一、胃粘膜疾病组织芯片制作及13种细胞周期调控因子的检测（论文文献综述）
陈媛媛[1]（2021）在《长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制》文中研究说明一、背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球第三大最常见的癌症,尽管早期诊断和干预方面的技术进步已经有效改善了结直肠癌的总体生存率,但鉴于结直肠癌高复发率、高转移性及抗癌治疗的耐受性,晚期结直肠癌患者的预后仍然较差。术前放疗是晚期结直肠癌的常规治疗方法之一,但是近三分之一的结直肠癌患者对放疗表现出低敏感性或者完全抵抗。因此,放疗抵抗仍是治疗结直肠癌面临的主要挑战。在“精准医疗”的时代,探索克服放疗抵抗的新靶点或新分子,是个体化治疗结直肠癌患者的重要工具,对于提高结直肠癌患者的总体生存率有十分重要的意义。DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）是一种精确的信号级联系统,可以检测DNA损伤并决定受损细胞的命运,是肿瘤生物学研究的重要领域之一,尤其在肿瘤的放疗敏感性调控中起关键作用。肿瘤细胞产生放疗抗性的重要原因是,癌细胞可以识别电离辐射诱导的DNA损伤,并通过激活各种途径修复这些损伤,癌细胞对DNA损伤具有较高的修复活性,因此对放疗产生高度抵抗。结直肠癌的发生也与癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因突变有关,如KRAS、TP53和BRCA1/2突变等,这些突变会引起基因组不稳定性,促进癌变过程。研究显示,靶向DNA损伤修复可以有效提高结直肠癌对放疗的敏感性,但关于DNA损伤修复的调控机制仍不清楚,研究发现了很多新的调控分子在DDR中发挥关键作用。因此,进一步寻找肿瘤中DNA损伤修复异常激活的新靶点或新分子,对于克服放疗抵抗、提高癌症治愈率具有重要意义。长链非编码RNA（Long noncoding RNA,lnc RNA）可以调节多种生物学过程,如细胞周期、细胞分化、X染色体失活、m RNA选择性剪接、RNA转录和翻译等。多项研究表明,lnc RNA失调是结直肠癌发生的主要因素之一,它通过调控其靶基因的表达,影响结直肠癌中的信号通路、癌细胞转移以及对放疗的敏感性。lnc RNA在DNA损伤修复中具有重要作用,它可以通过直接或间接的转录方式与蛋白质、DNA或RNA相互作用,调控DNA损伤修复。因此lnc RNA通过DNA修复通路调控结直肠癌对放疗的敏感性已经成为临床研究的一个重要领域,探索能够通过DDR通路调节结直肠癌放疗抗性的候选lnc RNA及其分子机制,对于改善结直肠癌患者的临床疗效意义重大。但是,目前大多数lnc RNA在DDR中的功能在很大程度上尚未阐明。ATR是检查点信号通路的中心转导因子,它可被DNA损伤和复制应激激活,在DNA损伤修复、细胞周期调节和细胞凋亡中具有广泛的功能和重要的生理意义。基于我们前期发现DNA损伤修复关键分子ATR具有结合lnc RNA能力的认知前提,本课题以此为切入点,利用RNA免疫共沉淀与高通量测序（RIP-seq）筛选出与ATR结合的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR验证,筛选出与ATR结合丰度最高的SCARNA2,从DNA损伤修复角度,全面探索了它调控结直肠癌放疗敏感性的具体效应及分子机制,为开发潜在的、预测结直肠癌放疗敏感性的标志物和治疗靶点提供了新的科学依据。二、研究内容及方法（一）Lnc RNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨1、RIP-seq筛选ATR结合的lnc RNA首先选用ATR抗体通过RNA免疫共沉淀方法（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）富集与ATR结合的RNA,通过高通量二代测序筛选与ATR结合的lnc RNA,选取排名前30位的lnc RNA,然后通过RIP和RT-PCR的方法验证它们与ATR的相互作用关系,发现SCARNA2与ATR的结合丰度最高,因此将目标靶分子确定为SCARNA2。通过探究SCARNA2在15种细胞系的基础表达量,确定研究细胞系为结肠癌细胞系HCT116和HT29。2、DNA损伤对SCARNA2表达水平的影响将HCT116和HT29细胞经电离辐射（Ionizing radiation,IR）、DNA损伤诱导剂喜树碱（Camptothecin,CPT）或依托泊苷（Etoposide,ETO）处理后,在不同时间点分别提取细胞的RNA,经反转录和RT-PCR检测SCARNA2转录水平的变化。将HCT116和HT29细胞分别与DDR通路抑制剂（DNA-PKcs抑制剂Nu7441、ATM抑制剂Ku-55933、ATR抑制剂VE-821）孵育后,再分别用IR、CPT或ETO处理细胞后,在SCARNA2响应DNA损伤最明显的时间点提取RNA,RT-PCR检测DDR通路抑制剂对SCARNA2转录水平的影响。3、SCARNA2对DNA损伤修复通路的影响通过慢病毒包装质粒系统构建SCARNA2敲低（sh-SCARNA2）、CRISPR Cas9敲除（sg-SCARNA2）和过表达（SCARNA2-OE）稳转细胞系,通过RT-PCR测定下调和过表达效率。通过彗星电泳检测SCARNA2下调细胞照后的DNA损伤程度;通过免疫荧光的方法检测SCARNA2干扰细胞在照后0、0.5、4、8、12和24 h形成γH2AX和53BP1 foci的动态变化情况。最后通过蛋白凝胶电泳（Western Blot,WB）的方法检测SCARNA2下调细胞经IR、CPT或ETO处理后,DDR通路相关蛋白分子的表达水平变化情况。（二）Lnc RNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径的调控作用及机制1、下调SCARNA2对细胞照后基因转录组的影响取对照组和SCARNA2敲除组细胞,通过RNA-seq检测下调SCARNA2对照后基因转录组的影响。2、SCARNA2对非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复方式的影响通过构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统测定SCARNA2下调细胞中NHEJ或HR的修复效率。通过免疫荧光检测下调SCARNA2对细胞核中形成RAD51和RPA2 foci的动态变化过程的影响。3、SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定通过RNA pull down实验筛选HCT116细胞中与SCARNA2结合的蛋白复合物,然后通过质谱检测,筛选与SCARNA2结合的蛋白。4、SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作情况的影响通过免疫共沉淀的方法探讨SCARNA2对ATR与HR通路相关蛋白互作及蛋白修饰的影响。（三）Lnc RNA SCARNA2促进DNA损伤修复调控结直肠癌放疗敏感性1、SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的影响采用SCARNA2下调和过表达细胞系,经IR、CPT、ETO等处理后,通过克隆形成率、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术以及Western Blot检测SCARNA2对结肠癌细胞存活率、增殖能力和细胞活力、细胞凋亡率及细胞凋亡通路相关蛋白表达水平的影响,进而探究SCARNA2对结肠癌细胞放射敏感性的调控作用。通过流式细胞术和Western Blot检测结肠癌细胞经IR、CPT、ETO等处理后,SCARNA2对细胞周期进程以及周期通路相关蛋白水平变化的影响。2、SCARNA2对裸鼠荷瘤（CDX）模型放射敏感性的影响构建人源肿瘤细胞系裸鼠皮下荷瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）,通过测量照后裸鼠皮下荷瘤肿瘤的体积,探究SCARNA2对瘤体细胞增殖能力的影响;通过对肿瘤组织进行TUNEL染色,检测SCARNA2肿瘤细胞的凋亡情况;通过对肿瘤组织进行免疫组化染色,探究SCARNA2对HR通路相关分子蛋白表达水平的影响。通过以上体内实验,探究SCARNA2对裸鼠皮下肿瘤放疗敏感性的调控作用。3、SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结肠癌组织中的表达差异通过组织芯片荧光原位杂交（Florescence In-Situ Hybridization,FISH）的方法分别检测临床结直肠癌病人放疗敏感和抵抗的肿瘤组织中,SCARNA2、ATR的表达以及二者共定位情况。具体研究内容及方法见技术路线图（图1）图1.技术路线图三、研究结果:（一）Lnc RNA SCARNA2可以促进结肠癌细胞的DNA损伤修复1、通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,它在结肠癌细胞中的基础表达量相对较高,并且以时间依赖性的方式响应由IR、CPT和ETO诱导的DNA损伤应答;当使用ATM和ATR抑制剂后,显着抑制了SCARNA2对DNA损伤的响应,说明DNA损伤诱导的SCARNA2上调受ATM/ATR激酶调控。2、下调SCARNA2会显着加重电离辐射导致的DNA损伤,同时延缓了DNA损伤的修复过程;并且抑制了由IR、CPT或ETO诱导的ATR-Chk1通路的激活。（二）Lnc RNA SCARNA2通过HR通路调控DNA损伤修复1、SCARNA2通过HR通路促进DNA损伤修复,下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2在损伤位点的募集,进而延缓了DNA损伤修复过程。2、SCARNA2结合蛋白主要富集在细胞周期、DNA损伤修复、DNA复制与合成、RNA转录及翻译等通路。SCARNA2的缺失会对细胞周期、细胞凋亡以及DNA损伤刺激反应的相关基因转录组产生影响。此外,下调SCARNA2可以抑制ATR与HR通路相关蛋白如Top BP1、NBS1、Mre11、Chk1等的相互作用。3、SCARNA2的缺失抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化,其机制可能与Chk1甲基化或泛素化的修饰方式有关。（三）Lnc RNA SCARNA2通过促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌的放疗敏感性1、照射和DNA损伤剂处理后,下调SCARNA2可以降低结肠癌细胞的存活能力、增殖能力和细胞活力;促进细胞凋亡,抑制G2/M周期阻滞。2、通过移植瘤内多点注射sg-SCARNA2慢病毒载体,成功下调了瘤体细胞内SCARNA2的表达水平,发现下调SCARNA2可以抑制照后肿瘤的生长速度、促进肿瘤细胞的凋亡,并抑制照后肿瘤细胞的HR修复通路。3、相较放疗敏感的结直肠癌组织,SCARNA2在放疗抵抗的结直肠癌组织中的表达水平高了80%左右（p<0.00001）。四、结论:本研究通过RIP-seq筛选出与ATR结合的lnc RNA SCARNA2,通过一系列的体内外生物学实验发现SCARNA2与结肠癌细胞的DNA损伤修复和放射敏感性密切相关,SCARNA2的缺失可以抑制结肠癌细胞的DNA损伤修复能力。与DNA损伤诱导剂或IR联合使用,可以促进肿瘤细胞凋亡,增加了结肠癌细胞对放射的敏感性。通过对其具体机制的探讨,发现SCARNA2通过HR修复方式参与DNA损伤修复。缺失SCARNA2抑制了ATR下游靶点Chk1的磷酸化,其机制可能与Chk1发生了甲基化或泛素化修饰有关。同时,下调SCARNA2抑制了CDC25C的磷酸酶活性和Wee1的激活,进而通过影响Cyclin B/CDC2复合物的活性抑制G2/M期阻滞,由此明确SCARNA2通过激活ATR-Chk1-CDC25C/Wee1通路调控细胞周期进程。综上所述,SCARNA2有潜力成为结直肠癌的放疗增敏新靶点。此外,SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着,也有望作为潜在的结直肠癌放疗预后生物标志物。
赵传多[2]（2021）在《Cortactin在结直肠癌中的表达与临床病理参数的关系和对肿瘤细胞增殖的影响研究》文中研究说明背景皮动蛋白是一种分子标志物,在细胞骨架形成中,它作为一种肌动蛋白结合蛋白,对细胞运动及运输起作用。其在包括头颈部、乳腺、胃、肝脏等肿瘤组织中呈现高表达,与肿瘤进展及预后等方面均存在相关性。既往cortactin与结直肠癌相关研究较少,其表达对肿瘤细胞增殖的影响尚不清楚。目的通过免疫组化及组织芯片研究,明确皮动蛋白在结直肠癌组织及正常组织中的表达差异,分析其差异表达与肿瘤病理参数及预后的相关性。在体外对细胞中皮动蛋白表达进行调控,通过评估增殖能力及细胞周期与凋亡变化,探索其表达对于结直肠癌细胞增殖的影响。方法（1）应用免疫组化相关技术对319例结直肠癌患者手术标本中cortactin的表达进行检测,对比其在肿瘤组织和正常组织中的表达差异;（2）对比患者病理结果与该蛋白表达的关系,收集患者随诊及预后信息,并对比术后辅助治疗情况,分析cortactin对结直肠癌患者的临床指导作用;（3）采用Western blot法及qRT-PCR检测siRNA及质粒在体外细胞系中的转染效率,证实相关方法可以调节细胞系中cortactin蛋白的表达;（4）敲降两个肿瘤细胞系HT29和SW1116中cortactin的蛋白表达,EdU法检测细胞的增殖活性;（5）提高肿瘤细胞系SW1116和正常细胞系FHC中cortactin的表达,CCK8法检测细胞增殖活性;（6）对HT29、SW1116和FHC细胞系中的cortactin表达进行调控,对于细胞成球增殖能力和细胞群体依赖性,使用软琼脂克隆形成实验进行检测;使用流式细胞检测调控cortactin表达对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果（1）319例患者中cortactin在肿瘤组织中的表达比例显着高于在正常组织中的表达比例（p<0.001）;（2）319例患者中cortactin表达与肿瘤T分期（p=0.004）、N分期（p<0.001）、AJCC分期（p<0.001）、分化程度（p=0.015）、神经侵犯（p=0.004）和术前CEA（p=0.013）显着相关;（3）Cortactin表达与较差的无病生存期（DFS）（p=0.036）和总生存期（OS）（p=0.043）相关,分层分析显示这种倾向在Ⅱ-Ⅲ期患者中更明显;（4）在多因素分析中,cortactin表达是一个独立的预后风险因素,与较差的无病生存期（风险比3.686（95%CI 2.167-6.268）,p<0.001）和总生存期（风险比 2.018（95%CI 1.133-2.884）,,p=0.012）相关;（5）回顾性研究Ⅱ-Ⅲ期cortactin 阳性患者行术后放化疗后DFS（p=0.007）及OS（p=0.015）均延长;而对于cortactin阳性的Ⅱ期患者,术后放化疗并没有改善患者的DFS或OS;（6）降低cortactin表达可以减弱HT29、SW1116的细胞增殖能力;（7）提高SW1116和FHC中cortactin表达,可以增强肿瘤和正常细胞的增殖能力;（8）降低肿瘤细胞HT29、SW1116中cortactin表达可以促进细胞凋亡,降低细胞处于合成期的比例,减弱细胞的增殖成球能力;提高正常细胞FHC中cortactin表达,可以促进细胞凋亡,提高细胞处于合成期的比例,增强细胞的增殖成球能力。结论（1）结直肠癌患者癌组织中的cortactin阳性表达比例明显高于配对的正常组织;（2）结直肠癌组织中的cortactin的表达与肿瘤的T分期、N分期、AJCC分期、分化程度、神经侵犯和术前CEA均呈现相关性;（3）Cortactin表达是一个独立的预后风险因素,预示较差的DFS和OS,这种倾向在Ⅱ-Ⅲ期患者中更加明显;（4）对于术后辅助治疗有争议的中晚期患者,或是为了区分相同分期下的高危患者和管理病理分期与临床表现有差距的患者,cortactin表达可以作为一条参考标准;（5）肿瘤细胞中cortactin表达下降可以降低细胞增殖能力,促进细胞凋亡;正常细胞中cortactin表达上升可以增强细胞增殖能力,促进细胞凋亡。
吕星儿[3]（2021）在《胃癌预后分子指标ZNF326的发现及其在胃癌中的表达与功能研究》文中进行了进一步梳理目的:胃癌,是全球癌症发病率第五,癌症相关死亡原因第三的癌种。它在我国的发病率为第二位、死亡率为第三位。无论是在全球还是我国范围内,胃癌都是严重威胁人类健康的癌症之一。尽管随着标准术式推广,手术技法日渐纯熟,其它辅助治疗手段的提高,并且在分子机制、治疗选择和理解等方面都取得了重要进展,胃癌治疗水平有所提高,胃癌的预后仍不满意。因此,探寻胃癌发生发展中复杂的分子机制,为胃癌患者发现高效的胃癌诊断、预后评价的分子标志物和寻找靶向治疗的位点具有重要的临床意义。本研究旨在从公共数据库中寻找胃癌预后预测基因,并验证其表达与功能,对未来临床上选择合适的胃癌预后预测基因,建立胃癌预后预测模型,以及个体化精准治疗提供循证医学依据。研究方法:第一部分,我们通过GEO、TCGA数据库以及本地测序数据,进行胃癌基因差异表达以及预后预测分析。根据测序及芯片数据结果,选择ZNF326为我们的主要研究对象,并在TCGA数据库中对其肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、干细胞指数等进行相关分析。通过免疫组织化学染色的方法,分析ZNF326在胃癌组织中的表达水平,并且对其与患者病理资料及预后信息进行相关性分析,验证并探寻其用于临床诊断的价值与意义。第二部分,通过CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验和划痕实验测定ZNF326对胃癌细胞生物学特性的改变。通过裸鼠皮下成瘤和肺转移模型实验,验证ZNF326对胃癌细胞体内功能的影响。通过western blotting实验研究ZNF326对胃癌细胞EMT表型的影响。结果:1、在公共数据库中,ZNF326无论是在m RNA表达水平还是蛋白表达水平均与胃癌患者预后呈显着负相关,p值均小于0.001,即癌中相对表达较高者预后更好,且为独立于TNM分期的预后影响因子;2、在TCGA数据集中,ZNF326表达与TMB呈正相关（p<0.001,R=0.17）,与MSI呈正相关（p<0.001,R=0.28）,与基于表达数据所计算出的干细胞指数呈正相关（p<0.001,R=0.23）;3、ZNF326在胃癌组织中显着低表达（P=0.008）;4、ZNF326是独立的胃癌预后影响因素;5、在体外以及体内功能实验中,过表达ZNF326均能够抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,而敲除则促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭;6、ZNF326能够影响胃癌细胞EMT表型,过表达ZNF326能抑制胃癌细胞向间充质型转化,反之敲除ZNF326则能够导致胃癌细胞上皮型性状的丢失。结论:1、ZNF326在公开数据库中是一个独立的胃癌预后影响因子;2、ZNF326在胃癌组织中显着低表达,且是独立预后影响因素;3、ZNF326在体内外实验中均抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;4.ZNF326与EMT表型相关。
彭妍钰[4]（2021）在《Hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌病理生物学行为的影响及机制研究》文中研究说明背景与目的环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种闭合呈环状特殊结构的非编码RNA。研究发现它具有多种生物学功能。作为ce RNA之一,它可吸附miRNA继而影响mRNA的转录;结合RBPs（RNA结合蛋白）参与转录表达或翻译。miRNA是一类长度约为22个核苷酸组成,广泛参与基因转录后调控的非编码小RNA。miRNA本身不具备编码功能,它主要通过与靶基因完全或不完全配对结合,从而发挥调控功能。mRNA作为信使RNA在肿瘤的发生发展中发挥着多重作用。RBPs可参与circRNA的形成,对circRNA的生物发生、定位、拼接和折叠、促进表达稳定中发挥作用。EMT是肿瘤细胞侵袭转移造成扩散的根源之一。在EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition上皮间质转化）表型转化中,非编码RNA可以通过表观遗传学控制肿瘤相关基因的表达而影响肿瘤细胞增殖和转移生物学行为。本研究旨在发现并探讨肿瘤相关基因及其对胃癌病理生物学行为的影响。通过对胃癌发生和侵袭转移等机制的深入研究,为胃癌早期诊断及预后评估提供理论依据支持;为寻求个性化的精准治疗靶点提供理论基础。研究方法:1、常规培养人永生化正常胃粘膜上皮细胞系GES-1及人胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27和MKN-45,手术切除的新鲜胃癌组织及配对远癌正常胃粘膜组织共130例均收集自中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科,提取total RNA后反转录cDNA,应用qRT-PCR法检测胃癌细胞和组织中hsa＿circ＿0005230的相对表达。分析胃癌组织中hsa＿circ＿0005230的表达与各临床病理因素间的关系。2、合成siRNA,在AGS和HGC-27胃癌细胞系中构建沉默hsa＿circ＿0005230表达的功能细胞系。采用CCK-8实验和平板克隆形成实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的增殖能力影响;采用流式细胞术评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的细胞周期变化的影响;采用划痕愈合实验及transwell迁移实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞迁移能力的影响;采用transwell侵袭实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的侵袭能力的影响。采用Western Blotting检测沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞中EMT相关蛋白的表达变化。3、通过生信网站Circinteractome预测hsa＿circ＿0005230可海绵吸附miR-1299,应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和33例胃癌组织及其配对正常胃粘膜组织中miR-1299的表达情况,通过相关性分析明确hsa＿circ＿0005230与miR-1299在胃癌组织中的表达关系。利用Kaplan-Meier Plotter网站中胃癌数据库对miR-1299做生存分析。利用miRWalk和Target Scan网站对miR-1299结合的下游mRNA做预测。应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和51例胃癌及其配对正常胃粘膜组织RHOT1 mRNA表达量,分析胃癌组织RHOT1 mRNA表达水平与临床病理因素间的关系。基于hsa＿circ＿0005230、miR-1299和RHOT1 mRNA在胃癌组织中的表达水平分析三者之间的相关性;qRT-PCR检测沉默hsa＿circ＿0005230后miR-1299和RHOT1 mRNA表达水平的变化。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1299与RHOT1之间是否有结合位点特异性结合。应用Western Blotting检测49例新鲜胃癌及其配对正常胃粘膜组织RHOT1蛋白表达水平;应用免疫组化染色法检测155例胃癌组织的RHOT1蛋白表达并分析其与临床病理因素之间的关系。4、通过Starbase网站预测与hsa＿circ＿0005230有潜在结合位点的RBP FUS。应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和32例人胃癌组织及其配对正常胃粘膜中FUS mRNA的表达水平。分析FUS mRNA与hsa＿circ＿0005230和RHOT1mRNA之间的表达相关性。分析胃癌组织中FUS mRNA表达水平与各临床病理因素间的关系。5、实验数据应用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0.2软件进行统计分析和作图。计量资料以mean士SD表示,两组间比较采用配对t检验;计数资料采用卡方检验,生存分析采用Kaplan-Meier分析并进行Log-rank检验,相关性分析采用spearman相关性检验,P<0.05时差异有统计学意义。结果:1、qRT-PCR法检测结果显示,与GES-1细胞系相比,hsa＿circ＿0005230在五大人胃癌细胞系中表达显着上调;与配对正常胃粘膜组织相比,hsa＿circ＿0005230在130例胃癌组织中表达上调（P=0.0477）。胃癌组织中hsa＿circ＿0005230表达水平与临床病理因素中胃癌的组织学分级（X2=4.186,P=0.014）、淋巴结转移（X2=7.754,P=0.021）和pTNM分期密切相关（X2=7.486,P=0.006）;其中在淋巴结转移因素亚组分析中,淋巴结转移数量较多亚组（N2-3）高表达率显着高于无淋巴结转移组（N0）（X2=4.873,P=0.027）。其他临床病理因素如性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、WHO分型、Lauren分型、浸润深度、远处转移以及发病部位等与hsa＿circ＿0005230表达无关。2、本研究合成的siRNA片段可有效沉默hsa＿circ＿0005230。沉默hsa＿circ＿0005230后CCK-8实验结果显示胃癌细胞的增殖能力明显受到抑制;沉默hsa＿circ＿0005230后平板克隆形成实验结果显示胃癌细胞克隆形成能力明显减弱;沉默hsa＿circ＿0005230后流式细胞术实验显示胃癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。沉默hsa＿circ＿0005230后划痕愈合实验结果显示胃癌细胞迁移能力减弱,细胞划痕愈合率降低。Transwell迁移实验结果显示,沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞的迁移能力明显减弱。Transwell侵袭实验结果显示,沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞的侵袭能力明显减弱。沉默hsa＿circ＿0005230后Western blotting检测EMT通路主要蛋白的表达变化结果可见:与si-NC组相比,转染si-hsa-circ5230后上皮表型蛋白E-cadherin表达上调,同时间质表型的蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail表达均下调。3、与正常胃粘膜上皮细胞GES-1相比,miR-1299在胃癌细胞系中表达显着下调;RHOT1 mRNA在胃癌细胞系中表达显着上调。与配对正常胃粘膜组织相比,miR-1299在33例胃癌组织中表达下调（P=0.0179）,RHOT1 mRNA在51例胃癌组织中表达上调（P=0.045）。胃癌细胞中沉默hsa＿circ＿0005230后miR-1299表达上调,RHOT1 mRNA表达下调。胃癌组织中hsa＿circ＿0005230与miR-1299表达呈负相关（P=0.0228,r=-0.4078）;miR-1299与RHOT1表达呈负相关（P=0.0237,r=-0.4053）;hsa＿circ＿0005230与RHOT1 mRNA表达呈正相关（P=0.0044,r=0.4971）;hsa＿circ＿0005230/miR1299/RHOT1轴分子之间在表达相关性上成立。双荧光素酶报告基因实验证实RHOT1与miR-1299之间有特异性结合位点。4、胃癌组织中RHOT1 mRNA表达水平与胃癌临床病理因素中淋巴结转移（X2=6.708,P=0.035）和pTNM分期（X2=8.209,P=0.042）相关,其中在淋巴结转移亚组分析中,与无淋巴结转移亚组（N0）相比,淋巴结转移数量较多组（N3）RHOT1 mRNA高表达率显着增加（X2=4.297,P=0.038）。胃癌其他临床病理因素如性别、年龄、大体分型、组织学分级、WHO分型、Lauren分型、浸润深度、远处转移以及发病部位等与RHOT1 mRNA表达水平无关。5、RHOT1蛋白定位于胞质,在胃癌组织中表达上调;与正常胃粘膜相比,RHOT1蛋白在胃癌组织表达阳性率显着升高（P<0.01）。对155例胃癌组织RHOT1蛋白表达与临床病理因素分析中发现:胃癌中RHOT1蛋白表达与组织学分级（X2=7.045,P=0.03）、Lauren分型（X2=8.861,P=0.012）、浸润深度（T）（X2=6.534,P=0.038）、淋巴结转移（N）（X2=5.929,P=0.015）和pTNM分期（X2=14.74,P<0.01）等临床病理因素相关。在Lauren分型亚组中,弥漫型胃癌组织RHOT1蛋白高表达较肠型的显着增多（X2=5.397,P=0.02）;混合型胃癌组织的RHOT1蛋白高表达与肠型的相比也显着增多（X2=8.607,P=0.003）;浸润深度（T）亚组分析中,浸润深度T4的RHOT1蛋白高表达率比浸润深度T3的显着增多（X2=4.958,P=0.026）。而其他病理因素如性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、WHO分型、远处转移以及发病部位等与胃癌RHOT1蛋白表达无关。6、胃癌患者miR-1299的生存分析提示:按最佳cutoff值将胃癌患者分为miR-1299低表达组和高表达组,当突变负荷低时,miR-1299高表达的胃癌患者总生存时间（38.43个月）较低表达组（17.77个月）延长（P=0.014）,患者预后较好;而突变负荷高时两组表达无明显差异。在GEO数据库的GSE29272数据集中进行RHOT1 mRNA预后生存分析,纳入592例有效病理资料,依据表达中位值分为RHOT1 mRNA高表达组和低表达组,结果显示:RHOT1 mRNA低表达组总生存时间（28.7个月）较高表达组生存时间（20.6个月）明显增多,预后较好（P=0.0035）。7、预测FUS作为hsa＿circ＿0005230的RBP可能通过影响hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴调控EMT通路影响胃癌的病理生物学行为。结论:1、Hsa＿circ＿0005230在胃癌细胞系和组织中表达上调,与组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关,提示hsa＿circ＿0005230有望成为潜在的肿瘤标记物,为提高胃癌诊断水平,准确评估预后,为寻找个性化治疗靶点提供理论基础。2、沉默hsa＿circ＿0005230后可显着抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,逆转EMT表型变化,提示胃癌中差异表达的hsa＿circ＿0005230可影响胃癌细胞的恶性生物学行为。3、胃癌组织和细胞中RHOT1在mRNA及蛋白水平上均表达上调,与淋巴结转移和pTNM分期相关;胃癌细胞中上调表达的hsa＿circ＿0005230可调控miR-1299/RHOT1轴通过EMT表型通路影响胃癌的侵袭转移行为。这提示RHOT1和miR-1299有望成为胃癌患者治疗的新靶标,为有效控制胃癌提供精准治疗。4、FUS mRNA在胃癌组织和细胞中表达上调,且与淋巴结转移和pTNM分期临床病理因素相关,患者预后生存差。FUS作为RBP可能在上游作用于hsa＿circ＿0005230,进而影响其对胃癌的病理生物学行为。
孙永红[5]（2021）在《FAM60A在结直肠癌中的表达及其在结直肠癌发生发展中的作用》文中进行了进一步梳理第一部分FAM60A蛋白在结直肠癌中的表达及临床病理意义目的:探讨FAM60A蛋白在结直肠癌中的表达及临床病理意义。方法:采用回顾性研究方法,选取140例在兰州大学第一医院确诊为结直肠癌患者的癌组织,34例癌旁组织,制作成组织芯片。采用免疫组织化学法检测FAM60A蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达情况,统计学分析FAM60A的表达与结直肠癌患者临床病理特征之间的关系。Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,Cox多元回归进行预后多因素分析。CCK-8实验检测FAM60A对结直肠癌细胞增殖能力的影响。结果:与癌旁组织相比,结直肠癌组织中FAM60A蛋白的表达明显升高,差异具有统计学意义（P﹤0.001）。FAM60A的表达与结直肠癌组织Ki67增殖指数相关,差异具有统计学意义（P=0.03）。生存分析显示,FAM60A的表达越高,结直肠癌患者的总体生存率越低。多因素Cox回归分析显示,FAM60A的表达是结直肠癌独立的不良预后因素之一。CCK-8细胞增殖实验显示,敲低结直肠癌HT-29细胞中FAM60A的表达会抑制癌细胞的生长。结论:与癌旁组织相比,FAM60A蛋白在结直肠癌组织中高表达,且其表达与Ki67增殖指数相关,是结直肠癌的不良预后因素。FAM60A的表达水平与结直肠癌细胞的增殖能力相关,表明FAM60A可能在结直肠癌的发展及预后中具有重要的意义。第二部分FAM60A在结直肠癌发生中的作用及意义目的:探讨FAM60A在结直肠癌发生中的作用及意义。方法:采用回顾性研究方法,收集兰州大学第一医院2014年1月-2020年7月行结直肠肿瘤根治性手术切除且病理诊断为结直肠癌（侵及粘膜下层）19例、癌旁粘膜组织15例、行内镜下粘膜剥脱术且病理诊断为结直肠高级别上皮内瘤变17例及低级别上皮内瘤变20例,制作成组织芯片。采用免疫组织化学法检测FAM60A蛋白在结直肠各组织中的表达情况,分析FAM60A的表达与结直肠癌（侵及粘膜下层）、高级别上皮内瘤变、低级别上皮内瘤变及癌旁组织之间的关系,探讨FAM60A在结直肠癌发生中的作用。结果:统计学分析结果显示,FAM60A蛋白在结直肠癌（侵及粘膜下层）、高级别上皮内瘤变组中的表达均比正常粘膜组及低级别上皮内瘤变组中的表达上调,差异均具有统计学意义（P﹤0.05）。从正常粘膜到结直肠癌（侵及粘膜下层）组织,FAM60A的表达呈逐渐上调趋势。结论:FAM60A蛋白在结直肠癌（侵及粘膜下层）、高级别上皮内瘤变组中的表达上调,初步认为FAM60A可能促进结直肠癌的发生。全文结论:1.与癌旁组织相比,结直肠癌组织中FAM60A蛋白的表达明显升高,FAM60A的表达越高,结直肠癌患者的总体生存率越低。FAM60A是结直肠癌的独立不良预后因素之一。2.与正常组织相比,FAM60A蛋白在结直肠癌（侵及粘膜下层）、高级别上皮内瘤变组中的表达水平上调,可能在促进结直肠癌的发生、发展及预后中具有重要的意义。
朱金亮[6]（2021）在《HIP1R在胃癌中的表达及功能与分子机制研究》文中研究说明目的:胃癌目前仍然是世界范围内广泛分布的恶性肿瘤,尽管最新的全球癌症统计显示胃癌的新发癌症病例数和死亡病例数均明显降低,但胃癌的死亡率在恶性肿瘤中依旧排在前列。胃癌的临床症状通常出现在疾病发展的进展期,大多数病人在进展期才被诊断发现,导致治疗手段有限。此外,术后的高复发率和高远处转移率也是导致胃癌预后不良的主要原因。因此,探寻新的胃癌诊疗生物标志物和潜在治疗靶标仍然十分迫切且具有重要科学意义。亨廷顿蛋白互作蛋白1相关蛋白（Huntingtin-interacting protein 1-related,HIP1R）是一个多结构域蛋白,具有多种细胞功能,包括改变T细胞介导的细胞毒性和控制细胞内的物质转运等。近年来关于HIP1R在肿瘤研究及肿瘤免疫治疗方面的报道不断增加,但其在胃癌中的临床意义和作用机制尚未被研究报道。因此,我们探讨其在胃癌发生发展中的分子机制,为胃癌的治疗提供新思路和治疗靶标。研究方法:第一部分,通过挖掘公共数据库和利用本中心收集的30对组织样本检测HIP1R的表达情况,并利用免疫组化在包含580例胃癌及癌旁非癌组织的组织芯片中检测HIP1R的表达水平。然后,通过对胃癌组织芯片的数据分析,探究其表达水平与临床病理资料及预后的关系。我们还利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）评价HIP1R的诊断效能。进一步利用现有的公共数据库探究了HIP1R与免疫评分、免疫细胞组分、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性以及肿瘤错配修复基因之间的关系。第二部分,我们首先利用实时定量PCR（quantitative real‐time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测4种胃癌细胞系（AGS,HGC27,SGC7901,MGC803）和正常胃黏膜细胞系GES1中HIP1R的表达水平。然后通过流式细胞术、Transwell、CCK-8、集落形成和Ed U实验测定HIP1R在细胞凋亡、迁移、侵袭和增殖方面所具有的细胞学功能。利用TCGA数据库中胃癌相关数据,使用cluster Profiler R软件包进行基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）预测HIP1R下游信号通路。Western blot验证相关信号通路中的关键分子,最后运用胃癌组织芯片进一步验证表达相关性。结果:Oncomine公共数据库显示,与癌旁非癌组织相比较,HIP1R在胃癌组织中的m RNA表达水平明显降低。组织验证结果显示HIP1R在胃癌中明显降低（m RNA:癌旁非癌组织34.12±17.013 vs胃癌组织20.99±12.371,P<0.001;蛋白:癌旁非癌组织3.33±0.200 vs胃癌组织2.99±0.211,P<0.001）。免疫组化结果显示,在380例癌旁非癌组织中有352例HIP1R高表达（93%）,在胃癌组织中只有55%（209/380）的胃癌组织HIP1R高表达。胃癌组织中HIP1R的低表达与淋巴结转移（P<0.05）和胃癌低分化（P<0.05）呈正相关。ROC曲线结果显示AUC为0.791。生信分析显示HIP1R的表达量与T细胞（r=0.138,P<0.05）、Th2细胞（r=0.247,P<0.05）、Treg（r=0.325,P<0.05）呈正相关性,而与NK细胞（r=-0.293,P<0.05）呈负相关性。与正常胃粘膜细胞系GES1相比,HIP1R在胃癌细胞系中普遍低表达。过表达HIP1R促进胃癌细胞凋亡（空载体:5.64±0.66 vs HIP1R过表达质粒:20.12±0.26,P<0.001）;敲除HIP1R抑制胃癌细胞凋亡（对照组si RNA:29.88±3.00 vs HIP1R si RNA:14.74±1.42,P=0.001）。Ed U实验、CCK8实验和集落形成实验显示,过表达HIP1R抑制胃癌细胞增殖（P<0.01）;敲除HIP1R促进胃癌细胞增殖（P<0.01）。Transwell实验显示,过表达HIP1R抑制胃癌细胞的迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.05）;敲除HIP1R促进胃癌细胞迁移（P<0.01）和侵袭（P<0.001）。Western blot实验结果显示,过表达HIP1R组p-Akt、p-m TOR的表达水平降低,而Cleaved Caspase-9和Bak蛋白的表达水平升高。敲除HIP1R组中p-Akt、p-m TOR的表达水平升高,而Cleaved Caspase-9和Bak蛋白的表达水平降低。过表达HIP1R组E-Cadherin表达增加,Vimentin表达降低,敲除组结果相反。73例胃癌组织芯片免疫组化验证结果显示,HIP1R的表达与p-Akt的表达呈负相关性（P=0.015）。结论:1、HIP1R在胃癌组织及胃癌细胞中表达显着降低。2、HIP1R对胃癌及癌旁非癌组织的鉴别具有一定意义。3、HIP1R对胃癌细胞的凋亡具有促进作用而对胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭具有抑制作用。4、HIP1R可能通过调控PI3K/Akt信号通路中的Akt分子进而调节胃癌细胞功能。
张慧[7]（2020）在《下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展》文中指出背景能量代谢重编是肿瘤重要特点,脂肪酸代谢异常是其中之一。近年多项研究表明,肿瘤普遍存在脂肪酶过度表达的状况,众多研究拟探索脂肪酶抑制剂作为癌症潜在治疗方法。本研究旨探索乙酰辅酶A羧化酶A（Acetyl-CoA Carboxylase-A,ACACA）基因对前列腺癌（Prostate Cancer,PCa）细胞及线粒体功能,代谢产物和动物体内肿瘤形成影响。方法免疫组织化学检测ACACA在人前列腺癌组织芯片中的表达,评估不同临床分期病理分级中的情况。公共数据库GEPIA分析ACACA在人前列腺癌及非癌中的表达。细胞功能实验检测前列腺癌低表达ACACA细胞系功能及代谢组学变化。WB检测脂肪酸及酯类代谢途径相关蛋白表达。海马实验检测细胞系线粒体潜能及能量产生变化。流式细胞术和荧光显微镜检测线粒体染色情况。qRT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）。流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平。比色法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）水平。动物体内探讨ACACA对裸鼠肿瘤形成影响。结果1、ACACA在前列腺癌组织中高表达,临床TNM分期显示晚期PCa患者ACACA表达水平强于低级别患者。T3强于T2、T1,N1强于N0,M1强于M0,均有统计学差异。GEPIA统计显示前列腺癌患者中ACACA表达明显高于健康者。2、细胞功能实验显示,与对照组相比敲低ACACA基因后,DU145细胞和PC3细胞迁移能力,侵袭能力,增殖能力明显减弱,细胞周期G1期延长。均有统计学意义。3、代谢组学检测显示,敲低ACACA基因后,DU145细胞中有94种代谢物质发生改变,PC3细胞中105种物质发生改变,两种细胞中39种物质同时发生改变。ATP水平在两种细胞中均降低。PC3细胞中敲低ACACA基因后,脂肪酸代谢产物L-棕榈酰肉碱和硬脂肉碱水平减少,相关途径蛋白（FAS,Lipin1,ATP-CL,P-ATP-CL,AceCS1,ACSL1）水平下调。均有统计学意义。4、海马实验显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中ATP产量,基础呼吸,最大呼吸,储存呼吸能力均下降。实时ATP检测中发现,DU145细胞总ATP产生率下降,线粒体ATP产生率显着下降。5、线粒体荧光染色显示,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞线粒体染色及平均荧光强度均减弱。DU145和PC3细胞mtDNA均明显降低。且均有统计学差异。6、NAD+/NADH检测发现,敲低ACACA基因后,DU145和PC3细胞中该比值均上升,且细胞内ROS水平均高于对照组,均有统计学差异。7、裸鼠成瘤模型中,实验组肿瘤在各个时间点体积明显小于对照组,肿瘤重量也明显小于对照组,均有统计学差异。结论:ACACA基因的高表达与前列腺癌的TNM分期呈正相关。结果证实,前列腺癌细胞中ACACA的下调通过干扰NAD+/NADH,线粒体ATP产量,mtDNA和ROS水平的平衡而影响线粒体潜力,从而降低了肿瘤细胞的增殖能力。测试线粒体潜力和ACACA的表达可能会在将来成为预测目标和治疗方法。
程向炜[8]（2020）在《星孢菌素类似物7-oxostaurosporine抗肿瘤作用及机制研究》文中研究指明胰腺癌,被称为癌症之王,是恶性程度极高的消化道肿瘤,5年整体生存率只有9.3%。靶向分子治疗日益成为了癌症治疗的研究热点,而胰腺癌的发病机制复杂,目前尚无有效的可用于临床的靶向抑制剂。寻找新的诊疗靶点是当前胰腺癌研究的重点。我们前期从海洋微生物中分离鉴定化合物和抗肿瘤活性研究中发现了一种具有显着抗肿瘤活性的化合物7-oxostaurosporine（33C）,属于星孢菌素类化合物,星孢菌素类化合物是很好的PKC抑制剂,迄今尚未见该活性成分抗肿瘤作用的相关研究报道。本文对33C体内外抗胰腺癌效应和作用机制进行了系统的研究。结果表明,33C在体内外具有良好的抗肿瘤效果,且毒副作用较小;33C通过抑制PKC-NF-κB信号通路,从而显着诱导人胰腺癌细胞凋亡;同时活化的PKCδ和P65在胰腺癌病人的瘤块组织中、细胞浆和细胞核中均高表达,并与病人的预后负相关。主要研究内容与结果如下:1.运用硅胶柱色谱法、凝胶柱色谱法和高效液相色谱法等现代分离纯化方法从海洋放线菌Streptomyces sp.NB-A13的固体发酵产物中提取了7-oxostaurosporine（33C）,并采用核磁共振等技术对其结构进行了鉴定。2.用Cell Counting Kit-8试剂盒检测不同浓度的33C作用胰腺癌、肺癌和结肠癌等肿瘤细胞24h后,测定细胞的存活率。结果显示,在处理浓度为3.2μM,对胰腺癌和肺癌细胞株的抑制率均在90%左右,并且在33C处理浓度降低时,其对肿瘤细胞的抑制率也随之下降,呈现一定的浓度依赖性关系。通过计算33C对各个肿瘤细胞的IC50在18～3.2μM范围之内。3.建立小鼠的人胰腺癌细胞Bx PC-3移植瘤模型和胰腺癌人源肿瘤异种移植模型（PDX）,考察了33C的体内抑瘤作用。考察了各组肿瘤体积变化情况,并计算肿瘤体积并绘制肿瘤体积生长曲线。给药期间,各组裸鼠的瘤体积均持增长趋势,但与对照组相比,Napabucasin组和33C组的肿瘤增长速度明显减慢,其中33C组显着抑制了Bx PC-3移植瘤和胰腺癌PDX增长速度。4.通过对小鼠一般情况观察发现,小鼠精神状态良好,与阴性对照组比较,各给药组小鼠体重稍微有下降,但均无显着性差异。采用HE染色重要脏器观察33C对小鼠主要脏器的毒副作用。结果表明,小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要组织脏器未见明显的病理改变。5.用流式细胞仪检测不同浓度的33C对人胰腺癌Bx PC-3、PANC-1与MIA paca-2细胞凋亡率的影响。结果显示,不同浓度的33C（0、0.25μM、0.5μM、1μM）干预细胞24小时后,经流式检测结果显示,三种胰腺癌细胞的凋亡率会随药物浓度的增加而升高,1μM时诱导肿瘤细胞凋亡显着;不同干预浓度之间的细胞凋亡率存在明显差异（P<0.05）。6.用Western Blot（WB）对不同浓度的33C干预Bx PC-3细胞后,肿瘤细胞中PKC亚型的表达情况和磷酸化水平进行研究。结果显示,0.25μM 33C作用组PKCθ（T538）亚型磷酸化水平降低,0.5μM 33C作用组PKCθ（T538）亚型磷酸化水平显着降低、PKCδ（T505）亚型磷酸化水平下降,1μM 33C作用组PKCθ（T538）、PKCδ（T505）亚型磷酸化水平均明显下降。而其它PKC亚型的磷酸化水平未发生变化。7.利用HTRF体外激酶试验研究33C对PKCδ和PKCθ的活性影响,计算33C对PKCδ、PKCθ激酶的IC50值。结果表明,33C对PKCδ(IC50=10.94n M)和PKCθ(IC50=3.262 n M)要明显优于Sotrastaurin对PKCδ(IC50=198.6n M)和PKCθ(IC50=33.85 n M)。8.si RNA分别沉默胰腺癌Bxpc-3和As PC-1中的PKCδ和PKCθ,然后利用WB法研究33C对PKCδ/NF-κB信号通路中p-p65表达及磷酸化水平的影响。结果表明,si RNA沉默胰腺癌Bxpc-3和As PC-1中PKCδ表达时发现p-p65磷酸化水平被抑制,而沉默Bxpc-3和As PC-1中PKCθ后,p-p65磷酸化水平并没有变化。9.应用组织芯片技术研究胰腺癌中蛋白激酶PKCδ、NF-κB的表达及其临床意义,研究其与胰腺癌病人预后的相关性。结果表明,活化的PKCδ和P65在胰腺癌病人的瘤块组织中,细胞浆和细胞核中均高表达,并与病人的预后负相关。通过本文对33C以PKCδ为靶点的体内外抗胰腺癌效应和作用机制研究,可为PKCδ作为胰腺癌的治疗靶点和33C的临床应用提供理论基础和科学依据。
杨政道[9]（2020）在《BRF2在胃癌发生和发展阶段表达及功能的研究》文中进行了进一步梳理目的:TFⅡB相关因子2（BRF2）是构成TFⅢB复合体的关键组成部分,BRF2-TFⅢB复合体也是使Pol Ⅲ精确募集到靶基因处并形成转录活性起始复合物全过程所需的关键因子。近年来,在多种癌症细胞中发现BRF2蛋白表达异常并对癌症发生发展发挥一定作用,而在胃癌中的研究并未见有报道。本研究旨在研究BRF2在胃癌以及胃癌前疾病中的表达和功能的研究。方法:1、通过免疫组织化学实验在806例胃癌患者的癌和癌旁组织中检测BRF2的表达,并利用15例胃癌患者的癌和癌旁新鲜组织的WB、PCR实验以及数据库分析验证BRF2在胃癌和癌旁正常组织中的表达。2、根据详尽的临床资料,分析BRF2表达高低与患者病理资料的相关性,包括:性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤的侵袭（pT）、淋巴结转移（pN）、生长方式等,并做Kaplan-Meier生存曲线分析BRF2的表达与患者生存的相关性。再进一步将患者按各种病理资料的不同分成不同亚组人群,在这些亚组人群中分析BRF2的表达高低和患者的生存情况有无相关性。3、提取5种细胞系的总RNA做PCR实验,其中4种胃癌细胞系:AGS、MGC803、HGC27、SGC7901和1种胃粘膜细胞系GES-1。研究BRF2在胃癌细胞系中表达情况,并选择在BRF2基因表达较高的两种细胞系:AGS和SGC7901中,用Si-RNA敲除BRF2基因,做进一步细胞功能的研究,包括:检测细胞增殖能力的CCK-8实验、细胞迁移能力的划痕实验、细胞侵袭能力的Transwell实验,以及流式细胞周期试验。4、为了研究BRF2是否与肿瘤发生阶段具有相关性,选取了于2017年在中国医科大学附属一院接受胃镜下取病理且诊断为胃癌前疾病的病例的组织蜡块,包括诊断为:胃粘膜高级别异型增生、萎缩性胃炎伴肠化生、胃溃疡、胃息肉的患者的组织蜡块,各20例。并同时取胃镜下诊断为胃癌和正常组织即浅表性胃炎的病例的组织蜡块作对照组,再次做免疫组化实验。5、统计分析:全文统计均使用SPSS 22.0计算完成。免疫组化实验的评分结果用Mean±SD表示,使用t-test检验分析。用非参检验分析表达高低与临床病理资料的相关性;生存分析采用Kaplan-Meier方法计算。以P<0.05判定是否有显着性差异。结果:1、BRF2在胃癌（6.124±2.096）中的表达明显高于邻近的正常组织（4.275±1.886）（P<0.001）。为了进一步研究BRF2在组织中表达情况,将15对新鲜组织提取RNA,做PCR,结果显示△Ct癌组织为9.818±1.158,而△Ct癌旁组织为11.08±1.319（P<0.01）。同时,WB显示这些病例中BRF2蛋白在胃癌组织内（T=1.214±0.4605）的表达也高于癌旁正常组织（N=0.6709±0.2261）（P<0.01）。这与Oncomine数据库分析获得的趋势一致。2、统计分析结果显示:BRF2的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤的侵袭（pT）、淋巴结转移（pN）、生长方式等均无相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析表明BRF2的表达高低和患者的生存情况也无显着相关性（P=0.245）。将患者按各种病理资料分成不同亚组人群,在这些亚组人群中也没有发现BRF2的表达的高低和生存的相关性。因此,推测BRF2可能与肿瘤的发展无相关性,而应该与癌症的发生阶段有变化。3、相比于正常胃粘膜细胞系GES-1,BRF2在多种胃癌的细胞系中出现显着的高表达（P<0.01）。依据PCR结果,在BRF2基因表达较高的两种胃癌细胞系:AGS和SGC7901中,用Si-RNA敲除BRF2基因,做进一步细胞功能的研究。但很遗憾的是增殖实验、划痕实验、和Transwell实验以及流式细胞周期试验均没有发现Si-RNA组与对照组NC组有显着的差异。这进一步提示:在胃癌中BRF2虽然表达上调,但它可能在胃癌的发展阶段并不起显着作用。4、BRF2在多种癌前疾病以及胃癌组织（6.35±2.159）中的细胞核内表达明显高于浅表性胃炎（4.35±1.899）,这些癌前疾病包括:胃粘膜高级别异型增生（6.2±1.881）（P<0.01）、萎缩性胃炎伴肠化生（5.9±1.553）（P<0.01）、胃息肉组织（6.05±2.038）（P<0.01）。而在胃溃疡（4.6±1.93）中表达水平与浅表性胃炎差异不明显（P=0.682）。结果表明:在胃癌的多种癌前病变组织中BRF2的表达已有明确的上调,尤其在胃粘膜高级别异型增生组织、萎缩性胃炎组织和胃息肉组织中。因此这结果提示,BRF2在胃癌的发生阶段已出现异常表达,这对研究胃癌发生的机制提供一个新的思路。结论:1、在胃癌组织中,BRF2的表达水平显着高于癌旁组织。2、BRF2在胃癌患者癌组织内表达的水平与患者的临床病理资料以及预后均无显着相关性。3、相比于正常胃粘膜细胞系GES-1,BRF2在多种胃癌的细胞系中,如AGS、SGC-7901等均出现显着的高表达,但对胃癌进展阶段的多种细胞功能均未见显着作用。4、相对于胃正常粘膜组织,BRF2在多种胃癌癌前疾病组织中出现显着高表达,包括:胃粘膜高级别异型增生组织、萎缩性胃炎伴肠化生组织和胃息肉组织。这证实了BRF2在胃癌发生阶段已经出现表达上调,它表达的上调是胃癌发生的早期事件。这些结果提示BRF2可能对胃癌的发生发挥潜在的作用。BRF2能成为潜在的用于胃癌早期诊断的生物学的标志物和早期治疗的作用靶点。
宋孟秋[10]（2020）在《蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌生长中的作用及其抑制剂的筛选》文中认为背景与目的食管癌（Esophageal cancer,EC）是我国常见的恶性肿瘤之一,占世界食管癌发病的53%,成为第四大癌症死亡原因,在亚洲和非洲的某些地区高度流行。食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌最主要的病理组织学类型,每年约占食管癌总发病率的90%。在中国,食管鳞癌发病具有显着的地域特色,多集中在中国中北部及太行山脉一带,如林州市（河南）和涉县（河北）等。目前,手术结合放化疗的方法是食管鳞癌临床治疗的常用手段,5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇是临床常用的食管鳞癌化疗药物,然而,食管鳞癌的发病率仍然在持续上升,不良反应不断出现,术后5年生存率也只有15%～25%,因此,阐明食管鳞癌的发病机制,寻找新的作用靶点,筛选靶向抑制剂,对改善食管鳞癌的治疗现状,提高临床治疗效率,降低疾病带来的痛苦与损失以及提升病人5年生存率,均具有重要的科学意义。PI3-K/AKT/mTOR通路参与癌症转化的机制包括增强细胞增殖与存活、促进细胞侵袭或转移等。AKT蛋白是PI3-K激酶的直接下游分子,可将信号传递至下游100余种底物蛋白,是PI3-K通路的关键节点之一。AKT是一个重要的信号中枢,在多种癌症的发生发展过程中起着决定性的作用,其功能的发挥影响细胞代谢、生长、存活和增殖等多种生理过程。AKT已经被证实在结肠癌、乳腺癌等癌症中通过调控多种信号通路发挥促癌功能,是一个具有潜力的治疗靶点。在食管鳞癌中,AKT分子的功能及作用机制仍然需要系统性研究。有丝分裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路是促进肿瘤发生发展的一条重要信号通路。TAOs处于p38 MAPK上游,在p38 MAPK级联信号通路中属于MAP3Ks家族,具有1001个氨基酸残基,可以调节G蛋白偶联受体家族信号通路、细胞骨架的稳定性和细胞存活力,并可在DNA损伤机制中激活p38从而调控细胞周期。抑制TAOK1蛋白功能可以加强中心体富集化的乳腺癌细胞中心体的解聚并破坏有丝分裂,揭示了 TAOK1成为乳腺癌治疗潜在靶标的可能性。目前,TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的功能尚不清楚,在食管鳞癌中靶向TAOK1激酶的抑制剂也未见报道,因此,研究TAOK1在食管鳞癌中的作用机制并筛选靶向该蛋白的天然小分子抑制剂,有望为食管鳞癌的研究与治疗提供新的作用靶标和治疗思路。天然小分子抑制剂,是一类从植物中提纯出的具有生物活性的化合物,如类胡萝卜素、类黄酮、花青素等。近年来,一些天然化合物被报道具有调节信号转导通路、调控细胞周期、抑制细胞分化和促进凋亡相关基因表达的能力,具有良好的抗癌活性。目前,广泛应用于肿瘤临床治疗的天然小分子药物有紫杉醇、喜树碱（类）、长春碱（类）、人参皂苷Rg3和高三尖杉酯碱等,均取得了有效的治疗效果。因此,筛选并研究靶向蛋白激酶AKT及TAOK1的天然小分子抑制剂,对食管鳞癌的临床预防与治疗具有指导意义。在本论文中,我们分别对蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌中的功能进行了深度研究,探讨AKT和TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的相关功能及分子机制,明确了其在食管鳞癌中的促癌作用,并评价了通过抑制蛋白激酶AKT与TAOK1的功能来治疗食管鳞癌的意义与可行性。在此基础上,借助Kinase Profiling assay和超级计算机分子对接模型,分别筛选到了 AKT蛋白的天然小分子抑制剂冬凌草甲素和TAOK1蛋白的天然小分子抑制剂白藜芦醇,并通过蛋白下拉、激酶实验、SPR技术等一系列分子生物学和PDX动物模型来进行验证,最终明确了冬凌草甲素和白藜芦醇分别通过靶向AKT和TAOK1蛋白激酶来抑制食管鳞癌的分子机制和研究发现。方法1.通过免疫组织化学法检测AKT蛋白在食管正常组织和癌组织中表达量的变化;采用免疫组织化学法结合蛋白免疫印迹技术评价TAOK1在食管鳞癌组织和细胞中的表达水平;2.采用基因敲减和过表达技术研究AKT蛋白在食管鳞癌中的功能;采用基因沉默、蛋白过表达结合MTT、Soft agar、流式细胞术等技术检测TAOK1在食管鳞癌细胞中的相关功能;3.将AKT特异性小分子抑制剂MK-2206处理细胞,评价MK-2206通过调控AKT功能抑制食管鳞癌的可行性;4.采用CDX或PDX的方法进一步验证TAOK1蛋白在食管鳞癌移植瘤模型中的作用;5.采用Kinase Profiling assay筛选到了 AKT蛋白的天然小分子抑制剂冬凌草甲素,采用激酶实验、蛋白下拉实验并结合ATP竞争性结合实验研究冬凌草甲素与AKT的体外结合机制及IC50值;通过分子对接模型模拟冬凌草甲素分别与AKT1和AKT2蛋白的结合位点及结合模式;6.采用超级计算机模拟程序筛选与TAOK1亲和指数较高的天然小分子化合物并运用MTT比色法筛选该化合物在食管鳞癌中的IC50剂量;通过激酶实验、SPR技术、KINOME ScanTM技术、蛋白下拉以及分子对接模型,验证小分子抑制剂与TAOK1蛋白激酶的结合模式及结合位点;7.采用MTT比色法和Soft agar实验检测天然小分子抑制剂冬凌草甲素和白藜芦醇对食管鳞癌细胞体外增殖的影响;8.采用流式细胞术结合蛋白免疫印迹法检测冬凌草甲素对食管鳞癌细胞周期和凋亡的影响;采用流式细胞术结合蛋白免疫印迹法检测白藜芦醇对食管鳞癌细胞凋亡的影响;9.采用双荧光素酶报告基因法结合蛋白免疫印迹法检测冬凌草甲素对PI3-K/AKT信号转导通路的影响;采用蛋白免疫印迹法检测白藜芦醇对TAOK1调控p38 MAPK信号通路的影响;10.采用人源肿瘤异种移植瘤（PDX）模型,观察冬凌草甲素和白藜芦醇口服给药后分别对食管鳞癌PDX的生长的影响。结果1.p-AKT（Ser473）和AKT蛋白在食管鳞癌组织中显着过表达;AKT在食管鳞癌中发挥促癌基因的功能,其过表达可促进细胞增殖,基因沉默可抑制癌细胞的体外生长;2.MK-2206通过抑制AKT激酶活性显着性降低食管鳞癌细胞的体外增殖;3.冬凌草甲素在食管鳞癌细胞中特异性靶向AKT并显着抑制AKT1和AKT2激酶的体外活性,IC50值分别为8.4±1.34 μM（AKT1）和8.9 ±0.29μM（AKT2）;4.冬凌草甲素通过ATP竞争性模式与AKT1激酶的Asp292氨基酸残基形成两个氢键而结合,与AKT2激酶的Asp293及Lys277氨基酸残基分别形成一个氢键而结合;5.冬凌草甲素通过靶向AKT1/2蛋白激酶显着抑制食管鳞癌细胞的体外增殖和克隆的形成,阻滞细胞周期G2/M期进展并促进细胞凋亡,下调PI3-K/AKT信号转导通路并显着抑制食管鳞癌PDX模型的生长;6.TAOK1蛋白在食管鳞癌组织和细胞中过表达,在晚期食管鳞癌组织中过表达现象尤为明显;7.TAOK1基因沉默显着抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆的形成,将细胞周期阻滞在G1期,并下调p38 MAPK信号通路;TAOK1基因沉默显着抑制食管鳞癌CDX及PDX的生长;TAOK1蛋白过表达促进食管鳞癌细胞的体外增殖及克隆形成能力,促进细胞周期进展,并上调p38 MAPK信号通路;TAOK1蛋白过表达促进食管鳞癌CDX的生长;8.在超级计算机对接得到的候选天然小分子化合物中,白藜芦醇在食管鳞癌细胞中具有最小的IC50值;9.白藜芦醇对TAOK1蛋白激酶具有极高的亲和力和极小的解离常数,在食管鳞癌中特异性靶向TAOK1并显着抑制TAOK1激酶的体外活性;10.白藜芦醇有效抑制食管鳞癌细胞的体外增殖、克隆的形成并诱导细胞凋亡的发生;白藜芦醇通过靶向TAOK1蛋白激酶显着抑制食管鳞癌PDX的生长并下调相关MAPK通路。结论1.AKT蛋白激酶在食管鳞癌组织中过表达,其基因敲减或过表达可分别抑制或促进食管鳞癌细胞的增殖,在食管鳞癌中发挥促癌功能。2.冬凌草甲素以ATP竞争性模式与AKT蛋白激酶结合并抑制其活性。3.冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白抑制食管鳞癌细胞的体外增殖、周期进展并促进凋亡的发生,通过抑制PI3-K/AKT信号转导通路显着减弱食管鳞癌PDX的生长。4.TAOK1蛋白在食管鳞癌组织和细胞中过表达,作为促癌基因促进食管鳞癌细胞的增殖、细胞周期进展并调控p38 MAPK信号通路。5.白藜芦醇在食管鳞癌中特异性靶向TAOK1并显着抑制TAOK1激酶的体外活性。6.白藜芦醇通过靶向TAOK1有效抑制食管鳞癌细胞的体外增殖,诱导细胞凋亡的发生,下调p38 MAPK信号通路并显着性减弱食管鳞癌PDX的生长。
二、胃粘膜疾病组织芯片制作及13种细胞周期调控因子的检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胃粘膜疾病组织芯片制作及13种细胞周期调控因子的检测（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA SCARNA2在DNA损伤修复中的作用探讨 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、~(60)Co-γ射线照射 |
| 2、细胞培养与处理 |
| 3、总RNA的提取、纯化及质量评估 |
| 4、RNA的反转录 |
| 5、实时荧光定量PCR(RT-PCR) |
| 6、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 7、RIP-seq生信分析 |
| 8、SCARNA2下调(敲低/敲除)和过表达细胞系的构建 |
| 9、蛋白凝胶电泳(Western Blot) |
| 10、中性彗星电泳(Comet Assay) |
| 11、免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 12、统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| 1、RNA免疫共沉淀及高通量测序 |
| 2、ATR结合lncRNA的筛选与验证 |
| (二)SCARNA2的染色体定位及二级结构预测 |
| (三)SCARNA2在不同肿瘤细胞系中表达 |
| (四)结肠癌细胞在应答IR和 DNA损伤诱导剂时SCARNA2转录水平的变化 |
| 1、SCARNA2可以响应IR诱导的DNA损伤 |
| 2、SCARNA2可以响应CPT和 ETO诱导的DNA损伤 |
| (五)DDR通路抑制剂对SCARNA2表达水平的影响 |
| (六)SCARNA2下调和过表达细胞系的构建与验证 |
| (七)下调SCARNA2显着增加结肠癌细胞受到照射后的DNA损伤程度 |
| (八)下调SCARNA2显着抑制照后结肠癌细胞的DNA损伤修复过程 |
| (九)SCARNA2对DNA损伤修复信号通路的影响 |
| 1、下调SCARNA2可以抑制照后DNA损伤修复通路的激活 |
| 2、下调SCARNA2可以抑制由CPT和 ETO诱导的DNA损伤修复通路的激活 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 LncRNA SCARNA2对ATR及同源重组修复途径调控作用及机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、主要实验试剂 |
| 3、主要实验仪器及耗材 |
| 4、质粒信息 |
| 5、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、真核RNA-seq测序 |
| 2、构建I-Sce I-HR/NHEJ报告基因系统 |
| 3、RNA pull down-MS |
| 4、蛋白免疫共沉淀(IP) |
| 5、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)敲除SCARNA2对照后基因转录组的影响 |
| 1、文库质检 |
| 2、基因表达相关性分析 |
| 3、基因差异表达分析 |
| 4、差异表达基因的GO富集分析 |
| 5、差异表达基因的KEGG富集分析 |
| (二)SCARNA2主要通过HR通路修复DNA损伤 |
| (三)下调SCARNA2可以抑制照后HR通路关键修复分子RAD51和RPA2 的募集 |
| (四)SCARNA2结合蛋白的筛选与鉴定 |
| (五)下调SCARNA2可以影响ATR与 HR通路相关蛋白的互作 |
| (六)下调SCARNA2抑制了ATR下游Chk1靶点的磷酸化 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LncRNA SCARNA2促进DNA损伤修复通路调控结直肠癌放疗敏感性 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1、实验细胞 |
| 2、实验动物 |
| 3、主要实验试剂 |
| 4、主要实验仪器及耗材 |
| 5、SABER-ISH探针信息 |
| 6、抗体信息 |
| (二)实验方法 |
| 1、克隆形成率 |
| 2、细胞凋亡 |
| 3、细胞增殖/细胞活力 |
| 4、细胞周期 |
| 5、构建裸鼠皮下荷瘤(CDX)模型 |
| 6、移植瘤体内注射慢病毒载体方法 |
| 7、荷瘤裸鼠放射处理 |
| 8、石蜡切片制作实验 |
| 9、石蜡切片免疫组化实验 |
| 10、石蜡切片荧光TUNEL实验 |
| 11、组织芯片荧光原位杂交(FISH) |
| 12、其他方法 |
| 二、实验结果 |
| (一)下调SCARNA2可以降低由IR和 DNA损伤剂诱导的细胞存活率 |
| (二)下调SCARNA2可以增加照射和DNA损伤剂诱导的细胞凋亡 |
| (三)下调SCARNA2可以降低照射后结肠癌细胞的增殖能力和细胞活力 |
| (四)下调SCARNA2可以显着抑制结肠癌细胞经照射和DNA损伤剂诱导的G2/M期阻滞 |
| (五)SCARNA2对结直肠癌荷瘤模型放射敏感性的影响 |
| 1、构建裸鼠皮下荷瘤模型 |
| 2、移植瘤内多点注射慢病毒模型构建成功 |
| 3、下调SCARNA2可以抑制照后裸鼠皮下肿瘤细胞的增殖 |
| 4、下调SCARNA2可以促进照后结肠癌肿瘤细胞的凋亡 |
| 5、下调SCARNA2可以抑制照后结直肠癌肿瘤组织的HR修复 |
| (六)SCARNA2在放疗敏感和抵抗的结直肠癌组织中表达差异显着 |
| 三、讨论 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附图 |
| 附表一、RIP-seq数据分析软件及参数列表 |
| 附表二、RIP-seq数据库信息 |
| 附表三、RNA-seq测序质量预处理结果 |
| 附表四、ATR结合相关lncRNA列表(前100 位) |
| 附表五、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表六、RNA-seq:sg-ctrl(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表七、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(下调) |
| 附表八、RNA-seq:sg-SCARNA2(CON vs IR)差异基因(上调) |
| 附表九、RNA pulldown-MS鉴定的差异蛋白列表 |
| 文献综述 lncRNA在DNA损伤诱导的细胞周期检查点激活中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（2）Cortactin在结直肠癌中的表达与临床病理参数的关系和对肿瘤细胞增殖的影响研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.标本收集 |
| 1.1.纳入标准 |
| 1.2.排除标准 |
| 1.3.结直肠癌TNM分期 |
| 2.患者复查随访与术后管理 |
| 3.实验仪器和试剂 |
| 3.1.主要实验仪器 |
| 3.2.主要实验试剂 |
| 4.免疫组化研究 |
| 4.1.组织标本处理与组织芯片的制作 |
| 4.2.免疫组化染色 |
| 4.3.免疫组化染色结果评估 |
| 4.4.统计学方法 |
| 5.体外细胞系研究cortactin在细胞增殖中的影响 |
| 5.1.细胞的处理与转染过程 |
| 5.2.Western blot验证细胞的目的蛋白表达水平 |
| 5.3.通过qRT-PCR检测目的蛋白转录水平 |
| 5.4.CCK8实验评估细胞增殖情况 |
| 5.5.EdU示踪法评估细胞增殖情况 |
| 5.6.软琼脂克隆形成实验检测细胞集落形成实验 |
| 5.7.流式细胞仪检测各组细胞周期及凋亡情况 |
| 研究结果 |
| 1.Cortactin在结直肠癌细胞和在正常粘膜细胞中的表达差异 |
| 2.患者临床病理特征与cortactin表达的关系 |
| 3.Cortactin表达和临床病理参数与DFS和OS单因素Cox回归分析 |
| 4.Cortactin阳性术后辅助治疗与DFS和OS单因素Cox回归分析 |
| 5.临床病理参数和cortactin表达与DFS和OS多因素Cox分析 |
| 6.验证siRNA对细胞cortactin表达的干扰作用 |
| 7.检测两种肿瘤细胞系敲降cortactin表达后的增殖情况 |
| 8.检测SW1116和FHC干扰cortactin表达后细胞增殖情况 |
| 9.软琼脂克隆形成实验检测各组细胞增殖情况 |
| 10.流式细胞学检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文的创新与不足 |
| 文献综述 结直肠癌的预后判断及相关标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（3）胃癌预后分子指标ZNF326的发现及其在胃癌中的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于转录组学及蛋白组学寻找胃癌预后预测因子并进行本地验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 转录组学数据来源 |
| 2.1.2 蛋白组学数据来源 |
| 2.1.3 临床标本收集 |
| 2.1.4 主要应用软件及程序包 |
| 2.1.5 主要仪器设备及软件 |
| 2.1.6 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 数据预处理及清洗 |
| 2.2.2 筛选胃癌预后相关分子指标 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色实验(Immunocytochemistry,IHC) |
| 2.2.4 免疫组化染色评分 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 建立整合数据集,筛选胃癌预后相关基因 |
| 3.2 TCGA数据集中ZNF326 与其他基因的共表达分析及通路富集 |
| 3.3 TCGA数据集中ZNF326 表达水平与肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)的关系 |
| 3.4 TCGA数据集中ZNF326 表达水平与微卫星不稳定性(Microsatellite instability,MSI)相关性 |
| 3.5 TCGA数据集中ZNF326 表达水平与肿瘤干细胞相关性分析 |
| 3.6 组织芯片验证胃癌患者组织中ZNF326 的表达情况 |
| 3.7 组织芯片ZNF326 表达水平与临床病理资料的关系 |
| 3.8 组织芯片ZNF326 表达水平与胃癌患者预后的关系 |
| 3.8.1 ZNF326 表达水平与全组患者的生存分析 |
| 3.8.2 亚组分析——肿瘤大小 |
| 3.8.2 亚组分析——组织分型 |
| 3.8.3 亚组分析——组织分化 |
| 3.8.4 亚组分析——TNM分期 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:ZNF326 在人胃癌细胞系中的体内外功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 引物序列 |
| 2.1.4 抗体列表 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒载体及慢病毒载体 |
| 2.2.2 细胞 |
| 2.3 实验研究方法 |
| 2.3.1 质粒的构建、转化与提取 |
| 2.3.2 细胞系培养 |
| 2.3.3 稳转细胞系构建 |
| 2.3.4 Trizol法提取total RNA实验 |
| 2.3.5 cDNA反转录实验 |
| 2.3.6 Real-time PCR实验 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.8 全蛋白提取 |
| 2.3.9 BCA法蛋白定量 |
| 2.3.10 Western Blot实验 |
| 2.3.11 Transwell小室迁移实验 |
| 2.3.12 Transwell小室侵袭实验(以六孔板一孔细胞为例) |
| 2.3.13 CCK8 细胞增殖实验 |
| 2.3.14 细胞划痕实验(以12 孔板一孔为例) |
| 2.3.15 裸鼠成瘤及观察实验 |
| 2.3.16 裸鼠肺转移模型建立及观察实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 稳筛细胞株的构建和ZNF326 在细胞系中的表达定位 |
| 3.2 ZNF326 影响胃癌细胞的迁移能力 |
| 3.3 ZNF326 影响胃癌细胞的侵袭能力 |
| 3.4 ZNF326 表达水平改变对EMT指标的影响 |
| 3.5 ZNF326 影响胃癌细胞的增殖能力 |
| 3.6 ZNF326 影响胃癌细胞裸鼠皮下成瘤 |
| 3.7 ZNF326 影响胃癌细胞裸鼠肺转移 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 胃癌患者预后分子指标研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）Hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌病理生物学行为的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 Hsa_circ_0005230 表达及与胃癌临床病理因素间的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 收集组织标本 |
| 2.2.2 细胞系的培养 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 提取Total RNA |
| 2.3.2 反转录cDNA |
| 2.3.3 qRT-PCR产物环化验证及表达检测 |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物Sanger测序证实碱基序列剪接成环 |
| 3.2 Hsa_circ_0005230 在胃癌细胞系中表达显着上调 |
| 3.3 Hsa_circ_0005230 在胃癌组织中表达显着上调 |
| 3.4 Hsa_circ_0005230 表达水平与胃癌组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 Hsa_circ_0005230 对胃癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 研究对象 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 合成siRNA |
| 2.2.2 胃癌细胞培养及siRNA转染 |
| 2.2.3 提取Total RNA及制备cDNA |
| 2.2.4 检测沉默效率 |
| 2.2.5 CCK-8 实验 |
| 2.2.6 平板克隆形成 |
| 2.2.7 流式细胞术 |
| 2.2.8 细胞划痕愈合实验 |
| 2.2.9 Transwell迁移实验 |
| 2.2.10 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.11 Western Blotting 实验 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 siRNA片段有效沉默hsa_circ_0005230 的表达 |
| 3.2 CCK-8 实验显示沉默hsa_circ_0005230后胃癌细胞增殖能力显着抑制 |
| 3.2.1 沉默hsa_circ_0005230后HGC-27 胃癌细胞增殖能力受到抑制 |
| 3.2.2 沉默hsa_circ_0005230后AGS胃癌细胞增殖能力受到抑制 |
| 3.3 平板克隆形成实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞克隆形成能力减弱 |
| 3.3.1 沉默hsa_circ_0005230后HGC-27 胃癌细胞克隆形成能力减弱 |
| 3.3.2 沉默hsa_circ_0005230后AGS胃癌细胞克隆形成能力减弱 |
| 3.4 流式细胞术显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞细胞周期阻滞在G0/G1期 |
| 3.4.1 沉默hsa_circ_0005230 后流式细胞术检测HGC-27 胃癌细胞细胞周期阻滞于G0/G1期 |
| 3.4.2 沉默hsa_circ_0005230 后流式细胞术检测AGS细胞细胞周期阻滞于G0/G1期 |
| 3.5 划痕愈合实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞迁移能力减弱 |
| 3.5.1 沉默hsa_circ_0005230 后划痕愈合实验检测HGC-27 胃癌细胞迁移能力减弱 |
| 3.5.2 沉默hsa_circ_0005230 后划痕愈合实验评估AGS胃癌细胞迁移能力减弱 |
| 3.6 Transwell迁移实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞迁移能力减弱· |
| 3.6.1 沉默hsa_circ_0005230后transwell迁移实验评估HGC-27 细胞迁移能力减弱 |
| 3.6.2 沉默hsa_circ_0005230后transwell迁移实验评估AGS细胞迁移能力减弱 |
| 3.7 Transwell侵袭实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞侵袭能力减弱· |
| 3.7.1 沉默hsa_circ_0005230后transwell侵袭实验评估HGC-27 细胞侵袭能力减弱 |
| 3.7.2 沉默hsa_circ_0005230后transwell侵袭实验评估AGS细胞侵袭能力减弱 |
| 3.8 沉默 hsa_circ_0005230 抑制 EMT 通路中关键蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 Hsa_circ_0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌生物学行为的影响机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 组织标本的收集 |
| 2.2.2 细胞系的培养 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 提取Total RNA |
| 2.3.2 RNA反转录及qRT-PCR |
| 2.3.3 Kaplan-Meier生存分析 |
| 2.3.4 生物信息学分析 |
| 2.3.5 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.6 Western Blotting实验 |
| 2.3.7 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MiR-1299 在胃癌细胞系及胃癌组织中表达水平下调 |
| 3.1.1 MiR-1299 在胃癌细胞系表达水平下调 |
| 3.1.2 MiR-1299 在胃癌组织中表达显着下调 |
| 3.2 胃癌组织中miR-1299 高表达患者预后较好 |
| 3.3 RHOT1 mRNA在胃癌细胞系及胃癌组织中表达上调 |
| 3.3.1 RHOT1 mRNA在胃癌细胞系中表达上调 |
| 3.3.2 RHOT1 mRNA在胃癌组织中表达上调 |
| 3.4 胃癌组织中RHOT1 mRNA高表达患者预后较差 |
| 3.5 RHOT1 mRNA的表达水平与淋巴结转移和pTNM分期相关 |
| 3.6 沉默hsa_circ_0005230后miR-1299 表达上调,RHOT1 mRNA表达下调 |
| 3.6.1 沉默hsa_circ_0005230后miR-1299 的表达上调 |
| 3.6.2 沉默hsa_circ_0005230后RHOT1 mRNA表达下调 |
| 3.7 相关性分析 |
| 3.7.1 胃癌组织中hsa_circ_0005230与miR-1299 表达水平呈负相关 |
| 3.7.2 胃癌组织中miR-1299与RHOT1 mRNA表达水平呈负相关 |
| 3.7.3 胃癌组织中hsa_circ_0005230与RHOT1 mRNA表达呈正相关 |
| 3.8 双荧光素酶报告基因实验显示RHOT1与miR-1299 间有特异性结合位点 |
| 3.9 RHOT1 蛋白在胃癌组织中表达上调 |
| 3.10 RHOT1 蛋白在胃癌组织呈阳性表达 |
| 3.10.1 RHOT1 蛋白在胃癌组织中显着高表达 |
| 3.10.2 RHOT1 蛋白表达与胃癌临床病理因素间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 FUS影响hsa_circ_0005230 的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 收集组织标本 |
| 2.2.2 细胞系的培养 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 提取Total RNA |
| 2.3.2 反转录cDNA |
| 2.3.3 相关性分析 |
| 2.3.4 Kaplan-Meier生存分析 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 FUS mRNA在胃癌细胞系及胃癌组织中表达上调 |
| 3.1.1 FUS mRNA在胃癌细胞系表达上调 |
| 3.1.2 FUS mRNA在胃癌组织中表达上调 |
| 3.2 FUS mRNA在胃癌高表达与胃癌淋巴结转移和pTNM分期相关 |
| 3.3 胃癌患者FUS mRNA高表达预后较差 |
| 3.4 相关性分析 |
| 3.4.1 胃癌组织FUS mRNA与 hsa_circ_0005230 表达呈正相关 |
| 3.4.2 胃癌组织FUS与 RHOT1 表达水平正相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 环状 RNA 生物学特性及其在胃癌中功能研究新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）FAM60A在结直肠癌中的表达及其在结直肠癌发生发展中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 FAM60A在结直肠癌中的表达及临床病理意义 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 实验试剂及用品 |
| 2.1.3 实验仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病理学诊断与组织学分级 |
| 2.2.2 临床病理分期 |
| 2.2.3 组织芯片制作流程 |
| 2.2.4 苏木精-伊红(HE)染色及流程 |
| 2.2.5 免疫组织化学染色 |
| 2.2.6 免疫组织化学染色判读标准 |
| 2.2.7 细胞转染 |
| 2.2.8 CCK-8 实验 |
| 2.3 随访 |
| 2.4 质量控制 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 入组病例的临床病理特征情况 |
| 3.2 FAM60A在结直肠癌中的表达情况 |
| 3.3 FAM60A 的表达与结直肠癌患者临床病理特征之间的关系 |
| 3.4 FAM60A的表达与结直肠癌患者预后之间的关系 |
| 3.4.1 预后相关因素分析 |
| 3.5 抑制FAM60A在结直肠癌HT-29 细胞系中的表达对结直肠癌细胞增殖能力的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 FAM60A在结直肠癌发生中的作用及意义 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.1.3 实验试剂及用品、实验仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织学诊断 |
| 2.2.2 组织芯片制作方法、免疫组织化学染色方法 |
| 2.2.3 免疫组织化学结果判读 |
| 2.3 质量控制 |
| 2.4 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 入组病例的一般情况 |
| 3.2 FAM60A在各结直肠组织中的表达情况 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 全文小结与展望 |
| 1 全文小结 |
| 2 研究展望 |
| 文献综述 FAM60A 在细胞功能调控作用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）HIP1R在胃癌中的表达及功能与分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:HIP1R在胃癌中的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床标本采集 |
| 2.1.2 临床病理特征及随访信息采集 |
| 2.1.3 Oncomine数据库 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组化实验(Immunohistochemistry,IHC) |
| 2.2.2 免疫组化染色评分 |
| 2.2.3 绘制受试者工作特征曲线 |
| 2.2.4 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HIP1R在胃癌及癌旁非癌组织中的表达情况 |
| 3.2 HIP1R在胃癌中的诊断价值 |
| 3.2.1 HIP1R在总体胃癌病人中的诊断价值 |
| 3.2.2 HIP1R在无/有淋巴结转移及不同TNM分期中的诊断价值 |
| 3.3 HIP1R的表达与临床病理资料的关系 |
| 3.4 HIP1R的表达与预后的关系 |
| 3.4.1 HIP1R与总体胃癌病人预后的关系 |
| 3.4.2 HIP1R与胃癌亚组人群预后的关系 |
| 3.4.3 影响预后的风险因素分析 |
| 3.5 HIP1R与肿瘤免疫的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:HIP1R蛋白在胃癌中的功能与机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞培养 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要引物及载体 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 提取细胞RNA |
| 2.2.6 RNA浓度纯度检测 |
| 2.2.7 反转录 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.9 细胞转染 |
| 2.2.10 摇菌和质粒抽提 |
| 2.2.11 蛋白提取及定量 |
| 2.2.12 Western blot实验 |
| 2.2.13 细胞凋亡实验 |
| 2.2.14 细胞增殖实验 |
| 2.2.15 Transwell细胞迁移实验和侵袭实验 |
| 2.2.16 生物信息学分析 |
| 2.2.17 免疫组化实验(Immunohistochemistry,IHC) |
| 2.2.18 免疫组化染色评分 |
| 2.2.19 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HIP1R在胃癌细胞系中表达水平检测 |
| 3.2 HIP1R过表达及敲除转染效率验证 |
| 3.3 过表达HIP1R促进胃癌细胞凋亡 |
| 3.4 敲除HIP1R抑制胃癌细胞凋亡 |
| 3.5 过表达HIP1R抑制胃癌细胞增殖 |
| 3.6 敲除HIP1R促进胃癌细胞增殖 |
| 3.7 过表达HIP1R抑制胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 3.8 敲除HIP1R促进胃癌细胞迁移和侵袭 |
| 3.9 生物信息学预测HIP1R下游通路 |
| 3.10 HIP1R下游信号通路验证 |
| 3.11 HIP1R与 p-Akt相关关系验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 HIP1R 和 HIP1 蛋白的生物学功能及在肿瘤进展过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 前列腺癌概述 |
| 1.2 肿瘤细胞能量代谢改变 |
| 1.3 脂代谢与肿瘤 |
| 1.4 ACACA的一般特点 |
| 1.5 ACACA的功能区划分 |
| 1.6 ACACA的生理功能 |
| 1.6.1 ACACA的生理功能 |
| 1.6.2 ACACB的生理功能 |
| 1.7 ACACA调控肿瘤的分子机制及相关信号通路 |
| 1.7.1 ACACA调控肿瘤的分子机制 |
| 1.7.2 肿瘤中ACACA相关信号通路 |
| 1.8 靶向ACACA基因在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.8.1 TOFA |
| 1.8.2 ND-630 |
| 1.8.3 ND-646 |
| 1.8.4 BAY ACC002 |
| 1.8.5 ACACA活性的新型调节剂 |
| 1.9 ACACA与脂代谢在肿瘤细胞中的调节 |
| 1.9.1 阻止脂肪酸合成 |
| 1.9.2 阻断脂肪酸合成基因的表达 |
| 1.9.3 增加脂肪酸降解 |
| 1.9.4 将脂肪酸转移到储存中或阻止脂肪酸从储存中释放 |
| 1.10 目前ACACA在肿瘤中的研究现状 |
| 1.10.1 ACACA在头颈细胞癌中的研究 |
| 1.10.2 ACACA在非小细胞肺癌中的研究 |
| 1.10.3 ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.4 ACACA与p-ACACA在乳腺癌中的研究 |
| 1.10.5 ACACA在胃癌中的研究 |
| 1.10.6 ACACA在肝癌中的研究 |
| 1.10.7 ACACA在前列腺癌中的研究 |
| 1.11 本研究拟解决的问题 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 前列腺癌患者组织芯片 |
| 2.1.2 实验细胞株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂和耗材 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学实验及评分方法 |
| 2.2.2 细胞培养冻存和复苏 |
| 2.2.3 载体设计和细胞系构建 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.2.5 免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.6 细胞功能实验 |
| 2.2.7 液相色谱-质谱检测(LC-MS)细胞代谢组学检测 |
| 2.2.8 海马线粒体压力检测 |
| 2.2.9 海马XF-ATP效率实时检测 |
| 2.2.10 海马XF糖酵解速率检测 |
| 2.2.11 荧光显微镜及流式细胞术检测线粒体示踪 |
| 2.2.12 比色法检测NAD+/NADH水平 |
| 2.2.13 流式细胞术检测细胞内活性氧水平 |
| 2.2.14 动物实验构建裸鼠肿瘤模型 |
| 2.2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 ACACA在前列腺癌组织中上调其表达与TNM分期有关 |
| 3.2 ACACA基因低表达的前列腺癌细胞系(DU145和PC3)构建 |
| 3.3 敲低ACACA基因抑制前列腺癌细胞(DU145和PC3)功能 |
| 3.4 ACACA基因对前列腺癌细胞(DU145和PC3)凋亡的影响 |
| 3.5 抑制ACACA基因影响DU145和PC3细胞ATP水平 |
| 3.6 PC3细胞中敲低ACACA基因后降低L-棕桐酰肉碱和硬脂肉碱水平及代谢途径相关蛋白表达 |
| 3.7 敲低前列腺癌细胞系ACACA基因抑制线粒体-ATP水平和线粒体潜能 |
| 3.8 ACACA能影响线粒体MTDNA及染色情况 |
| 3.9 ACACA基因影响前列腺癌细胞系NAD+/NADH比值和ROS水平 |
| 3.10 敲低ACACA基因后将抑制裸鼠皮下移植瘤形成 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 本研究的不足之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 31种肿瘤简称 |
| 博士研究生期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）星孢菌素类似物7-oxostaurosporine抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究方案 |
| 1.4 预期目标 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 胰腺癌诊疗的研究进展 |
| 2.1.1 EGFR抑制剂 |
| 2.1.2 VEGF抑制剂 |
| 2.1.3 IGF抑制剂 |
| 2.1.4 MMPs抑制剂抑制剂 |
| 2.1.5 针对原癌基因K-Ras信号靶向治疗药物 |
| 2.1.6 靶向诱导肿瘤细胞凋亡药物 |
| 2.1.7 其他靶向药物 |
| 2.2 胰腺癌的发病因素及机制 |
| 2.3 蛋白激酶C(Protcin Kinase C,PKC)在胰腺癌中的研究进展 |
| 2.3.1 PKC的结构及分类 |
| 2.3.2 PKC各亚型的功能 |
| 2.3.3 PKC抑制剂研究进展 |
| 2.4 核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)在胰腺癌中的研究进展 |
| 2.5 星孢菌素研究进展 |
| 2.5.1 星孢菌素的生物功能 |
| 2.5.2 7-羰基星孢菌素化合物(7-oxostaurosporine,33C)研究进展 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 33C制备方法 |
| 3.2.2 抑菌活性、体内外抗肿瘤作用及抗肿瘤机制、预后等实验方法 |
| 第四章 7-oxostaurosporine(33C)制备及其抑菌活性研究 |
| 4.1 7-oxostaurosporine(33C)制备 |
| 4.2 核磁鉴定数据及谱图 |
| 4.3 7-oxostaurosporine(33C)抑菌活性研究 |
| 4.3.1 菌种的活化与培养 |
| 4.3.2 抑菌效果测定 |
| 4.3.3 实验结果与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 7-oxostaurosporine(33C)抗肿瘤药效作用研究 |
| 5.1 33C体外抗肿瘤作用研究 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 实验结果与分析 |
| 5.1.4 讨论 |
| 5.2 33C体内对BXPC-3胰腺癌荷瘤小鼠的药效研究 |
| 5.2.1 材料与方法 |
| 5.2.2 实验结果与分析 |
| 5.2.3 讨论 |
| 5.3 33C体内抗人胰腺癌小鼠异体移植瘤(PDX)药效研究 |
| 5.3.1 材料与方法 |
| 5.3.2 实验结果与分析 |
| 5.3.3 讨论 |
| 第六章 7-oxostaurosporine(33C)抗肿瘤作用机制研究 |
| 6.1 33C诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 6.1.1 材料与方法 |
| 6.1.2 实验结果与分析 |
| 6.2 33C对蛋白激酶家族磷酸化水平影响 |
| 6.2.1 材料与方法 |
| 6.2.2 实验结果与分析 |
| 6.3 体外激酶试验研究33C对 PKCδ和PKCθ 的活性影响 |
| 6.3.1 材料与方法 |
| 6.3.2 实验结果与分析 |
| 6.3.3 讨论 |
| 6.4 PKCδ调控下游NF-κB活性的机制研究 |
| 6.4.1 材料与方法 |
| 6.4.2 实验结果与分析 |
| 6.4.3 讨论 |
| 第七章 应用组织芯片技术研究胰腺癌中蛋白激酶PKCδ、NF-κB的表达及其临床意义 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验方法 |
| 7.1.3 原始实验数据的判读方式 |
| 7.1.4 原始实验数据的标准化方案 |
| 7.2 实验结果与分析 |
| 7.2.1 p-PKC(T505)组织芯片p-PKCδ的表达情况 |
| 7.2.2 p-PKC(T505)组织芯片p-P65 的表达情况 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 3 参与的科研项目及获奖情况 |
| 学位论文数据集 |
（9）BRF2在胃癌发生和发展阶段表达及功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织蜡块来源 |
| 2.1.2 新鲜组织来源 |
| 2.2 实验试剂和实验器材 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 胃癌、癌前疾病及胃息肉的组织芯片的制作 |
| 2.3.2 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 反转录胃癌组织及细胞系的总RNA提取 |
| 2.3.4 反转录 |
| 2.3.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR) |
| 2.3.6 全蛋白提取 |
| 2.3.7 BCA法蛋白定量 |
| 2.3.8 Western blot实验 |
| 2.3.9 细胞培养 |
| 2.3.10 细胞转染 |
| 2.3.11 细胞增殖能力检测(CCK-8) |
| 2.3.12 细胞迁移能力检测(划痕实验) |
| 2.3.13 细胞Transwell迁移侵袭实验 |
| 2.3.14 流式细胞周期检测 |
| 2.4 免疫组化结果的判读 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 BRF2在胃癌中的表达情况 |
| 3.2 BRF2的在胃癌中的表达与患者病理资料相关性的研究 |
| 3.3 BRF2在胃癌细胞中的作用的研究 |
| 3.4 BRF2与胃癌癌前疾病相关性的研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌生长中的作用及其抑制剂的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白激酶从体内外抑制食管鳞癌的机制研究 |
| 第一部分 研究AKT蛋白激酶在食管鳞癌中的生物学功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 AKT蛋白在食管鳞癌组织中的表达高于正常组织 |
| 2.2 研究AKT蛋白激酶在食管鳞癌中的功能 |
| 2.3 AKT特异性抑制剂MK-2206抑制食管鳞癌细胞的体外增殖 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 研究冬凌草甲素靶向并抑制AKT激酶的能力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 冬凌草甲素可与AKT蛋白结合 |
| 2.2 冬凌草甲素抑制AKT蛋白激酶的活性 |
| 2.3 冬凌草甲素抑制AKT1/2蛋白激酶的IC50活性检测 |
| 2.4 冬凌草甲素以ATP竞争性模式抑制AKT1/2蛋白激酶的活性 |
| 2.5 冬凌草甲素与AKT1/2激酶呈ATP竞争性动力学反应模式 |
| 2.6 冬凌草甲素与AKT1和AKT2蛋白的结合模式 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 研究冬凌草甲素通过靶向AK对食管鳞癌的抑制效应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 低浓度冬凌草甲素对食管正常上皮细胞无细胞毒性 |
| 2.2 冬凌草甲素抑制食管鳞癌细胞的增殖 |
| 2.3 冬凌草甲素阻滞食管鳞癌细胞周期的进展 |
| 2.4 冬凌草甲素促进食管鳞癌细胞的凋亡 |
| 2.5 冬凌草甲素通过靶向AKT蛋白激酶抑制食管鳞癌细胞的增殖 |
| 2.6 冬凌草甲素在食管鳞癌细胞中下调PI3-K/AKT信号通路 |
| 2.7 冬凌草甲素抑制食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型的生长 |
| 2.8 冬凌草甲素对食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型小鼠的体重无影响 |
| 2.9 冬凌草甲素对食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)模型小鼠无肝脾毒性 |
| 2.10 冬凌草甲素在食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)组织中降低相关标志物的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 本章结论 |
| 第二章 TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的机制研究及天然小分子抑制剂筛选 |
| 第一部分 研究TAOK1蛋白激酶在食管鳞癌中的功能 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TAOK1蛋白在食管鳞癌组织中的表达高于正常组织或癌旁组织 |
| 2.2 TAOK1蛋白与食管鳞癌肿瘤分期呈正相关 |
| 2.3 p-TAOKs及TAOK1蛋白在不同食管鳞癌细胞中的表达高于正常食管上皮细胞 |
| 2.4 TAOK1基因沉默抑制食管鳞癌 |
| 2.5 研究TAOK1蛋白过表达对食管鳞癌的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 筛选TAOK1蛋白激酶的天然小分子抑制剂 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 与TAOK1高度亲和的天然小分子抑制剂 |
| 2.2 候选天然小分子抑制剂在食管鳞癌细胞增殖中具有不同的活性 |
| 2.3 白藜芦醇高度亲和TAOK1蛋白激酶 |
| 2.4 白藜芦醇与TAOK1蛋白激酶结合后不易解离 |
| 2.5 白藜芦醇与TAOK1蛋白的体外结合模型 |
| 2.6 白藜芦醇与TAOK1蛋白在食管鳞癌中相结合 |
| 2.7 白藜芦醇抑制TAOK1激酶的体外活性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 研究白藜芦醇通过靶向TAOK1对食管鳞癌的抑制效应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 低浓度白藜芦醇对食管正常上皮细胞无细胞毒性 |
| 2.2 白藜芦醇抑制食管鳞癌细胞的体外增殖 |
| 2.3 白藜芦醇抑制食管鳞癌细胞克隆的形成 |
| 2.4 白藜芦醇促进食管鳞癌细胞的凋亡 |
| 2.5 白藜芦醇抑制shTAOK1细胞体外增殖的能力弱于Scramble细胞 |
| 2.6 白藜芦醇下调TAOK1相关p38 MAPK信号通路 |
| 2.7 白藜芦醇抑制食管鳞癌人源肿瘤异种移植瘤(PDX)的生长 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 本章结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 AKT作为癌症潜在治疗靶点的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间学术交流、发表学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
四、胃粘膜疾病组织芯片制作及13种细胞周期调控因子的检测（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA SCARNA2介导的DNA损伤修复在结直肠癌放疗敏感性中的作用及机制[D]. 陈媛媛. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]Cortactin在结直肠癌中的表达与临床病理参数的关系和对肿瘤细胞增殖的影响研究[D]. 赵传多. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]胃癌预后分子指标ZNF326的发现及其在胃癌中的表达与功能研究[D]. 吕星儿. 中国医科大学, 2021
- [4]Hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌病理生物学行为的影响及机制研究[D]. 彭妍钰. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]FAM60A在结直肠癌中的表达及其在结直肠癌发生发展中的作用[D]. 孙永红. 兰州大学, 2021(12)
- [6]HIP1R在胃癌中的表达及功能与分子机制研究[D]. 朱金亮. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]下调乙酰辅酶A羧化酶A基因表达通过调控线粒体功能抑制前列腺癌进展[D]. 张慧. 华南理工大学, 2020(05)
- [8]星孢菌素类似物7-oxostaurosporine抗肿瘤作用及机制研究[D]. 程向炜. 浙江工业大学, 2020(02)
- [9]BRF2在胃癌发生和发展阶段表达及功能的研究[D]. 杨政道. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]蛋白激酶AKT和TAOK1在食管鳞癌生长中的作用及其抑制剂的筛选[D]. 宋孟秋. 郑州大学, 2020(02)