3.4.3 雌二醇E2和双酚A对抑制性突触传递的影响是雌激素经典通路ERα/β依赖的 |
| 3.5 本章小结与讨论 |
| 第四章 发育期双酚A暴露对SD大鼠行为的影响及其可能机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂和药品 |
| 4.2 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Morris水迷宫 |
| 4.3.2 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 4.3.3 Golgi-cox染色 |
| 4.4 数据分析 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 发育期双酚A暴露后,SD大鼠的学习能力发生了明显的降低 |
| 4.5.2 发育期双酚A暴露后,SD大鼠的记忆能力受到了明显的损害 |
| 4.5.3 发育期双酚A暴露对海马CA1区和DG区神经元树突分支的影响 |
| 4.5.4 发育期双酚A暴露改变了SD大鼠海马CA1区和DG区神经元树突棘密度和形态 |
| 4.5.5 发育期双酚A暴露SD大鼠海马CA1区和DG区神经元Arc表达的影响 |
| 4.6 本章小结与讨论 |
| 第五章 发育期双酚A暴露影响学习记忆的神经环路及其潜在机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 主要试剂和药品 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 实验病毒 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Thy1-Cre转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 5.2.2 半定量聚合酶链式反应(PCR) |
| 5.2.3 Morris水迷宫 |
| 5.2.4 巴恩斯(Barnes)迷宫 |
| 5.2.5 PFA灌流和冰冻切片 |
| 5.2.6 免疫组织化学 |
| 5.2.7 脑定位立体注射病毒技术 |
| 5.3 数据分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 双酚A发育期暴露降低了Thy1-Cre小鼠的学习记忆能力 |
| 5.4.2 Thy1-Cre小鼠海马CA1区逆向单级示踪注射位点 |
| 5.4.3 发育期双酚A暴露导致海马内部CA3-CA1和内嗅皮层EC-CA1投射的减少 |
| 5.4.4 发育期双酚A暴露导致的海马内部投射的较少主要表现在CA3-CA1的兴奋性投射上 |
| 5.4.5 发育期双酚A暴露导致的内嗅皮层EC-CA1的投射的减少表现在EC-CA1的兴奋性投射上 |
| 5.5 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
（7）应用类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）定点修饰猪基因组（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 基因靶向修饰技术的研究进展 |
| 1.1 经典同源重组介导的基因靶向修饰 |
| 1.2 病毒介导的基因靶向修饰 |
| 1.3 锌指核酸酶介导的基因靶向修饰 |
| 1.4 类转录激活因子效应物核酸酶介导的基因靶向修饰 |
| 1.5 RNA 介导的基因靶向修饰 |
| 1.6 条件性控制靶向修饰 |
| 1.7 单碱基突变修饰 |
| 1.8 基因靶向修饰技术的问题与展望 |
| 第二章 基因靶向修饰动物模型的研究及应用 |
| 2.1 基因靶向修饰动物制备方法 |
| 2.2 基因靶向修饰动物的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 TALEN 构建以及活性验证体系的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 TALEN 介导的猪基因敲除研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TALEN 介导的猪基因敲入研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 TALEN 介导的猪基因组定点突变研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）利用miR-155转基因小鼠解析miR-155在肝癌发生和糖脂代谢中的功能及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 建立过表达miR-155的转基因小鼠 |
| 第一节 运用Cre/lox P系统建立条件性过表达miR-155的转基因小鼠 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 本节小结 |
| 第二节 利用小动物活体荧光成像筛选纯合子转基因小鼠 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三节 创建广泛过表达miR-155的转基因小鼠 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 小结 |
| 第二章 利用肝脏特异过表达miR-155的转基因小鼠解析miR-155在肝癌发生和肝脂代谢中的功能 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 利用miR-155转基因小鼠解析miR-155对糖代谢的影响及机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略表 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（9）严格调控表达HCVNS3/4A蛋白三转基因小鼠的建立（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HCV 细胞模型的建立及其在病毒复制周期机制研究与抗病毒药物开发中的应用 |
| 二、HCV 实验动物模型的开发与应用 |
| 三、HCV NS3/4A 蛋白结构与功能及与宿主蛋白相互作用的研究进展 |
| 四、在体光学成像技术及其应用 |
| 第一部分 构建 Tet-On 和 Cre/LoxP 系统双重调控表达 HCV NS3/4A 蛋白的真核表达载体 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 NS3/4A 转基因小鼠建系和筛选调控表达 Fluc 的 NS3/4A/Lap 双转基因小鼠 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 筛选严格调控表达 NS3/4A 蛋白的 NS3/4A/Lap/LC-1 三转基因小鼠 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）心肌肥厚中的第一道防线 ——抵御心脏疾病发生的第一类抑制因子（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 病理性心肌肥厚 |
| 1.1.1 心肌肥厚 |
| 1.1.2 生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚 |
| 1.1.3 病理性心肌肥厚与心衰 |
| 1.1.4 向心性病理肥厚和离心性病理肥厚 |
| 1.2 介导病理心肌肥大的信号通路 |
| 1.2.1 G蛋白信号通路 |
| 1.2.2 PI3K (p110γ)信号通路 |
| 1.2.3 有丝分裂激活蛋白激酶通路(MAPK) |
| 1.2.4 钙信号通路 |
| 1.2.5 Tgf-β信号通路 |
| 1.3 病理性心肌肥大中的一些正调控因子和负调控因子 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 1.5 研究结果概述 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物信息学软件 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 工具酶和试剂 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA的提取和基因型鉴定 |
| 2.2.2 Southern Blot |
| 2.2.3 组织及细胞中总RNA的提取 |
| 2.2.4 Real-time PCR和RT-PCR |
| 2.2.5 Northern Blot杂交 |
| 2.2.6 石蜡包埋、切片及HE染色 |
| 2.2.7 Masson染色 |
| 2.2.8 免疫组织化学 |
| 2.2.9 腺病毒的构建与扩充 |
| 2.2.10 大鼠原代心肌细胞分离、培养及心肌细胞面积统计 |
| 2.2.11 Western Blot |
| 2.2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.2.13 GST PULL DOWN |
| 2.2.14 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.2.15 凝胶阻滞实验(EMSA) |
| 2.2.16 荧光素酶报告基因活性分析实验(Luciferase) |
| 2.2.17 小鼠心脏的超声检测 |
| 第三章 POP1,一个心脏中天然的防卫心肌肥厚的膜蛋白分子 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 目的和意义 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Pop1过表达腺病毒的研制 |
| 3.3.2 腺病毒介导Pop1在大鼠原代心肌细胞中过表达 |
| 3.3.3 原代心肌细胞中过表达Pop1抑制PE诱导的心肌肥厚 |
| 3.3.4 α-MHC-Pop1-hGH转基因载体的构建 |
| 3.3.5 转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 3.3.6 Pop1在转基因小鼠心肌组织中检测到Pop1过表达 |
| 3.3.7 ISO诱导心肌肥大的小鼠模型 |
| 3.3.8 Pop1转基因小鼠抑制ISO诱导的的心肌肥厚 |
| 3.3.9 Pop1转基因小鼠抑制ISO诱导P-Akt分子的活化 |
| 3.3.10 建立在心脏中过表达Pop1剔除Geft的小鼠 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 GEFT,一个心脏中天然的防卫心肌肥厚的膜锚定蛋白分子 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 目的和意义 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Geft在肥大的心肌细胞中表达下调 |
| 4.3.2 Geft基因的打靶策略 |
| 4.3.3 Geft基因打靶Southern探针设计和验证 |
| 4.3.4 利用Red重组系统构建Geft条件基因敲除载体 |
| 4.3.5 中靶ES细胞的筛选 |
| 4.3.6 Geft条件基因敲除嵌合体小鼠纯合子小鼠的获得 |
| 4.3.7 Geft在胚胎期心脏中表达 |
| 4.3.8 第二心域特异性剔除Geft小鼠的获得 |
| 4.3.9 Geft对于第二心域发育不是必须的 |
| 4.3.10 心脏特异性剔除Geft小鼠的获得 |
| 4.3.11 心脏特异性剔除Geft小鼠易于心肌肥厚 |
| 4.3.12 心脏特异性剔除Geft小鼠伴随着P-Akt分子的激活 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 LRRC10,一个心脏中天然的防卫心肌肥厚的胞浆蛋白分子 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 目的和意义 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Lrrc10在小鼠心肌肥厚模型中和人类心衰标本中表达下调 |
| 5.3.2 腺病毒介导Lrrc10在大鼠原代心肌细胞中过表达和敲低 |
| 5.3.3 体外实验证明Lrrc10抑制心肌肥大 |
| 5.3.4 α-MHC-Lrrc10-hGH转基因载体的构建 |
| 5.3.5 转基因小鼠的基因型鉴定 |
| 5.3.6 转基因小鼠中检测Lrrc10过表达以及表型分析 |
| 5.3.7 体内过表达Lrrc10抑制病理刺激导致的心肌肥大 |
| 5.3.8 Lrrc10与SRF发生相互作用并抑制其转录活性 |
| 5.3.9 体内外过表达Lrrc10下调SRF靶基因的表达 |
| 5.3.10 Lrrc10调节SRF的转位 |
| 5.3.11 SRF转录调控Lrrc10 |
| 5.3.12 体内注入Lrrc10腺病毒能抑制ISO刺激的心肌肥大 |
| 5.3.13 体内注入SRF腺病毒能逆转Lrrc10转基因小鼠对ISO刺激的心肌肥大的抑制作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 细胞类型的转变在疾病发生当中发挥着重要作用 |
| 6.2 在心肌肥厚中胚胎基因重新激活是心肌细胞类型的转变的分子事件 |
| 6.3 在心肌肥厚中一类天然的防御分子在信号通过的各个环节扣押着一些胚胎基因的激活 |
| 6.4 在心肌肥厚的各个阶段是心脏在功能代偿中不同稳态的表现形式,伴随着不同的分子事件 |
| 6.5 参考文献 |
| 第七章 综述:抵抗心脏疾病的第一道防线 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 心肌肥厚中的第一道防线 |
| 7.2.1 转录因子 |
| 7.2.2 Ca~(2+)处理蛋白 |
| 7.2.3 合成与代谢 |
| 7.2.4 氧化应激与凋亡 |
| 7.2.5 收缩蛋白装置 |
| 7.2.6 纤维化 |
| 7.2.7 血管生成 |
| 7.3 展望 |
| 7.4 参考文献 |
| 第八章 其他工作 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 生物信息学软件 |
| 8.1.2 质粒 |
| 8.1.3 细胞 |
| 8.1.4 引物 |
| 8.1.5 工具酶和试剂 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 载体构建 |
| 8.2.2 荧光素酶报告基因活性分析实验(Luciferase) |
| 8.3 RMND5A诱导心肌肥厚 |
| 8.3.1 研究背景 |
| 8.3.2 目的和意义 |
| 8.3.3 实验结果 |
| 8.3.4 讨论 |
| 8.3.5 参考文献 |
| 8.4 LRRC10启动子分析 |
| 8.4.1 前言 |
| 8.4.2 研究目的和意义 |
| 8.4.3 实验结果 |
| 8.4.4 讨论 |
| 8.4.5 参考文献 |
| 附录 |
| 一、论着及会议论文 |
| 1、已(拟)发表第一作者SCI论文: |
| 2、已发表中间作者SCI论文: |
| 3、已发表中文论文: |
| 二、常用缩略词 |
| 致谢 |
四、检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立（论文参考文献）
- [1]利用类器官研究肝胆胰导管上皮祖细胞特性[D]. 刘淼. 东北林业大学, 2020(01)
- [2]单链退火（SSA）介导的动物基因组精确编辑系统的构建、优化及应用[D]. 李欣忆. 西北农林科技大学, 2019
- [3]CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型[D]. 于淼. 宁夏大学, 2019(02)
- [4]Kap147/Kpn杂合启动子引导Cre重组酶在转基因小鼠睾丸组织中特异性表达[J]. 刘飞,孟军,范立强. 华东理工大学学报(自然科学版), 2019(06)
- [5]Ets-1降低胰岛素基因表达并引起胰岛β细胞功能缺陷的表观遗传机制研究[D]. 吴倜珺. 南京医科大学, 2018(06)
- [6]食品源性双酚A发育期暴露对突触传递和大脑环路损伤及可能机理研究[D]. 丁锦君. 合肥工业大学, 2018(01)
- [7]应用类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）定点修饰猪基因组[D]. 杨翌. 吉林大学, 2014(09)
- [8]利用miR-155转基因小鼠解析miR-155在肝癌发生和糖脂代谢中的功能及机制[D]. 林晓琳. 南方医科大学, 2014(05)
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