一、猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立（论文文献综述）
冯逸雪[1]（2021）在《三种猪呼吸道病原TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用》文中研究表明胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌与猪肺炎支原体临床症状相似,且常与其他呼吸道病原形成混合感染,临床鉴别诊断十分困难。建立一种能够快速、灵敏、高特异性且可量化的检测方法,对这三种呼吸道疾病的早期诊断、预防控制及净化具有重要意义。以NCBI中已有上述3种病原基因序列为参考,针对胸膜肺炎放线杆菌的ApxⅣ基因、副猪嗜血杆菌Omp2基因、猪肺炎支原体的P46基因分别设计三对特异性引物和三条TaqMan探针,建立能够同时检测三种病原的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行试验。并对临床样品进行了应用检测,同时与普通PCR方法进行了对比。获得如下结果:成功建立了胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体TaqMan多重实时荧光定量PCR检测方法,通过对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、巴氏杆菌等病原检测,不同病原之间无交叉反应,仅有胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体阳性模板有扩增信号。建立的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,胸膜肺炎放线杆菌标准曲线相关系数为0.999;副猪嗜血杆菌标准曲线相关系数为0.998;猪肺炎支原体标准曲线相关系数为1.000。建立的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法最低检测拷贝数胸膜肺炎放线杆菌为9.14×100copies/μL、副猪嗜血杆菌1.18×101copies/μL、猪肺炎支原体1.55×101copies/μL,检测下限比常规PCR高103倍;重复试验变异系数在2%以下,重复性良好。使用本方法检测了284份临床样本,TaqMan多重实时荧光定量PCR病原检出率20.42%,其中胸膜肺炎放线杆菌28例,副猪嗜血杆菌31例,猪肺炎支原体44例,两种或三种病原同时存在28例,常规PCR病原检出率4.58%。
熊如月[2]（2020）在《猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定》文中提出猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的猪呼吸系统传染病,急性发病时死亡率高,传染性强,给全世界养猪业造成了重大经济损失。疫苗防治仍然是预防该病的重要手段,也能减少抗生素的使用从而降低耐药性的产生。APP分泌的ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ毒素属于脂酰化蛋白质,同时是APP最主要的毒力因子和保护性抗原。本实验室已将三种重组的非脂酰化Apx毒素蛋白（rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA）与灭活的血清1型APP菌体抗原混合,制备出“猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗”,免疫猪产了生良好的多血清型交叉免疫保护力,且无明显副反应。本研究通过建立针对rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的三种ELISA抗体检测方法,进行猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗的免疫试验,测定了其免疫后的抗体消长规律,为评价该疫苗的免疫效果及免疫程序的制定提供科学依据。主要研究结果如下:1.rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA间接ELISA方法的建立将实验室保存的重组质粒pQE-ApxⅠA、pQE-ApxⅡA和pQE-ApxⅢA分别转化入大肠杆菌M15感受态细胞,诱导表达了rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA重组蛋白,用纯化后的重组蛋白分别建立三种ELISA抗体检测方法,并进行了条件优化,重复性较好。rApxⅠA间接ELISA检测方法中,rApxⅠA抗原包被浓度22.57μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释40倍,37℃孵育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min。在最佳反应条件下,阴阳临界值为0.267。rApxⅡA抗原包被浓度为39.88μg/m L,4℃过夜包被;1%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍后37℃温育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光室温显色30min;阴阳临界值为0.447的间接ELISA检测方法。rApxⅢA间接ELISA检测方法中,抗原稀释到11.10μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍,37℃孵育30min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min;阴阳临界值为0.283。2.疫苗抗体消长规律的测定在猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫试验中,共购入9头50日龄仔猪,3头为空白对照组、6头为疫苗组,分别耳后肌肉注射本实验室制备的PBS对照和亚单位-灭活菌苗,免疫后28天加强免疫一次。首免后0、14、21、28、60、68、75、82、89、96、110天前腔静脉采血分离血清。ELISA检测结果显示,疫苗组免疫后rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体变化趋势基本一致:首免0天至28天的变化不明显,二次免疫后显着上升,疫苗组rApxⅠ抗体在首免后75天达到峰值（效价230倍）,rApxⅡ抗体在首免后60天达到峰值（效价483倍）,rApxⅢ抗体在首免后68天达到峰值（效价73倍）,而后抗体水平逐渐下降。一免后110天rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体仍维持在较高水平。本研究建立了三种间接ELISA抗体效价检测方法,重复性较好。猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫后的抗体消长规律表明该疫苗能刺激机体产生rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA的特异性抗体,建议50日龄首免,首免后28天进行二免为宜。
袁园园[3]（2020）在《盐酸多西环素-氟苯尼考注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的PK-PD同步模型研究》文中进行了进一步梳理由副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌引起的猪呼吸道疾病,发病率和死亡率较高,给国内外养猪业带来了巨大的损失。因氟苯尼考（Florfenicol,FF）和盐酸多西环素（Doxycycline hydrochloride,Dox·HCl）的联合用药对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌具有较强的抗菌活性,已作为临床治疗猪传染性胸膜肺炎和副猪嗜血杆菌病的重要药物。为了科学规范Dox·HCl和FF联合用药在猪胸膜肺炎放线杆菌病和副猪嗜血杆菌病治疗上的应用并避免其耐药性的产生,通过药动学-药效学（Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PK-PD）模型预测和制定合理的用药方案尤为重要,同时也为复方药物PK-PD同步模型的研究提供参考。本课题利用PK-PD同步模型制定出前期研发出的盐酸多西环素-氟苯尼考（Doxycycline hydrochloride-florfenicol,Dox·HCl-FF）注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的临床给药方案,以期在取得最佳治疗效果的同时避免细菌耐药性的产生,为猪传染性胸膜肺炎和副猪嗜血杆菌病的治疗提供新的给药方案,充分发挥Dox·HCl-FF注射剂的临床应用价值,促进养殖业健康发展。1 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF分别对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的药效学研究FF、Dox·HCl和Dox·HCl-FF分别对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学研究本试验所用菌株为实验室保存的131株猪胸膜肺炎放线杆菌菌株。参考临床实验室标准化研究所（CLSI）推荐的琼脂稀释法测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对131株猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）,得到FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF对131株猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC90分别为8、8和2μg/m L。选出MIC90附近的胸膜肺炎放线杆菌进行血清型鉴定和小鼠毒力试验,最终选择编号为BW1的胸膜肺炎放线杆菌进行PK-PD实验。参考CLSI推荐的微量肉汤稀释法,测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对胸膜肺炎放线杆菌BW1在体外和半体内的MIC和最小杀菌浓度（Minmum bactericidal concentration,MBC）,通过平板计数法测定防突变浓度（Minmum prevention concentration,MPC）,绘制体外和半体内生长曲线和杀菌曲线。将不同浓度药物与胸膜肺炎放线杆菌BW1孵育1 h和2 h后测得抗菌后效应（Post-antibiotic effect,PAE）和耐药突变选择窗（Mutant selection window,MSW）。结果表明在体外和半体内条件下FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对胸膜肺炎放线杆菌BW1的MIC均为8、8和2μg/m L,MBC均为8、8和4μg/m L,MPC分别为19.2、19.2和6.4μg/m L,故MSW范围分别为8-19.2μg/m L、8-19.2μg/m L、2-6.4μg/m L。1 h和2 h的PAE结果分别为0.01-1.25 h和0.28-1.39 h;0.19-1.34 h和0.29-3.00 h;0.19-4.54 h和0.73-6.07 h。通过体外、半体内杀菌曲线和PAE发现FF对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用呈现浓度依赖性,Dox·HCl对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用既有时间依赖性又有浓度依赖性,当FF和Dox·HCl联用以后,随着Dox·HCl/FF浓度的增加,杀菌作用明显增强,表现出明显的浓度依赖性,因此最终选择AUC/MIC（药时曲线下面积与最小抑菌浓度的比值,area under the concentration-time by MIC）作为PK-PD拟合参数。FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对猪副猪嗜血杆菌的药效学研究本试验所用菌株为实验室保存的115株猪副猪嗜血杆菌。通过琼脂稀释法测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF对115株猪副猪嗜血杆菌的MIC,得到FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF对115株猪副猪嗜血杆菌的MIC90分别为4、4和1/1μg/m L。选出MIC90附近的副猪嗜血杆菌进行血清型鉴定和小鼠毒力试验,最终选择编号为55的副猪嗜血杆菌进行PK-PD实验。通过微量肉汤稀释法,测定FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对副猪嗜血杆菌55在体外和半体内的MIC,MBC,MPC和PAE。在体外和半体内条件下测得FF、Dox·HCl和Dox·HCl/FF分别对副猪嗜血杆菌55的MIC值均为4、4和1/1μg/m L,MBC值均为8、8和2/2μg/m L,MPC值分别为12.8、12.8和4.8μg/m L,故MSW范围分别为4-12.8μg/m L、4-12.8μg/m L、1-4.8μg/m L。1 h和2 h的PAE结果分别为0.05-1.18 h和0.16-3.46 h;0.32-1.73 h和0.87-2.18 h;0.67-3.08 h和1.76-5.54 h。通过体外、半体内杀菌曲线和PAE发现FF对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用呈现浓度依赖性,Dox·HCl对胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用既有时间依赖性又有浓度依赖性,当FF和Dox·HCl联用以后,随着Dox·HCl/FF浓度的增加,杀菌作用明显增强,表现出明显的浓度依赖性,因此最终选择AUC/MIC（药时曲线下面积与最小抑菌浓度的比值,area under the concentration-time by MIC）作为PK-PD拟合参数。2 Dox·HCl-FF注射剂在猪呼吸道的药动学研究Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌在猪呼吸道的药动学研究试验选取24头体重25 kg左右的健康断奶三元杂交仔猪,随机分为4组,每组6头,分别为FF健康组、Dox·HCl健康组,Dox·HCl/FF健康组和患病组。用胸膜肺炎放线杆菌临床分离株接种感染仔猪,建立人工感染的仔猪患病模型。4个组均按20 mg/kg b.w.肌内注射给药后,在不同时间点采集血浆和肺泡灌洗液样品,用高效液相色谱方法（High performance liquid chromatography,HPLC）分别测定血浆和肺泡灌洗液中游离的FF和Dox·HCl浓度,使用Winnonlin软件中的一级吸收二室模型对获得的药物浓度进行拟合,试验结果为单方FF健康组以及复方FF健康组和患病组在血浆中的达峰时间（Tmax）分别为3.41±0.27 h、3.45±0.21 h和3.67±0.08 h,达峰浓度（Cmax）分别为4.13±0.11μg/m L、4.08±0.09μg/m L和4.09±0.05μg/m L,24 h药时曲线下面积（AUC24h）分别为91.86±4.52 h·μg/m L、105.52±1.46 h·μg/m L和115.05±1.88h·μg/m L;单方Dox·HCl健康组以及复方Dox·HCl健康组和患病组在血浆中的Tmax分别为1.86±0.14 h、1.97±0.06 h和2.04±0.07 h,Cmax分别为3.63±0.14μg/m L、3.58±0.07μg/m L和3.60±0.09μg/m L,AUC24h分别为68.20±3.98 h·μg/m L、72.77±1.41h·μg/m L和73.29±1.05 h·μg/m L;单方FF健康组以及复方FF健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为3.14±0.10 h、2.90±0.05 h和3.07±0.01 h,Cmax分别为8.03±0.20μg/m L、8.87±0.08μg/m L和8.67±0.07μg/m L,AUC24h分别为144.22±1.98 h·μg/m L、172.75±2.52 h·μg/m L和180.22±3.13 h·μg/m L;单方Dox·HCl健康组以及复方Dox·HCl健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为2.19±0.05 h、2.72±0.03 h和2.68±0.03 h,Cmax分别为7.68±0.07μg/m L、7.91±0.09μg/m L和7.99±0.05μg/m L,AUC24h分别为133.26±4.43 h·μg/m L、126.96±3.70 h·μg/m L和169.82±4.38 h·μg/m L。在血浆和肺泡液中,FF及Dox·HCl在单方的健康组以及复方的健康组和患病组的药动学参数均无显着差异。Dox·HCl-FF注射剂对猪副猪嗜血杆菌在猪呼吸道的药动学研究试验选取12头体重20 kg左右的健康断奶三元杂交仔猪,随机分为2组,每组6头,用副猪嗜血杆菌临床分离株接种感染仔猪,建立人工感染的仔猪患病模型。健康组和患病组均以20 mg/kg b.w.肌内注射给药后,在不同时间点采集血浆和肺泡灌洗液样品,用HPLC分别测定血浆和肺泡灌洗液中游离的FF和Dox·HCl浓度,使用Winnonlin软件中的一级吸收二室模型对获得的药物浓度进行拟合,得到复方FF健康组和患病组在血浆中的Tmax分别为3.56±0.05 h和3.85±0.13 h,Cmax分别为4.18±0.05μg/m L和4.15±0.08μg/m L,AUC24h分别为104.38±3.29 h·μg/m L和111.51±1.79 h·μg/m L;复方Dox·HCl健康组和患病组在血浆中的Tmax分别为1.91±0.07 h和2.16±0.05 h,Cmax分别为3.56±0.06μg/m L和3.65±0.06μg/m L,AUC24h分别为72.18±1.66 h·μg/m L和74.39±2.11 h·μg/m L;复方FF健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为3.39±0.06 h和3.41±0.18 h,Cmax分别为8.55±0.07μg/m L和8.33±0.07μg/m L,AUC24h分别为159.73±3.61 h·μg/m L和162.92±2.59 h·μg/m L;复方Dox·HCl健康组和患病组在肺泡液中的Tmax分别为2.99±0.07 h和3.08±0.05 h,Cmax分别为7.35±0.03μg/m L和7.24±0.04μg/m L,AUC24h分别为145.43±2.89 h·μg/m L和152.34±1.06 h·μg/m L。在血浆和肺泡液中,复方FF和Dox·HCl在健康组和患病组的药动学参数均无显着差异。3半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌的半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定将半体内胸膜肺炎放线杆菌浓度变化对数值与健康和患病组的AUC24h/MIC值通过Sigmoid Emax模型进行拟合,获得复方FF健康组和患病组的参数,当E分别取0、-3和-4时获得相应的抑菌、杀菌和根除作用的AUC24h/MIC值分别为3.94、15.99、28.63 h（复方FF健康组）,5.61、18.83、32.68 h（复方FF患病组）;复方Dox·HCl健康组和患病组的参数,E分别取0、-3、-4时的AUC24h/MIC值分别为0.78、10.32、24.06 h（复方Dox·HCl健康组）,7.42、19.64、31.08 h（复方Dox·HCl患病组）。由于患病组PK-PD参数更高,抗菌效果更好,按照患病组的数据,通过剂量公式,得到患病组预防、治疗和根除的剂量分别为1.37、4.59和7.99 mg/kg（复方FF患病组）,1.92、5.08和8.04 mg/kg（复方Dox·HCl患病组）。Dox·HCl-FF注射剂对猪副猪嗜血杆菌的半体内PK-PD模型拟合和给药方案制定将半体内副猪嗜血杆菌浓度变化对数值与健康和患病组的AUC24h/MIC值通过Sigmoid Emax模型进行拟合,获得复方FF健康组和患病组的参数,当E分别取0、-3和-4时获得相应的抑菌、杀菌和根除作用的AUC24h/MIC值分别为7.95、21.90、34.38 h（复方FF健康组）,7.96、23.09、38.58 h（复方FF患病组）;复方Dox·HCl健康组和患病组的参数,E分别取0、-3和-4时的AUC24h/MIC值分别为9.05、22.42、33.54 h（复方Dox·HCl健康组）,9.27、23.73、37.70 h（复方Dox·HCl患病组）。由于患病组PK-PD参数更高,抗菌效果更好,按照患病组的数据,通过剂量公式,得到患病组的预防、治疗和根除剂量分别为1.07、3.11和5.21 mg/kg（复方FF患病组）,1.34、3.42和5.43 mg/kg（复方Dox·HCl患病组）。Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌给药方案的制定为了更好的治愈胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌疾病,选出Dox·HCl-FF注射剂治疗这两种菌剂量中的较大者,即Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌的剂量方案,然后为了既能达到治疗效果又能节约用药量的目的,选择Dox·HCl/FF联合用药成分中的较小剂量即FF的剂量作为最终剂量方案,最终得到Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌病的预防、治疗和根除剂量依次为1.37、4.59和7.99 mg/kg。根据细菌生长动力学机制的PK-PD模型预测结果表明在治疗剂量下以24 h给药间隔,连续给药2天能达到预期疗效。
梁娟[4]（2020）在《猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌分别是引起猪巴氏杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎、猪传染性胸膜肺炎和格拉瑟氏病的主要病原,也是当前养猪业常见的五种呼吸系统疾病病原菌。这五种病原菌均可引起猪的呼吸道疾病,且引起的临床症状和病理变化通过肉眼观察有时难以区分。有时还存在这几种病原菌混合感染的情况,更给疾病的诊断造成困难。为了有效鉴定这些病原菌,本课题拟建立一种同时鉴定这五种病原的PCR诊断方法。1.猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的单重PCR检测方法。方法:针对巴氏杆菌plpE基因、猪链球菌gdh基因、猪肺炎支原体mhp677基因、胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ基因和副猪嗜血杆菌vanY基因序列各设计1对引物,确定每种病原单重PCR的退火温度和敏感性,验证引物的特异性。结果:确定五种病原单重PCR扩增的退火温度范围为54℃-60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。plpE基因的最低检出限为0.01 ng/μL,gdh基因的最低检出限为0.1 ng/μL,mhp677基因的最检出限为0.1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为0.1 ng/μL,vanY基因的最低检出限为1 ng/μL。结论:建立了五种病原各自的单重PCR检测方法,为五重PCR检测方法的建立奠定了基础。2.猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的五重PCR检测方法。方法:将确定的5种病原菌单重PCR检测方法的引物和模板混合,确定五重PCR反应的退火温度和和敏感性,验证引物的特异性。结果:五重PCR反应的退火温度为60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。在五重反应PCR体系中,plpE基因的最低检出限为1 ng/μL,gdh基因的最低检出限为10 ng/μL,mhp677基因的最低检出限为1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为10 ng/μL,vanY基因的最低检出限为10ng/μL。结论:建立了猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法。3.猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的应用目的:验证所建立的五重PCR方法是否可用于临床检测。方法:采集病变猪肺组织,提取基因组后用已经建立的方法检测五种巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌。结果:对采集的224份临床样本的检测结果表明,在65份样品中检测到上述五种病原中的至少一种,其中50份样品为单纯感染,15份为混合感染。结论:本研究所建立的猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法可用于猪呼吸系统病原菌巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的检测及病原流行病学调查。
程素芳[5]（2019）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备》文中指出猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的以急性肺脏出血或慢性纤维素性胸膜粘连等为特征的一种呼吸道传染性疾病。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,且有ApxI、ApxII、ApxⅢ和ApxⅣ4种毒素因子,其中ApxⅠ可引起疾病出现肺部典型病变,也是引起猪传染性胸膜肺炎的最强毒力因子,而ApxⅣ毒力相对较弱,但可由所有的APP分泌,且只有APP在动物体内时ApxⅣ才会被诱导表达,因此当ApxI、ApxⅣ两种毒素因子同时存在时,则会对猪传染性胸膜肺炎的诊断具有十分重要的临床价值。通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和ApxIVA基因组DNA,建立双重PCR方法检测并扩增ApxIA和ApxIVA基因片段,并采用TA克隆技术获得重组质粒,然后进行生物信息学分析目的基因片段特性并进筛选,再进一步的蛋白表达、纯化及多克隆抗体制备。试验结果如下:1、成功建立了毒素ApxIA和ApxⅣA基因双重PCR体系,ApxIA和ApxⅣA在DNA模板浓度为240μmol/L和150μmol/L、引物浓度为2ng/mL、Tm值55℃条件下可同时获得两条较亮目的条带,且特异性和稳定性检测效果极佳。2、成功获得了pMD18–ApxIA、pMD18–ApxIVA重组质粒,通过基因生物信息学分析筛选出了基因片段长度为1 209 bp的ApxIA和目的基因片段长度为972bp的ApxⅣA的两段蛋白表达强基因片段。与NCBI上的基因序列进行同源性比较发现相似度均有90%以上。3、获得高效价的ApxIA和ApxⅣA多克隆抗体,经ELISA检测的效价分别可高达1:200000和1:50000;在此效价经Western Blot检测为阳性。结论:成功建了ApxI A和ApxⅣA基因双重PCR方法,其特异性、稳定性较强;获得了ApxI A和ApxⅣA基因的多克隆抗体,效价分别可高达1:200000和1:50000,为今后猪传染性胸膜肺炎的诊断防控提供了参考。
张龙飞[6]（2019）在《头孢喹肟和达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD同步模型研究》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种严重呼吸道疾病,在全世界广泛流行,给养猪业造成巨大的经济损失,阻碍着养殖业的发展。治疗该病常用的药物有头孢菌素类、氟喹诺酮类、酰胺醇类等。然而,由于抗菌药物的不合理使用,细菌逐渐表现出耐药现象,影响着药物的治疗效果和使用寿命。特别是头孢菌素类和氟喹诺酮类药物,在人类和动物上都有广泛应用,如果耐药菌的耐药基因不断传播,对人类和动物的健康都有着巨大的威胁。因此,本论文选择头孢喹肟和达氟沙星两种抗菌药物,研究其对猪胸膜肺炎放线杆菌的药动学/药效学（PK/PD）同步模型,以期为制定合理给药方案、抑制耐药菌的产生提供指导。同时,本论文初步研究了微透析技术在头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌药动药效学上的应用。首先,论文研究了头孢喹肟和达氟沙星在含不同药物浓度（0～64×MIC）的TSB肉汤中对猪胸膜肺炎放线杆菌的抗菌效果和杀菌曲线,计算了不同时间段内的杀菌速率,并采用Sigmoid Emax模型分析杀菌速率与药物浓度的关系。头孢喹肟和达氟沙星在TSB肉汤中对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC分别为0.008μg/m L和0.016μg/m L。头孢喹肟和达氟沙星分别在4×MIC和8×MIC时,可以产生杀菌效果。头孢喹肟杀菌速率较小,达到杀菌效果需要较长的时间（>12 h）,达氟沙星只需要6 h左右。当头孢喹肟浓度增加到16×MIC时,杀菌速率达到最大,继续增加药物浓度,杀菌速率几乎不再增加,而达氟沙星的杀菌速率,随着药物浓度的增加一直增加。总之,在体外,头孢喹肟表现出了时间依赖性的抗菌特征,达氟沙星表现出了浓度依赖性的抗菌特征。在体外药效学的基础上,论文采用猪组织笼感染模型,研究了头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的体内PK/PD同步模型。当组织笼内细菌含量达到106 CFU/m L时,肌肉注射不同剂量（0.2、0.4、0.8、1、2、4 mg/kg）的头孢喹肟,一天一次,连续3天。给药后,在不同时间点收集组织液,用于检测组织液中的药物浓度和细菌含量。并采用抑制型Sigmoid Emax模型分析PK/PD参数和抗菌效果之间的关系。头孢喹肟在组织液中对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC为0.016μg/m L。不同给药剂量下能够产生的最大抗菌效果是使细菌数量下降3.96 Log10 CFU/m L。经过分析不同PK/PD参数与抗菌效果的关系发现,%T>MIC与抗菌效果相关性最好,相关系数R2达到0.967,并计算了使细菌含量下降1/3-Log10 CFU/m L、2/3-Log10 CFU/m L、1-Log10 CFU/m L所需要的%T>MIC值分别为11.59%、27.49%、59.81%。研究结果表明,头孢喹肟在猪体内亦表现出时间依赖性的抗菌活性。论文同样采用猪组织笼感染模型,研究了达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的抗菌活性及PK/PD参数与细菌敏感性和突变分数变化的关系。试验中组织笼内的细菌含量达到108 CFU/m L,肌注不同剂量的达氟沙星（0.4、0.6、0.8、1.25、2.5、3.5、5 mg/kg）,一天一次,连续5天。给药后收集组织液,用于检测药物含量和细菌数量,同时检测每次给药后的细菌敏感性和突变分数变化。对于MIC值增大的细菌,检测氟喹诺酮耐药基因（gyr A、gyr B、par C、par E）是否有基因突变。测量耐药菌在是否存在利血平时对达氟沙星和恩诺沙星的MIC值,确定耐药特性是否是由外排泵机制引起。结果显示,当药物浓度位于MIC99（0.05μg/m L）和MPC（0.4μg/m L）之间时,细菌的MIC值和突变频率会明显增加。当AUC24h/MIC99位于34.68～148.65 h,或者AUC24h/MPC位于4.38～18.58 h时,耐药菌会被选择出和逐渐富集。耐药菌的gyr A上发生了相对于大肠杆菌的gyr A基因的83位的氨基酸取代（Ser-83→Tyr或Ser-83→Phe）,在par C序列上检测到了相对于大肠杆菌par C基因的53位的氨基酸取代（Lys-53→Glu）。因此,研究结果提示,在使用达氟沙星治疗猪胸膜肺炎放线杆菌感染时,给药剂量应该达到使AUC24h/MPC>18.58 h。最后,论文还初步研究了微透析技术在头孢喹肟药动学上的应用,并采用小鼠大腿感染模型研究了头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD结合模型。采用正向微透析法和反向微透析法测量了微透析探针对头孢喹肟的体外回收率,采用反向微透析法测量头孢喹肟在小鼠大腿中的体内回收率。小鼠在皮下注射不同剂量的头孢喹肟（0.04、0.16、0.63、2.5、10 mg/kg）后,采用微透析法和眶后静脉丛采血的方法收集透析液和血浆样品,检测头孢喹肟在大腿和血浆中的药动学,采用非房室模型计算头孢喹肟的药动学参数。然后,将总剂量为0.01、0.04、0.16、0.63、2.5、10 mg/kg的头孢喹肟,分成3、6、8、12、24 h五个给药间隔给药,给药后24 h,检测小鼠大腿中细菌含量,并分析PK/PD参数与抗菌效果之间的关系。结果表明,体外回收率随流速的增大而减小,与浓度无关,正向法和反向法测得的回收率无明显差异。与大腿中头孢喹肟的药动学特征相比,血浆中的消除半衰期较短,最大药物浓度较高。药物从血浆到大腿的渗透性为0.591。与抗菌效果关系最好的PK/PD参数是%f T>MIC。使细菌下降0-Log10 CFU/thigh、1-Log10 CFU/thigh、2-Log10 CFU/thigh、3-Log10 CFU/thigh所需的%f T>MIC值在血浆中分别为19.56%、28.65%、41.59%、67.07%,在大腿中分别为21.74%、36.11%、52.96%、82.68%。本论文研究了体内外头孢喹肟和达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的抗菌活性,对于临床上优化给药方案,预防细菌耐药性的产生,具有重要的指导意义。同时,本论文初步研究了微透析技术对头孢喹肟在PK/PD模型上的应用,对于应用微透析技术优化给药方案具有重要的参考价值。
孙达[7]（2019）在《猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋耐药判定标准研究》文中进行了进一步梳理猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoinae,APP）,原称胸膜肺炎嗜血杆菌,易引起猪呼吸道疾病传染性胸膜肺炎,不同年龄段的猪都有易感性且死亡率较高。随着国内动物抗生素的滥用,一些治疗该疾病的药物的治疗效果已经大大降低,所以需要我们通过合理的用药来减少耐药性的产生。头孢噻呋是第一个用于动物的第三代头孢类抗生素,对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均有效,对动物呼吸道细菌具有良好的临床治疗效果。为了降低猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药性的产生,需要我们对猪胸膜肺炎放线杆菌开展耐药监控措施。通过建立猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药判定标准,能够有效科学的对耐药进行监控。本课题通过测定头孢噻呋对135株猪胸膜肺炎放线杆菌的药物敏感性,建立了野生型临界值:检测体外和半体内条件下头孢噻呋对临床分离的致病性菌株的抗菌作用,研究头孢噻呋在猪体内的药动学,建立PK-PD模型,制定出最佳的给药方案,建立药效学临界值。研究头孢噻呋对不同MIC致病性菌株所致感染疾病的治疗效果,建立头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的临床临界值,制定头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌检测标准,为猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药提供合理的科学的判定依据。1.头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学研究及野生型临界值的制定采用琼脂稀释法测定头孢噻呋对135株临床分离的猪胸膜肺炎放线杆菌的药物敏感性,通过ECOFFinder软件分析最低抑菌浓度（MIC）分布。然后用微量肉汤稀释法测定头孢噻呋在TSB肉汤培养基和猪血浆中对猪胸膜肺炎放线杆菌BW39菌株的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度（MBC）,同时在体外条件下测定头孢噻呋对BW39菌株的最小防突变浓度（MPC）以及抗菌后效应（PAE）,在含有不同浓度头孢噻呋的培养基和猪血浆中进行体外和半体内杀菌曲线的测定。头孢噻呋对135株猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC分布范围在0.0075-4 μg/mL之间,MIC50和MIC90分别为0.015 μg/mL和0.5μg/mL,制定的野生型临界值为0.125μg/mL。体外和半体内条件下头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌BW39的MIC分别为0.5 μg/mL 和 1 μg/mL,MBC 均为 1 μg/mL,MPC 为 1.6 μg/mL,耐药突变选择窗（MSW）为0.5-1.6μg/mL,头孢噻呋与猪胸膜肺炎放线杆菌暴露1 h产生的PAE为0.33-0.66 h,暴露2 h产生的PAE为0.73-1.17 h。体外和半体内杀菌曲线试验结果均显示头孢噻呋对BW39菌株的抗菌作用类型为时间依赖型。2.头孢噻呋在猪体内的药动学研究及药效学临界值的制定试验选取12头体重15 kg左右的健康断奶二元杂交仔猪,随机分为2组,每组6头。对健康组和患病组均按照5 mg/kg·b.w剂量肌肉注射盐酸头孢噻呋。给药后于不同时间点采集血浆,采用高效液相色谱（HPLC）法检测药物浓度。通过半体内PK-PD模型拟合以及剂量计算公式,制定出最佳的给药方案。同时利用蒙特卡罗模拟方法对药动学数据进行模拟分析,得到药效学临界值。根据药动学数据选择最佳的PK-PD参数,构建头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的半体内PK-PD模型,通过Sigmoid Emax模型方程对半体内杀菌曲线中AUC/MIC值和细菌对数变化量之间的关系进行拟合,计算得到健康组中抑菌、杀菌、清除效果下的AUC/MIC值分别为45.73、63.83、69.04 h,患病组中抑菌、杀菌、清除效果下的AUC/MIC值分别为38.94、47.23、49.16 h。通过剂量计算公式得到健康组和患病组预防、治疗、根治目的下的剂量分别为2.2、3.0、3.3 mg/kg·b.w和1.8、2.2、2.3 mg/kg·b.w。利用蒙特卡罗方法对AUC的均值和标准差进行模拟,得到头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学临界值为2 μg/mL。3.头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌临床临界值及耐药判定标准的制定将36头仔猪随机分为6组,1组为阴性对照组,5组为药物治疗组,每组6头。选择具有致病力的5株不同MIC猪胸膜肺炎放线杆菌进行攻毒试验,建立人工感染患病模型。不同菌株攻毒的猪只进行治疗,统计治愈率和死亡率,利用数学统计算法WindoW和CART模型以及非线性回归分析,制定临床临界值。根据折点制定树状图,建立头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药判定标准。选择编号为 BW9,BW29,BW39,QG17 和 18119,MIC 分别为 0.015 μg/mL、0.125μg/mL、0.5 μg/mL、2 μg/mL和4 μg/mL的5株猪胸膜肺炎放线杆菌分别对试验组进行攻毒,然后对感染仔猪进行肌肉注射头孢噻呋3mg/kg.b.w,一天一次,连续三天的给药治疗,得到头孢噻呋对上述5株菌株的治愈率分别为100%、83%、83%、67%和50%,通过WindoW和CART算法分析模型确定临床临界值的分布范围为0.5-1.25μg/mL,最后通过非线性回归分析方法,制定头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的临床临界值为0.5-1.25 μg/mL。结合获得的野生型临界值、药效学临界值和临床临界值,最终建立猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药判定标准为0.5-1.25 μg/mL。本课题参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI）和欧洲药敏试验联合委员会（EUCAST）组织公布的标准程序,建立了猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋的耐药判定标准。为猪胸膜肺炎放线杆菌的耐药监控提供科学的理论依据,有利于保护和维持头孢噻呋在临床治疗中的有效性。
施雷[8]（2015）在《安徽地区猪传染性胸膜肺炎血清学调查及APP分离与生物学特性研究》文中认为猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）,是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪高度传染性呼吸道疾病,严重危害我国养猪业的健康发展。为了解安徽地区PCP的流行情况,提高APP亚临床感染的检出率和细菌分离率,并研究分离株的生物型特性,本试验将从以下几个方面开展。运用ApxⅣ-ELISA试剂盒检测1288份血清感染抗体,了解安徽地区总体感染情况及流行特点。结果显示,APP感染抗体总阳性率为26.40%（340/1288）,猪场感染率为78.37%（58/74）,母猪/后备母猪/公猪APP感染抗体阳性率（45.47%）高于哺乳仔猪（28.02%）、保育猪（6.16%）、育肥猪（7.20%）;夏季（41.42%）高于春季（29.75%）、秋季（26.35%）、冬季（19.26%）,淮北地区（30.73%）和江淮地区（28.57%）高于皖南地区（13.77%）,中型猪场（47.16%）高于大型猪场（19.28%）和小型猪场及散养户（23.15%）。安徽地区PCP的流行特点,为制定有效防控措施提供了科学依据。比较dsbE-PCR、omlA-PCR和ApxⅣA-PCR的敏感性和特异性,并同时运用三种PCR方法检测135份母猪鼻腔棉拭子中APP核酸,比较三种PCR方法的APP核酸检出率。结果显示:三种PCR最低检测限度均为102CFU,且至对APP发生反应;dsbE-PCR 方法的 APP 核酸检出率（23.7%）显着高于 omlA-PCR（8.1%）和 ApxⅣA-PCR（14.8%）,三者符合率较高,分别为84.4%、91.1%和93.3%。本试验为APP亚临床感染分子检测方法的改良提供参考。同时使用添加抗生素、NAD及血清的mPPLO、TSA、CA和BA四种选择性培养基分离135份母猪鼻腔棉拭子中APP,比较四种分离培养基的分离率。结果显示:mPPLO 的 APP 分离率（11.9%）显着高于 TSA（0.7%）、CA（5.2%）和 BA（2.2%）,四者符合率较高,分别为88.9%、93.3%、90.37%、95.6%、98.5%和97.0%。本试验为猪鼻腔中APP分离方法的优化及培养基的选择提供理论参考。通过细菌学试验,研究APP分离株和参考株的生化特性。结果显示:分离株和参考菌株的细菌形态、生化特性以及生长曲线一致。G-,具有典型的多形性,菌体较小,多为球杆菌;与甘露醇、葡萄糖等反应为阳性,与乳糖、七叶苷等反应为阴性;2h～12h期间处于对数期,12h～14h达到最大值,14h后稍有下降并趋于平稳。本试验结果为APP的细菌学检测、生化鉴定及疫苗制作提供参考依据。运用常规药敏纸片法,研究APP分离株药物敏感性。结果显示:安徽分离株对环丙沙星,氟苯尼考和诺氟沙星的敏感率最高（100%）,其次是阿奇霉素和复方新诺明（85.7%）,对丁胺卡那、青霉素等较敏感（71.4%～42.9%）,对四环素、阿莫西林、万古霉素和林可霉素耐药（0%）;福建分离株对环丙沙星和氨苄西林的敏感率最高（88.9%）;其次是诺氟沙星、卡那霉素和头孢唑林（77.8%）,对青霉素、氟苯尼考等较敏感（66.7%～33.3%）,对四环素、林可霉素和万古霉素耐药（0%）。本试验为APP临床用药提供指导。通过辅酶试验,鉴定APP的生物型。结果显示:安徽分离株及参考菌株属于生物Ⅰ型,福建分离株属于生物Ⅱ型;运用ApaⅠ-PFGE技术,对APP分离株及参考株进行基因型分型。结果显示:参考株和分离株共分为6种基因型,不同地区、相同地区不同猪场、相同猪场APP分离株间基因型均有差异,本试验为今后安徽地区APP筛选流行优势菌株及疫苗免疫菌株的选择垫定了基础。
朱岩昆[9]（2013）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析》文中提出猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。以血清5a型作为待检菌进行灵敏性验证时，发现最低检出菌量为50个。表明通过表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA建立的多重PCR方法灵敏度高，特异性强。该PCR方法的建立，为猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了一种快捷高效的方法。为了指导临床用药，筛选出合适的临床药物，对以前分离的通过生理生化分析等鉴定和本次多重PCR确认的App进行了药敏试验和最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration, MIC）试验，确认的4株App仅对10种临床常用药物中的头孢噻呋、阿米卡星、左旋氧氟沙星敏感，其它7种药物不敏感。对敏感药物进行MIC分析发现，左旋氧氟沙星对xx-1、xx-2、xx-3、xx-5四株菌株的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/23、6.25/23，阿米卡星的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/22、6.25/23，头孢噻呋的MIC值分别为37.5/22、37.5/22、37.5/23、37.5/24。通过药敏试验和最小抑菌浓度试验给临床用药及防治提供参考。App的毒力因子主要包括外毒素（Apx）、荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBp）等，近年的研究热点主要集中在外毒素，所以本研究克隆并构建了pMD-ApxⅠA、pMD-ApxⅡA、pMD-OmpD15载体，为序列分析及其后续研究奠定基础。ApxⅠA和ApxⅡA蛋白结构分析发现，ApxⅠA毒素蛋白α螺旋存在于1647aa，251269aa，344358aa，530546aa，β折叠分布较均匀，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为1185aa，407979aa；ApxⅡA毒素蛋白α螺旋存在于7090aa，172190aa，248275aa，207431aa，446469aa，812834aa，β折叠除在361406aa有较大折叠外其他折叠较小，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为418918aa。毒力因子Omp D15（Omp D15）是App一个重要的的表面抗原蛋白，蛋白结构分析表明其存在的抗原表位比较多，具有一定免疫原性，适合作为抗原抗体检测的重要靶标。因此本文以构建的pMD-D15载体为基础，构建了pET32a-OmpD15表达载体并在Rostta细胞中得到了表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，通过梯度透析法获得纯化的重组蛋白。用初步纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以破碎的App作为抗原用ELISA方法检测抗血清，结果显示抗OmpD15血清能识别App，且3号免疫小鼠效价最高；Western-blot分析发现该重组蛋白可与抗App血清型5a血清中的抗体发生特异性反应，结果表明本实验所获得的D15重组蛋白具有良好的抗原性。用最小致死量App攻毒Balb/c小鼠，以D15重组蛋白作为抗原，ELISA方法监测小鼠体内抗体水平变化，发现攻毒后第三天即可在小鼠体内检测到OmpD15抗体的存在。通过OmpD15的原核表达、纯化及抗原性分析等的研究，为以表面抗原蛋白OmpD15开发亚单位疫苗、建立猪胸膜肺炎的ELISA诊断方法提供了理论基础及实验依据。
李本强[10]（2010）在《重组外膜蛋白抗原检测猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA方法的建立》文中指出猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种以肺脏的出血、坏死及纤维素性胸膜肺炎粘连为特征的传染病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子很多,其中外膜蛋白被认为是该菌的重要毒力因子。本论文旨在应用分子生物学技术,对猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因片段在原核表达系统中表达,为建立猪传染性胸膜肺炎的诊断方法和研制高效的亚单位疫苗奠定基础。本研究以胸膜肺炎放线杆菌I型为研究对象,进行了培养和生物学特性的研究,并对小鼠进行了免疫学研究。结果表明血清I型菌株对小白鼠的半数致死量（LD50）为1.36×105.5CFU。第一次免疫小鼠两周后用试管凝集方法测得血清凝集价为4log2,第二次免疫小鼠两周后试管凝集价为6log2。首免两周后,以100 LD50菌液攻击相同血清型的小鼠,攻毒保护数5/6;二免两周后攻击相同剂量菌液,攻毒保护为6/6。根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型外膜蛋白基因序列设计合成了一对特异性引物,以放线杆菌血清I型菌株基因组DNA为模板,扩增出了预期约为1 319bp的目的片段,然后连接到pGEM-T-easy中,构建了重组质粒,重组质粒经酶切鉴定和序列分析鉴定为外膜蛋白基因。将所获得的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的外膜蛋白基因序列,同Genbank上已报道的胸膜肺炎放线杆菌血清3、5、7型菌外膜蛋白基因序列之间进行同源性比较,同源性在97.9%-98.1%之间。运用鉴定正确的重组质粒,酶切回收外膜蛋白基因片段,插入到原核表达载体pET-15b,构建原核表达质粒。在转化大肠杆菌BL21中进行诱导,表达了重组外膜蛋白为48.766KD,经鉴定此蛋白与预期的胸膜肺炎放线杆菌的外膜蛋白大小相同。Western-blotting结果表明标准胸膜肺炎放线杆菌血清I型的外膜蛋白可与I型阳性血清发生反应,具有良好的免疫原性。将纯化后的表达产物外膜蛋白包被96孔酶标板,建立了间接ELISA方法。并对临床送检血清及APP标准阳性血清进行了检测。该方法的试验结果表明,建立的间接ELISA检测方法具有较好的敏感性和特异性,可用于初步检测。
二、猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立（论文提纲范文）
（1）三种猪呼吸道病原TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 猪三种呼吸道病原及荧光定量PCR方法的研究概况 |
| 1.1 胸膜肺炎放线杆菌研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.3.1 外毒素 |
| 1.1.3.2 荚膜多糖 |
| 1.1.3.3 脂多糖 |
| 1.1.3.4 转铁结合蛋白 |
| 1.1.4 胸膜肺炎放线杆菌诊断方法的研究 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 毒力因子 |
| 1.2.3.1 外膜蛋白 |
| 1.2.3.2 脂多糖 |
| 1.2.3.3 细胞致死性膨胀毒素 |
| 1.2.3.4 神经氨酸酶 |
| 1.2.4 副猪嗜血杆菌诊断方法的研究 |
| 1.3 猪肺炎支原体研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 抗原蛋白 |
| 1.3.4 猪肺炎支原体诊断方法的研究 |
| 1.4 实时荧光定量PCR检测技术的研究进展 |
| 1.4.1 荧光染料法荧光定量PCR |
| 1.4.2 TaqMan探针法荧光定量PCR |
| 1.5 APP、HPS和 Mhp多重PCR及荧光定量PCR诊断方法的研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 APP、HPS及 Mhp TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株,菌株和细胞株 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2.2 细菌DNA的提取 |
| 2.3 质粒19T-APPapx IV的构建 |
| 2.3.1 Apx IV目的片段回收纯化 |
| 2.3.2 目的片段Apx IV与载体19T的连接 |
| 2.3.3 转化 |
| 2.3.4 阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 2.3.5 19T-APPapx IV质粒的提取、浓度的测定及鉴定 |
| 2.4 质粒19T-HPSomp2 的构建 |
| 2.4.1 Omp2 目的片段回收纯化 |
| 2.4.2 目的片段Omp2 与载体19T的连接 |
| 2.4.3 转化 |
| 2.4.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.4.5 19T-HPSomp2 质粒的提取、浓度的测定及鉴定 |
| 2.5 质粒19T-Mhp P46 的构建 |
| 2.5.1 P46 目的片段回收纯化 |
| 2.5.2 目的片段P46 与载体19T的连接 |
| 2.5.3 转化 |
| 2.5.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.5.5 19T-Mhp P46 质粒的提取、浓度的测定及鉴定 |
| 2.6 TaqMan多重荧光定量PCR扩增 |
| 2.6.1 TaqMan多重荧光定量PCR反应条件优化 |
| 2.6.2 TaqMan多重荧光定量PCR特异性试验 |
| 2.6.3 TaqMan多重荧光定量PCR标准曲线建立 |
| 2.6.4 TaqMan多重荧光定量PCR灵敏性试验 |
| 2.6.5 TaqMan多重荧光定量PCR重复性试验 |
| 2.7 结果 |
| 2.7.1 阳性质粒鉴定结果 |
| 2.7.2 标准模板制备结果 |
| 2.7.3 TaqMan多重荧光定量PCR反应条件优化结果 |
| 2.7.4 TaqMan多重荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 2.7.5 TaqMan多重荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.7.6 TaqMan多重荧光定量PCR灵敏性试验结果 |
| 2.7.7 TaqMan多重荧光定量PCR重复性试验结果 |
| 2.8 讨论 |
| 2.9 小结 |
| 第三章 APP、HPS及 Mhp TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的临床应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 主要仪器设备 |
| 附录 B 实验操作方法 |
| 附录 C 重组质粒测序结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎及其危害 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.4 治疗和防控 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的检测与诊断 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 分子生物学诊断 |
| 1.2.3 血清学诊断 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 亚单位疫苗 |
| 1.3.3 弱毒活疫苗 |
| 1.3.4 菌影疫苗 |
| 2 目的和意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株和血清 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 主要培养基及溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 试验动物 |
| 3.1.6 疫苗 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒的转化 |
| 3.2.2 重组质粒的提取 |
| 3.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.5 包涵体蛋白的纯化 |
| 3.2.6 蛋白浓度的测定 |
| 3.2.7 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.2.8 重组蛋白的Western-Blot检测 |
| 3.2.9 Apx毒素间接ELISA方法的建立 |
| 3.2.10 免疫血清的制备 |
| 3.2.11 抗体消长的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 重组质粒的鉴定 |
| 4.2 重组蛋白的SDS-PAGE及 Western-blot验证 |
| 4.3 Apx毒素间接ELISA方法的建立 |
| 4.3.1 rApxIA间接ELISA检测方法 |
| 4.3.2 rApxIIA间接ELISA检测方法 |
| 4.3.3 rApxIIIA间接ELISA检测方法 |
| 4.4 猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体消长规律 |
| 4.4.1 rApxIA-ELISA抗体消长规律 |
| 4.4.2 rApxIIA-ELISA抗体消长规律 |
| 4.4.3 rApxIIIA-ELISA抗体消长规律 |
| 5 讨论 |
| 5.1 间接ELISA抗原的选择 |
| 5.2 rApxIA、rApxIIA和 rApxIIIA重组蛋白的纯化 |
| 5.3 间接ELISA的建立 |
| 5.4 疫苗免疫消长规律对免疫程序的建议 |
| 5.5 实验动物对实验的影响 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）盐酸多西环素-氟苯尼考注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的PK-PD同步模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 猪胸膜肺炎放线杆菌病的研究进展 |
| 1.2.2 猪副猪嗜血杆菌病的研究进展 |
| 1.2.3 氟苯尼考的药效学和药动学研究 |
| 1.2.4 盐酸多西环素药效学与药动学研究 |
| 1.2.5 药动学-药效学(PK-PD)模型研究进展 |
| 1.3 研究内容与目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 药品与试剂 |
| 2.1.1 药品 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 药物溶液和培养基的配制 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 动物与菌种 |
| 2.3.1 动物 |
| 2.3.2 菌种 |
| 2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 2.4.1 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌MIC的测定 |
| 2.4.2 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌MIC的测定 |
| 2.5 致病性胸膜肺炎放线杆菌的选择 |
| 2.5.1 胸膜肺炎放线杆菌血清型鉴定 |
| 2.5.2 胸膜肺炎放线杆菌小鼠毒力实验 |
| 2.6 致病性副猪嗜血杆菌的选择 |
| 2.6.1 副猪嗜血杆菌血清型鉴定 |
| 2.6.2 副猪嗜血杆菌小鼠毒力实验 |
| 2.6.3 联合抗菌活性的测定 |
| 2.7 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌的体外药效学研究 |
| 2.7.1 胸膜肺炎放线杆菌生长曲线的绘制 |
| 2.7.2 最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 |
| 2.7.3 耐药防突变浓度(MPC)的测定 |
| 2.7.4 抗菌后效应(PAE)的测定 |
| 2.7.5 杀菌曲线的绘制 |
| 2.8 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌的体外药效学研究 |
| 2.8.1 副猪嗜血杆菌生长曲线的绘制 |
| 2.8.2 最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 |
| 2.8.3 耐药防突变浓度(MPC)的测定 |
| 2.8.4 抗菌后效应(PAE)的测定 |
| 2.8.5 杀菌曲线的绘制 |
| 2.9 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF在猪体内的药动学研究 |
| 2.9.1 FF和 Dox·HCl在血浆和肺泡灌洗液中HPLC方法的建立 |
| 2.9.2 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF在猪体内的药动学实验 |
| 2.9.3 尿素氮(BUN)检测 |
| 2.9.4 FF和 Dox·HCl在肺泡液中蛋白结合率的测定 |
| 2.10 数据处理与PK-PD模型的拟合 |
| 2.10.1 药动学数据处理 |
| 2.10.2 半体内PK-PD模型的拟合 |
| 2.10.3 给药方案的制定 |
| 3 结果 |
| 3.1 MIC测定结果 |
| 3.1.1 FF、Dox·HCl和 Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌的MIC测定结果 |
| 3.1.2 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌的MIC测定结果 |
| 3.2 致病性胸膜肺炎放线杆菌的选择 |
| 3.2.1 胸膜肺炎放线杆菌血清型鉴定 |
| 3.2.2 胸膜肺炎放线杆菌小鼠毒力实验 |
| 3.3 致病性副猪嗜血杆菌的选择 |
| 3.3.1 副猪嗜血杆菌血清型鉴定 |
| 3.3.2 副猪嗜血杆菌小鼠毒力实验 |
| 3.3.3 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的联合抗菌活性结果 |
| 3.4 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对致病性胸膜肺炎放线杆菌的体外药效学试验 |
| 3.4.1 胸膜肺炎放线杆菌BW1的生长曲线 |
| 3.4.2 FF、Dox·HCl和 Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌BW1 的药敏实验结果 |
| 3.4.3 FF、Dox·HCl和 Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌BW1 的体外杀菌曲线和半体内杀菌曲线 |
| 3.4.4 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌BW1 的抗菌后效应 |
| 3.5 FF、Dox·HCl和 Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌的体外药效学试验 |
| 3.5.1 副猪嗜血杆菌55的生长曲线 |
| 3.5.2 FF、Dox·HCl和 Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌55的MIC、MBC以及体外MPC的测定 |
| 3.5.3 FF、Dox·HCl以及Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌55 的体外杀菌曲线和半体内杀菌曲线 |
| 3.5.4 FF、Dox·HCl以及Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌55 的抗菌后效应 |
| 3.6 FF、Dox·HCl和 Dox·HCl/FF在猪体内的药动学研究 |
| 3.6.1 Dox·HCl和 FF在猪血浆和肺泡灌洗液中HPLC定量分析方法学 |
| 3.6.2 FF、Dox·HCl、Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌在猪血浆中的药动学 |
| 3.6.3 FF、Dox·HCl以及Dox·HCl/FF对胸膜肺炎放线杆菌在猪肺泡灌洗液中的药动学 |
| 3.6.4 Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌在猪血浆中的药动学 |
| 3.6.5 Dox·HCl/FF注射剂对副猪嗜血杆菌在猪肺泡液中的药动学 |
| 3.7 Sigmoid Emax PK-PD模型 |
| 3.7.1 Dox·HCl/FF注射剂对胸膜肺炎放线杆菌在猪肺泡液中的PK/PD参数值 |
| 3.7.2 Dox·HCl/FF注射剂对胸膜肺炎放线杆菌半体内PK-PD模型的拟合 |
| 3.7.3 Dox·HCl/FF注射剂对副猪嗜血杆菌在猪肺泡液中的PK/PD参数值 |
| 3.7.4 Dox·HCl/FF注射剂对副猪嗜血杆菌半体内PK-PD模型的拟合 |
| 3.7.5 Dox·HCl/FF注射剂对胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌给药方案的确定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌强致病性菌株的筛选 |
| 4.2 Dox·HCl/FF对副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的药效学研究 |
| 4.3 Dox·HCl-FF注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌在猪体内的药动学研究 |
| 4.4 Dox·HCl-FF注射剂对胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌半体内PK-PD模型的拟合 |
| 4.5 给药方案的分析 |
| 5 全文总结 |
| 6 文献综述 兽用抗菌药物联合用药的 PK-PD 研究进展 |
| 6.1 联合用药 |
| 6.2 PK/PD |
| 6.2.1 PK/PD介绍 |
| 6.2.2 抗菌药物PK/PD的分类及对给药方案的指导 |
| 6.3 联合用药的PK/PD进展 |
| 6.3.1 β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂联合用药的PK/PD研究 |
| 6.3.2 β-内酰胺类与氨基糖苷类/氟喹诺酮类联合用药的PK/PD研究 |
| 6.3.3 磺胺类药物与甲氧苄啶类/氟喹诺酮类药物联合用药的PK/PD研究 |
| 6.4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A-研究生简介 |
| 附录 B-相关数据 |
（4）猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪链球菌研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 毒力因子 |
| 1.3 巴氏杆菌研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 毒力因子 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌研究进展 |
| 1.4.1 病原学 |
| 1.4.2 流行病学 |
| 1.4.3 毒力因子 |
| 1.5 猪肺炎支原体研究进展 |
| 1.5.1 病原学 |
| 1.5.2 流行病学 |
| 1.5.3 毒力因子 |
| 1.6 实验室检测技术 |
| 1.6.1 血清学方法 |
| 1.6.2 分子生物学方法 |
| 1.6.3 多重PCR检测方法 |
| 1.6.4 实时荧光定量PCR检测方法 |
| 1.6.5 微滴数字PCR定量检测方法 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 相关试剂的配制 |
| 3.1.4 主要仪器与设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 菌株培养 |
| 3.2.2 细菌、病毒基因组的提取 |
| 3.2.3 反转录 |
| 3.2.4 核酸浓度的测定 |
| 3.2.5 引物设计与合成 |
| 3.2.6 单重PCR退火温度的确定 |
| 3.2.7 单重PCR反应的特异性检验 |
| 3.2.8 单重PCR引物敏感性检验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 单重PCR退火温度的确定 |
| 3.3.2 单重PCR反应中引物特异性检验 |
| 3.3.3 单重PCR反应的敏感性检验 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌种、毒株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 相关试剂的配制 |
| 4.1.4 主要仪器与设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 五重PCR退火温度确定 |
| 4.2.2 五重PCR引物特异性检验 |
| 4.2.3 五重PCR反应敏感性检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 五重PCR反应退火温度的确定 |
| 4.3.2 五重PCR反应特异性检验 |
| 4.3.3 五重PCR敏感性检验 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的应用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 相关试剂的配制 |
| 5.1.4 主要仪器与设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 样品采集 |
| 5.2.2 基因组的提取 |
| 5.2.3 临床样品中猪呼吸系统病原菌的五重PCR检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文章综述 |
| 1 概述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害及流行病学特点 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的诊断 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎的防治 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌的特征 |
| 2 生物学特性 |
| 2.1 外毒素 |
| 2.2 ApxⅠ相关特性 |
| 2.3 ApxⅣ相关特性 |
| 2.4 荚膜多糖 |
| 2.5 脂多糖 |
| 2.6 外膜蛋白 |
| 2.7 转铁结合蛋白 |
| 3 研究目的意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA基因双重PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基、酶、试剂盒及其它试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 细菌的培养及DNA的提取 |
| 2.3 单重PCR体系的建立 |
| 2.4 双重PCR特异性和灵敏性检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 单重PCR实验结果 |
| 3.2 双重PCR实验结果 |
| 3.3 特异性和稳定性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 试验二 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIA基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 ApxIA基因DNA的提取 |
| 1.2.2 ApxI A 基因的 PCR 扩增 |
| 1.2.3 PCR产物经胶回收纯化 |
| 1.2.4 ApxIA基因片段与pMD18–T的连接 |
| 1.2.5 连接产物转化感受态细胞 |
| 1.2.6 p MD18–ApxIA的鉴定 |
| 1.2.7 测序分析 |
| 1.2.8 ApxIA基因的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ApxIA基因的扩增和T-A克隆与鉴定 |
| 2.2 ApxIA基因的生物信息学分析 |
| 2.2.1 ApxIA基因测序 |
| 2.2.2 ApxIA蛋白的理化性质分析 |
| 2.2.3 ApxIA蛋白磷酸化、糖基化位点的分析 |
| 2.2.4 ApxIA蛋白抗原肽与信号肽预测 |
| 2.2.5 ApxIA蛋白的亲/疏水性预测及跨膜结构域分析 |
| 2.2.6 ApxIA蛋白的二三级结构预测 |
| 3 讨论 |
| 试验三 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病菌来源 |
| 1.1.2 酶及其试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 细菌培养 |
| 2.3 p MD18-T-ApxⅣA重组质粒构建 |
| 2.3.1 ApxⅣA DNA提取 |
| 2.3.2 ApxⅣA基因序列的PCR扩增 |
| 2.3.3 PCR反应条件及电泳检测 |
| 2.3.4 胶回收以及重组质粒 |
| 2.3.5 ApxⅣA基因的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ApxⅣA基因片段PCR扩增、克隆与鉴定 |
| 3.2 基因测序 |
| 3.3 ApxⅣA片段基因信号肽测定 |
| 3.4 ApxⅣA基因稀有密码子的分析 |
| 3.5 ApxⅣA基因疏水性与亲水性的分析 |
| 3.6 Coil区分析 |
| 3.7 二级结构预测 |
| 4 讨论 |
| 试验四 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA多克隆抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 ApxIA和 ApxⅣA特征性抗原肽段的合成 |
| 2.2 合成多肽的溶解和分装 |
| 2.3 抗原与佐剂的乳化 |
| 2.4 免疫兔子制备 |
| 2.5 免疫前后采血 |
| 2.6 ELISA检测抗体 |
| 2.7 Western b Iot检测抗体 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 附录 |
（6）头孢喹肟和达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD同步模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 细菌的分类和形态结构 |
| 1.1.2 细菌的生物分类和血清型分类 |
| 1.1.3 致病因子 |
| 1.1.4 流行特点 |
| 1.1.5 诊断方法 |
| 1.1.6 防治措施 |
| 1.1.7 在防治猪胸膜肺炎时现存的问题 |
| 1.2 解决方案 |
| 1.2.1 基于杀菌曲线的PK/PD结合模型指导给药方案 |
| 1.2.2 基于MIC的 PK/PD结合模型指导给药方案 |
| 1.2.3 基于MPC的 PK/PD结合模型指导给药方案 |
| 1.2.4 微透析技术在PK/PD结合模型上的应用前景 |
| 1.3 研究的目的与意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第二章 头孢喹肟和达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 药品和试剂 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 药物储备液的配制 |
| 2.2.5 NAD储备液和灭菌生理盐水的配制 |
| 2.2.6 TSB和 TSA培养基的配制 |
| 2.2.7 猪胸膜肺炎放线杆菌的启用和培养 |
| 2.2.8 猪胸膜肺炎放线杆菌的鉴定 |
| 2.2.9 猪胸膜肺炎放线杆菌生长曲线的绘制 |
| 2.2.10 对数期菌悬液的制备 |
| 2.2.11 头孢喹肟和达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的敏感性测定 |
| 2.2.12 不同浓度药物在TSB中对猪胸膜肺炎放线杆菌的杀菌曲线 |
| 2.2.13 杀菌速率的计算 |
| 2.2.14 杀菌速率与药物浓度的拟合和分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细菌鉴定结果 |
| 2.3.2 猪胸膜肺炎放线杆菌在TSB中的生长曲线 |
| 2.3.3 头孢喹肟和达氟沙星在TSB肉汤中对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC和 MBC |
| 2.3.4 头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性 |
| 2.3.5 头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌杀菌速率的计算和拟合 |
| 2.3.6 达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性 |
| 2.3.7 达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌杀菌速率的计算和拟合 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 头孢喹肟在猪体内对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 药品和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 药液和试剂的配制 |
| 3.2.5 猪胸膜肺炎放线杆菌培养基的配制 |
| 3.2.6 猪胸膜肺炎放线杆菌培养方法 |
| 3.2.7 试验动物和猪组织笼的埋置 |
| 3.2.8 头孢喹肟在TSB和 TCF中对猪胸膜肺炎放线杆菌的敏感性检测 |
| 3.2.9 猪组织笼感染模型的建立 |
| 3.2.10 给药方案和组织液样品的收集 |
| 3.2.11 头孢喹肟在TCF中浓度的检测 |
| 3.2.12 PK/PD参数与抗菌效果的拟合 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC |
| 3.3.2 头孢喹肟在猪组织笼感染模型中的药动学 |
| 3.3.3 头孢喹肟在猪组织笼感染模型中对猪胸膜肺炎放线杆菌的抗菌活性 |
| 3.3.4 PK/PD参数与抗菌效果的拟合分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 达氟沙星在猪体内对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD-MSW研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 药品和试剂 |
| 4.2.3 仪器设备 |
| 4.2.4 试剂配制 |
| 4.2.5 达氟沙星在MHA上对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC、MIC_(99)和MPC的测定 |
| 4.2.6 猪组织笼感染模型的建立 |
| 4.2.7 达氟沙星的给药方案和在组织液中的药动学 |
| 4.2.8 达氟沙星在组织笼对猪胸膜肺炎放线杆菌的杀菌曲线和突变菌的恢复生长曲线 |
| 4.2.9 猪胸膜肺炎放线杆菌敏感性和突变频率的检测 |
| 4.2.10 PK/PD参数与细菌敏感性和突变频率的关系 |
| 4.2.11 耐药菌的QRDRs基因的PCR扩增 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC、MIC_(99)、MPC |
| 4.3.2 达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的杀菌曲线和耐药菌的恢复生长曲线 |
| 4.3.3 达氟沙星在组织笼内的药动学 |
| 4.3.4 猪胸膜肺炎放线杆菌敏感性和突变分数变化 |
| 4.3.5 PK/PD参数与耐药突变菌的关系 |
| 4.3.6 耐药菌外排泵机制的检验和耐药基因的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 小鼠大腿微透析液中头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD同步模型 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌种和实验试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 药液和试剂的配制 |
| 5.2.4 实验动物 |
| 5.2.5 头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌敏感性检测 |
| 5.2.6 微透析探针对头孢喹肟的体外回收率的测定 |
| 5.2.7 免疫抑制小鼠和感染小鼠的制备 |
| 5.2.8 小鼠大腿微透析探针的埋置及对头孢喹肟的体内回收率测定 |
| 5.2.9 游离头孢喹肟在小鼠血浆和大腿中的药动学 |
| 5.2.10 微透析技术测量头孢喹肟在血浆中的蛋白结合率 |
| 5.2.11 血浆和透析液中头孢喹肟浓度的检测 |
| 5.2.12 头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD结合模型的研究 |
| 5.2.13 PK/PD参数与抗菌效果关系的分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 头孢喹肟对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC |
| 5.3.2 微透析探针在体内外对头孢喹肟的回收率 |
| 5.3.3 微透析探针对头孢喹肟的体内回收率和头孢喹肟的血浆蛋白结合率 |
| 5.3.4 游离头孢喹肟在小鼠血浆和大腿中的药动学 |
| 5.3.5 PK/PD参数与抗菌效果的关系 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文讨论与结论及创新点 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.2 全文结论 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:感染小鼠血浆和大腿中的游离头孢喹肟浓度及给药前后的细菌数量 |
| 附录B:发表的文章 |
（7）猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋耐药判定标准研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 猪胸膜肺炎放线杆菌耐药性研究 |
| 1.2.2 头孢噻呋药效学与药动学研究进展 |
| 1.2.3 耐药判定标准研究进展 |
| 1.3 研究内容与目标 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 药品与试剂 |
| 2.1.1 药品 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 药物溶液和培养基的配置 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 试验菌种 |
| 2.4 试验动物 |
| 2.5 野生型临界值的制定 |
| 2.5.1 菌种的鉴定与保存 |
| 2.5.2 体外敏感性的测定 |
| 2.5.3 制定野生型临界值 |
| 2.6 头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌PK-PD研究及药效学临界值的制定 |
| 2.6.1 头孢噻呋对猪致病性胸膜肺炎放线杆菌药效学研究 |
| 2.6.2 头孢噻呋在胸膜肺炎放线杆菌患病猪体内药动学研究 |
| 2.6.3 Sigmoid E_(max) PK-PD模型构建 |
| 2.6.4 药效学临界值的制定 |
| 2.7 临床临界值和耐药判定标准的制定 |
| 2.7.1 临床实验菌株菌株的筛选 |
| 2.7.2 实验分组和治疗 |
| 2.7.3 猪胸膜肺炎放线杆菌患病模型的建立 |
| 2.7.4 临床症状评判标准 |
| 2.7.5 定量判断疗效指标 |
| 2.7.6 临床临界值的制定 |
| 2.7.7 耐药判定标准的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 野生型临界值的制定 |
| 3.1.1 猪胸膜肺炎放线杆菌PCR鉴定 |
| 3.1.2 敏感性测定结果 |
| 3.1.3 建立野生型临界值 |
| 3.2 头孢噻呋对致病性胸膜肺炎放线杆菌PK-PD研究及药效学临界值制定 |
| 3.2.1 头孢噻呋对致病性胸膜肺炎放线杆菌药效学研究 |
| 3.2.2 头孢噻呋在猪体内的药动学研究 |
| 3.2.4 药效学临界值的制定 |
| 3.2.5 Sigmoid Emax模型的构建 |
| 3.3 临床临界值和耐药判定标准的制定 |
| 3.3.1 攻毒菌株的选择 |
| 3.3.2 临床疗效 |
| 3.3.3 临床临界值的制定 |
| 3.3.4 耐药判定标准的制定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌敏感性检测 |
| 4.2 野生型临界值的制定 |
| 4.3 猪胸膜肺炎放线杆菌致病性菌株的筛选 |
| 4.4 头孢噻呋对猪胸膜肺炎放线杆菌的药效学/药动学研究 |
| 4.5 药效学临界值的制定 |
| 4.6 临床临界值的制定 |
| 5 全文总结 |
| 6 文献综述 |
| 6.1 动物呼吸道疾病概述 |
| 6.1.1 动物呼吸道细菌 |
| 6.2 头孢噻呋的概述 |
| 6.3 头孢噻呋的药效学 |
| 6.3.1 头孢噻呋对牛,马呼吸道细菌的药效学研究 |
| 6.3.2 头孢噻呋对猪呼吸道细菌的药效学 |
| 6.4 头孢噻呋的药动学 |
| 6.4.1 分布与吸收 |
| 6.4.2 生物转化 |
| 6.4.3 头孢噻呋在牛体内的药动学研究 |
| 6.4.4 头孢噻呋在马体内的药动学研究 |
| 6.4.5 头孢噻呋在猪体内的药动学研究 |
| 6.4.6 头孢噻的临床应用 |
| 6.5 头孢噻呋的毒性,不良反应和残留 |
| 6.5.1 头孢噻呋的毒性和不良反应 |
| 6.5.2 头孢噻呋残留 |
| 6.6 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）安徽地区猪传染性胸膜肺炎血清学调查及APP分离与生物学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要略缩语列表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 安徽省的地理划分 |
| 1.1.2 样品及来源 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 ELISA试剂盒 |
| 1.1.5 APP鉴定PCR引物序列 |
| 1.1.6 抗生素药敏试验纸片 |
| 1.1.7 细菌微量生化反应管 |
| 1.1.8 主要仪器 |
| 1.1.9 相关培养基及溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 样品采集及处理 |
| 1.2.2 ELISA方法检测APP感染抗体 |
| 1.2.3 三种PCR方法敏感性比较 |
| 1.2.4 三种PCR方法特异性比较 |
| 1.2.5 三种PCR方法检测鼻腔棉拭子中APP核酸 |
| 1.2.6 四种选择性培养基分离鼻腔棉拭子中APP |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 1.2.8 APP形态学观察 |
| 1.2.9 NAD需求试验 |
| 1.2.10 生化试验 |
| 1.2.11 药敏试验 |
| 1.2.12 APP生长曲线的测定 |
| 1.2.13 凝胶脉冲场试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 血清APP感染抗体检测结果 |
| 2.1.1 安徽省与其他省份血清APP感染抗体检测结果比较 |
| 2.1.2 不同生长阶段血清APP感染抗体检测结果 |
| 2.1.3 不同季节血清APP感染抗体检测结果 |
| 2.1.4 不同地区血清APP感染抗体检测结果 |
| 2.1.5 不同规模猪场血清APP感染抗体检测结果 |
| 2.2 三种PCR方法敏感性比较结果 |
| 2.3 三种PCR方法特异性比较结果 |
| 2.4 三种PCR方法检测鼻腔棉拭子中APP核酸结果 |
| 2.5 四种选择性培养基分离鼻腔棉拭子中APP结果 |
| 2.6 dsbE-PCR检测结果与mPPLO分离结果比较 |
| 2.7 APP形态学观察结果 |
| 2.8 NAD需求试验结果 |
| 2.9 生化试验结果 |
| 2.10 药敏试验结果 |
| 2.11 APP生长曲线测定结果 |
| 2.12 脉冲场凝胶电泳结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 PCP对养猪业的危害 |
| 3.2 安徽地区PCP的流行情况 |
| 3.3 三种PCR方法的APP核酸检出率比较 |
| 3.4 四种选择性培养基的APP分离率比较 |
| 3.5 APP分离株的生物学特性 |
| 3.6 APP分离株基因型分型 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在读期间发表论文 |
（9）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理及其危害 |
| 1.4.1 致病机理 |
| 1.4.2 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子 |
| 1.5.1 溶血毒素（Apx） |
| 1.5.2 外膜蛋白（Omp） |
| 1.5.3 荚膜多糖（CPS） |
| 1.5.4 脂多糖（LPS） |
| 1.5.5 其他毒力因子 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病原学方法 |
| 1.6.2 血清型方法 |
| 1.6.3 分子学诊断方法 |
| 1.7 猪传染性胸膜肺炎的防制 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 检测方法的建立、药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.1.1 培养基及菌株 |
| 2.1.2 酶类及主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 App 基因组提取 |
| 2.1.5 PCR 扩增 |
| 2.1.6 App PCR 特异性检测 |
| 2.1.7 App PCR 敏感性检测 |
| 2.1.8 重复性试验 |
| 2.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.2.1 培养基及实验菌株 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 试验用药及药敏片制备 |
| 2.2.4 药品原液制备及保存 |
| 2.2.5 菌株的活化及菌液制备 |
| 2.2.6 药敏试验 |
| 2.2.7 MIC 的测定 |
| 2.2.8 结果判定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 App 标准菌株 PCR 扩增 |
| 2.3.2 App PCR 扩增特异性试验 |
| 2.3.3 App 的敏感性试验 |
| 2.3.4 重复性试验 |
| 2.3.5 建立的 PCR 方法对临床分离菌株的鉴定 |
| 2.3.6 药敏试验 |
| 2.3.7 MIC 的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.4.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 第三章 毒力因子 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 基因片段的克隆 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 仪器及试剂 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂配制 |
| 3.2 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 片段的扩增与克隆 |
| 3.2.1 基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.2 基因的扩增 |
| 3.2.3 PCR 产物电泳及纯化 |
| 3.2.4 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接 |
| 3.2.5 感受态细胞制备 |
| 3.2.6 连接产物的转化和阳性菌落的鉴定 |
| 3.2.7 阳性克隆质粒的提取 |
| 3.2.8 阳性克隆质粒序列测定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 ApxⅠC、ApxⅡA、 OmpD15 基因片段的克隆结果 |
| 3.4.2 测序结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 OmpD15 的原核表达及其抗原性分析 |
| 4.1 OmpD15 基因的原核表达 |
| 4.1.1 工具酶及主要试剂配制 |
| 4.1.2 OmpD15 的基因扩增 |
| 4.1.3 目的片段和载体的酶切、电泳及回收 |
| 4.1.4 基因 OmpD15 的连接与转化 |
| 4.1.5 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.1.6 pET32a-OmpD15 重组表达质粒的诱导表达 |
| 4.1.7 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.1.8 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.1.9 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.2 动物实验 |
| 4.2.1 实验材料及实验动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.2.4 抗体的监测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 OmpD15 基因的扩增 |
| 4.3.2 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.3.3 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.3.4 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.3.5 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.3.6 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.3.7 抗体的监测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（10）重组外膜蛋白抗原检测猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1 猪胸膜肺炎放线杆菌研究的目的和意义 |
| 2 猪胸膜肺炎放线杆菌的研究现状 |
| 2.1 猪胸膜肺炎放线杆菌的生物学特性 |
| 2.2 猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断方法 |
| 2.3 猪胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子研究现状 |
| 2.4 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展 |
| 3 本研究的特色 |
| 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1 型生物学特性及对小鼠的免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 药物及试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 培养基的制备 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 APP-1 菌株培养性状 |
| 2.2 卫星现象观察结果 |
| 2.3 生化试验结果 |
| 2.4 中草药茶多酚及抗生素药物对猪胸膜肺炎放线杆菌血清１型抑菌效果比较结果 |
| 2.5 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1 型对小鼠的致病性及免疫原性研究结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌OMP基因的克隆和原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 APP-1 OMP基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 APP-1 OMP 基因的克隆与酶切鉴定 |
| 2.3 APP 1 OMP基因测序结果及核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 2.4 表达重组质粒的鉴定 |
| 2.5 OMP基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 第三章 APP-1 OMP蛋白的纯化及间接OMP-ELISA方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western-blotting 分析结果和OMP融合蛋白的纯化结果 |
| 2.2 间接ELISA操作的相应结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立（论文参考文献）
- [1]三种猪呼吸道病原TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 冯逸雪. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定[D]. 熊如月. 华中农业大学, 2020(05)
- [3]盐酸多西环素-氟苯尼考注射剂对猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的PK-PD同步模型研究[D]. 袁园园. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立与应用[D]. 梁娟. 西南大学, 2020(01)
- [5]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备[D]. 程素芳. 江西农业大学, 2019
- [6]头孢喹肟和达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD同步模型研究[D]. 张龙飞. 华南农业大学, 2019
- [7]猪胸膜肺炎放线杆菌对头孢噻呋耐药判定标准研究[D]. 孙达. 华中农业大学, 2019(02)
- [8]安徽地区猪传染性胸膜肺炎血清学调查及APP分离与生物学特性研究[D]. 施雷. 安徽农业大学, 2015(05)
- [9]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D]. 朱岩昆. 河南师范大学, 2013(S2)
- [10]重组外膜蛋白抗原检测猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA方法的建立[D]. 李本强. 天津农学院, 2010(05)