一、细胞分化剂对肿瘤细胞凋亡的诱导与耐药性的逆转（论文文献综述）
李姣[1]（2021）在《BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究》文中研究指明近年来,随着基因测序与蛋白结构解析技术的不断提高,针对恶性肿瘤的相关研究取得了不少进展。大量研究表明恶性肿瘤发病过程中极其复杂的生物学行为运用单纯的中心法则已经无法解释清楚,而表观遗传学的发展使得对恶性肿瘤发病机制的认识更加深刻。表观遗传（epigenetic inheritance）是指在不改变遗传物质DNA序列的情况下改变遗传性状的可遗传变化。目前表观遗传主要是通过对组蛋白翻译后修饰、DNA修饰和非编码RNA的调控等方式进行。近年来随着对癌症发展过程中关键表观事件的研究不断深入,新的表观遗传学关键靶点不断被发现,设计研发针对这些靶点的新一代药物是表观靶向治疗学的主要策略和方向。溴结构域识别蛋白4（Bromodomain-containing protein 4,BRD4）是溴结构域超末端蛋白（Bromodomain and extra terminal protein,BET）众家族成员中研究最为广泛的一员,它可以通过两个结构域（BD1和BD2）识别并结合组蛋白氮端尾部的乙酰化赖氨酸残基,参与表观遗传组蛋白翻译后修饰乙酰化信号的传递,调控下游基因转录。当BD1和/或BD2被抑制时会导致不同的表型,说明两个结构域具有不同的生物学功能。目前为止,虽然已有部分BRD4抑制剂进入了临床研究阶段,但相似的结构骨架可能为该类靶向抑制剂将来的临床应用带来潜在的耐药性风险,因此发现全新结构骨架的BRD4抑制剂仍具有重大意义。而天然化合物作为大自然进化产生的“天然分子库”,具有多样的化学骨架、广泛的生物活性、丰富的资源等优点,长期以来都是人类药物的重要来源。因此,本文基于BRD4蛋白重要的生物学功能带来的科学问题,充分发挥天然化合物自身优势,从筛选结构新颖的天然抑制剂、探索苗头化合物的生物活性及作用机制等角度着手,进行BRD4天然抑制剂的研究。本论文主要包含了以下几个方面的工作:1.利用AlpHaScreen assay从天然黄酮类化合物中筛选了 一个全新结构骨架的BRD4天然抑制剂-3’,4’,7,8-Tetrahydroxyflavone（以下简写 3478）,并结合 Counter assay 分析3478分别对BD1及BD2的亲和作用。结果表明3478对BRD4具有较好亲和活性,而其他结构相似的天然黄酮类化合物及衍生物无明显活性,这说明3478自身特异的结构骨架对BRD4的亲和作用具有非常重要的意义,这种亲和作用并非黄酮类化合物普遍存在的性能。同时,3478对BD2的亲和活性（IC50=204nM）约是对BD1（IC50=17.9μM）的100倍,具有BRD4-BD2选择性;2.选用急性骨髓性白血病细胞MV4-11作为研究对象,观察3478在体外对MV4-11细胞增殖、凋亡、原癌基因c-Myc及BRD4表达等的影响,探索3478的生物活性及可能的分子调控机制。结果显示3478可以抑制MV4-11细胞增殖、促进MV4-11细胞凋亡,同时可以下调原癌基因c-Myc mRNA水平以及c-Myc表达;3.构建急性骨髓性白血病小鼠模型,研究3478在体内对干预白血病细胞皮下移植瘤组织生长的作用及潜在的分子调控机制,为天然化合物3478可能干预急性骨髓性白血病提供客观的实验依据。结果发现3478在不影响小鼠体重及脏器指数的情况下可以减缓皮下移植瘤组织体积及重量的增长,同时也可以下调原癌基因c-Myc mRNA水平,降低细胞核和细胞质中c-Myc的表达;4.利用蛋白质晶体学的技术手段,通过解析3478分别与BD1及BD2的复合物结构、分析他们在结合模式、结合特点等方面的差异,解释3478对BRD4亲和活性及潜在选择性背后的分子机制。本研究中解析了 3478分别与BD1和BD2 1.3 A和1.73 A的高分辨率复合物晶体结构,发现3478与BD1和BD2的结合方式非常相似,与BD1 N140及BD2的N433均形成氢键,且通过水分子与BD1 Y97位及BD2的Y390均形成氢键,同时化合物的7-羟基与BD1 P82及BD2 P375均形成氢键,这3个氢键分别将化合物骨架环紧紧固定在 BD1 及 BD2 口袋内。另外,BD1 的 V87、1146、194 及 BD2 的 V380、V439、L387 与3478均形成较强的疏水相互作用。这些结合特点从分子水平阐明了 3478对BD1及BD2均具有亲和活性的机理。此外,在BD1-3478复合物晶体中,化合物的苯基电子密度较弱,表明该苯基与BD1相互作用较弱,相比之下,其密度在BD2中明显较好,表明3478在BD2中具有更稳定的构象且相互作用更强。并且BD2 N433附近的水分子与3478形成一个额外的氢键,同时H437的NH指向化合物苯环上的两个碳原子,可能会形成疏水作用,而在BD1中的对应位置为D144,其侧链距离化合物太远,无法建立有效的相互作用。近来研究也发现BD2 H437是设计BD2选择性抑制剂的重要氨基酸位点,这些结构特点揭示了 3478对BRD4-BD2的活性明显高于BRD4-BD1的分子机理。3478的化学骨架及其与BRD4溴域的结合模式,与迄今为止报道过的BRD4抑制剂截然不同。鉴于3478对BRD4不同结构域均具有较好的亲和活性,化学骨架及与BRD4活性口袋的的结合模式均较新颖,对BD2具有一定的选择性,且分子量也较小（MW:286.24）,还有较大的结构改造和结构优化的空间等优点,该化合物值得作为BRD4先导化合物进行进一步探索,以启发癌症及其他BRD4相关疾病的药物研发。
白玲[2]（2021）在《CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究》文中认为背景:急性B淋巴细胞白血病（B-cell Acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）的免疫治疗发展迅速,使复发难治B-ALL的有效率从30%提高到90%;但由于其副作用和疗效仍然有限而限制了其应用。因此,寻找减少毒副作用和延长生存期的新策略至关重要。TLR9激动剂作为一种免疫佐剂在抗肿瘤治疗中已显示出良好的安全性和有效性,其不仅具有免疫调节作用,对于肿瘤细胞也具有直接作用。它能够在增强抗肿瘤免疫的同时影响肿瘤的抑制性免疫微环境,从而促进免疫系统更好地识别肿瘤,实现“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转变。然而,既往的研究主要集中在其免疫调节方面,而对于肿瘤的直接作用常被忽略,尤其是对于B-ALL的直接作用尚无报道。通过我们前期研究发现:TLR9激动剂能够抑制B-ALL增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞而清除B-ALL,但对于不同类型B-ALL的作用具有异质性。因此,明确TLR9激动剂在不同类型B-ALL患者中的作用及分子机制,可能有助于发掘TLR9激动剂治疗有效的生物标志物和患者特征,优化B-ALL的精准治疗。研究目的:1.明确TLR9表达与B-ALL患者临床病理特征及预后的关系;2.探索CpG 685对B-ALL的作用;3.探讨CpG 685诱导B-ALL细胞凋亡的分子机制,发掘治疗有效的关键生物标志物;4.寻找针对不同类型B-ALL的治疗策略以及CpG 685应用有效的预测标志物。研究方法：1.通过实时定量RT-PCR和流式细胞术检测TLR9的表达,应用统计学分析明确TLR9表达与临床病理特征及预后的关系;2.通过WST-1增殖实验、AnnexinⅤ/7-AAD凋亡检测和流式细胞术检测CpG 685在不同类型B-ALL中的作用,明确CpG 685对B-ALL细胞体外直接作用的差异;3.通过构建NCG B-ALL小鼠移植瘤模型,应用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏和外周血中肿瘤负荷的变化和观察小鼠生存期,明确CpG 685对B-ALL细胞在体内的作用差异;4.通过有或无相关信号通路及关键分子抑制剂预处理,在CpG 685刺激后,应用Western Blot、蛋白纯化及免疫沉淀、免疫荧光共定位、染色质免疫共沉淀检测TLR9下游信号通路相关蛋白的表达和基因的作用位点;通过RT-PCR和实时定量RT-PCR明确通路涉及的mi RNA的表达情况;通过对其作用机制的探究,发掘CpG 685治疗B-ALL有效的预测生物标志物;5.通过Ficol密度梯度离心法分离临床样本中的外周血单个核细胞,在有或无CpG 685刺激后,明确基于细胞系发现的预测标志物在临床应用中的可行性;6.通过在BALB/C小鼠中构建肿瘤移植瘤模型,应用流式细胞术检测各种免疫细胞所占小鼠淋巴细胞的比例,明确CpG ODN对小鼠机体抗肿瘤免疫的调节情况。研究结果:1.相比于正常人的外周血单个核细胞,TLR9在B-ALL患者的外周血单个核细胞中高表达;并且,相比于TLR9低表达组,高表达组的B-ALL患者预后较好;2.CpG 685对B-ALL细胞的作用存在异质性。对于BLIN-1细胞,其能抑制增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞、上调共刺激分子及免疫调节分子、降低小鼠骨髓、脾脏和外周的肿瘤负荷、延长生存期;而对于Sup-B15细胞无明显作用;3.BLIN-1细胞中,CpG 685通过P38/P53/BAX信号通路,依赖C-MYC过表达诱导B-ALL细胞凋亡。过表达的C-MYC可以促进P53稳定,诱导P53磷酸化,增强BAX转录,并介导BAX激活相关构象改变。4.伊马替尼和CpG 685联合应用于Ph（+）B-ALL细胞逆转两药单独应用的耐药、降低小鼠肿瘤负荷、延长小鼠生存期;伊马替尼能促进BAX的激活,同时抑制C-MYC低表达的抗凋亡效应;而CpG 685通过下调mi R-21,上调PTEN,进而逆转了PI3K/AKT/m TOR通路过度激活所致的伊马替尼耐药;5.临床患者中,CpG 685可直接诱导PBMC C-MYC高表达且Ph染色体阴性的B-ALL患者的原代B-ALL细胞凋亡;6.CpG ODN能够促进B细胞、pDC细胞的增殖,抑制MDSC细胞增殖,进而增加NK细胞、T细胞的比例,促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,促进抗肿瘤免疫的激活。结论:1.TLR9的表达与B-ALL患者的预后相关;2.TLR9是B-ALL潜在的治疗靶点,CpG 685可通过P38/P53/BAX信号通路诱导B-ALL细胞凋亡,该过程依赖于C-MYC的高表达;3.C-MYC可能是协助预测CpG 685单药对B-ALL患者有效的预测标志物;4.而对于Ph（+）B-ALL,联合应用伊马替尼和CpG 685可逆转两药单独应用的耐药。该联合治疗不仅能直接诱导Ph（+）B-ALL细胞凋亡,还增强了B-ALL细胞的免疫原性,促进CD8+T细胞的识别。5.CpG ODN能够通过促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,激活抗肿瘤免疫。
许远[3]（2021）在《miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究》文中进行了进一步梳理甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid caner,ATC）是所有甲状腺肿瘤中恶性程度最高且预后极差的一种病理类型,临床确诊时往往已是晚期。由于其缺乏分化不能聚碘,所以无法以放射碘进行治疗。阿霉素（doxorubicin,DOX）目前是治疗ATC的一线化疗药物,但是在治疗后期ATC对阿霉素的耐药性是导致最终化疗失败的主要原因。然而目前ATC阿霉素耐药的机制研究进展缓慢,耐药逆转剂的开发更是滞后。阿霉素化疗的耐药机制尚不十分清楚,近年的研究表明,异常表达的多种微小RNA（microRNAs,miRNAs）参与了肿瘤多药耐药的形成。miRNAs是一类高度保守的内源性、非编码、单链RNA分子,参与了多种肿瘤的发生发展。我们通过GEO、TCGA等数据库检索、生物信息学分析以及大量文献复习,确定microRNA-27b-3p（miR-27b-3p）及过氧化物酶体增殖物受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ）作为进一步的研究目标。之前的研究发现,miR-27b-3p以及PPAR-γ的异常表达与胃癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤耐药性相关,但两者在ATC中的表达情况以及对阿霉素治疗敏感性的影响等尚未见报道。为了阐明miR-27b-3p与PPAR-γ是否参与ATC细胞耐药形成、以及如何逆转ATC细胞对阿霉素的耐药性,我们探讨了在ATC阿霉素耐药细胞系SW1736/DOX 和 8305C/DOX 中 miR-27b-3p 与 PPAR-γ 靶向调控关系、miR-27b-3p与PPAR-γ的动态表达对ATC细胞阿霉素耐药性的影响、以及可能同时参与调控的miR-27b-3p/PPAR-γ轴上游及下游基因,为逆转ATC阿霉素耐药提供理论依据。第一部分 人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株的构建目的建立人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株,描述其生物学特性;并在mRNA水平及蛋白水平检测耐药相关基因P-gp在耐药株与敏感株中的表达差异以验证耐药株的成功建立,为下一步开展肿瘤耐药性的机制研究提供科研模型。方法1.以人甲状腺癌未分化癌细胞SW1736、8305C为亲代细胞,以阿霉素为筛选药物,采用逐步递增阿霉素浓度,间歇作用体外诱导构建SW1736/DOX、8305C/DOX耐药细胞株模型。2.采用CCK-8法检测经不同浓度阿霉素作用后耐药株细胞及其亲代细胞的抑制情况,以便筛选出最合适的干预浓度和作用时间。3.通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹印迹法检测耐药相关蛋白P-gp在耐药株和敏感株细胞中的表达差异。4.利用腺病毒转染技术,构建稳定表达荧光LUC细胞株SW1736-LUC/DOX、8305C-LUC/DOX,用于后期动物实验。结果1.采用低浓度加药持续诱导法,逐步递增培养液中阿霉素的浓度,间歇作用体外诱导筛选,历时3个月获得了在阿霉素作用下生长良好的耐药细胞株,分别命名为SW1736/DOX和8305C/DOX。通过实验我们发现,在逐渐升高的阿霉素浓度作用下,耐药株SW1736/DOX、8305C/DOX细胞抑制比率上升幅度明显低于亲本细胞株。2.用CCK-8法测得SW1736细胞对阿霉素的IC50为0.82 μM,SW1736/DOX细胞对阿霉素的IC50为8.83 μM,其耐药系数RI为10.73;8305C细胞对阿霉素的IC50为1.77 μM,8305C/DOX细胞对阿霉素的IC50为9.22 μM,其耐药系数RI为5.41。根据RI常规分级,SW1736/DOX、8305C/DOX细胞较亲本SW1736、8305C细胞对阿霉素为中度耐药,具有明显的耐药性。并筛选出1 μM的最适阿霉素作用浓度和48小时的作用时间。3.qRT-PCR 结果显示,在耐药细胞株 SW1736/DOX、8305C/DOX 中 P-gp mRNA表达较其亲代细胞株SW1736、8305C明显上调,存在显着性差异（p<0.01）;Western Blot结果显示,耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中P-gp蛋白表达量明显升高,存在显着性差异,提示ATC耐药株模型构建成功。4.利用腺病毒（pHBLV-CMV-MCS-EF1-fLUC-T2A-PURO）转染技术,我们获得了稳定表达LUC基因的细胞株SW1736-LUC/DOX和8305C-LUC/DOX,用于后期动物实验。结论两种ATC细胞获得耐药性的过程是逐渐改变的,有明显的剂量依赖关系,耐药株细胞较其亲代细胞对阿霉素药物更为耐受,而且耐药株中耐药相关蛋白P-gp的mRNA和蛋白高表达也验证了耐药细胞株的成功构建。利用SW1736/DOX、8305C/DOX模型,我们可以在后续的microRNAs及其靶基因调控水平上研究其耐药性的改变,并以此为基础进一步开展逆转耐药的研究。第二部分 miR-27b-3p的表达水平与人甲状腺未分化癌细胞对阿霉素敏感性的关系目的通过生物信息学分析结合文献复习,找出可能与ATC阿霉素耐药性相关的差异表达miRNAs,进一步筛选出在ATC阿霉素耐药株细胞中异常表达的miRNA,通过体外和体内实验检测其表达水平与ATC细胞阿霉素药物敏感性的关系。方法1.通过NCBI网站上的GEO数据库、TCGA数据库等检索并下载与甲状腺癌化疗耐药相关的数据集,分析差异表达的miRNAs。筛选出可能与甲状腺未分化癌阿霉素化疗耐药相关的差异miRNAs作为主要研究对象。2.在多种相关miRNAs中,采用qRT-PCR技术,进一步筛选出ATC耐药株细胞和亲代细胞中存在显着差异表达的miRNA。3.体外实验:通过控制miRNA表达（miRNA inhibitor）,观察转染组与非转染组耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。4.体内实验:构建裸鼠异种体内ATC耐药细胞株移植瘤模型,通过敲低目标miRNA（miRNA antagomir）,观察实验组与对照组荷瘤小鼠移植瘤的生长曲线,qRT-PCR分析移植瘤中目标miRNA的表达改变。结果1.我们使用 TCGAbiolinks R 包下载 TCGA-THCA miRNA-seq readcount 数据与临床样本数据,使用ggplot2R包绘制火山图。共找到差异miRNA394个,其中上调miRNA264个,下调miRNA 130个。通过查阅大量文献综述,我们在差异miRNA中筛选出与甲状腺未分化癌密切相关,且参与多种不同恶性肿瘤化疗耐药性调控的 miRNA:miR-200 家族（包括 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141）、miR-205 和 miR-27b 作为下一步研究的目标 miRNAs。2.通过RT-PCR实验对上述miRNAs在ATC细胞株SW1736、8305C及其耐药株SW1736/DOX、8305C/DOX中的表达水平进行了筛选检测,结果显示,miR-27b-3p在耐药株细胞中的表达水平明显升高,与其亲代细胞相比,具有显着性差异（p<0.01）。因此,我们选择miR-27b-3p作为研究ATC阿霉素耐药机制的目标miRNA。3.为了明确miR-27b-3p表达水平的高低是否对ATC细胞的耐药性产生影响,我们在耐药细胞株中转染miR-27-3p inhibitor及scramble miRNA,采用CCK-8法检测耐药细胞株中转染组和对照组细胞对化疗药物阿霉素敏感性的变化。结果显示,与对照组相比,转染miR-27-3p inhibitor组随着药物浓度增加,细胞抑制比率逐渐上升,IC50值明显降低,差异具有统计学意义（p<0.01）,提示抑制miR-27b-3p表达可显着提高ATC细胞对阿霉素的敏感性。4.为了进一步验证miR-27b-3p在体内对ATC阿霉素耐药性的调控作用,我们构建了裸鼠异种体内皮下移植瘤模型。实验组在瘤体内注射了 miR-27b antagomir之后,移植瘤生长明显减缓;取出瘤体后检测瘤重变化与体积变化一致。两组荷瘤小鼠移植瘤大体照片对比进一步表明,注射miR-27b antagomir增强了阿霉素的抗肿瘤效应。与体外细胞实验结果一致,miR-27b antagomir干扰后,移植瘤组织中miR-27b-3p的表达显着降低。以上体内实验结果证实,敲低miR-27b-3p可以增强ATC耐药细胞对阿霉素药物的化疗敏感性。结论miR-27b-3p在甲状腺未分化癌阿霉素耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中显着高表达,抑制miR-27b-3p表达可以增强甲状腺未分化癌细胞对阿霉素化疗敏感性。第三部分 miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性目的探讨miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ对ATC细胞阿霉素耐药性的调控及其分子机制,并对miR-27b-3p/PPAR-γ调控轴的上游及下游信号分子进行初步的拓展研究。方法1.通过多个数据库预测miR-27b-3p下游的靶基因并进行Venn分析,采用clusterProfiler R包对靶基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,同时结合TCGA-THCA mRNA-seq readcount数据与临床样本数据,选取与甲状腺癌相关的靶基因作为下一步的研究对象。2.通过生物信息学分析明确miR-27b-3p与靶基因的结合位点。3.通过双荧光素酶报告实验验证该基因是否miR-27b-3p的直接靶标。4.在SW1736和8305C细胞转染miR-27b-3p模拟物,通过qRT-PCR和WB实验观察靶基因mRNA以及蛋白水平的改变,以明确两者表达相关性。5.通过qRT-PCR和WB实验明确该靶基因在耐药细胞株与亲代细胞株中mRNA和蛋白的表达差异。6.构建并转染该基因的过表达质粒,观察耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。7.在SW1736和8305C细胞转染miR-27b-3p模拟物,qRT-PCR检测转染组和非转染组下游转录因子的mRNA表达水平,筛选出显着性差异表达的下游基因,ELISA实验检测其在耐药株与敏感株中的表达情况,并通过挽救实验验证其是否参与miR-27b-3p对ATC细胞阿霉素耐药性的调节。8.WB法分别检测耐药株细胞胞浆以及细胞核内磷酸化NF-κB p65的含量变化;在耐药细胞株SW1736/DOX和8305C/DOX中分别转染NF-κBp65的抑制剂BAY 11-7082,通过qRT-PCR检测miR-27b-3p及其靶基因的mRNA表达改变,以验证NF-κB p65是否通过影响miR-27b-3p对其靶基因的调控进而影响ATC细胞阿霉素耐药性。结果1.通过TargetScan数据库、miRDB数据库和miRTarBase数据库预测miR-27b-3p的靶基因,进行Venn分析,同时能在3个数据库可预测到的靶mRNA共17个。针对miR-27b-3p筛选到的mRNA基因进行功能富集分析,GO分析发现显着差异表达的基因在生物过程方面主要参与生殖系统发育、对制动应激反应、动物器官的再生、胚胎上皮形态的发生以及胎盘发育等;在细胞成分上主要集中在细胞质膜和膜的外源性组分、泛素配体复合物、非对称性突触、内质网腔等;在分子功能方面主要影响蛋白C末端结合、VEGF受体结合等。KEGG富集分析发现差异表达的基因主要集中在miRNA对恶性肿瘤的调控作用、MAPK信号通路、p53相关通路、甲状腺癌调控等方面。从KEGG信号通路分析我们可以看出,PPAR-γ与甲状腺癌密切相关,我们将筛选出的差异基因通过Gepia在线工具检索,发现PPAR-γ基因在甲状腺癌症组中相对于癌旁组显着低表达。前期的研究提示PPAR-γ基因高表达能提高甲状腺癌放射性碘治疗疗效,我们使用 TCGAbiolinks R 包下载 TCGA-THCA mRNA-seq readcount数据与临床样本数据,经分析发现PPAR-γ在甲状腺癌放疗组的表达较非放疗组明显下调。此外我们通过查阅文献,发现PPAR-γ还参与乳腺癌、卵巢癌、肺癌等化疗耐药性的形成。因此我们假设PPAR-γ是miR-27b-3p调控ATC化疗耐药性的一个重要靶标,故而选择miR-27b-3p/PPAR-γ来作为我们下一步研究的对象。2.采用TarScan4.0软件分析miR-27b-3p对PPAR-y的靶向作用,结果显示miR-27b-3p靶向作用于PPAR-γ的可能PCT值达到73,且context score的百分概率达到67。我们也采用miRanda数据库分析miR-27b-3p的作用靶点,结果显示miR-27b-3p的5’种子区有7个核苷酸与PPAR-y的3’-UTR完全互补,位于82-88碱基之间。3.在ATC细胞株转染miR-27b-3p mimics,qRT-PCR及WB实验结果显示:与对照组相比,转染组PPAR-γ的mRNA和蛋白水平均显着降低,差异有统计学意义（p<0.01）,表明过表达miR-27b-3p可以有效调控PPAR-y在甲状腺未分化癌细胞株中mRNA和蛋白的表达,两者呈显着负相关。4.在转染野生型pmirGLO-PPARG-3’UTR-wt报告基因质粒的两组细胞中,共转染miR-27b-3p mimics组的荧光素酶活性为空白对照组的45.2%,存在显着的统计学差异（p<0.01）;而在转染突变型pmirGLO-PPARG-3’UTR-mut质粒的两组细胞中,共转染miR-27b-3p mimics组和对照组的荧光酶素活性无显着差异,提示miR-27b-3p可以明显抑制含有PPAR-y 3’UTR的荧光素酶报告基因的表达,而这种抑制作用可以被结合位点5个核苷酸的突变所逆转。由此可见,miR-27b-3p对PPAR-γ存在靶向调控,表明PPAR-γ的确是miR-27b-3p的直接靶基因。5.RT-PCR及WB实验结果提示PPAR-γ在耐药株中的mRNA及蛋白水平显着低于亲代细胞株,差异具有统计学意义（p<0.01）。6.构建过表达PPAR-γ质粒并转染耐药细胞株SW1736/DOX及8305C/DOX,结果显示耐药株对阿霉素的IC50明显下降,提示过表达PPAR-γ可显着提高ATC细胞对阿霉素的敏感性。7.在ATC细胞株中转染miR-27b-3p mimics后,下游基因bFGF的mRNA表达明显降低,而c-Myc、Bcl2、VEGF的表达无显着差异,通过ELISA法测定转染组培养基中bFGF的浓度,得到了相同的结果。ELISA法检测耐药细胞株的bFGF表达显着低于亲本细胞株。提示miR-27b-3p水平上调对bFGF的表达有抑制作用,挽救实验证实过表达PPAR-γ可以逆转这种抑制作用。以上结果均提示bFGF受PPAR-γ正向调节,并可能参与miR-27b-3p/PPAR-γ轴对ATC细胞阿霉素敏感性的调控。8.耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX中NF-κB p65的总蛋白和核蛋白水平均显着上升,提示耐药株细胞中NF-κB p65呈现活化状态。NF-κB p65受到抑制后,miR-27b-3p的表达也随着显着下调,而PPAR-γ的表达较对照组显着上调。以上结果提示,ATC耐药细胞中miR-27b-3p水平上调与NF-κB p65活化有关,NF-κB p65可能作为miR-27b-3p/PPAR-γ调控轴的上游调控基因对ATC耐药性产生影响。结论过表达PPAR-γ可以增加甲状腺未分化癌耐药细胞株SW1736/DOX、8305C/DOX对阿霉素的敏感性;PPAR-γ是miR-27b-3p的直接靶基因,miR-27b-3p可能通过靶向PPAR-γ参与调控ATC细胞阿霉素耐药性;NF-κB p65与bFGF分别作为miR-27b-3p/PPAR-γ轴的上游及下游信号分子,参与调控ATC细胞对阿霉素的耐药性。
余世龙[4]（2020）在《锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究》文中指出背景肺癌目前仍然是位居全球肿瘤发病率和死亡率首位的恶性肿瘤。组织类型上肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,其中,NSCLC占肺癌总类型的80-85%,肺腺癌是NSCLC的主要病理类型。近年来尽管以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗和以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗将具有相应驱动基因的晚期NSCLC患者生存期提高到了25-30月,远远超越了传统化疗的8-10月,但因获益人群的局限性,以铂类抗癌药物为主的联合化疗仍然是大部分NSCLC患者首选的一线治疗方案,特别是不适合分子靶向治疗或免疫治疗的NSCLC患者、分子靶向治疗或免疫治疗失败的NSCLC患者以及术后需要辅助化疗的I-IIIa期NSCLC患者。顺铂（DDP）是铂类药物中最常用的化疗药物。顺铂对早期肺癌的抑制作用显着,但在短期缓解之后,几乎对顺铂治疗有效的患者都会相继出现多药耐药、复发和进一步转移等恶性进展,导致化疗失败,成为提高临床肺癌治疗效果的一大瓶颈。三十多年来,研究者对肺癌的顺铂耐药进行了大量研究并获得了重要成果,但顺铂诱导的肿瘤耐药表现出极其复杂的多因素性,其中一个严峻的现实是,针对目前已知的顺铂耐药机制研发的小分子药物并没有达到预期的临床抑癌效果。因此,进一步深入挖掘顺铂诱发的肺癌耐药机制是当前亟待解决的重要课题。为了进一步探讨NSCLC获得性耐药机制,本研究在前期成功建立人NSCLC耐药细胞A549/DDP的基础上开展相关研究,具体研究内容如下:1)NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定;2)耐药相关基因的筛选和鉴定;3)ZNF300与NSCLC恶性进展;4)ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制;5)淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制。本研究将为寻找肿瘤耐药新靶点,逆转NSCLC耐药提供理论和实验依据。方法1)DDP处理A549和A549/DDP细胞后,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（MMP）,ATP试剂盒测定细胞内ATP含量以及DCFH-DA探针标记法检测细胞内氧自由基（ROS）,以比较DDP对两种细胞线粒体功能的影响,并用流式细胞术检测DDP诱导的细胞凋亡。采用CCK8药敏实验检测五种化疗药物对两组细胞的IC50值,鉴定NSCLC耐药细胞的多药耐药性。2)以差异倍数|FC|≥3为标准筛选基因表达谱芯片（A549/DDP vs.A549）中差异表达基因,并把该数据和DNA甲基化芯片数据进行整合,筛选候选基因,尔后采用RT-PCR验证潜在侯选基因表达情况。RT-PCR和WB进一步验证候选基因在五种肺癌细胞株及其耐药株中的表达水平。BSP法检测三株NSCLC细胞及其耐药株中ZNF300启动子甲基化水平,WB检测5-Azacitidine和Belinostat处理后各细胞中ZNF300水平。3)重组慢病毒过表达或沉默相应细胞中靶基因表达后,CCK-8试剂检测五种化疗药物对各种细胞IC50。流式细胞术检测不同浓度DDP诱导下各组细胞的凋亡情况。建立免疫缺陷鼠移植瘤模型,体内验证靶基因对NSCLC肿瘤细胞耐药性的影响。4)Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,划痕愈合试验检测各组细胞迁移能力,失巢凋亡实验评估各组细胞集落形成能力和抗失巢凋亡能力,Ed U染色检测各组细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,鬼笔环肽染色激光共聚焦观察细胞骨架形态。从Oncomine、Betastasis和Biogps等生物信息数据平台下载靶基因表达数据,分析靶基因与NSCLC临床特征之间的相关性。免疫组化法检测靶基因在肺癌标本中的表达水平,并分析其临床特点相关性。5)GO、KEGG和GSEA确定表达谱芯片中与耐药细胞表型改变相关的信号通路（A549-ZNF300 vs.A549-ZNF300-NC）,WB验证相关通路核心蛋白表达。使用通路抑制剂和激动剂体外验证靶基因调控NSCLC耐药和恶性进展的分子机制。6)ICA、ATRA和DDP处理时,高内涵系统动态观察共培养细胞。WB检测药物处理后各组细胞的CD235a和CD61表达水平,SA-β-GAL染色检测药物处理后各组细胞衰老情况。RT-PCR检测DDP对衰老基因和SASP相关基因表达影响。结果1)DDP处理后,A549/DDP细胞MMP改变、ROS水平显着低于A549细胞（p<0.05）,而ATP含量显着高于A549细胞（p<0.05）。DDP诱导A549/DDP细胞的凋亡显着低于A549细胞（p<0.05）。顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞对A549/DDP细胞的IC50显着高于A549细胞（p<0.05）。2)A549/DDP和A549细胞的表达谱芯片数据和甲基化数据整合后,初步筛选出140个候选基因,其中包括77个启动子低甲基化上调表达基因和63个启动子高甲基化下调表达基因。RT-PCR结果显示,15个启动子低甲基化基因的表达上调,25个启动子高甲基化基因的表达下调。候选基因ZNF300在A549/DDP、H520/DDP和H1650/DDP细胞中的水平显着高于相应亲代细胞。5-Azacitidine处理后ZNF300在上述三种耐药细胞的亲代细胞中表达显着性升高。3)成功建立ZNF300过表达细胞（A549-ZNF300）和低表达细胞（A549/DDP-sh ZNF300）。五种化疗药物对ZNF300高表达细胞的IC50显着高于ZNF300低表达细胞（p<0.05）。顺铂诱导ZNF300高表达细胞的凋亡显着性低于ZNF300低表达细胞（p<0.01）。DDP处理后,ZNF300低表达细胞形成的皮下移植瘤比ZNF300高表达细胞的重量和体积显着缩小,证明ZNF300促进NSCLC肿瘤细胞耐药形成。4)体外实验表明,耐药细胞的侵袭、迁移、集落形成和抗失巢凋亡能力均显着强于药敏细胞（p<0.05）,耐药细胞的细胞增殖率显着低于药敏细胞（p<0.05）。相比药敏细胞,耐药细胞出现细胞周期阻滞（p<0.05）,且具有更明显的细胞伪足。生物学信息分析结果表明,ZNF300与NSCLC恶性进展有关。免疫组化结果提示,ZNF300高表达与NSCLC患者病理分级、临床分期、术前淋巴结转移、区域性转移和复发呈正相关,与患者OS呈负相关。5)与A549-ZNF300-NC细胞相比,A549-ZNF300细胞中大部分与生长分化因子和MAPK/ERK通路相关的基因（CD61,CD235a,p-ERK1/2,p-p38 MAPK）表达下调,而大部分与细胞周期和癌症干性相关的基因（PCNA,p15,Nanog,Oct-4）表达上调。AZD6244处理ZNF300低表达细胞后,p-ERK1/2、p-p38 MAPK和CD61下降,而p15和Nanog增加,细胞迁移、侵袭、抗凋亡和顺铂耐受性显着增强,细胞增殖减弱。而Hesperetin对ZNF300高表达细胞的作用相反。6)与药敏细胞相比,ICA和ATRA能上调耐药细胞中CD235a和CD61水平。细胞共培养发现,耐药细胞对顺铂联合ATRA或ICA的反应比药敏细胞更明显。ICA和ATRA作用下,耐药细胞被药敏细胞吞噬的比例显着高于药敏细胞被耐药细胞吞噬的比例。DDP、ICA和ATRA药物处理后,耐药细胞中SA-β-GAL阳染率明显高于药敏细胞,并且,耐药细胞中衰老相关基因和SASP相关基因的表达显着性高于药敏细胞。结论1)ZNF300是NSCLC耐药相关基因。2)ZNF300可促进肿瘤细胞恶性生长,其高表达预示NSCLC患者预后不良。3)ZNF300通过抑制MAPK/ERK信号通路调控耐药细胞缓慢周期表型和细胞分化。4)ZNF300通过抑制WEE1/MYT1和调控MYC/AURKA/BORA/PLK1信号轴激活CDK1从而调节耐药细胞的细胞周期。5)ICA和ATRA通过诱导细胞分化提高DDP对耐药细胞抑癌作用。
张玺[5]（2020）在《苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究》文中认为背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于早期无明显症状,缺乏有效的早期检测筛查手段,约70%患者在诊断时已是晚期。目前,手术联合化疗是卵巢恶性肿瘤的主要治疗手段,但化疗对患者身体毒副作用大,且容易复发并产生耐药性。磷酸化是目前研究最广泛的翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）,能够调节细胞生长、分化、凋亡等多种细胞功能。磷酸化信号通路的改变与癌症密切相关,同时它们也可作为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质组学研究表明,由磷酸化等蛋白翻译后修饰介导的信号通路在卵巢癌的发生和耐药过程中起着关键作用。苦参碱是从中药苦参中提取的有效生物活性成分,具有广泛的生物学活性,比如抗炎、抗病毒、抗癌、镇痛、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化等。大量研究表明,苦参碱在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种类型的癌症中具有明确的抗癌效果。然而,苦参碱对卵巢癌的影响及其潜在的分子机制尚未见报道。目的:本研究旨在探究苦参碱对卵巢癌的作用及其分子机理,为苦参碱作为新型抗癌药物的深入研究提供线索和依据。方法:1.MTT法和平板克隆形成实验检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP增殖能力的影响。2.流式细胞术检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞周期和凋亡的影响。3.透射电子显微镜和荧光显微镜观察苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP自噬的影响。4.划痕实验、Transwell侵袭实验和免疫荧光技术评估苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞迁移和侵袭的影响。5.体外血管生成试验探讨苦参碱对肿瘤血管生成的影响。6.酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3分泌血管内皮生成因子VEGFA的影响。7.逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测苦参碱对血管内皮生成因子VEGFA和血管生成素ANG-1m RNA水平的影响。8.Western blot检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关蛋白的表达及肿瘤相关磷酸化信号通路的影响。9.分别建立卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP裸鼠皮下移植瘤和尾静脉小鼠模型,定期腹腔注射苦参碱,观察苦参碱对体内卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响。10.苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织坏死、肿瘤转移及肝脏损伤的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织凋亡的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780和小鼠肿瘤组织总的蛋白质磷酸化水平的影响以及肿瘤组织中增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。12.免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）进一步验证苦参碱对小鼠肿瘤组织中信号通路蛋白磷酸化水平的影响。13.全自动生化分析仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartic aminotransferase,AST）含量,评估苦参碱对小鼠肝功能的影响。结果:1.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱阻滞卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞周期在G0/G1期,上调p21蛋白表达,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达;同时降低ERK1/2和MEK1/2蛋白磷酸化水平。3.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3发生凋亡,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达;同时降低PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。4.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3自噬,上调LC3-II蛋白表达,下调SQSTM1蛋白表达;同时降低Akt和m TOR蛋白磷酸化水平。5.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3迁移和侵袭,降低FAK和Rho A蛋白活性及磷酸化水平。6.苦参碱抑制卵巢癌细胞对血管生成的促进作用,降低卵巢癌细胞A2780和SKOV3分泌VEGFA水平,同时降低卵巢癌A2780和SKOV3细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平。7.苦参碱降低HUVEC/A2780和HUVEC/SKOV3共培养体系中内皮细胞HUVECs中ANG-1 m RNA和蛋白表达水平,同时下调VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。8.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780体内肿瘤增殖和转移能力,降低卵巢癌细胞和肿瘤组织中总的蛋白质磷酸化水平。9.Western blot和IHC结果表明,苦参碱下调肿瘤组织中信号通路相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2、Tie2蛋白磷酸化水平。10.苦参碱对肝脏组织无损伤作用,对小鼠血清中ALT和AST含量变化无显着影响。11.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,抑制细胞迁移和肿瘤血管生成。12.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP体内肿瘤增殖和转移能力。结论:苦参碱能够抑制卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成,同时降低ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。苦参碱通过抑制肿瘤相关磷酸化信号通路调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成,从而抑制卵巢癌的发生发展。背景:近几十年来,分子靶向治疗已在许多癌症类型的临床治疗中取得了良好的疗效,如乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等。确定理想的靶点是肿瘤分子靶向治疗成功的关键。分子靶向治疗的靶点可作用于细胞表面抗原、受体和生长因子,能够调控细胞增殖和转移、细胞周期和血管生成相关信号转导通路。靶向治疗可与过表达的分子结合,调节该分子调控的信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖,最终导致细胞死亡。原癌基因c-Src（Src）是一种非受体酪氨酸激酶,与多种人类癌症的发生、维持、进展和转移扩散密切相关。Src通过与多种蛋白和蛋白复合物相互作用并使其磷酸化,在细胞信号传导过程中起关键作用。苦参碱是从传统中药苦参中提取的生物碱之一,具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等广泛的药理学活性。研究表明,苦参碱对多种癌症类型包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病等均具有抗肿瘤活性。苦参碱发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭、抑制血管生成等途径实现的。目前,有关苦参碱抗肿瘤作用的研究颇为广泛,然而其发挥抗癌活性的直接作用靶点尚未见报道。目的:本研究旨在寻找苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点并探讨其作用机制,为开发肿瘤靶向药物提供实验依据。方法:1.选取人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF7、人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3、人宫颈癌细胞He La六种癌细胞为研究对象,MTT法检测苦参碱对癌细胞增殖能力的影响。2.分别建立人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3皮下移植瘤模型,定期腹腔注射苦参碱或生理盐水,观察苦参碱对体内肿瘤增殖能力的影响。3.以槐果碱和乙醇胺为原料进行化学反应,合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱。红外光谱和质谱对13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱进行结构表征。4.13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱与氨基偶联树脂进行偶联反应,制备苦参碱偶联树脂。紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度变化,间接反映偶联反应效率。5.提取卵巢癌细胞SKOV3总蛋白,利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色寻找苦参碱特异性结合蛋白。液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）鉴定苦参碱特异性结合蛋白。6.细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）实验验证苦参碱作用靶点;构建GST-Src重组蛋白,Pull down实验进一步验证苦参碱作用靶点。7.构建Src分段质粒,转染HEK293T细胞,Pull down实验验证苦参碱结合区域。8.构建GST-Kinase重组蛋白,Western blot进一步验证苦参碱结合区域。9.采用Discovery Studio 4.5软件,分子对接苦参碱与Src激酶结构域,探究苦参碱结合Src激酶结构域的氨基酸。10.选取苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞,测定苦参碱对癌细胞中Src激酶活性的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:1.苦参碱抑制癌细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱抑制体内癌细胞增殖能力。3.化学合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱,产率为65%,红外光谱与质谱结构表征结果与13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱结构一致。4.制备苦参碱偶联树脂,紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度,偶联反应效率为54%。5.利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色结果显示,分子量55-70 k Da之间有明显蛋白条带;且加入苦参碱后,此蛋白条带明显减弱,猜测此蛋白可能为苦参碱特异性结合蛋白。LC-MS/MS质谱定性分析发现,Src为苦参碱特异性结合蛋白。6.CETSA实验结果表明,与对照组相比,苦参碱处理组Src蛋白的热稳定性明显增强。同时,GST-Src重组蛋白进行Pull down实验,结果显示,苦参碱偶联树脂组检测到Src蛋白,且加入苦参碱后,Src蛋白明显减少,进一步证实Src为苦参碱作用靶点。7.分别构建Src分段质粒USH3、SH4-UD、SH3、SH2、Kinase,转染HEK293T细胞过表达后,提取总蛋白进行Pull down实验,Western blot结果分析显示,苦参碱结合Src激酶结构域。8.GST-Kinase重组蛋白进行Pull down实验,Western blot结果表明,苦参碱偶联树脂组检测到目的蛋白,且加入苦参碱后,目的蛋白明显减少,进一步证实Src激酶结构域为苦参碱结合区域。9.Discovery Studio 4.5软件预测苦参碱与Src激酶结构域3D分子对接情况,结果显示,苦参碱结合Src激酶结构域,主要作用可能是因为苦参碱与Ala392形成较强的氢键作用力;同时,苦参碱与周围氨基酸形成范德华力等其他作用力。10.苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞后,细胞中Src激酶活性均显着降低。11.Western blot结果表明,苦参碱显着下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。结论:苦参碱抑制癌细胞增殖。苦参碱作用靶点为Src,Src激酶结构域为苦参碱结合区域。同时,苦参碱能够下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。因此,苦参碱通过靶向Src激酶结构域下调磷酸化信号通路进而抑制癌细胞增殖。
杨业国[6]（2020）在《源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究》文中指出肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤的发生、复发和转移中起着重要作用。到目前为止,还没有发现针对CSCs的特异性药物,因为CSCs对大多数传统疗法都有耐药性,并且无限期增殖。三阴性乳腺癌是一种难以治疗而且特殊的乳腺癌亚型,缺乏针对三阴性乳腺癌的有效靶向疗法与富集肿瘤干细胞群和耐药密切相关。本课题研究,我们通过磁激活细胞分选法从MDA-MB-231和HCC1806细胞中富集了CD44+/CD24-乳腺癌干细胞,并将其在无血清培养基中培养。本研究的目的是评价从白钻（S.viridis A.C.Smith）中分离得到的Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌细胞的抑制作用,并通过体内外细胞凋亡的方法靶向MDA-MB-231和HCC1806乳腺癌干细胞。首先,我们研究了白钻衍生出来的天然化合物的抗增殖活性。我们用11种化合物对两株人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和HCC1806给药两天,并用Alamar blue测定法测量了细胞活力。Gomisin M2被认为是从白钻提取的11种化合物中最有效的细胞毒性化合物。我们发现Gomisin M2以剂量依赖的方式抑制三阴性乳腺癌细胞活力,并以时间依赖的方式减小3D球体形成的大小。Gomisin M2对两种三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,IC50=60μM;HCC1806,IC50=57μM)最具细胞毒性。我们根据BCSCs标志物通过磁激活细胞分选（MACS）对癌症干细胞进行了分选。我们使用MACS从正常癌细胞中分离出CD44+/CD24-细胞,并检测CD44的表达,以通过流式细胞术确定CD44的纯度。用MACS分离的癌症干细胞（CD44+/CD24-）比例的细胞计数分析结果>99%。我们发现,BCSCs具有形成肿瘤球的能力,并且使用高内涵系统免疫荧光技术发现CD44在肿瘤球中的表达显着增加。一小部分CD44+/CD24-细胞形成了肿瘤球。我们移植了从肿瘤球和非癌干细胞收集的200–300个癌症干细胞,并将它们注入受精后2 d的斑马鱼胚胎,以评估它们的增殖和迁移行为。在细胞移植后第6 d,观察到了来自2-dpf斑马鱼胚胎中乳腺球的MDA-MB-231-GFP细胞迁移至躯干。此外,与非CSC组相比,斑马鱼异种移植物中荧光颗粒的数量增加。然而,在细胞移植后的第3 d,用Di I标记并来源于肿瘤球的HCC1806细胞迁移到了2-dpf斑马鱼胚胎的躯干中。与非肿瘤干细胞相比,肿瘤干细胞在体内具有更高的致瘤性。为了探讨Gomisin M2是否能在体外抑制肿瘤球的形成,我们用Gomisin M2处理了MDA-MB-231 CSC和HCC1806 CSC群体48 h,并在没有Gomisin M2的情况下进行了另外两次肿瘤球培养。结果表明,Gomisin M2治疗后肿瘤球的大小和数量显着减少。使用高内涵筛选观察到核浓缩,细胞通透性,线粒体膜电位和细胞色素c释放。根据总强度除以体积,定量结果表明,阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,细胞通透性和细胞色素c的荧光强度增加,而线粒体膜电位显着降低。阿霉素和Gomisin M2处理48 h后,总核强度的蓝色荧光减弱。此外,Western blot结果表明在MDA-MB-231和HCC1806中,应用不同浓度的Gomisin M2作用48 h后,细胞色素c的表达显着增加。为了确定最有效的Gomisin M2化合物对癌细胞的细胞毒性是否是由凋亡引起的,我们使用IC50值小于60μmol/L的Gomisin M2化合物在MDA-MB-231和HCC1806细胞中进行了凋亡分析。我们通过流式细胞仪分析了Gomisin M2治疗的乳腺癌细胞的凋亡。细胞分别用20μM,40μM和60μM Gomisin M2处理48 h。结果表明,Gomisin M2以剂量依赖性方式显着增加了MDA-MB-231和HCC1806细胞系中凋亡细胞的数量。然后流式细胞术分析了MDA-MB-231和HCC1806细胞凋亡的百分比。此外,Gomisin M2以剂量依赖性方式诱导了两种细胞系中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达。为了研究Gomisin M2是否通过阻断DNA合成来诱导细胞增殖抑制,我们评估了Gomisin M2对MDA-MB-231和HCC1806中DNA复制的影响。Brd U分析的结果表明Gomisin M2对细胞增殖和DNA合成具有抑制作用。为了进一步评估Gomisin M2在体内的抗乳腺癌肿瘤干细胞效果,使用了斑马鱼模型进行评估。从MDA-MB-231-GFP和HCC1806（用Di I标记）富含的肿瘤干细胞重悬于PBS中将200-300个干细胞显微注射到2-dpf斑马鱼胚胎中。然后,斑马鱼胚胎用10μM Gomisin M2处理。植入后0 h,24 h和48 h通过荧光显微镜捕获荧光密度。结果表明,Gomisin M2处理显着降低了富含CSC的MDA-MB-231或HCC1806细胞的生长和增殖。定量结果表明,与对照组相比,Gomisin M2组在48 h内荧光强度逐渐降低。另外,与DMSO组相比,在48 h内没有增殖的胚的百分比显着增加。为了研究Gomisin M2对乳腺肿瘤干细胞的作用所涉及的机制,我们通过蛋白质印迹分析评估了涉及肿瘤进展的关键信号转导通路的参与。许多研究表明,Wnt/β-catenin通路在调节干细胞自我更新中起关键作用。我们的结果清楚地表明,在MDA-MB-231和HCC1806细胞中,Gomisin M2以剂量和时间依赖性方式显着下调Cyclin D1,β-catenin或p-GSK3β,并上调p-β-catenin或GSK3-β。综上所述,Gomisin M2是源自白钻的天然化合物,已被证明具有抗癌活性。这项研究表明Gomisin M2在体外和体内均能抑制乳腺癌干细胞,这为Gomisin M2或白钻提取物对乳腺癌化学预防的未来临床评估提供了强有力的依据。乳腺癌是由少数乳腺癌干细胞引发并维持的。当前可用的化学疗法和放射疗法不能抑制癌症干细胞群体。乳球形成试验表明,Gomisin M2在体外能抑制乳腺癌干细胞。斑马鱼异种移植模型显示Gomisin M2在体内消除了乳腺癌干细胞。此外,我们的结果表明,通过Gomisin M2对Wnt/β-catenin信号通路的下调是其功效的可能机制之一。这些数据表明Gomisin M2可能在乳腺癌治疗中具有潜能。
李佳林[7]（2020）在《FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究》文中提出第一部分FOXD3蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:肺癌分别是全球男女性发病率排名第二的恶性肿瘤;骨转移尤其是脊柱转移是导致肺癌不良预后的重要因素。肿瘤干细胞与肿瘤发生发展、侵袭转移密切相关。FOXD3与胚胎发育及恶性瘤发生有相关性,但其对肺癌的作用机制有待进一步探究。同时FOX（forkhead box）蛋白家族是常用临床药物治疗靶点,本研究的目的是探究FOXD3对肺癌干细胞的调控机制及对骨转移相关恶性生物学行为影响,为临床药物开发提供理论支持。研究方法:本研究利用前期实验室构建的特异性脊柱转移肺癌细胞系,评估此细胞系的肿瘤干细胞特性,通过癌球形成和再分化实验、细胞耐药性分析和细胞迁移实验对FOXD3在肺癌肿瘤干细胞内的功能进行分析评价;通过细胞实验及载瘤动物模型进一步将FOXD3对肿瘤恶性生物学行为影响进行探究,同时使用全基因组RNASeq和Ch IP-Seq分析来预测FOXD3在肺癌干细胞中的直接作用靶基因位点,并通过双荧光素酶报告系统及细胞功能实验验证其相互作用及参与调控的信号通路。结果:肺癌脊柱转移细胞具有肿瘤干细胞特征;FOXD3在脊柱转移细胞及肿瘤干细胞内表达下调。同时发现,FOXD3在体外和体内水平均与肿瘤干细胞的扩增和迁移、肿瘤细胞耐药性以及骨转移灶破骨细胞分化呈负相关关系。FOXD3通过对WDR5的转录阻遏,实现对其表达调控的作用,最终达到对肺癌干细胞相关生物学功能调控。结论:本研究揭示了FOXD3作为肺癌肿瘤抑制因子的作用机制,我们证明了FOXD3可以通过抑制WDR5在肺癌中的表达来抑制肿瘤干细胞的积累,从而影响肺癌生物学进程,进而参与肺癌骨转移、骨破坏等恶性生物学行为发生与发展的调控。WDR5做为临床常用药物开发靶点,该研究为进一步探索肺癌治疗,特别针对骨转移相关事件的靶向药物治疗提供了潜在靶点及理论基础。第二部分乙酰化依赖的SCF-β-TRCP1功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤性疾病,是全球恶性肿瘤导致死亡的主要原因。SCF-β-TRCP1泛素化系统与结直肠癌关系密切,可通过泛素化降解β-catenin等癌基因实现对结直肠癌调控。本研究主要探讨β-TRCP1的乙酰化调节途径对结直肠癌恶性生物学行为的影响,探索β-TRCP1新的调节途径,为结直肠癌治疗提供可行的靶点与思路。研究方法:我们通过WB实验、免疫共沉淀、泛素化实验、CHX蛋白降解等实验找到参与β-TRCP1乙酰化调控的相关乙酰化/去乙酰化酶,进而通过细胞功能实验探究β-TRCP1乙酰化水平对结直肠癌恶性生物学行为的影响,并通过临床标本免疫组化染色进行验证;最后找到β-TRCP1反向调控乙酰化酶稳定性的具体机制,构建完整反馈调节环路。结果:本研究阐明GCN5-SIRT1系统介导的SCF-β-TRCP1乙酰化修饰路径:乙酰化酶GCN5参与β-TRCP1乙酰化过程,去乙酰化酶SIRT1参与β-TRCP1去乙酰化过程。乙酰化影响β-TRCP1蛋白稳定性的同时增强结肠癌中β-TRCP1的抑癌功能;β-TRCP1可通过CKⅡ磷酸化依赖的泛素化途径降解SIRT1,同时这种效果可以被Pin1蛋白所拮抗。这项研究阐明了控制β-TRCP1稳定性及其E3连接酶功能活性的新上游途径。结论:研究揭示TRCP/GCN5/SIRT1相互作用的新机制,由此GCN5/SIRT1可以以乙酰化依赖性的方式调控β-TRCP1的功能与蛋白稳定性。除充当调节剂外,SIRT1还充当β-TRCP1的底物,进而影响自身乙酰化过程;GCN5/SIRT1活性的启动推动了反馈回路的产生,影响β-TRCP1功能。在β-TRCP1调节过程中,CKⅡ磷酸化通路和SIRT1乙酰化途径之间存在潜在的联系,CKⅡ可以磷酸化SIRT1,介导其被β-TRCP1识别并通过泛素化途径降解从而影响去乙酰化酶活性。该研究确定了乙酰化依赖的β-TRCP1功能调控新机制,并提供了有关乙酰化系统调控E3连接酶活性的新线索。
付彬[8]（2020）在《敷和备化方对肝癌干细胞的调控作用研究》文中研究表明目的:敷和备化方是全国名老中医荣远明教授治疗肝癌（Hepatocellular Carcinoma HCC）的验方,治疗HCC临床效果良好。本研究旨在通过分离、培养CD133+Hep G2肝癌干细胞,用敷和备化方含药血清培养,检测肝癌干细胞表面标记物CD133的表达水平,以及肝癌干细胞分化相关指标转录因子SOX2,NANOG和OCT4的m RNA表达和蛋白水平。从而验证敷和备化方可通过调控肝癌干细胞表面标记物CD133以及转录因子SOX2,NANOG和OCT4的表达从而起到诱导肝癌干细胞分化的作用,为中医药防治肝癌提供理论和实验依据。方法:1.CD133+Hep G2肝癌干细胞的分离与鉴定:通过免疫磁珠法分选出CD133+Hep G2肝癌干细胞,采用流式细胞术鉴定CD133+Hep G2肝癌干细胞阳性比率达到90%以上,作为后续实验的细胞。2.分别用2%、4%、8%、10%、12%、16%六个不同浓度敷和备化方含药血清干预CD133+Hep G2肝癌干细胞,通过CCK-8法测定细胞抑制率,筛选出最佳含药血清浓度。将细胞分为阳性对照组、敷和备化方组、血清对照组、空白对照组。阳性对照组用0.5%二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide DMSO）干预,敷和备化方组用敷和备化方含药血清干预,血清对照组用正常大鼠血清干预。3.采用流式细胞术检测CD133+Hep G2肝癌干细胞百分比。4.Q-PCR法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的m RNA水平。5.Western Blot法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的蛋白水平。结果:1.CD133+Hep G2肝癌干细胞的分离与鉴定:培养Hep G2肝癌细胞,通过免疫磁珠法分选出CD133+Hep G2肝癌干细胞,流式细胞术鉴定CD133+Hep G2细胞阳性率达到99.6%,细胞结构完整,生长情况良好,可用于后续试验。2.CCK-8法筛选最佳含药血清浓度:敷和备化方含药血清对CD133+Hep G2细胞的增殖有抑制作用,且和时间、浓度相关,16%敷和备化方含药血清干预72小时抑制作用最明显。后续试验中中药组采用16%敷和备化方含药血清。3.流式细胞术检测敷和备化方含药血清干预后CD133+Hep G2细胞百分比:血清对照组CD133+Hep G2细胞阳性率94.1%;空白对照组94.9%;DMSO组90.8%;敷和备化方组84.2%。敷和备化方组和DMSO组都可降低CD133+Hep G2细胞百分比（P<0.05）,且敷和备化方组作用更明显（P<0.05）。4.Q-PCR法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的m RNA水平:与空白对照组相比,敷和备化方组和DMSO组都可下调转录因子SOX2,NANOG和OCT4的表达（P<0.05）,且敷和备化方组作用更明显（P<0.05）。5.Western Blot法检测转录因子SOX2,NANOG和OCT4的蛋白水平:与空白对照组相比,敷和备化方组和DMSO组都可下调转录因子SOX2,NANOG和OCT4蛋白水平（P<0.05）,且DMSO组对SOX2蛋白水平作用更明显（P<0.05）。敷和备化方组对NANOG和OCT4的蛋白水平作用更明显（P<0.05）。结论:1.敷和备化方含药血清能有效降低肝癌干细胞表面标记物CD133的表达水平。2.具有健脾调肝功效的验方敷和备化方能降低肿瘤干细胞分化相关转录因子SOX2,NANOG和OCT4的表达水平,诱导肝癌干细胞分化。
王开雷[9]（2020）在《粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景和意义:大肠癌是全球第四大常见的癌症,每年大约有639 000人因大肠癌而死亡。近年来,我国大肠癌患者的发病率和死亡率呈现出一种显着上升的趋势,而且很多大肠癌患者在明确诊断时已经为中晚期,其治疗效果较差。寻找一种有效且可靠的治疗大肠癌的方法已成为一项现代医学亟需解决的问题。目前,有多种方法可用于治疗大肠癌,包括手术、放射治疗、化疗和生物治疗等。现阶段的医学指南认为手术和化疗为大肠癌主要而有效的治疗手段。尽管通过手术治疗可以使部分早期大肠癌患者得到根治性治疗,但是很多大肠癌患者在临床明确诊断时已经为肿瘤中晚期,手术切除肿瘤后部分患者会出现肿瘤的复发转移,因此化疗就成为大肠癌患者手术之后必要的治疗方法之一。大肠癌患者在手术治疗之后辅助以化疗,可以在很大程度上防止肿瘤复发转移;对部分中晚期大肠癌患者通过手术治疗无法将肿瘤完全切除干净时,通过化疗可以将残余肿瘤细胞杀灭或者抑制肿瘤细胞继续生长;对于有些肿瘤患者在确诊时已为晚期,且有广泛转移而无法进行手术,通过化疗可使肿瘤体积缩小,使患者的部分症状缓解,有时候甚至达到可以实施手术的可能。但是,在大肠癌患者进行化疗的过程中,除部分原发耐药者之外,还有部分肿瘤患者可能在治疗的过程中随着化疗疗程的增加,最终出现对某种化疗药物的耐药,甚至出现对多种化疗药物耐药,进而导致化疗失败,肿瘤复发转移。有研究表明由于肿瘤多药耐药的出现,大约有三分之一的大肠癌患者会出现肿瘤复发、转移。因此,多药耐药的出现是大肠癌化疗失败的主要原因之一。在大肠癌的化疗药物中,五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）作为最有效的临床药物之一,在临床治疗中有着广泛的应用,但是多药耐药的大肠癌细胞对5-Fu产生的耐药性也是大肠癌患者在临床化疗中失败的常见原因之一。因此探讨大肠癌细胞的耐药机制,寻找一种新的、有效的能够逆转大肠癌多药耐药的方法是当前在大肠癌研究中的热点问题之一。鉴于此原因,我们建立了具有良好稳定性和耐药性的五氟尿嘧啶耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞系,并利用LOVO/5-Fu耐药细胞株研究大肠癌耐药的分子机制,将多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞逆转为对化疗药物敏感的肿瘤细胞,同时研究其可能的逆转机制。P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是细胞膜上重要的转运蛋白,属于ABC转运蛋白（ATP依赖性转运蛋白）超家族成员,在引起肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR）中起重要的作用。肿瘤细胞发生MDR的原因很多,其中的重要原因之一是P-gp增多,而P-gp是肿瘤细胞MDR1基因编码的。在人类中,MDR1 mRNA在肾上腺、胰腺、大肠、小肠等组织中是低表达状态,它参与了人体正常组织细胞的生长;在MDR表型的肿瘤细胞中,MDR1/P-gp有过量表达现象。有体外实验研究表明,MDR1基因和P-gp的表达水平越高,则MDR细胞内抗肿瘤药物的浓度越低,其耐药性越强。另有研究表明P-gp具有药物泵的功能,它可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外,从而使蓄积在肿瘤细胞内的抗肿瘤药物减少,进而使肿瘤细胞发生MDR。C-jun N端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）也被人们称之为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK）,是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,是哺乳类动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族中的重要成员之一。JNK信号通路在渗透压、氧化应激、电离辐射等多种环境应激因素以及生长因子、细胞因子（如TNF、IL21）作用下均可被激活,从而导致JNK/SAPK信号通路中的苏氨酸和丝氨酸双磷酸化而将其活化,最终导致JNK/c-jun信号通路被激活。在细胞生长、应激反应、癌基因转化、细胞分化以及细胞凋亡等多种生理和病理过程中JNK/SAPK信号通路均发挥着重要的作用。有研究发现,大肠癌的发生、发展以及耐药机制与JNK信号通路有着密切的关系。粉防已碱（Tetrandrine,Tet）又称汉防己甲素,是一种双苄基异喹啉生物碱,是从中草药粉防己根块中提取的。它具有抗炎、降低血压、阻断钙离子通道等广泛的药理作用,有研究报道称其可在体内外均表现有较好的逆转白血病细胞多药耐药的作用,其逆转耐药的机制为下调MDR1 mRNA/P-gp的表达、使抗肿瘤药物在细胞内积聚,同时使抗肿瘤药物的敏感性增加,进而导致肿瘤细胞凋亡。基于此,我们推测Tet可能会通过调节MDR1 mRNA/P-gp的表达,进而调节大肠癌在化疗过程中产生的MDR。我们在本研究中将Tet在体外作用于大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株,研究Tet对大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株的生长抑制及其诱导凋亡的情况,进而了解其对多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu细胞的逆转作用及其逆转机制。研究结果表明Tet通过抑制MDR1基因的表达,使P-gp的表达降低,进而逆转大肠癌LOVO/5-Fu对5-Fu的耐药。同时通过对JNK信号通路的研究发现,Tet可调控细胞内JNK和c-jun的磷酸化水平,进而调控细胞的耐药性。Tet可能成为逆转大肠癌多药耐药的一个重要逆转药物。方法:1.建立LOVO/5-Fu多药耐药细胞系本实验采取逐渐递增5-Fu药物浓度,并持续作用于大肠癌敏感细胞LOVO细胞株,进行体外诱导使其产生耐药性,逐步筛选出具有多药耐药性的LOVO/5-Fu细胞株。多次使用MTT法检测其多药耐药性,从而确认我们建立的LOVO/5-Fu多药耐药细胞系拥有良好的多药耐药性和稳定性。2.分析MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌细胞LOVO和耐药细胞LOVO/5-Fu中的表达实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中多药耐药基因的MDR mRNA表达,Western blot检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中P-gp蛋白的表达。揭示MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌LOVO和LOVO/5-Fu细胞中的表达情况。3.MTT法确定逆转剂的浓度使用不同浓度的Tet分别作用于LOVO细胞和LOVO/5-Fu细胞,MTT实验检测Tet对细胞抑制率的影响。4.耐药逆转试验使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,MTT实验检测细胞抑制率,并进一步计算出IC50以及耐药指数。5.流式细胞术检测细胞周期分布Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞周期分布情况。6.流式细胞术检测细胞凋亡Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化情况。7.流式细胞术检测细胞P-gp的表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞P-gp的表达情况。8.PCR检测MDR1基因表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用PCR检测MDR1基因表达情况。9.Western blot 检测 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 蛋白Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用Western blot检测各组细胞 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 的表达情况。结果在本实验研究中,我们发现与对照组大肠癌细胞LOVO细胞相比,五氟尿嘧啶耐药的LOVO/5-Fu细胞中MDR mRNA表达水平明显上调,P-gp蛋白含量明显增高。进一步研究我们还发现使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,可以增强LOVO/5-Fu细胞对五氟尿嘧啶的敏感性。使用Tet作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞之后,可以使LOVO/5-Fu细胞凋亡率升高,使被阻滞在G1期的细胞增多,而进入分裂期的细胞较前明显减少;LOVO/5-Fu细胞MDR1表达量和P-gp蛋白含量较未使用Tet作用之前明显降低。Tet作用于LOVO/5-Fu细胞后,p-JNK较未使用Tet的LOVO/5-Fu组细胞明显升高,其下游分子p-c-jun表达量也显着增加;加入JNK信号通路抑制剂SP600125之后,Western blot检测结果显示,Tet作用组细胞的p-JNK、p-c-jun较未加入JNK信号通路抑制剂SP600125之前表达量显着降低;各个组总JNK和c-jun表达量无明显变化。结论1、本实验方法建立的LOVO/5-Fu耐药细胞系有良好的耐药性和稳定性。2、LOVO/5-Fu组细胞中MDR mRNA表达水平和P-gp蛋白含量比LOVO组细胞中明显上调。3、Tet体外可以逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞的MDR。4、Tet可以通过对人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞凋亡率和细胞周期的调控,改变细胞的MDR。5、Tet逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞MDR的机制可能是通过调控JNK信号通路,下调MDR mRNA和P-gp蛋白的表达来实现的。
丁聚贤[10]（2020）在《肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤（MG-63）细胞的逆转作用及机制研究》文中提出目的:通过体外实验研究肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤MG-63/MTX耐药细胞的逆转作用,初步探索肉苁蓉逆转MG-63/MTX耐药细胞机制。方法:通过肉苁蓉及盐水灌胃SD大鼠获得高、中、低剂量组的肉苁蓉含药血清及对照组血清,贴壁培养法培养MG-63细胞,MTT法检测药物干预前MTX的IC50值,将MG-63细胞分为四组,高剂量组（A）、中剂量组（B）、低剂量组（C）、空白组（N）,采用IC50浓度的MTX分别干预各组贴壁细胞,24小时后换液并加入不同浓度的肉苁蓉含药血清及对照组含药血清,持续干预并换液至对照组细胞加入IC50浓度的MTX仍稳定生长后各组停止干预。显微镜下观察各组细胞形态学变化,MTT比色法检测各组肉苁蓉含药血清干预后的IC50及RI,流式细胞仪检测细胞凋亡率及MRP1的表达,Western blot检测各组P53蛋白的表达。结果:（1）显微镜下观察到MG-63细胞贴壁生长,体积中等,细胞多梭形,偶见不规则形,核较大,核仁清晰。药物干预后的A、B、C、N组细胞较原始MG-63体积增长,呈长梭形、不规则形,伪足增多,生长状态减慢;（2）MTX干预后A、B、C、N四组细胞的IC50值分别为:（4.60±0.14）ug/ml、（6.32±0.30）ug/ml、（7.04±0.14）u g/ml、（9.28±0.18）ug/ml,耐药指数（RI）依次为:1.80、2.55、2.84、3.74;（3）肉苁蓉含药血清干预后A、B、C、N四组细胞凋亡率依次为（39.30±1.85）%、（29.33±1.65）%、（24.33±0.91）%、（18.23±1.51）%,A组>B组>C>组>N组,各组之间比较有统计学意义（P<0.01）;（4）干预后A、B、C、N四组MRP1蛋白的表达分别为（8.47±0.91）%、（13.80±1.2）%、（28.97±1.2）%、（39.77±1.81）%,A组<B组<C组<N组,各组之间比较有统计学差异（P<0.001）;（5）相比较N组,A、B、C各组P53蛋白表达均下调,A组<B组<C组<N组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:肉苁蓉能逆转人骨肉瘤MG-63细胞对MTX的耐药性,其机制可能与肉苁蓉促进人骨肉瘤MG-63细胞凋亡、下调MRP1及P53蛋白的表达有关。
二、细胞分化剂对肿瘤细胞凋亡的诱导与耐药性的逆转（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞分化剂对肿瘤细胞凋亡的诱导与耐药性的逆转（论文提纲范文）
（1）BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 表观遗传概述 |
| 1.3 组蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.1 组蛋白乙酰化 |
| 1.3.2 组蛋白磷酸化 |
| 1.3.3 组蛋白甲基化 |
| 1.4 Bromodomains家族蛋白概述 |
| 1.5 研究BET亚家族及BRD4的意义 |
| 1.6 BET亚家族蛋白抑制剂研究进展 |
| 1.7 天然化合物的优势及开发 |
| 1.8 台湾相思及其活性成分3',4',7,8-Tetrahydroxyflavone的相关研究 |
| 1.9 急性髓系白血病在表观遗传方面的进展 |
| 1.10 本论文选题依据及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 BRD4天然抑制剂3478的发现 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验药物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 AlphaScreen Assay |
| 2.3.2 AlphaScreen Counter Assay |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 筛选出对BRD4-BD1具有较好活性的天然化合物3478 |
| 2.4.2 3478对BRD4-BD2具有一定的选择性 |
| 2.4.3 AlphaScreen Counter Assay验证筛选结果是可信的 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 3478体外对MV4-11细胞生长的作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验药物及细胞株 |
| 3.2.2 实验耗材 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的培养 |
| 3.3.2 细胞增殖试验 |
| 3.3.3 细胞凋亡试验 |
| 3.3.4 Western blot检测MV4-11细胞中BRD4以及c-Myc的表达水平 |
| 3.3.5 数据处理分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 BRD4在MV4-11细胞中显着高表达 |
| 3.4.2 3478对MV4-11细胞生长的影响 |
| 3.4.3 3478对MV4-11细胞生长影响的分子机制研究 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 3478体内抑制MV4-11皮下移植瘤的作用及其机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验药物 |
| 4.2.2 实验细胞 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.2.4 实验耗材、试剂及仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞的培养 |
| 4.3.2 人髓性单核细胞白血病细胞MV4-11裸小鼠移植瘤模型的建立 |
| 4.3.3 各实验组给药处理 |
| 4.3.4 Western blot检测瘤组织中BRD4蛋白以及肿瘤因子c-Myc的水平 |
| 4.3.5 免疫荧光检测瘤组织中c-Myc的表达 |
| 4.3.6 qRT-PCR检测瘤组织中c-Myc的mRNA水平 |
| 4.3.7 数据处理分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 各组小鼠生长状况观察 |
| 4.4.2 各组小鼠瘤组织生长状况观察 |
| 4.4.3 瘤组织取材及观察 |
| 4.4.4 3478对小鼠脏器指数的影响 |
| 4.4.5 实时荧光定量PCR法检测3478对瘤组织中c-Myc mRNA的影响 |
| 4.4.6 免疫荧光法检测3478对瘤组织中肿瘤标志物c-Myc的影响 |
| 4.4.7 Western Blot检测瘤组织中BRD4、c-Myc蛋白表达水平 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 3478与BRD4蛋白共晶结构的解析及其抑制机理研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 质粒及菌株 |
| 5.2.2 化学试剂及耗材 |
| 5.2.3 试剂盒 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.2.5 常用溶液及配制方法 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 感受态细胞制备方法 |
| 5.3.2 质粒转化 |
| 5.3.3 蛋白表达 |
| 5.3.4 蛋白纯化及检测 |
| 5.3.5 蛋白质结晶 |
| 5.3.6 数据收集及结构解析与建模 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 蛋白质纯化结果 |
| 5.4.2 3478与BRD4-BD1及BD2复合物晶体 |
| 5.4.3 X-射线衍射复合物晶体结果 |
| 5.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附: 缩略语中英文对照表 |
| 附: 综述 中医药治疗白血病的研究进展 |
| 1 中医学对AML的认识 |
| 1.1 病因病机 |
| 1.2 治疗原则 |
| 1.3 辨证论治 |
| 2 中医药治疗AML |
| 2.1 自拟方治疗 |
| 2.2 中成药治疗 |
| 2.3 协定处方治疗 |
| 3 中医药治疗AML的机制研究 |
| 3.1 抑制白血病细胞增殖 |
| 3.2 诱导白血病细胞分化 |
| 3.3 诱导白血病细胞凋亡 |
| 3.4 提高机体免疫力、增效减毒 |
| 3.5 逆转白血病多药耐药 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 Toll样受体的免疫调控机制及其所介导的肿瘤细胞死亡方式 |
| 2.1 Toll样受体 |
| 2.2 基于TLRs的免疫调节机制 |
| 2.2.1 肿瘤微环境的免疫平衡 |
| 2.2.2 TLRs对抗原提呈细胞的免疫调节机制 |
| 2.2.3 TLRs对巨噬细胞的免疫调节机制 |
| 2.3 TLRs所介导的细胞死亡的作用机制 |
| 2.4 TLRs在肿瘤治疗中的临床试验研究 |
| 2.4.1 TLR2 相关的临床研究 |
| 2.4.2 TLR3 相关的临床研究 |
| 2.4.3 TLR4 相关的临床研究 |
| 2.4.4 TLR5 相关的临床研究 |
| 2.4.5 TLR7/8 相关的临床研究 |
| 2.4.6 TLR9 相关的临床研究 |
| 2.4.7 传统抗肿瘤治疗对TLR通路的影响 |
| 2.5 总结和展望 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 主要仪器设备 |
| 3.2 主要耗材 |
| 3.3 主要抗体列表 |
| 3.3.1 流式抗体列表 |
| 3.3.2 Western Blot抗体列表 |
| 3.4 主要试剂 |
| 3.5 临床样本 |
| 3.5.1 研究对象 |
| 3.5.2 纳入标准 |
| 3.5.3 排除标准 |
| 3.5.4 资料收集及分组 |
| 3.5.5 随访 |
| 3.6 细胞系及培养条件 |
| 3.7 CpG基序的单链脱氧寡核苷酸(CpG ODNs)的制备 |
| 3.8 RNA提取、逆转录条件 |
| 3.9 普通PCR和实时定量PCR |
| 3.10 主要引物序列 |
| 3.11 细胞凋亡测定 |
| 3.12 细胞周期测定 |
| 3.13 细胞表面及细胞胞内蛋白测定 |
| 3.14 蛋白印迹试验 |
| 3.15 蛋白纯化及免疫沉淀 |
| 3.16 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 |
| 3.17 信号通路抑制剂 |
| 3.18 免疫荧光共聚焦显微镜成像 |
| 3.19 急性B淋巴细胞白血病NCG小鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.20 CT26 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 3.21 小鼠全身免疫微环境的测定 |
| 3.22 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 TLR9在B-ALL患者PBMC中的表达情况 |
| 4.2 TLR9 的表达与B-ALL患者预后的相关性 |
| 4.3 B-ALL细胞系的选择及鉴定 |
| 4.4 TLR9 激动剂——CpG 685对B-ALL细胞系的体外效应 |
| 4.5 CpG 685 对小鼠肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.6 CpG 685 诱导BLIN-1 细胞凋亡的分子机制 |
| 4.6.1 CpG 685 激活BLIN-1 细胞中的TLR9 下游信号通路 |
| 4.6.2 CpG 685 通过P38 MAPK信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.3 CpG 685 通过JNK/C-MYC信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.4 C-MYC过表达对CpG 685 诱导的BLIN-1 细胞凋亡至关重要 |
| 4.7 不同类型B-ALL对 CpG 685 具有异质性的影响因素 |
| 4.8 Sup-B15 细胞系对CpG 685 耐药的机制 |
| 4.9 联合应用CpG 685 和伊马替尼逆转单药耐药的分子机制 |
| 4.10 联合应用CpG 685 和伊马替尼对Sup-B15 移植瘤小鼠的肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.11 CpG 685 对原代B-ALL细胞的反应性 |
| 4.12 CpG ODN对小鼠机体免疫状态的调控 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（3）miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药株的构建 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二部分 miR-27b-3p的表达水平对ATC细胞阿霉素耐药性的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三部分 miR-27b-3p通过靶向PPAR-γ调节ATC细胞阿霉素耐药性 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 论文创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miRNA调控肿瘤耐药性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English paper Ⅰ |
| English paper Ⅱ |
（4）锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NSCLC耐药相关基因的筛选及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ZNF300与NSCLC恶性进展 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对NSCLC肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制探讨 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肿瘤化疗耐药机制的研究现况 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 锌指蛋白家族的结构与功能以及ZNF300的研究现况 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
（5）苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 苦参碱通过调控肿瘤相关磷酸化信号通路抑制卵巢癌的发生发展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点与作用机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 苦参碱抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（6）源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乳腺癌 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.3 中药及其活性化合物作为抗肿瘤干细胞的潜在疗法 |
| 1.4 斑马鱼作为肿瘤研究中的模式生物 |
| 1.5 肿瘤干细胞和乳腺癌 |
| 1.6 瑶药抗肿瘤研究进展 |
| 1.7 本课题研究意义 |
| 第二章 高内涵对瑶药白钻化合物体外抗肿瘤的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 CD44+/CD24-乳腺癌细胞系的分选以及生物学特性的鉴定研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 化合物GOMISIN M2对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞系的影响研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 化合物GOMISIN M2对乳腺癌干细胞体外线粒体启动的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 化合物GOMISIN M2对三阴性乳腺癌细胞诱导凋亡的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 GOMISIN M2诱导的抗乳腺癌干细胞体内斑马鱼异种移植以及信号通路的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 实验结果与讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 FOXD3 蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:FOXD3在肺癌骨转移细胞及肿瘤干细胞中表达状况研究 |
| 一、材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章:FOXD3对肺癌相关恶性生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章:FOXD3调控肺癌干细胞的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 乙酰化依赖的 SCF-β-TRCP1 功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响的相关机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:乙酰化修饰系统参与β-TRCP1功能调节相关研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 β-TRCP1乙酰化修饰对结直肠癌恶性生物学功能影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 β-TRCP1 对去乙酰化酶SIRT1 反馈调节机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 FOX 蛋白家族在恶性肿瘤调控中的作用 |
| 综述二 SKP1-cullin-1-F-box-protein(SCF)E3 泛素连接酶复合体中 F-box 蛋白在肿瘤发生过程中作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（8）敷和备化方对肝癌干细胞的调控作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 理论部分 |
| 1 HCC的发病机制 |
| 1.1 病毒性肝炎 |
| 1.2 AFT |
| 1.3 饮用水污染 |
| 1.4 酒精因素 |
| 1.5 遗传因素 |
| 2 中医对HCC的认识 |
| 2.1 中医病因病机 |
| 2.2 中医药治疗肝癌干细胞(Liver cancer stemcells LCSCs)研究进展 |
| 3 LCSCs及其表面标记物 |
| 3.1 LCSCs |
| 3.2 LCSCs表面标记物 |
| 4 转录因子OCT4,SOX2和NANOG与 LCSCs |
| 4.1 OCT4 |
| 4.2 SOX2 |
| 4.3 NONAG |
| 5 复方敷和备化方 |
| 6 总结 |
| 第二章 实验研究部分 |
| 1 实验材料与试剂 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验药物 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HepG2细胞培养 |
| 2.2 无血清悬浮培养法富集HepG2肝癌干细胞 |
| 2.3 免疫磁珠法分选CD133+HepG2 细胞 |
| 2.4 流式细胞术鉴定CD133+HepG2 细胞比例 |
| 2.5 敷和备化方含药血清备制 |
| 2.6 CCK-8法测定最佳血药浓度 |
| 2.7 流式细胞术检测CD133+HepG2 肝癌干细胞 |
| 2.8 Q-PCR检测SOX2,NANOG和 OCT4的mRNA水平 |
| 2.9 Western blot检测SOX2,NANOG和 OCT4 蛋白表达水平 |
| 3 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 HepG2细胞分选前后细胞生长情况 |
| 4.2 流式细胞术鉴定CD133+HepG2 细胞比例结果 |
| 4.3 敷和备化方含药血清对CD133+HepG2 细胞的影响以及最佳含药血清浓度筛选 |
| 4.4 流式细胞术检测CD133+HepG2 百分比结果 |
| 4.5 Q-PCR检测SOX2,NANOG和 OCT4的mRNA水平结果 |
| 4.6 Western blot检测SOX2,NANOG和 OCT4 蛋白表达水平结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 CD133+肝癌干细胞的分离与鉴定 |
| 5.2 最佳含药血清浓度筛选 |
| 5.3 实验检测指标的选择 |
| 5.4 阳性对照组DMSO的选择 |
| 5.5 问题与展望 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 中医药防治肝癌干细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（9）粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 LOVO/5-Fu耐药细胞系的建立及其MDR和P-gp的表达情况 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第二部分 粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu细胞多药耐药性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| ENGLISH ARTICLEⅠ |
| ENGLISH ARTICLEⅡ |
（10）肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤（MG-63）细胞的逆转作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 立题依据 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 研究意义 |
| 实验研究 |
| 2.1 技术路线图 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验药物 |
| 2.2.2 实验大鼠 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 制备不同剂量肉苁蓉含药血清 |
| 2.3.2 MG-63 细胞的培养 |
| 2.3.3 肉苁蓉含药血清干预前MTT法检测MTX半数抑制浓度(IC50 值) |
| 2.3.4 人骨肉瘤(MG-63)细胞的药物干预 |
| 2.3.5 肉苁蓉含药血清干预后MTX药敏的测定 |
| 2.3.6 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况 |
| 2.3.7 流式细胞仪检测各组MG-63 细胞MRP1 的表达 |
| 2.3.8 WB法检测MG-63 细胞P53 蛋白的表达 |
| 2.4 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 3.1 镜下观察细胞形态 |
| 3.2 各组细胞MTX药敏测定 |
| 3.3 各组MG-63 凋亡结果 |
| 3.4 各组细胞MRP1 蛋白的表达结果 |
| 3.5 P53 蛋白在各组细胞中的表达 |
| 讨论分析 |
| 4.1 中药肉苁蓉抗肿瘤的研究 |
| 4.2 OS化疗耐药机制及逆转方式 |
| 4.2.1 化疗在OS治疗中的应用 |
| 4.2.2 介导骨肉瘤化疗耐药产生的机制 |
| 4.2.3 逆转骨肉瘤化疗耐药性的研究 |
| 4.3 P糖蛋白与骨肉瘤 |
| 4.3.1 P-gp与肿瘤的关系 |
| 4.3.2 P53 蛋白在OS化疗耐药中的作用 |
| 4.4 MRP1 与骨肉瘤相关性 |
| 4.4.1 MRP与肿瘤的关系 |
| 4.4.2 MRP1 在骨肉瘤化疗耐药中的作用 |
| 4.5 小结 |
| 结语 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 存在问题 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药逆转骨肉瘤化疗耐药的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 发表的论文 |
| 参与的科研课题 |
| 参加的学术会议 |
| 获奖情况 |
四、细胞分化剂对肿瘤细胞凋亡的诱导与耐药性的逆转（论文参考文献）
- [1]BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究[D]. 李姣. 南京中医药大学, 2021(02)
- [2]CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究[D]. 白玲. 吉林大学, 2021(01)
- [3]miR-27b-3p靶向PPAR-γ调节人甲状腺未分化癌细胞阿霉素耐药性的机制研究[D]. 许远. 山东大学, 2021(11)
- [4]锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究[D]. 余世龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [5]苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究[D]. 张玺. 华中科技大学, 2020(01)
- [6]源于白钻的Gomisin M2抗乳腺癌干细胞机制及体内抗增殖作用的研究[D]. 杨业国. 华南理工大学, 2020(02)
- [7]FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究[D]. 李佳林. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [8]敷和备化方对肝癌干细胞的调控作用研究[D]. 付彬. 广西中医药大学, 2020(02)
- [9]粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究[D]. 王开雷. 山东大学, 2020(09)
- [10]肉苁蓉对化疗耐药骨肉瘤（MG-63）细胞的逆转作用及机制研究[D]. 丁聚贤. 甘肃中医药大学, 2020(12)