一、利用Tet-OnTM基因表达系统直接克隆 p53下游基因(英文)（论文文献综述）
李珊[1]（2021）在《岷江百合几丁质酶基因LrCHI2响应尖孢镰刀菌的机制研究》文中研究表明岷江百合（Lilium regale Wilson）是我国特有的野生品种,对引起百合根腐病的主要致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有极强的抗性,是培育百合抗病品种及研究百合抗病分子机理的重要种质资源。本研究前期对接种尖孢镰刀菌后的岷江百合进行了转录组测序,并筛选出一个由尖孢镰刀菌诱导表达的病程相关蛋白（pathogenesis-related protein,PR）基因,LrCHI2。本研究深入认识LrCHI2的功能。分析LrCHI2的表达特性以及亚细胞定位;表达并纯化获得LrCHI2的原核重组蛋白,分析其对几种病原真菌的抑制活性;在模式植物烟草中过表达LrCHI2以验证其在尖孢镰刀菌侵染过程中的作用。WRKY转录因子常作为PR基因的上游调控因子在植物的防御系统中发挥作用。于是进一步克隆了LrCHI2的启动子序列并研究了岷江百合LrWRKY2对LrCHI2的转录调控。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1、基于对尖孢镰刀菌侵染后百合的转录组测序分析结果获得一个岷江百合几丁质酶基因序列并命名为LrCHI2,通过PCR从岷江百合cDNA中克隆出LrCHI2。LrCHI2基因全长cDNA为1313bp,包含一个933 bp的开放读码框,编码含310个氨基酸的蛋白质。qRT-PCR结果表明,LrCHI2在根中高表达,在其它植物器官中低水平表达;LrCHI2的表达水平受四种信号分子乙烯利（ethephon,ETH）、水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）和过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）处理的诱导;LrCHI2的表达水平还受尖孢镰刀菌侵染的诱导。2、构建pBIN m-gfp5-ER-LrCHI2亚细胞定位载体,转化洋葱表皮细胞,共培养后在激光共聚焦显微镜下观察到LrCHI2-GFP融合蛋白定位于细胞壁。构建p ET-32a-LrCHI2原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达LrCHI2蛋白。抑菌实验结果表明,LrCHI2的原核重组蛋白明显抑制尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、茄腐镰刀菌（F.solani）、人参链格孢（Alternaria panax）等病原真菌的生长。构建植物超表达载体p CAMBIA2300s-LrCHI2,转入到烟草中过表达,获得T2代转基因烟草,qRT-PCR结果表明LrCHI2在T2代转基因烟草株系中稳定表达,叶片接种实验表明LrCHI2转基因烟草对尖孢镰刀菌具有很强抗性。3、通过染色体步移克隆获得LrCHI2的启动子,通过顺式作用元件分析表明该启动子含有顺式作用元件W-box。凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）结果表明LrWRKY2重组蛋白能够在体外与包含W-box的LrCHI2启动子片段结合。进一步构建诱饵载体pAbAi-pLrCHI2和猎物载体pGADT7AD-LrWRKY2进行酵母单杂交实验,结果表明LrWRKY2对LrCHI2启动子具有反式激活作用。此外,构建LrCHI2启动子与葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase,GUS）报告基因融合表达载体,分别转入LrWRKY2转基因烟草以及野生型烟草中。GUS荧光定量分析结果表明,LrCHI2启动子响应几种非生物胁迫（盐胁迫、镉胁迫和伤胁迫）、生物胁迫（尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌和稻黑胞霉（Nigrospora oryzae）侵染）及植物激素MeJA的处理。此外,与单表达LrCHI2启动子的转基因烟草相比,共表达LrCHI2启动子与LrWRKY2的转基因烟草的GUS活性显着提高,表明LrWRKY2能够正调控LrCHI2启动子的活性。综上所述,LrCHI2响应植物信号分子处理和尖孢镰刀菌侵染。原核重组蛋白LrCHI2对包括尖孢镰刀菌在内的几种病原真菌具有明显的抑制活性。LrCHI2基因在烟草中过量表达赋予了烟草对尖孢镰刀菌的抗性。此外,MeJA处理、生物和非生物胁迫都能增强LrCHI2启动子的活性。LrWRKY2正调控LrCHI2的转录活性。以上结果表明LrCHI2受WRKY转录因子的调控在岷江百合对尖孢镰刀菌的防御中发挥着重要作用。
李昕[2]（2020）在《P53通路激活剂的筛选及作用机制研究》文中指出P53（Tumor suppressor p53,TP53,TRP53）是由17号染色体上的TP53基因编码的蛋白,对细胞生长、分化、代谢及机体免疫具有重要调控作用。P53功能异常与多种人类疾病相关,如P53功能缺失或异常对肿瘤的发生和发展具有重要的促进作用,因此P53主要被作为一种关键的抑癌基因进行研究。几乎在所有人类肿瘤中,P53都以不同形式处于失活或功能异常状态:一些肿瘤中P53发生失活突变从而丧失抑癌活性,甚至促进肿瘤生长转移;另外一些肿瘤中,虽然P53以野生型存在,但其活性被异常的负调控机制抑制。利用外来干预恢复P53信号通路的正常功能,一直是有吸引力的肿瘤治疗策略。P53野生型肿瘤并不罕见,多见于结直肠癌、淋巴瘤及部分肿瘤病毒（如人乳头瘤病毒HPV和Epstein-Barr Virus等）诱发的肿瘤。这些肿瘤中,如果恢复或增强野生型P53蛋白的活性,将在很大程度上抑制肿瘤的生长。本研究利用高通量筛选、计算机药物虚拟筛选和知识图谱等多学科技术手段的交叉应用,聚焦于筛选P53信号通路小分子激活剂,得到两种潜在的P53通路激活剂——Torilin和UNBS5162,并对其中比较具有成药潜力的分子UNBS5162进行了较为系统的分子作用机制研究。围绕P53信号通路激活剂的开发,本研究分别构建了基于靶点（野生型P53蛋白）的计算机药物虚拟筛选系统和基于生物学表型（P53转录活性）的荧光素酶高通量药物筛选系统,并将两种系统交叉应用于后续的化合物分子作用机制研究和药效验证。一方面,从计算机虚拟筛选系统出发,联合荧光素酶筛选系统的验证,发现天然产物Torilin能激活P53信号通路,实验证明Torilin能够提高野生型P53的稳定性,进而激活P53下游通路,抑制P53野生型肿瘤细胞的生长,并通过分子对接表明Torilin通过2-甲基-2-丁烯醇直接结合在P53的关键氨基酸位点Cys124上,维持P53稳定性构象。另一方面,从高通量系统中筛选得到了潜在的P53通路激活剂UNBS5162,实验验证其在细胞模型和异种移植瘤动物模型中显着抑制肿瘤生长。进一步的机制研究发现UNBS5162促进MDM2（P53的E3泛素连接酶）的降解,抑制P53的泛素化,稳定P53蛋白,提高肿瘤细胞内P53蛋白水平,诱导P53信号通路下游基因表达,从而通过促进细胞凋亡和阻滞细胞周期,抑制多种P53野生型肿瘤细胞的生长。随后利用团队成员构建的P53蛋白调控网络知识图谱分析了P53活性和稳定性相关的信号通路和节点分子,缩小研究范围,并利用计算机虚拟筛选系统协助探索了UNBS5162可能的直接作用靶点。Torilin通过直接结合稳定P53蛋白构象,UNBS5162通过影响P53翻译后修饰调控因子间接激活P53信号通路,是两种典型的P53信号通路激活策略,有应用于临床治疗的潜力,且可能协同作用,提高抑癌效果。该方向的探索将在后续的研究中继续进行。综上,本论文为了快速而全面地进行P53通路激活剂筛选,尝试建立了两种不同策略的药物筛选系统:（1）基于P53蛋白靶点的计算机虚拟药物筛选系统;（2）基于P53转录活性的荧光素酶高通量药物筛选系统。随后利用其筛选出潜在的P53通路激活剂,并探索性地交叉利用分子生物学、计算机科学和药学等学科的新兴技术手段,进行药物作用机制研究和药物靶点探索,为基于P53信号通路的药物筛选及开发,奠定了一定基础。
祝振硕[3]（2020）在《OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制》文中认为猪既是一种在我国畜牧业生产中占有极大比重的重要经济动物,同时还是生物医学中常用的理想医学模型。然而猪多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）的建系仍未完全成功,并且对其多能调控机制的了解尚不清楚。因此,深入研究猪多能干细胞的多能调控机制,将为猪多能干细胞的建系提供理论基础。H3K9甲基化修饰是重要的表观抑制标记,在小鼠上的研究表明其是重编程过程中重要的表观障碍。而组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通过羟基化作用去除H3K9me1/2来维持干细胞的自我更新能力。因此,研究两者在猪多能干细胞中的功能机制,将更深入了解H3K9甲基化对多能干细胞的调控方式,并有利于解决当前猪内源多能调控网络激活不完全的问题。在本研究中,我们以实验室已建立的以药物介导的外源基因表达的猪诱导性多能干细胞为实验材料,分析了H3K9甲基化修饰状态转换对其自我更新能力的影响,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2为核心的H3K9去甲基化调控机制。实验结果如下:1.全基因组水平的H3K9的低甲基化状态对于猪i PSCs多能性的维持至关重要。本研究以DOX-i PSCs为研究对象,通过撤去DOX及LIF、b FGF、CHIR99021、SB431542,使i PSCs逐渐丧失多能态。研究发现猪i PSCs在该培养条件下,逐步丧失克隆形态且AP染色呈现阴性。外源多能基因已完全沉默,且内源多能基因OCT4、SOX2、LIN28A、NANOG表达量显着下调。此外,在这一分化进程中细胞整体的H3K9me1/2/3水平显着升高,而H3K4 me1/2/3的整体水平显着下降。这些结果表明H3K9甲基化修饰与猪多能干细胞多能性维持紧密相关。2.饲养层细胞与外源多能基因协同维持i PSCs整体H3K9低甲基化状态。我们进行了一系列的体系筛选,结果表明当撤去饲养层细胞（Feeder free,F-）时,i PSCs整体H3K9甲基化水平升高。进一步分析显示在无饲养层体系下,不添加DOX（Feeder and DOX free,FD-）会使i PSCs的H3K9甲基化水平进一步升高。此外,核心多能基因（OCT4/SOX2）整体蛋白水平也显着下降,同时细胞表达外胚层与中胚层的分化标记。EDU染色试验与Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测表明,细胞增殖能力快速下降且出现凋亡现象。转录组测序分析表明Feeder通过促进SOX家族的基因转录来维持猪i PSCs多能性。以上结果表明Feeder可能通过降低猪i PSCs中多能性相关基因区域的H3K9甲基化修饰,进而激活多能基因的表达,维持多能性。并且由DOX所控制的核心转录因子也可能参与了这一调控过程。3.猪i PSCs多能性丧失过程中,H3K9甲基化阻碍关键多能转录因子与其下游靶基因的互作。对正常培养的与FD-处理下的DOX-i PSCs进行H3K9me2/3的Ch IP-seq分析,结果表明整体H3K9甲基化丰度在FD-处理中显着升高。进一步Motif分析显示在FD-特异的H3K9me2区域富集出OCT4、SOX2、ESRRB等多能转录因子的结合模序,而正常培养条件下特异的甲基化区域富集出c-Jun、ATY13等体细胞特异基因结合模序。进一步将Ch IP数据与转录组测序数据联合分析显示,H3K9甲基化不但参与了分化进程中多能基因的沉默进程,同时在多能态下,也参与了体细胞相关基因的沉默。这些试验结果表明核心多能转录因子激活下游基因进程中,多能性相关基因区域的H3K9去甲基化是必要的。4.组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/KDM3B与核心转录因子OCT4/SOX2形成转录驱动复合物维持干细胞多能态。我们在DOX-i PSCs中进行了KDM3A与KDM3B的干扰试验,结果表明两者在H3K9去甲基化作用上存在功能互补现象,只有同时下调两者表达,猪i PSCs的H3K9me2/me3水平才会显着上升,细胞增殖也受到严重抑制并发生凋亡现象,AP染色呈现阴性。此外,过表达试验显示两者均可以显着降低细胞整体的H3K9甲基化水平,但两者之间存在一些表型差异。过表达KDM3A有效的提升了细胞的增殖与抗凋亡能力并促进了多能相关基因的表达,但过表达KDM3B却轻微抑制了细胞的增殖能力且对多能性无显着影响。为进一步解析多能转录因子与H3K9去甲基化作用的关系,我们首先通过单因子回补试验证明了DOX-i PSCs的维持主要依赖于OCT4与SOX2的足量表达。Ch IP-seq分析显示两者共同作用于基因间区与内含子区域的增强子激活多能性相关基因与通路维持多能态,但OCT4/SOX2并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达。将H3K9me2/3与OCT4/SOX2的Ch IP-seq进行联合分析,发现在FD-处理后大约20%的OCT4/SOX2的结合区域发生了H3K9me2。对KDM3A与KDM3B使用免疫共沉淀联用质谱分析技术（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS）来鉴定并分析两者的关联蛋白。结果表明两者之间存在直接的相互作用,进一步分析发现KDM3A与KDM3B的互作蛋白分别包含有SOX2与OCT4,且富集出大量染色质重塑蛋白,如HMG家族的HMGB2、HMGA1等。这些证据表明OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合物形成一个转录驱动复合物定向激活多能相关基因的表达。综上所述,本研究揭示了以KDM3A和KDM3B为核心的H3K9去甲基化作用在多能性维持中的重要作用,发现了组蛋白去甲基化酶通过形成蛋白复合体的形式来发挥转录激活作用。此外,我们还证明了组蛋白去甲基化的定向作用是通过与多能性转录因子的结合来实现的,这一转录激活机制不仅为猪多能干细胞的建系工作提供了理论基础,而且丰富了人类对于表观遗传激活机制领域的理解。
易雪丽[4]（2020）在《NOC2L过表达在HIV-1 Tat蛋白调控人类疱疹病毒8型复制周期中的作用》文中研究说明目的:明确NOC2L在HIV-1 Tat蛋白调控人类疱疹病毒8型（human herpes virus 8,HHV-8）复制周期中的作用,明确NOC2L是否通过激活P53-P21轴参与HIV-1 Tat蛋白调控HHV-8复制周期,为阐明NOC2L在AIDS相关卡波济肉瘤（Kapsi’s sarcoma,KS）的发生与发展中的作用提供部分依据。方法:（1）首先使用同源重组的方法构建p CDH-GFP-NOC2L重组慢病毒质粒并通过菌落PCR、质粒双酶切及测序对其进行验证,然后使用构建的p CDH-GFP-NOC2L重组慢病毒质粒包装NOC2L重组慢病毒,并用NOC2L重组慢病毒在293T细胞中过表达NOC2L基因进行验证;（2）使用Tat重组慢病毒感染BCBL-1细胞（HHV-8潜伏感染细胞系）,在BCBL-1细胞中表达Tat蛋白后通过RT-q PCR检测NOC2L m RNA表达水平,同时通过RT-q PCR及Western blot分别检测P53和P21的m RNA表达水平及蛋白表达水平;（3）利用NOC2L重组慢病毒过表达BCBL-1细胞中的NOC2L基因后,通过RT-q PCR检测HHV-8 ORF73、ORF50的m RNA表达水平,同时通过RT-q PCR及Western blot分别检测P21和P53的m RNA表达水平及蛋白表达水平。结果:（1）通过同源重组的方法,成功构建了p CDH-GFP-NOC2L慢病毒质粒,菌落PCR及质粒双酶切结果显示在构建的质粒中成功插入NOC2L基因片段,质粒测序结果显示该插入片段与Gen Bank中登记的NOC2L基因100%同源;（2）使用Tat重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,RT-q PCR检测显示能检测到Tat表达,在96 h的时候Tat表达量最高,Western blot能检测到Tat蛋白表达,Tat重组慢病毒感染BCBL-1细胞96 h后,宿主细胞的NOC2L、P53和P21 m RNA表达水平均上调,Western blot检测显示Phospho-p53、P53和P21蛋白表达水平均上调;（3）使用NOC2L重组慢病毒过表达BCBL-1细胞的NOC2L基因后,RT-q PCR检测显示在96 h的时候NOC2L表达量最高,NOC2L过表达后,ORF50、ORF73、P53和P21 m RNA表达水平均上调,Western blot检测显示Phospho-p53、P53和P21蛋白表达水平均上调。结论:（1）在BCBL-1细胞中表达Tat蛋白后,NOC2L m RNA表达水平上调,P53和P21 m RNA表达水平和蛋白表达水平均上调,证实了NOC2L、P53和P21参与了Tat调控HHV-8裂解复制周期;（2）NOC2L过表达后ORF50和ORF73上调,证实了NOC2L可以直接激活HHV-8裂解复制;P53和P21在NOC2L过表达后均表现为上调,表明NOC2L可能通过激活P53-P21轴参与调控HHV-8复制周期。
宁贻崇[5]（2020）在《p53相互作用蛋白CCDC106和ZCCHC10在癌症中的作用及分子机制》文中认为研究背景:p53功能障碍是导致肿瘤发生的重要原因。p53基因突变是p53功能失活的主要方式,在所有癌症病例中约有一半发生p53基因突变。在没有发生p53基因突变的肿瘤细胞中,p53正调控因子的表达下调或/和负调控因子的过度激活也可以导致野生型p53功能失活。本研究室前期发现CCDC106可以促进p53蛋白的降解,而ZCCHC10可以抑制p53蛋白的降解。本论文进一步对CCDC106和ZCCHC10在癌症组织中的表达及其对癌症发生发展的作用进行研究。研究方法:利用荧光定量PCR方法和Western blot实验分别检测基因的mRNA和蛋白质表达量。采用慢病毒系统构建基因过表达和干扰的稳定细胞株。采用免疫共沉淀法和GST-pull down检测蛋白相互作用。核质分离和免疫荧光染色检测蛋白亚细胞定位。磷酸化抗体检测蛋白质的磷酸化。MTT法测定细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,平板集落形成实验检测细胞增殖能力,伤口愈合实验检测细胞迁移能力,TransWell侵袭实验检测细胞侵袭能力。采用皮下移植瘤小鼠模型研究CCDC106或ZCCHC10对体内肿瘤生长的影响。采用尾静脉注射小鼠模型研究ZCCHC10对肿瘤转移的影响。研究结果:一、CCDC106在乳腺癌和宫颈癌中的作用及分子机制1、在含有野生型p53（wtp53）宫颈癌HeLa细胞和乳腺癌MCF7细胞中干扰CCDC106可以增强p53蛋白的稳定,促进细胞凋亡,抑制细胞存活、集落形成、迁移和侵袭。2、在含有wtp53的正常乳腺上皮HBL100和宫颈癌SiHa细胞中过表达CCDC106则促进p53蛋白的降解,抑制细胞凋亡,促进细胞存活、集落形成、迁移和侵袭。3、CCDC106对p53突变的宫颈癌和乳腺癌细胞（C33A和MDA-MB-231）的细胞存活、集落形成、迁移和侵袭没有显着影响。4、本研究室以前通过体外磷酸化实验发现CCDC106的Ser-130和Ser-147位点是蛋白激酶CK2的磷酸化位点。本文进一步证实在细胞中CK2确实可以在Ser-130和Ser-147这两个位点磷酸化CCDC106。将CCDC106的Ser-130突变为Ala,则CCDC106不能与p53蛋白相互作用;而Ser-147突变为Ala,则CCDC106不能定位于细胞核中,说明Ser-130和Ser-147位点磷酸化分别是CCDC106与p53相互作用和核定位磷酸化所必需的。5、将CCDC106的Ser-130和Ser-147都突变为Ala,或用CK2抑制剂CX-4945处理细胞,可以抑制CCDC106的磷酸化和促癌能力。6、在异种移植小鼠模型中,野生型CCDC106可以促进p53的降解和肿瘤生长,而突变型CCDC106则没有作用。7、在含有wtp53的癌细胞系中干扰CCDC106基因的表达,可以增加细胞对CX-4945的敏感性。二、ZCCHC10在肺癌中的作用及其分子机制1、通过对54对肺癌组织和癌旁组织中的ZCCHC10的表达分析,发现在肺腺癌组织中的ZCCHC10的表达水平低于相应的癌旁非癌组织。对癌症公共数据库的分析发现,癌组织中ZCCHC10的mRNA表达水平与患者生存率正相关。2、在含有wtp53的肺癌细胞中过表达ZCCHC10,显着抑制细胞的增殖、集落形成、迁移、侵袭和顺铂耐药,而在含有wtp53的正常肺细胞系Beas-2b中干扰ZCCCHC10则促进细胞的增殖、集落形成、迁移、侵袭和顺铂耐药。3、ZCCHC10对p53缺失的细胞（H358）或p53突变的细胞（H1437）的集落形成、增殖、迁移和侵袭没有影响。4、裸鼠皮下成瘤实验结果表明ZCCHC10过表达抑制肿瘤的生长,而裸鼠肿瘤转移模型实验结果表明ZCCHC10过表达抑制肿瘤的转移。5、免疫共沉淀证明野生型ZCCHC10蛋白能和p53蛋白相互作用,而突变其CCHC结构域,则不能与p53相互作用,说明ZCCHC10通过其CCHC结构域与p53发生作用。6、ZCCHC10抑制p53和MDM2之间的相互作用和MDM2介导的p53蛋白泛素化,从而增强p53蛋白的稳定性。7、p53抑制剂pifithrin-α减轻ZCCHC10过表达时对p53通路、细胞周期、细胞凋亡和上皮间质转换的影响,而p53激活剂Nutlin3可以反转ZCCHC10干扰引起的影响,说明ZCCHC10通过p53发挥作用。结论:1、在乳腺癌和宫颈癌中,CCDC106通过促进p53蛋白的泛素化和降解,发挥促癌作用。2、蛋白激酶CK2可以在Ser-130和Ser-147这两个位点磷酸化CCDC106,Ser-130和Ser-147位点的磷酸化分别是CCDC106与p53相互作用和核定位所必需的。3、在肺癌中,ZCCHC10通过抑制MDM2对p53蛋白的泛素化,增强p53蛋白的稳定性,从而抑制肺癌的进展和顺铂耐药性。
于淑惠[6]（2020）在《顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究》文中研究说明蛋白质主骨架链中,由于肽键-CO-NH-被认为具有部分刚性的性质,不能自由旋转,迫使以肽键为旋转轴的二面角（ω）只能在0°或者180°的附近转动。ω为0°时被称为顺式肽键,而当ω为180°时称为反式肽键。反式肽键的构象相对稳定,而顺式肽键的构象相对不稳定,因而一般情况下蛋白质主骨架上肽键都呈反式构象,而顺式肽键发生频率较低。任意两个氨基酸形成的肽键的反式肽键与顺式肽键之间的转换（肽键顺反异构）有着确定的顺式肽键发生频率（ICPB）,蛋白质构象和功能与ICPB值相关。氨基酸替换突变会导致蛋白质分子局部位点的ICPB值改变,从而导致生物体内相应的蛋白质构象与功能改变。因此,探讨蛋白质主链骨架上不同肽键ICPB发生与分布的规律,对揭示蛋白质结构与功能之间的关系具有重要的意义。通常情况下ICPB值不大,而肽键异构化又是一个动态变化过程,用X-射线衍射晶体技术、核磁共振、扫描三维电镜等传统方法很难捕捉到顺式肽键的构象。因此,本论文首先从理论上推导出了蛋白质主骨架上肽键扭转角（ω）与相邻α碳原子之间距离（d）的函数关系。利用PDB数据库建立非冗余数据集,从中提取其顺式肽键数据,统计出不同肽键的ICPB值并总结出不同氨基酸残基ICPB的规律。然后,利用分子模拟的方法创建了20种二肽的分子结构模型,动力学模拟了肽键的顺反异构过程中的自由能的变化,分析了其与各自的ICPB之间的变化规律。最后,以β-catenin作为模式蛋白,通过点突变方法构建不同ICPB值的β-catenin（Xaa246-P247）表达载体,并将这些载体导入到Pin1表达阳性的肝癌细胞株（hep G2）中,观测不同β-catenin（Xaa246-P247）分子与APC、E-cadherin之间的相互作用,以及不同β-catenin（Xaa246-P247）分子在hep G2中的亚定位水平,探讨β-catenin（Xaa246-P247）位点ICPB值与β-catenin亚细胞定位之间的效应关系。获得的主要研究结果如下:（1）在我们的数据集中,顺式肽键占肽键总数的0.33%,顺式肽键多出现在与脯氨酸（proline,P）相关联的肽键上,其中Xaa-P顺式肽键占总顺式肽键数的73%;不同Xaa种类对Xaa-P顺式肽键发生率的影响不同,当Xaa为酪氨酸（Y）、色氨酸（W）等芳香族氨基酸时,Xaa-P具有相对较高的ICPB值。当Xaa为亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）等残基时,ICPB值相对较低;除了很少一部分的顺式肽键分布在脯氨酸-色氨酸、色氨酸-丙氨酸、半胱氨酸-半胱氨酸、甘氨酸-甘氨酸的残基片段上之外,顺式肽键在一般情况下很少出现在与脯氨酸无关的肽键（Xaa-Xn P）上;从顺式肽键发生的部位来看,一般发生在蛋白质二级结构的柔性区域中,即α-螺旋C端,β-折叠的N端和无规则卷曲。（2）20种肽键基本都在反式情况下取得最小自由能,处于稳定状态,二面角在区间[-180°,-170°]或者[170°,180°]。自由能的最小值大多数分布在区间[0,17]kcal/mol。顺式肽键的自由能最小值的二面角大多分布在区间[10°,25°],对应的自由能值[1,49]kcal/mol。总体顺式肽键的自由能值大于反式肽键的自由能值。20种肽键的能量峰值多出现在二面角为[-110°,-60°]区间和[80°,110°]区间,对应的自由能值多分布在区间[25,55]kcal/mol和[20,40]kcal/mol。特别的是,E-P,P-P,N-P,Q-P的自由能差距比较大。从分子模拟的结果来看,肽键的ICPB值与其顺反异构构型能差和能垒都有关,是氨基酸残基结构,带电性,极性等共同作用的结果。ICPB值就反映了这些因素共同作用的结果。（3）我们实验结果表明β-catenin分子上Xaa246-P247的ICPB值改变是改变β-catenin/APC、β-catenin/E-cadherin之间相互作用的原因,并最终影响β-catenin分子在hep G2中的亚细胞定位。在hep G2细胞（真核细胞）中,β-catenin分子上Xaa246-P247位点的ICPB值与β-catenin的亚细胞定位之间,存在着一定的效应关系。本研究结果对揭示蛋白质肽键顺反异构规律及其对生命活动的调节具有重要的意义。此外,由于蛋白质的折叠与去折叠过程也与肽键顺反异构有关,因而利用ICPB规律还可以预测蛋白质结构,指导新功能蛋白质合成及多肽类新药的设计。
卜会铜[7]（2020）在《TAT-FOXM1-C（688-748）重组蛋白纯化及其抗肿瘤活性研究》文中认为FOXM1（Forkhead box M1）是FOX转录因子家族中的一员,它有3种常见的亚型,分别是FOXM1a、FOXM1b、FOXM1c,目前研究最多的是FOXMb。FOXM1可以介导细胞周期相关下游基因的转录激活,在胚胎的发育、细胞分化、组织器官再生和恶性肿瘤的发展进程中行使着巨大的功能。据大量文献报道,FOXM1是人恶性肿瘤中最常见的高表达蛋白之一,与肿瘤的形成、不良预后、药物的敏感性及耐药性等密切相关。异常高表达的FOXM1促使下游基因的转录激活,会导致增殖异常、转移、迁移和侵袭等不良后果,影响肿瘤的形成进程。将FOXM1作为抗癌药物的作用靶标进行的开发及研究存在广阔的前景,是临床治疗的潜在策略。FOXM1作为诊断和治疗癌症的一种重要标志物也是各国科研人员的热门研究分子。细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides,CPPs）是一种富含碱性氨基酸的短肽,能够穿过天然的细胞膜屏障,进入细胞质甚至细胞核,并且不会破坏细胞的完整结构。细胞穿膜肽具有强大的运载功能,可以通过化学结合、基因融合等共价或非共价结合方式与多种大分子物质（如蛋白质、多肽、DNA、化学小分子药物、纳米颗粒、荧光素、腺病毒载体、脂质体及铁颗粒等）结合,甚至可以负载100KD以上的蛋白,并且对所穿膜的细胞没有损伤。其中研究最多的是来源于人类免疫缺陷病毒HIV的反式转录活化因子（Trans-activating transcriptional activator,TAT）,其47-57位氨基酸对跨膜转运起着至关重要的作用,它是一种天然来源的穿膜肽,生物相容性良好,可以在生物体内呈现出极佳的穿膜效率,具有良好的应用前景,已广泛运用于抗肿瘤药物开发中。本论文中,通过在hela细胞中共转FOXM1及其不同蛋白分段质粒,采用双荧光素酶报告基因实验筛选出对FOXM1转录活性具有抑制作用的分段:FOXM1688-748。为了确定其是否具有抗肿瘤作用,通过构建融合细胞穿膜肽TAT的p GEX-4T2-FOXM1688-748-TAT原核表达载体,使用原核表达系统和GST标签亲和纯化方法,制备得到带有GST标签并融合细胞穿膜肽TAT的重组蛋白。由于在GST标签和目的蛋白之间含有特异性的凝血酶识别位点,通过凝血酶酶切进一步得到无GST标签仅包含目的蛋白融合细胞穿膜肽TAT的重组蛋白:TAT-FOXM1688-748。直接运用重组蛋白TAT-FOXM1688-748处理不同种类的肿瘤细胞,发现其可以有效抑制细胞活力,同时对FOXM1的转录活性也具备抑制作用。这初步表明TAT-FOXM1688-748具有一定的抗肿瘤活性,有望成为治疗肿瘤的潜在药物。
张梦筱[8]（2020）在《ATF3和CK2α过表达促进CHO细胞重组蛋白表达的作用及机制研究》文中研究指明背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是重组蛋白、单克隆抗体等生物大分子药物生产的主要宿主细胞之一,尤其适合需要复杂翻译后修饰的分子类型,例如需糖基化的细胞因子、各类全长单克隆抗体等。然而,与大肠杆菌、酵母等表达系统相比,以CHO细胞为代表的哺乳动物细胞表达系统的培养成本较高,导致产品价格昂贵、病人难以负担。因此,提高CHO工程细胞株的生长性能及外源蛋白表达能力,对降低药物成本、进而提高市场可及性具有重要意义。以往研究证实,培养基和培养条件优化、筛选外源基因整合位点等方式能够有效提高CHO的生长及表达水平,而近年来,随着高通量测序、高效基因编辑等新兴技术等的涌现,使得功能基因筛选及CHO细胞的精确基因编辑成为可能。本实验室前期进行了CHO细胞的DNA甲基转移酶3A（DNMT3a）敲除,在此基础上通过RNA-seq发现转录激活因子3（ATF3）基因受DNMT3a敲除的影响出现转录水平上调,可能与CHO细胞的生长、代谢及表达水平的变化相关。另一方面,本实验室采用规律成簇的间隔短回文重复/规律成簇的间隔短回文重复结合蛋白9（CRISPR/Cas9）建立了CHO细胞的基因敲除及外源基因整合技术,并筛选到C12orf35、HPRT等稳定性较好的外源基因整合位点,可用于基因定点整合的稳定细胞株建立。本研究中,我们结合前期研究及文献检索,选取具有细胞生长代谢调节功能的ATF3及酪蛋白激酶Ⅱ的α亚基（CK2α）两个基因,深入研究其过表达对CHO细胞的作用。方法:为了探究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞增殖和外源蛋白表达的作用,首先我们构建了瞬时表达ATF3和CK2α的质粒,并将这两种质粒各自转染到红色荧光蛋白（mCherry）稳定表达的CHO细胞株KCSG6中,通过转染后1～5天细胞计数、培养结束时m Cherry蛋白的表达水平检测,来初步评价ATF3和CK2α基因过表达对CHO细胞生长及蛋白表达的影响。为了更严谨地研究ATF3和CK2α两个基因的功能,我们采用CRISPR/Cas9介导的稳定细胞株构建技术,选取HPRT作为整合位点,选取向导RNA（sgRNA）序列,并设计和构建定点整合的Donor质粒ATF3-Donor、CK2α-Donor和ATF3+CK2α-Donor。在KCSG6细胞株上通过电转染、加压筛选以及5’/3’junction PCR的鉴定,获得相应的稳转细胞池,并通过有限稀释法铺板,对得到的单克隆细胞进行5’/3’junction PCR和OUT-OUT PCR的鉴定和测序等鉴定,挑选KCSG6细胞株背景下的ATF3、CK2α以及ATF3+CK2α过表达的细胞株。通过对所筛选到的稳定细胞株进行插入基因表达验证、生长特性以及模式蛋白表达水平检测,并进一步探究插入基因对CHO细胞凋亡和相关信号通路的影响,系统地研究ATF3和CK2α两个基因对CHO细胞的作用和机制。结果:通过瞬时转染ATF3和CK2α质粒进入KCSG6细胞,我们发现ATF3和CK2α对细胞增殖及蛋白表达均具有促进趋势。经过CRISPR/Cas9基因编辑技术将ATF3基因、CK2α基因以及ATF3+CK2α基因成功插入KCSG6细胞株的HPRT位点,最终成功得到3株稳转细胞株:ATF3-8、CK2α-3、AC-2。通过对这三株细胞进行相关性质的探究,证明目的基因定点整合到HPRT位点,并得到成功表达,且ATF3和CK2α对CHO细胞增殖具有促进作用,CK2α对mCherry总蛋白的产量具有促进作用。通过对比这3株细胞株与对照细胞株的细胞凋亡,我们发现AC-2细胞株的ATF3+CK2α过表达具有抑制细胞凋亡的作用,而单独的ATF3或CK2α基因无明显作用;通过对这3株细胞株的信号通路进行初步探究,发现相对于空白细胞,这3株细胞的ERK信号通路水平上调。其中,对DNMT3a敲除的CHO细胞进一步研究发现,ATF3基因的启动子区胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）甲基化水平受DNMT3a调控,这对理解ATF3的调控机制具有一定的启示。综上,本研究证实ATF3基因以及CK2α基因过表达对CHO细胞增殖具有促进作用且CK2α对于细胞总蛋白表达具有促进作用,提示该细胞改造策略具有重要意义。本研究中我们还获得了ATF3及CK2α基因过表达的CHO稳定细胞株,可结合细胞培养工艺优化等进行更深入的研究,不断提高CHO细胞培养和蛋白生产水平。
徐宇嘉[9]（2020）在《Otub1/c-Maf通路抑制剂的发现及其抗多发性骨髓瘤的作用研究》文中认为癌性转录因子c-Maf是非常理想的多发性骨髓瘤（MM）治疗靶点,但尚无有效的靶向策略。我们前期的质谱研究结果发现,卵巢肿瘤家族去泛素化酶Otub1可以与c-Maf结合,进一步研究发现Otub1可以抑制c-Maf K48类型的泛素化进而阻止c-Maf降解,促进其转录活性。因此,靶向Otub1/c-Maf轴可能是靶向c-Maf的有效方法。但Otub1在MM进展中的功能尚不明确,本课题中我们首先分析了 Otub1在MM细胞及动物水平的作用,发现Otub1促进MM细胞存活及MM肿瘤生长。相反,敲低Otub1导致c-Maf蛋白降解及MM细胞凋亡。因此,Otub1/c-Maf轴可作为MM的药物筛选靶点。为了进一步探索这一设想,我们构建了基于c-Maf转录活性的Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统筛选了 FDA批准上市的药物库和天然化合物库,寻找到了三种潜在抑制剂:强心苷类化合物毛花苷C（LanC）、南昌霉素（Nam）、乙酰缬草素（AVT）。本课题中,我们发现这三种化合物可以抑制Otub1对c-Maf的去泛素化作用,诱导c-Maf蛋白降解。进而抑制c-Maf转录,诱导MM细胞凋亡,抑制MM模型中小鼠肿瘤生长且没有毒性作用。此外,我们还发现Nam可以抑制Otub1对MDM2的去泛素化作用,下调MDM2蛋白水平,抑制MDM2非p53依赖型癌基因功能,诱导恶性血液肿瘤细胞凋亡并抑制恶性血液肿瘤小鼠中肿瘤生长。总之,本研究证明了 Otub1在MM中的癌基因功能,并证明靶向Otub1/c-Maf是治疗MM的潜在靶点。目的:初步探究Otub1在MM细胞及动物水平中的功能,并基于Otub1对c-Maf转录活性的促进作用构建Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统,从FDA批准的药物和天然化合物中筛选Otub1的潜在抑制剂。进一步验证筛选结果后探究这些潜在抑制剂抗MM的作用及机制,为靶向Otub1/c-Maf通路治疗MM提供药理学依据。方法:（1）收集MM患者及正常捐献者骨髓标本,RT-PCR分析Otub1表达水平并查阅相关数据库分析Otub1在MM进展阶段中的表达;同时,在MM细胞株中过表达和敲低Otub1,分析Otub1对MM细胞增殖、凋亡的影响,并在MM播散动物模型中验证这一结论。此外,查阅PROGgene数据库,分析Otub1对MM患者预后的影响。（2）构建稳定表达c-Maf、Otub1和MARE.Luci质粒的HEK293T细胞株,经FDA批准上市药物和天然化合物处理后,荧光素酶实验筛选抑制c-Maf转录活性的化合物。此后,挑选显着下调c-Maf转录活性的化合物处理MM细胞株,WB检测候选化合物对c-Maf蛋白水平的影响及抗MM活性。经文献查阅及分析选择下调c-Maf蛋白水平,诱导MM细胞凋亡且无毒的化合物进一步研究。最后,经MTT、RT-PCR、WB技术验证候选化合物抑制MM细胞增殖、抑制c-Maf转录作用,并寻找候选化合物合适的药物使用浓度。（3）采用WB、MTT、RT-PCR、流式细胞术检测LanC、Nam、AVT对多种MM细胞株增殖、凋亡影响是否有选择性,同时分析这三种化合物对c-Maf蛋白和mRNA水平的影响,并进行IP实验检测c-Maf泛素化水平,判断这三种潜在抑制剂是否影响c-Maf的泛素化修饰。此外,分别敲低和过表达Otub1后,WB、IP、荧光素酶实验检测LanC、Nam、AVT对MM细胞凋亡、c-Maf泛素化水平及转录活性的影响,以判别Otub1在这些化合物发挥抗肿瘤功能过程中的作用。（4）在体内实验中,构建恶性血液病皮下移植瘤模型和MM播散模型,经LanC、Nam和AVT治疗后,分析肿瘤生长速率、荷瘤小鼠生存期及肿瘤组织中c-Maf、Otub1等相关蛋白水平的变化以及小鼠体重、生化指标等评价药物毒性。此外,克隆形成实验分析LanC、Nam和AVT对MM患者骨髓细胞克隆形成的影响。结果:（1）RT-PCR分析发现MM患者骨髓细胞中Otub1 mRNA表达水平显着高于正常捐献者,数据库检索结果也发现Otub1的表达水平在MGUS、MM中表达水平高于正常捐献者。此外,过表达Otub1促进MM细胞增殖,相反的,敲低Otub1下调c-Maf蛋白水平,诱导MM细胞凋亡。并且过表达Otub1可缩短MM细胞株RPMI-8226小鼠生存期,与此一致的是,高表达Otub1的MM患者生存期要低于低表达Otub1的患者。（2）我们基于c-Maf转录活性筛选出三种候选化合物LanC、Nam和AVT。WB、MTT、RT-PCR和荧光素酶实验发现这三种化合物可下调c-Maf蛋白水平,抑制c-Maf转录,诱导MM细胞凋亡,降低MM细胞活力,呈现出较好的抗MM活性。（3）MTT和流式细胞术检测发现LanC和AVT可诱导高表达c-Maf的MM细胞凋亡,降低其细胞活力,但对低表达c-Maf的MM细胞株无此作用。WB、IP检测发现LanC和AVT可促进c-Maf K48类型的泛素化,降低c-Maf蛋白水平,减少c-Maf与Otub1结合,并且Otub1缺失时,LanC和AVT作用减弱,同样的,过表达c-Maf可拮抗LanC和AVT的作用。而Nam对几乎所有MM细胞株和多种类型白血病细胞株表现出极好的抗肿瘤活性,除了可下调c-Maf蛋白水平外,还促进MDM2泛素化,诱导MDM2蛋白降解,并且此过程须Otub1的参与。（4）体内动物实验及集落形成实验证实了 LanC和AVT可抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,并且抑制MM骨髓细胞集落形成。Nam可抑制白血病和骨髓瘤模型中肿瘤生长并且可抑制MM和白血病细胞集落形成。结论:Otub1可通过稳定c-Maf促进MM进展,基于此构建的Otub1/c-Maf通路抑制剂筛选系统发现了三种潜在抑制剂LanC、Nam和AVT。这三种化合物均能促进c-Maf降解,抑制c-Maf转录活性,诱导MM细胞凋亡。其中LanC和AVT可抑制Otub1与c-Maf结合,引起高表达c-Maf的MM细胞株凋亡,并抑制皮下肿瘤生长。Nam不仅可抑制c-Maf/Otub1通路,还可通过抑制Otub/MDM2,促进MDM2泛素化,调节其下游Rb/E2F通路和p21蛋白水平,诱导恶性血液肿瘤细胞凋亡,且该作用不依赖于p53的功能。
李姝[10]（2020）在《新型小分子化合物NL101对B细胞淋巴瘤的抑制作用及其机制研究》文中提出研究背景非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常见的成人血液肿瘤,在过去的三十年中,发病率持续上升。在所有非霍奇金淋巴瘤病例中,大约85%NHL都起源于B淋巴细胞。尽管利妥昔单抗联合化疗改善了B细胞淋巴瘤（B-NHL）的总体疗效和预后,但仍有部分病例原发耐药或者复发难治,此外药物副反应也是限制化疗效果的因素之一。因此,开发新的高效低毒药物治疗B细胞淋巴瘤很有必要。NL101是兼具苯达莫司汀和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）结构特征的新型小分子化合物,前期研究提示NL101具有较高的抗肿瘤活性,毒副作用轻,本研究将明确NL101对B细胞淋巴瘤的抑制作用,初步阐明其作用机制,为其在淋巴瘤的临床试验提供实验依据。研究方法为了明确NL101对B-NHL的增殖抑制作用,我们采用MTT法检测NL101对BNHL细胞系和原代细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞周期和凋亡,WB或q-PCR检测DNA损伤通路和B-NHL关键生存因子的表达。建立NOD-SCID小鼠淋巴瘤移植模型,观察NL101对体内抗瘤作用并随访小鼠的生存。为了探讨NL101的作用机制,RNA-seq检测NL101导致的基因表达谱改变,筛选出差异表达基因;通过慢病毒转染,改变细胞内基因的表达量;借助荧光素酶表达系统,鉴定微小RNA（miRNA）的靶基因以及转录因子在miRNA启动子上的结合区域。研究结果（1）NL101在体内外均显着抑制B-NHL。在体外,NL101显着抑制B-NHL细胞系及原代样本的增殖,48小时IC50多小于5μM;将B-NHL细胞周期阻滞在G0/G1期并诱导细胞凋亡;DNA损伤及凋亡通路激活,相关蛋白表达水平改变。在体内,NL101处理组小鼠的肿瘤体积较小,重量较轻,生存时间更长;肿瘤组织疏松,Ki-67表达量下降,cleaved caspase3上调。（2）miR-21为介导NL101作用的重要基因。RNA测序提示miR-21为N101使用后,0CI-LY10细胞中下调最显着的基因;q PCR证实NL101下调miR-21表达存在于其他B-NHL细胞;B-NHL细胞系存在普遍miR-21高表达;miR-21高表达引起细胞对NL101的反应性下降。（3）miR-21调控Mxd1/c-Myc。miR-21通过直接结合Mxd1 3’-UTR的nt440-461和nt1164-1184（主要）,负向调控Mxd1的表达;Mxd1通过MYC/MAX/MAD网络负向调控c-Myc的表达;c-Myc通过直接结合miR-21启动子-751bp处的结合单元调节miR-21的表达。研究结论新型小分子化合物NL101体内外显着抑制B-NHL生长。通过抑制miR-21下调cMyc并上调Mxd1,是NL101的作用机制之一,而c-Myc/miR-21/Mxd1环路是新的BNHL增殖调控机制。
二、利用Tet-OnTM基因表达系统直接克隆 p53下游基因(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用Tet-OnTM基因表达系统直接克隆 p53下游基因(英文)（论文提纲范文）
（1）岷江百合几丁质酶基因LrCHI2响应尖孢镰刀菌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 百合 |
| 1.1.1 百合根腐病 |
| 1.1.2 岷江百合 |
| 1.2 病程相关蛋白 |
| 1.2.1 病程相关蛋白的分类 |
| 1.2.2 病程相关蛋白响应病原菌的侵染 |
| 1.2.3 病程相关蛋白抗真菌活性与机制 |
| 1.3 WRKY转录因子 |
| 1.3.1 WRKY转录因子的结构域及识别特点 |
| 1.3.2 WRKY转录因子对PRs的调控 |
| 1.4 岷江百合对尖孢镰刀菌抗性的基础研究 |
| 1.5 本课题的研究意义及目的 |
| 第二章 病程相关蛋白基因LrCHI2的克隆及功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 植物及真菌材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 缓冲液及培养基的配置 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 病原真菌的活化 |
| 2.3.2 植物材料的处理及接种 |
| 2.3.3 全长cDNA的克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.4 qRT-PCR |
| 2.3.5 LrCHI2的亚细胞定位 |
| 2.3.6 LrCHI2的原核表达、重组蛋白的抑菌活性分析 |
| 2.3.7 LrCHI2转基因烟草的获得及分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 LrCHI2基因的序列分析 |
| 2.4.2 LrCHI2的聚类分析和多重序列比对 |
| 2.4.3 LrCHI2基因的表达谱分析 |
| 2.4.4 LrCHI2定位于细胞壁 |
| 2.4.5 LrCHI2原核重组蛋白的诱导纯化及活性分析 |
| 2.4.6 LrCHI2转基因烟草的产生、筛选及分析 |
| 2.4.7 LrCHI2过表达转基因烟草对尖孢镰刀菌的抗性明显增强 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 岷江百合WRKY转录因子对LrCHI2的转录调控作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.2.1 植物及真菌材料 |
| 3.2.2 菌株与载体 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 缓冲液及培养基的配置 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 LrCHI2启动子的克隆与顺式作用元件分析 |
| 3.3.2 EMSA验证LrWRKY2的专一性结合位点 |
| 3.3.3 LrWRKY2的转录激活特性分析 |
| 3.3.4 LrCHI2启动子转基因烟草的获得及分析 |
| 3.3.5 LrWRKY2与pLrCHI2共表达转基因烟草的获得及分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 LrCHI2启动子的克隆及序列分析 |
| 3.4.2 含有W-box的LrCHI2启动子片段能够在体外与LrWRKY2结合 |
| 3.4.3 LrWRKY2对LrCHI2启动子具有反式激活作用 |
| 3.4.4 LrCHI2启动子转基因烟草的产生及筛选 |
| 3.4.5 LrCHI2启动子转基因烟草的GUS活性荧光检测 |
| 3.4.6 LrWRKY2与pLrCHI2共表达转基因烟草的产生及筛选 |
| 3.4.7 LrWRKY2与pLrCHI2共表达转基因烟草的GUS活性荧光检测 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 载体图谱 |
| 附录B 攻读硕士学位期间发表论文 |
（2）P53通路激活剂的筛选及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 P53的功能 |
| 1.2 P53蛋白的结构 |
| 1.3 环境刺激对P53通路的调控 |
| 1.4 P53的调控因子 |
| 1.5 P53与肿瘤 |
| 1.6 P53与肿瘤治疗 |
| 1.7 针对P53的药物研发策略:现状与思考 |
| 第二章 基于P53蛋白靶点的激活剂筛选及作用机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 计算机虚拟药物筛选 |
| 2.2.2 细胞活性及分子生物学检测 |
| 2.3 结果与结论 |
| 2.3.1 基于P53新型成药性构象的高通量虚拟筛选 |
| 2.3.2 P53 激活剂——窃衣素(Torilin)的发现 |
| 2.3.3 窃衣素激活P53通路 |
| 2.3.4 窃衣素激活P53所依赖的重要官能团 |
| 2.3.5 窃衣素的构效关系研究 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 P53通路激活剂的高通量筛选及作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与结论 |
| 3.3.1 P53通路的激活剂——UNBS5162的发现 |
| 3.3.2 UNBS5162激活P53通路 |
| 3.3.3 UNBS5162特异性抑制P53野生型肿瘤的生长 |
| 3.3.4 UNBS5162激活P53通路的作用机制探索 |
| 3.3.5 UNBS5162的作用靶点探索 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 第四章 研究意义与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 多能干细胞研究进展 |
| 1.1 多能干细胞的建立及分类 |
| 1.1.1 多能干细胞的概述 |
| 1.1.2 胚胎干细胞研究进展 |
| 1.1.3 细胞重编程的研究进展 |
| 1.1.3.1 诱导性多能干细胞的建立 |
| 1.1.3.2 猪诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.2 多能干细胞的维持机制研究 |
| 1.2.1 多能性核心转录因子的研究进展 |
| 1.2.1.1核心转录因子Oct4 |
| 1.2.1.2核心转录因子Sox2 |
| 1.2.2 多能性调控通路 |
| 1.2.2.1 细胞因子维持多能性 |
| 1.2.2.2 小分子抑制剂维持多能性 |
| 1.2.2.2.1 Wnt信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.2 MAPK/Erk信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.3 TGFβ/SMAD信号通路抑制剂SB431542 |
| 1.2.2.3 MEF饲养层细胞 |
| 第二章 H3K9甲基化修饰的研究进展 |
| 2.1 细胞重编程过程中的表观遗传调控 |
| 2.1.1 表观遗传学 |
| 2.1.2 DNA甲基化修饰 |
| 2.1.2 组蛋白共价修饰 |
| 2.1.3.1 组蛋白乙酰化修饰 |
| 2.1.3.2 组蛋白甲基化修饰 |
| 2.2 H3K9甲基化及功能 |
| 2.3 多能态建立过程中H3K9甲基化的作用 |
| 2.3 组蛋白去甲基化酶的研究进展 |
| 2.4 组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的研究进展 |
| 2.5 多能态建立过程中组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的作用 |
| 2.6 小结与展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪iPSCs多能态转换过程中H3K9 甲基化的变化规律 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 撤去DOX及多能培养体系对猪DOX-i PSCs的影响 |
| 3.2.2 piPSCs多能性丧失过程中H3K9与H3K4 甲基化修饰水平的变化 |
| 3.2.3 筛选影响H3K9甲基化的主要因素 |
| 3.2.4 F-与FD-处理下pi PSCs表型检测 |
| 3.2.5 F-与FD-处理下pi PSCs多能基因检测 |
| 3.2.6 F-与FD-处理下pi PSCs组蛋白甲基化修饰水平的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Feeder与外源基因协同维持猪i PSCs多能性机制解析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 转录组测序揭示F-与FD-组的基因表达变化 |
| 4.2.2 功能富集分析揭示整个分化过程中转录变化 |
| 4.2.3 H3K9me2/me3 在基因组上的分布情况 |
| 4.2.4 Ch IP-seq分析分化过程中H3K9me2和H3K9me3 的变化情况 |
| 4.2.5 多能性丧失过程中H3K9 甲基化motif变化分析。 |
| 4.2.6 H3K9甲基化与转录组联合分析揭示其作用机理 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 KDM3A与 KDMB协同调节H3K9 甲基化修饰维持猪多能性调控网络 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料与耗材 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 KDM3A与 KDM3B共干扰导致猪i PSCs丧失多能性 |
| 5.2.2 猪i PSCs中共干扰KDM3A与 KDM3B后的转录组变化 |
| 5.2.2 干扰KDM3A与 KDM3B抑制PI3K-AKT信号通路影响多能性 |
| 5.2.4 KDM3A与 KDM3B过表达对猪i PSCs多能性的影响 |
| 5.2.5 转录组测序揭示KDM3A与 KDM3B过表达的分子作用机制 |
| 5.2.6 KDM3A过表达可抑制F-处理下引发的细胞分化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转录因子OCT4与SOX2 是维持猪i PSCs多能性调控网络的核心 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料与耗材 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同DOX浓度下猪i PSCs的表型变化 |
| 6.2.2 筛选维持猪iPSCs多能性的关键转录因子 |
| 6.2.3 无DOX下过表达OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性 |
| 6.2.4 Ch IP-seq揭示OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性机理 |
| 6.2.5 转录因子之间调控网络建立 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 OCT4/SOX2 与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B互作维持猪i PSCs多能性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 试验材料与耗材 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 OCT4与SOX2 并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达 |
| 7.2.2 H3K9去甲基化作用与核心转录因子之间的协同关系 |
| 7.2.3 转录调控水平揭示KDM3A与 OCT4/SOX2 之间的协作关系 |
| 7.2.4 IP-MS揭示KDM3A与 KDM3B的蛋白互作网络 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点及下一步研究方向 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）NOC2L过表达在HIV-1 Tat蛋白调控人类疱疹病毒8型复制周期中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 NOC2L基因重组慢病毒的构建 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 NOC2L在HIV-1 Tat蛋白调控HHV-8复制周期中的作用 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 NOC2L的表达对HHV-8复制周期的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 HHV-8 复制周期调控与卡波氏肉瘤发病机制的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（5）p53相互作用蛋白CCDC106和ZCCHC10在癌症中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 p53作为转录因子发挥抑癌功能 |
| 1.1.1 p53蛋白的结构 |
| 1.1.2 p53调控细胞周期和凋亡 |
| 1.1.3 p53抑制肿瘤细胞侵袭和转移 |
| 1.2 p53基因突变是癌症中最常见的突变 |
| 1.2.1 p53突变的热点和频率 |
| 1.2.2 突变对p53功能的影响 |
| 1.3 MDM2介导p53泛素化是野生型p53失活的主要因素 |
| 1.3.1 p53蛋白质的泛素化主要被MDM2调控 |
| 1.3.2 调控p53泛素化降解的其它E3连接酶 |
| 1.3.3 调控p53去泛素化的相关途径 |
| 1.3.4 和p53泛素化降解有关的蛋白 |
| 1.4 本论文的研究思路和研究意义 |
| 第二章 CCDC106在乳腺癌和宫颈癌中的作用及分子机制 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 细胞株和菌株 |
| 2.2.1.2 载体和工具酶 |
| 2.2.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.2.1.4 抗体 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 细胞培养和转染 |
| 2.2.2.2 质粒构建 |
| 2.2.2.3 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.2.4 蛋白质印迹(Western blotting) |
| 2.2.2.5 慢病毒感染及稳定细胞株筛选 |
| 2.2.2.6 细胞计数法 |
| 2.2.2.7 细胞增殖测定(MTT实验) |
| 2.2.2.8 克隆形成实验 |
| 2.2.2.9 细胞划痕实验 |
| 2.2.2.10 Trans Well法检测细胞侵袭能力 |
| 2.2.2.11 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 2.2.2.12 RNA抽提、反转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.2.13 药物敏感性实验 |
| 2.2.2.14 免疫荧光染色 |
| 2.2.2.15 原核融合蛋GST-p53的获得 |
| 2.2.2.16 细胞凋亡分析 |
| 2.2.2.17 核质分离 |
| 2.2.2.18 统计学分析应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 干扰CCDC106 可稳定p53,并抑制具有wtp53 的癌细胞的生长、迁移和侵袭 |
| 2.3.2 蛋白激酶CK2 磷酸化CCDC106 |
| 2.3.3 CCDC106在S130和S147 位点的磷酸化是与p53 相互作用和CCDC106定位所必需的 |
| 2.3.4 抑制CCDC106的磷酸化可减弱其对p53蛋白的降解 |
| 2.3.5 抑制CCDC106 磷酸化可以抑制CCDC106 的促癌功能 |
| 2.3.6 CCDC106 增加具有wtp53 的癌细胞对CX-4945 的耐药性 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 ZCCHC10在肺癌中的作用及分子机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 细胞株和菌株 |
| 3.2.1.2 肺癌临床样本 |
| 3.2.1.3 化学试剂和抗体 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 生物信息学分析 |
| 3.2.2.2 质粒构建 |
| 3.2.2.3 慢病毒感染和稳定细胞株构建 |
| 3.2.2.4 细胞培养和转染 |
| 3.2.2.5 免疫共沉淀实验 |
| 3.2.2.6 蛋白质印迹(Western blotting) |
| 3.2.2.7 细胞计数法 |
| 3.2.2.8 细胞增殖测定(MTT实验) |
| 3.2.2.9 克隆形成实验 |
| 3.2.2.10 细胞划痕实验 |
| 3.2.2.11 Trans Well法检测细胞侵袭能力 |
| 3.2.2.12 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 3.2.2.13 RNA抽提、反转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.2.14 药物敏感性实验 |
| 3.2.2.15 免疫荧光染色 |
| 3.2.2.16 细胞凋亡分析 |
| 3.2.2.17 细胞周期分析 |
| 3.2.2.18 裸鼠肿瘤转移实验 |
| 3.2.2.20 组织切片制作以及苏木精、伊红染色 |
| 3.2.2.21 免疫组化实验 |
| 3.2.2.22 荧光素酶报告基因实验 |
| 3.2.2.23 泛素化分析 |
| 3.2.2.24 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ZCCHC10在LUAD中表达下调 |
| 3.3.2 ZCCHC10 抑制含有wtp53 的肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 3.3.3 ZCCHC10在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长和转移 |
| 3.3.4 ZCCHC10 通过诱导p53 增强肺癌细胞对顺铂的敏感性 |
| 3.3.5 ZCCHC10与p53 相互作用并稳定p53 |
| 3.3.6 ZCCHC10 通过阻断MDM2与p53 的相互作用来抑制MDM2介导的p53泛素化 |
| 3.3.7 ZCCHC10 通过促进p53 的抑癌功能发挥作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论和研究展望 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写表 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文术语对照及缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 肽键构象的相关概念 |
| 1.1.2 Pin1 介导的肽键异构化 |
| 1.1.3 肽键异构化参与多种重要的生物过程调节 |
| 1.1.4 肽键异构化参与肿瘤发生过程的调节 |
| 1.1.5 肽键异构化与Wnt/β-catenin信号通路调节 |
| 1.1.6 肽键异构化的研究方法 |
| 1.1.7 肽键异构化研究的方法存在的问题 |
| 1.2 本论文研究的内容 |
| 1.2.1 PDB中蛋白质顺式肽键发生率分布规律探讨 |
| 1.2.2 突变型β-catenin(Xaa246)在hep G2 中的亚定位分析 |
| 1.3 本论研究所采用技术路线 |
| 1.3.1 顺式肽键信息提取及ICPB分布的分析 |
| 1.3.2 真核细胞中ICPB值与其功能效应关系的探讨 |
| 1.3.3 干扰Pin1 表达后β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin之间的相互作用及细胞定位分析 |
| 2 PDB中 ICPB分布的统计分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 顺式肽键提取及其分布规律研究 |
| 2.2.1 顺反式肽键的定义 |
| 2.2.2 二面角Omega与相邻Cα距离的关系推导 |
| 2.2.3 顺式肽键提取的C程序设计 |
| 2.2.4 非冗余PDB数据集的建立 |
| 2.2.5 顺式肽键提取的计算机程序操作 |
| 2.3 顺式肽键发生率的统计 |
| 2.3.1 不同Xaa-P顺式肽键发生率的统计 |
| 2.3.2 不同种类X影响Xaa-P顺式肽键发生的统计 |
| 2.3.3 顺式肽键发生的蛋白质结构部位的观测 |
| 2.3.4 顺式非脯氨酸肽键(X-Xn P)的统计及分析 |
| 2.4 Xaa-P肽键的分子模拟及能量分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 数据集中顺反式肽键的统计 |
| 2.5.2 Xaa-P顺式肽键分布及其ICPB统计 |
| 2.5.3 Xaa-P前后序列特征影响顺式肽键分布的Z值分析 |
| 2.5.4 非脯氨酸顺式肽键(Xaa-Xn P)的统计及分析 |
| 2.5.5 Xaa-P二肽的肽键二面角变化与能量关系 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 顺式肽键的定义对顺式肽键统计结果的影响 |
| 2.6.2 Xaa-P的结构与ICPB的关系 |
| 2.6.3 ICPB与 Xaa-P前后序列特征的关系 |
| 2.6.4 不同Xaa对 Xaa-P肽键ICPB影响 |
| 2.6.5 关于不同Xaa-P构型能量分布与ICPB的关系 |
| 2.6.6 二面角ω键旋转方向与ICPB的关系 |
| 2.6.7 其它因素与ICPB的关系 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 真核细胞中ICPB值与其功能效应关系的探讨 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 过表达载体质粒测序结果 |
| 3.3.2 重组质粒的ORF及 blast分析 |
| 3.3.3 稳定表达β-catenin(X246-P)的hep G2 细胞构建 |
| 3.3.4 β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin相互作用检测 |
| 3.3.5 干扰Pin1后β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin相互作用 |
| 3.3.6 不同β-catenin(Xaa246)突变体在hep G2 中的亚定位观察 |
| 3.3.7 干扰Pin1后β-catenin(Xaa246)亚细胞定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 ICPB值在真核细胞中进行功能效应验证的必要性 |
| 3.4.2 选择β-catenin(Xaa246-P247)作为模式蛋白的原因 |
| 3.4.3 其它Pin1 靶位点异构化与β-catenin亚细胞定位影响 |
| 3.4.4 β-catenin中S246 残基参与APC、E-cadherin的相互作用吗? |
| 3.4.5 干扰Pin1 表达对β-catenin(Xaa-P)与APC、E-cadherin相互作用及细胞亚定位的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 5 后续研究及应用展望 |
| 5.1 揭示肿瘤信号通路中各信号蛋白之间相互作用的亚分子机制 |
| 5.2 揭示脯氨酸突变改变蛋白质热稳定性的机理 |
| 5.3 ICPB理论与功能的探讨 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| B.附录 文件 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（7）TAT-FOXM1-C（688-748）重组蛋白纯化及其抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 转录因子FOXM1 |
| 1.2 癌症与治疗 |
| 1.3 GST重组蛋白表达系统简介 |
| 1.4 细胞穿膜肽TAT |
| 1.5 本论文的研究背景与内容 |
| 第2章 CMV-Flag-GFP-FOXM1_(688-748)抑制 FOXM1 转录活性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 质粒共转染实验 |
| 2.4.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.4.4 RNA提取、逆转录与RT-PCR检测 |
| 2.4.5 Western blotting |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 CMV-Flag-GFP-FOXM1_(688-748)可以抑制FOXM1 的转录活性 |
| 2.5.2 CMV-Flag-GFP-FOXM1_(688-748)影响FOXM1 下游靶基因的m RNA水平 |
| 2.5.3 CMV-Flag-GFP-FOXM1_(688-748)会影响FOXM1 下游靶基因的表达 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 GST-FOXM1_(688-748-)TAT重组蛋白的纯化及标签去除 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 原核表达质粒p GEX-4T2-FOXM1_(688-748-)TAT、pGEX-4T2-TAT的构建 |
| 3.4.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.4.3 质粒小提 |
| 3.4.4 GST-tag重组蛋白的纯化与标签去除流程 |
| 3.4.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.4.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 pGEX-4T2-FOXM1_(688-748-)TAT、p GEX-4T2-TAT重组表达质粒的构建 |
| 3.5.2 GST-FOXM1_(688-748-)TAT重组蛋白纯化与标签切除 |
| 3.5.3 TAT-FOXM1_(688-748)可以抑制FOXM1 的转录活性 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 TAT-FOXM1-C(688-748)的抑瘤效应 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验仪器 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 细胞培养 |
| 4.4.2 CCK8 法检测细胞活力 |
| 4.4.3 细胞平板克隆形成实验 |
| 4.4.4 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 4.4.5 细胞划痕检测细胞迁移 |
| 4.4.6 Western blotting |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 TAT-FOXM1_(688-748)对不同类型肿瘤细胞的生长均具有一定的抑制效果 |
| 4.5.2 TAT-FOXM1_(688-748)对231 细胞平板克隆形成的影响 |
| 4.5.3 TAT-FOXM1_(688-748)对细胞周期的影响 |
| 4.5.4 TAT-FOXM1_(688-748)对细胞迁移的影响 |
| 4.5.5 TAT-FOXM1_(688-748)对细胞蛋白表达水平的影响 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 英文缩写 |
| 附录 B 常用缓冲溶液与试剂配方 |
| 附录 C 攻读学位期间所发表的论文 |
| 致谢 |
（8）ATF3和CK2α过表达促进CHO细胞重组蛋白表达的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物技术药物表达系统 |
| 1.1.1 生物技术药物简介 |
| 1.1.2 生物技术药物在CHO细胞中的生产现状 |
| 1.2 CRISPR/Cas9 技术在基因编辑中的应用 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 技术用于工程细胞株改造的研究进展 |
| 1.3 转录激活因子 3(ATF3)研究进展 |
| 1.4 酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)研究进展 |
| 1.5 立题依据和研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章ATF3 及CK2α 瞬时转染对CHO细胞的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ATF3 以及CK2α 瞬时转染质粒的设计以及构建 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细胞瞬时转染 |
| 2.3.4 细胞生长以及蛋白表达的检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 ATF3-EGFP及CK2α-EGFP瞬时转染效率的检测 |
| 2.4.2 ATF3 和CK2α 瞬时转染对CHO细胞生长和蛋白表达的作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章ATF3 及CK2α 过表达的稳转细胞株的筛选和鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 sgRNA编辑效率的检测 |
| 3.3.2 供体质粒的构建和筛选 |
| 3.3.3 细胞培养 |
| 3.3.4 细胞转染 |
| 3.3.5 细胞池筛选和鉴定 |
| 3.3.6 单克隆细胞的筛选和鉴定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 sgRNA编辑效率的检测 |
| 3.4.2 ATF3 及CK2α 供体质粒的构建 |
| 3.4.3 细胞电转染情况检测 |
| 3.4.4 细胞池的加压筛选和PCR鉴定 |
| 3.4.5 单克隆细胞的加压筛选和PCR鉴定 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章ATF3 及CK2α 过表达单克隆细胞株的性质评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 插入基因表达验证 |
| 4.3.2 生长性质的比较 |
| 4.3.3 模式蛋白表达情况的检测 |
| 4.3.4 细胞凋亡的检测 |
| 4.3.5 细胞pERK & ERK信号通路的检测 |
| 4.3.6 ATF3 在CHO细胞中甲基化调控机制的探究 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 稳定细胞株ATF3 及CK2α 过表达的表达验证 |
| 4.4.2 ATF3 及CK2α 过表达细胞株生长性质的比较 |
| 4.4.3 模式蛋白mCherry在细胞株中表达情况的检测 |
| 4.4.4 细胞凋亡检测结果 |
| 4.4.5 细胞株pERK & ERK信号通路检测结果 |
| 4.4.6 ATF3 在CHO细胞中甲基化调控机制的探究结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 1 |
| 致谢 |
| 硕士期间成果 |
（9）Otub1/c-Maf通路抑制剂的发现及其抗多发性骨髓瘤的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Otub1在多发性骨髓瘤中功能的初步分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 细胞系及病人样本 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要仪器 |
| 1.2.4 主要抗体 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 主要试剂的配制 |
| 1.3.2 细胞培养 |
| 1.3.3 蛋白免疫印迹分析 |
| 1.3.4 单核细胞的分离 |
| 1.3.5 总RNA的提取 |
| 1.3.6 第一链cDNA的合成 |
| 1.3.7 RT-PCR (Reverse Transcription PCR) |
| 1.3.8 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 1.3.9 GEO数据库分析 |
| 1.3.10 慢病毒表达载体的构建 |
| 1.3.11 细胞增殖测定 |
| 1.3.12 流式细胞术 |
| 1.3.13 MM原位动物模型的构建 |
| 1.3.14 统计学分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 Otub1在多发性骨髓瘤病人样本中高表达 |
| 1.4.2 过表达Otub1促进MM细胞增殖 |
| 1.4.3 Otub1缩短MM动物和患者的生存期 |
| 1.4.4 敲低Otub1促进MM细胞凋亡 |
| 1.5 讨论 |
| 第二部分 Otub1/c-Maf抑制剂筛选系统的构建和初步筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要抗体 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 RT-PCR |
| 2.3.2 荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 Otub1/c-Maf通路抑制剂的筛选 |
| 2.4.2 候选化合物诱导MM细胞凋亡的检测 |
| 2.4.3 候选化合物抑制c-Maf转录活性 |
| 2.4.4 候选化合物下调c-Maf下游靶基因的mRNA和蛋白水平 |
| 2.4.5 候选化合物减少MM细胞的存活 |
| 2.5 讨论 |
| 第三部分 LanC抑制c-Maf/Otub1通路诱导MM细胞凋亡 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 主要抗体 |
| 3.3 主要实验方法 |
| 3.2.1 q-RT-PCR (quantitative real-time PCR) |
| 3.2.2 体内动物实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 LanC促进c-Maf蛋白K48类型的多聚泛素化 |
| 3.4.2 LanC诱导高表达c-Maf的MM细胞株凋亡 |
| 3.4.3 毛花苷C抑制高表达c-Maf的MM细胞增殖和克隆集落形成 |
| 3.4.4 Otub1对毛花苷C发挥作用非常重要 |
| 3.4.5 过表达c-Maf可逆转LanC诱导的MM凋亡 |
| 3.4.6 LanC抑制MM小鼠肿瘤生长 |
| 3.4.7 LanC下调内源性c-Maf蛋白水平 |
| 3.5 讨论 |
| 第四部分 Nam抑制恶性血液肿瘤细胞增殖及其机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞系 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 主要抗体 |
| 4.3 主要实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Nam促进c-Maf的泛素化,下调c-Maf蛋白水平 |
| 4.4.2 Nam抑制MM骨髓干细胞克隆形成,增加MM凋亡标志蛋白剪切 |
| 4.4.3 Nam诱导MM细胞凋亡 |
| 4.4.4 Nam诱导MM细胞凋亡须Otub1参与 |
| 4.4.5 Nam可以增加Dox/Len的抗MM活性 |
| 4.4.6 Nam抑制MM小鼠肿瘤的生长 |
| 4.4.7 Nam对小鼠无体内毒性作用 |
| 4.4.8 Nam诱导不表达c-Maf的MM细胞凋亡 |
| 4.4.9 Nam诱导不表达c-Maf的恶性血液病细胞凋亡 |
| 4.4.10 Nam抑制白血病小鼠肿瘤生长 |
| 4.4.11 Nam下调Otub1底物c-IAP1及MDMX蛋白水平 |
| 4.4.12 Nam浓度梯度下调MDM2及MDMX蛋白水平 |
| 4.4.13 Nam下调小鼠肿瘤中MDM2蛋白水平 |
| 4.4.14 Nam促进MDM2的泛素化,降低MDM2蛋白稳定性 |
| 4.4.15 Otub1上调MDM2的蛋白水平,并能与MDM2直接结合 |
| 4.4.16 Otub1通过非经典通路抑制MDM2泛素化 |
| 4.4.17 Nam抑制Rb/E2F通路,上调p21蛋白水平 |
| 4.4.18 Nam诱导肿瘤细胞G1期阻滞 |
| 4.5 讨论 |
| 第五部分 缬草提取物AVT抑制Otub1/c-Maf发挥抗肿瘤活性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞系 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 主要抗体 |
| 5.3 主要实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 AVT通过泛素蛋白酶体途径诱导MM细胞凋亡 |
| 5.4.2 AVT抑制c-Maf与Otub1的结合促进c-Maf的泛素化 |
| 5.4.3 AVT降低高表达c-Maf的MM细胞活力,增加PARP剪切 |
| 5.4.4 AVT诱导MM细胞凋亡依赖于c-Maf的参与 |
| 5.4.5 Otub1对AVT诱导MM细胞凋亡至关重要 |
| 5.4.6 AVT抑制异种移植MM小鼠肿瘤生长 |
| 5.4.7 AVT对荷瘤小鼠无毒性作用 |
| 5.5 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 去泛素化酶与药物设计研究现状 |
| 1.去泛素化酶的分类 |
| 2.去泛素化酶的功能 |
| 2.1 去泛素化酶在肿瘤中的作用 |
| 2.2 去泛素化酶在神经退行性疾病中的作用 |
| 2.3 去泛素化酶在免疫和炎症反应中的作用 |
| 2.4 去泛素化酶在传染病中的作用 |
| 3.去泛素化酶抑制剂 |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间出版或公开发表的论着、论文 |
| 附录:中英文缩略词对照表 |
| 致谢 |
（10）新型小分子化合物NL101对B细胞淋巴瘤的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 引言 |
| 1 NL101具有显着的B-细胞淋巴瘤抑制作用 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 主要实验设备及耗材 |
| 1.2.2 实验试剂 |
| 1.2.3 溶液配置 |
| 1.2.4 B-细胞淋巴瘤细胞系 |
| 1.2.5 原代细胞 |
| 1.2.6 动物 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 B-细胞淋巴瘤细胞系培养 |
| 1.3.2 原代淋巴细胞的分离和培养 |
| 1.3.3 MTT检测细胞存活情况 |
| 1.3.4 流式细胞学检测细胞周期 |
| 1.3.5 流式细胞学AV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 1.3.6 WB检测细胞相关蛋白的表达水平 |
| 1.3.7 NOD-SCID异体淋巴瘤模型小鼠的构建及处理 |
| 1.3.8 小鼠瘤块的免疫组化 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 NL101对B-细胞淋巴瘤细胞系存在普遍抑制作用 |
| 1.4.2 NL101显着抑制原代B细胞淋巴瘤细胞 |
| 1.4.3 NL101将淋巴瘤细胞阻滞在G0/G1期 |
| 1.4.4 NL101可诱导B细胞淋巴瘤细胞发生凋亡 |
| 1.4.5 NL101 通过激活Caspase途径诱导细胞凋亡 |
| 1.4.6 NL101抑制小鼠淋巴瘤的生长并延长其生存期 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 1.6 结论 |
| 2 miR-21-Mxd1-c-Myc调节通路参与NL101对B-NHL的抑制过程 |
| 2.1 NL101 抑制miR-21 的表达及miR-21在B-NHL的意义 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 研究结果 |
| 2.1.5 小结与讨论 |
| 2.1.6 结论 |
| 2.2 Mxd1为miR-21在B-NHL中的靶基因 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 实验结果 |
| 2.2.5 小结与讨论 |
| 2.2.6 结论 |
| 2.3 Mxd1与c-Myc在 B-NHL中的相关性 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 实验材料 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 研究结果 |
| 2.3.5 小结与讨论 |
| 2.3.6 结论 |
| 2.4 c-Myc调节miR-21 的表达 |
| 2.4.1 前言 |
| 2.4.2 实验材料 |
| 2.4.3 实验方法 |
| 2.4.4 研究结果 |
| 2.4.5 小结与讨论 |
| 2.4.6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 microRNA在B细胞淋巴瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 作者简历及科研成果 |
四、利用Tet-OnTM基因表达系统直接克隆 p53下游基因(英文)（论文参考文献）
- [1]岷江百合几丁质酶基因LrCHI2响应尖孢镰刀菌的机制研究[D]. 李珊. 昆明理工大学, 2021
- [2]P53通路激活剂的筛选及作用机制研究[D]. 李昕. 兰州大学, 2020(04)
- [3]OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制[D]. 祝振硕. 西北农林科技大学, 2020
- [4]NOC2L过表达在HIV-1 Tat蛋白调控人类疱疹病毒8型复制周期中的作用[D]. 易雪丽. 右江民族医学院, 2020(04)
- [5]p53相互作用蛋白CCDC106和ZCCHC10在癌症中的作用及分子机制[D]. 宁贻崇. 湖南师范大学, 2020(01)
- [6]顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究[D]. 于淑惠. 重庆大学, 2020(02)
- [7]TAT-FOXM1-C（688-748）重组蛋白纯化及其抗肿瘤活性研究[D]. 卜会铜. 湖南大学, 2020(02)
- [8]ATF3和CK2α过表达促进CHO细胞重组蛋白表达的作用及机制研究[D]. 张梦筱. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]Otub1/c-Maf通路抑制剂的发现及其抗多发性骨髓瘤的作用研究[D]. 徐宇嘉. 苏州大学, 2020(06)
- [10]新型小分子化合物NL101对B细胞淋巴瘤的抑制作用及其机制研究[D]. 李姝. 浙江大学, 2020(01)