一、AMID, an AIF homologous protein, induces caspases-independent apop-tosis（论文文献综述）
李文杰[1]（2021）在《鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究》文中研究表明鸡贫血病毒VP3基因表达的凋亡蛋白Apoptin在正常细胞中无细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导细胞发生凋亡。表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3能够在多种肿瘤细胞中特异性表达Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡,且Ad-VT可以在肿瘤细胞中特异性复制起到溶瘤作用。癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成为发病率第一的癌症;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌症死亡率首位。目前针对乳腺癌的治疗方法副作用大,对转移患者疗效欠佳,并且患者经治疗后仍有复发的风险。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。在癌症内部有一部分细胞被称为癌症起始细胞或癌症干细胞,这部分细胞在癌症起始、治疗抵抗、转移和复发中起关键作用。这意味着,以乳腺癌干细胞为靶标可能是根除乳腺癌的有前途的治疗策略。迄今为止,还没有针对癌症干细胞的特定药物。因此,诱导癌症干细胞分化并靶向杀伤癌症干细胞可能有助于开发针对癌症的新的治疗策略,在治疗癌症时可能具有临床优势。本研究目的是富集分选表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,对其干细胞特性进行分析。利用本课题组前期构建的表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3作用于乳腺癌干细胞,分析重组腺病毒对细胞的杀伤作用、干性抑制及增加乳腺癌干细胞药物敏感性的作用。通过靶向癌症干细胞,诱导其分化,抑制其治疗抗性寻找临床癌症治疗的新策略。首先是采用无血清悬浮培养与磁珠分选方法富集分选乳腺癌干细胞,对其自我更新、分化、耐药性等进行分析;其次是利用重组腺病毒作用于乳腺癌干细胞,对乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等进行检测分析;之后检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体内肿瘤形成能力的影响、体内肿瘤杀伤作用;最后利用Ad-VT与紫杉醇联合应用于乳腺癌干细胞后,检测乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等,分析Ad-VT是否能够使乳腺癌干细胞对化疗药的敏感性增强,从而抑制癌症干细胞的治疗抗性。本研究主要取得如下结果:1.对乳腺癌干细胞的干性特征进行检测分析后发现,无血清培养条件下,乳腺癌干细胞能够形成乳腺癌细胞球;血清诱导实验显示乳腺癌干细胞能够分化增殖,自我更新能力强于乳腺癌细胞;干细胞调控因子表达上调,过表达与人类肿瘤干细胞相关的多个基因;对化疗药紫杉醇也具有一定的耐药性。2.通过检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体外抑制作用后发现,Ad-VT与Ad-VP3作用下,CD44+CD24-细胞群比例降低,干细胞调控因子表达下调,乳腺癌干细胞干性受到抑制;Ad-VT与Ad-VP3能够抑制细胞增殖;对细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白表达进行检测,结果显示Ad-VT与Ad-VP3能够诱导乳腺癌干细胞线粒体途径的凋亡;细胞迁移与侵袭实验结果也显示乳腺癌干细胞的迁移侵袭能力受到抑制。3.检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的小鼠体内抑制作用。小鼠体内成瘤结果显示Ad-VT与Ad-VP3作用后的乳腺癌干细胞干性受到抑制,失去了体内肿瘤形成的能力;将状态良好的乳腺癌干细胞进行小鼠皮下注射荷瘤,重组腺病毒对荷瘤成功的小鼠进行注射治疗,结果显示Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞小鼠荷瘤模型具有体内杀伤作用,能够抑制小鼠体内肿瘤生长。4.Ad-VT与紫杉醇联合作用能够抑制乳腺癌干细胞耐药性,Ad-VT与紫杉醇联合使用后对乳腺癌干细胞的干性抑制、诱导细胞凋亡水平、对细胞的增殖抑制、迁移侵袭抑制均显着强于Ad-VT单独治疗组及紫杉醇单独治疗组,并且联合应用增强了对乳腺癌干细胞的小鼠体内肿瘤形成能力的抑制。综上所述,经富集分选的乳腺癌干细胞具有自我更新、分化、治疗抗性等干细胞特性,表达VP3蛋白的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞具有一定的体内外抑制作用,能够抑制乳腺癌干细胞干性,Ad-VT能够增强乳腺癌干细胞对药物的敏感性,抑制乳腺癌干细胞的治疗抗性,增强化疗药紫杉醇抑制乳腺癌干细胞的作用。
巩卓彦[2]（2021）在《半夏泻心汤对APP/PS1双转基因小鼠海马神经元早期自噬影响》文中认为阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种年龄相关的神经退行性疾病,最典型的病理特征除突触神经元丢失外,主要表现为细胞内外异常蛋白质表达、加工和共沉积。值得注意的是,自噬缺陷是导致蛋白质异常沉积的关键问题之一,在AD典型的病理改变中起到至关重要的作用,改善自噬功能成为AD治疗的目标之一。自噬缺陷可导致包括AD在内的多种神经退行性疾病,并且自噬系统功能障碍是AD公认的早期神经病理学特征。经典的PI3K/Akt/mTOR通路下游靶标mTOR激酶直接调节自噬体的形成过程,是影响自噬过程的关键因子。PI3K-Akt可以激活mTOR介导的生物合成过程,神经元mTOR信号传导的异常表达是AD的早期发病机制。课题组前期研究发现“从脾论治”的复方中药半夏泻心汤能够改善AD小鼠认知调节中枢胰岛素信号通路和大脑葡萄糖代谢,明显升高PI3K/Akt/mTOR自噬经典通路上游的PI3K和Akt蛋白表达水平,而且半夏泻心汤的有效成分小檗碱可以通过提高自噬保护神经元突触的结构和可塑性,人参皂苷干预Aβ处理的PC12细胞可以通过激活自噬通路PI3K/Akt信号通路使细胞凋亡水平明显降低。目的通过行为药理学方法检测小鼠记忆获取和维持能力、对新环境探索和记忆探索能力。应用透射电镜检测海马神经元和自噬体超微结构的改变。采用分子生物学方法检测海马mTOR、p-mTOR、Beclin1、LC3和Aβ42蛋白的表达分布以及下游蛋白mRNA的表达。探究半夏泻心汤对自噬经典通路下游自噬关键信号通路因子mTOR的作用,检测APP/PS1双转基因小鼠自噬相关蛋白及Aβ表达,认识其对AD早期自噬的影响。方法1实验动物分组给药:实验所用动物为3月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠45只和同月龄同背景C57BL/6J小鼠15只。APP/PS1双转基因小鼠随机分为3组,分别为模型组（等体积0.5%羧甲基纤维素钠）、多奈哌齐组（0.92mg/kg/d）和半夏泻心汤组（6.7mg/kg/d）;C57BL/6J小鼠为正常组（同模型组）,连续灌胃给药3个月。2行为学检测:灌胃结束后进行跳台、Y迷宫和Morris水迷宫实验测试。3电镜观察:海马神经元和自噬体超微结构。4免疫组织化学和Western-blot检测:检测海马经典自噬通路mTOR、p-mTOR,以及自噬下游相关蛋白Beclin1、LC3和特征病理改变Aβ42的表达表达和分布。5 RT-PCR检测:自噬下游相关蛋白海马Beclin 1和LC3mRNA的表达。结果1行为学实验:跳台实验中,模型组小鼠与正常组相比潜伏期显着缩短、错误次数明显增加（P<0.01）,药物组小鼠与模型组相比潜伏期均增加（P<0.05）,错误次数均明显减少（P<0.01）;Y迷宫实验中,模型组小鼠与正常组相比进入新异臂的次数显着减少（P<0.01）,药物组小鼠与模型组相比进入新异臂的次数均显着增加（P<0.01）;Morris水迷宫实验中,模型组小鼠与正常组相比第1～5天逃避潜伏期和游泳距离增加（P<0.01或P<0.05）,第6天撤台后穿越站台次数显着减少（P<0.01）,药物组小鼠与模型组相比第1～5天逃避潜伏期和游泳距离均缩短（P<0.01或P<0.05）,第6天撤台后穿越站台次数均增多（P<0.01或P<0.05）。2超微结构观察:透射电镜下,模型组小鼠神经元内可见细胞核仁降解、染色质固缩,线粒体结构被破坏,出现空泡和内部嵴断裂,在神经元内可见较多自噬泡;药物组部分神经元发生肿胀、固缩,多奈哌齐组神经元内可见体积较大的自噬体和少量自噬泡,半夏泻心汤组神经元内可见包含线粒体在内的自噬体。3自噬蛋白质和mRNA表达:免疫组化检测,与正常组相比,模型组海马Aβ42、mTOR阳性表达面积百分比显着增加,而Beclin1和LC3阳性表达面积百分比显着降低（P<0.01）;与模型组相比,药物组Aβ42、mTOR阳性面积百分比显着降低（P<0.05或P<0.01）,而Beclin1和LC3阳性表达面积百分比显着增加（P<0.01）,mTOR、Beclin1和LC3阳性细胞数结果与阳性表达面积百分比一致。Western-blot检测,与正常组相比模型组海马Aβ42、mTOR、p-mTOR蛋白表达显着升高,而Beclin1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显着降低（P<0.05或P<0.01）,与模型组相比,药物组Aβ42、mTOR、p-mTOR蛋白表达均呈降低趋势,其中p-mTOR降低显着（P<0.05或P<0.01）,而Beclin1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均呈升高趋势。Beclin1和LC3mRNA检测,与正常组相比,模型组Beclin1和LC3mRNA均显着降低（P<0.01）,与模型组相比药物组表达呈增高趋势,其中多奈哌齐组LC3mRNA显着增高（P<0.05）。结论半夏泻心汤改善APP/PS1双转基因小鼠认知水平,可能是通过作用于自噬经典通路mTOR通路,影响下游mTOR蛋白和自噬蛋白LC3、Beclin1的表达,减少Aβ42积聚发挥早期神经保护作用。
王惠[3]（2021）在《基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响》文中研究说明研究背景:受饮食习惯、生活方式和社会压力等因素影响,心肌缺血和心肌梗死及其导致的心衰仍严重影响居民的身体健康和生活质量,其中涉及的中青年患者也在不断增多。研究发现,当心肌受损后可导致内质网、线粒体功能障碍,触发包括细胞焦亡在内的多种细胞死亡途径,导致心脏功能受损。临床使用益气活血中药治疗,可有效改善患者症状和心脏功能。而益气活血药主要包括黄芪50g,生晒参10g,当归15g,川芎15g,三七6g,是以中医气血理论（气虚血瘀、气滞血瘀）为理论基础而创立,为导师临床治疗心肌缺血缺氧、心肌损伤以及心肌梗死后各种遗留症状的经验效方,其作用主要是有益心气,促进血液运行和疏通脉络,本课题组在前期研究中已经证明益气活血药能够改善心肌梗死患者疼痛、胸闷、气短等的症状,明显改善心脏射血功能和心脏形态,可以改善大鼠心肌梗死后炎症反应对心肌的损伤,减轻血清中炎症细胞因子分泌水平。研究目的和意义:探究心肌梗死后内质网应激与细胞焦亡的相互作用和调控机制,详细研究心肌梗死的病理生理过程,揭示益气活血药防治心肌缺血、心肌梗死的作用机制和靶点,对于心梗的临床治疗和新药的研发有重要理论意义和实际应用价值。研究方法:本课题内容分为动物实验和细胞实验两部分。动物实验:购买雄性SD大鼠（200±20g）,适应性喂养三天后,结扎左冠状动脉前降支构建急性心梗动物模型。术后根据心电图情况,选取符合要求（5个及5个以上病理Q波）的成模大鼠并随机分为4组:模型组（Model,M）,益气活血组（YQHX,Y）,培哚普利组（Perindopril,P）和只穿线不结扎的假手术组（Sham,S）,于术后第二天给予相应药物和蒸馏水灌胃。前期研究结果表明益气活血药改善心肌缺血、减轻心肌梗死的作用以益气药和活血药2:1时作用最为显着,且服用28天疗效更佳显着。28天时间点还是心梗后心衰的时间窗,模拟临床急性心梗导致心衰的病理情况。因此本实验观察灌胃28天后,各组大鼠的心脏超声情况,HE染色观察各组大鼠心肌细胞状态,评价各组大鼠心脏功能;透射电镜观察心肌组织超微结构,免疫荧光染色观察TXNIP、GSDMD分布及表达情况;免疫蛋白印记法观察各组大鼠梗死边缘区心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况,揭示心肌梗死后梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡变化情况及益气活血药的调节作用。细胞实验:采用H9c2心肌细胞系复制缺糖缺氧模型,根据课题组前期研究结果,并考虑益气活血药冻干粉的存放时间,选用冻干粉200μg/ml、300μg/ml和400μg/ml浓度进行观察。将心肌细胞分为:对照组（C）;缺糖缺氧模型组（M）;200μg/ml益气活血药组（Y2）;30μg/ml益气活血药组（Y3）;400μg/ml益气活血药组（Y4）。根据课题组的前期研究成果,选用造模12h时的时间点观察益气活血药对中轻度心肌细胞损伤的保护作用。采用CCK-8试剂盒观察各组心肌细胞的活力,测定各组细胞中LDH和ROS水平,筛选出益气活血药调节氧化应激水平的最佳浓度为300μg/ml。为进一步观察内质网应激和细胞焦亡间的关系,使用内质网应激抑制剂4-PBA,并将心肌细胞以40×104密度随机分为5组:对照组（C）,缺糖缺氧模型组（M）,益气活血药组（Y）,4-PBA抑制剂组（4-PBA）,益气活血药组+4-PBA抑制剂组（Y+4-PBA）。通过Hoechst 33342/PI双染检测各组心肌细胞细胞焦亡率,免疫蛋白印记法观察各组心肌组织中GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达情况。实验结果:1.超声结果评价各组大鼠左室心功能情况。各组大鼠相应干预28天后,与假手术组相比,M组大鼠的左室射血分数（EF）和左室短轴率（FS）显着降低（p<0.01）,LVAWd、LVIDd、LVIDs 也都显着升高（p<0.01）,LVPWs 也有升高（p<0.05）,而、LVAWs降低（p<0.01）。益气活血药干预后可显着改善各组大鼠心功能,促进各组超声相应指标向正常范围恢复。2.各组大鼠梗死边缘区组织HE染色的心肌细胞情况。可见S组心肌细胞排列整齐,结构完整,细胞核位于细胞中央,无炎性细胞浸润;M组心肌细胞形态受损,细胞肿胀,细胞核散乱,形态位置都发生变化,心肌纤维断裂,结构破坏,胞浆着色不均,排列紊乱,细胞间隙显着增大,有大量炎性细胞浸润;Y组和P组边缘区组织可见心肌细胞肿胀,但整体结构完整,炎性细胞较M组减少,可见少量心肌纤维断裂,心肌细胞间隙略有增宽。3.透射电镜观察各组超微结构的变化。S组大鼠心肌Z线、M线清晰,粗细肌丝清晰排列整齐,线粒体结构完整,双层膜清晰可见,线粒体内基质颗粒和线粒体嵴排列清楚,内质网结构正常。心梗28天后,M组心肌细胞内超微结构紊乱,线粒体肿胀破裂,线粒体嵴模糊甚至消失,细肌丝断裂,粗肌丝堆积,肌原纤维断裂,内质网肿胀,多处可见空泡样结构。而药物干预组粗细肌丝融合分界不清,内质网、线粒体肿胀,线粒体嵴模糊,结构尚完整。5.免疫组化染色TXNIP、GSDMD的情况。TXNIP在假手术组少有表达,模型组显着增加,阳性细胞率大幅度提高。益气活血药和培哚普利组可减少TXNIP的阳性率表达。GSDMD在模型组广泛表达,强阳性染色细胞率较假手术组显着增多,用药组干预后GSDMD的蛋白阳性率可明显降低6.各组大鼠梗死边缘区组织内质网应激和细胞焦亡相关蛋白表达情况。蛋白免疫印迹法结果显示:与 S 组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11 蛋白表达水平都显着增高（p<0.01）,而益气活血药和培哚普利可不同程度的降低各组蛋白表达,发挥相应调节作用（p<0.05）。7.益气活血药对缺糖缺氧H9c2心肌细胞的保护作用。与C组相比,缺糖缺氧12h后心肌细胞活力显着降低（p<0.01）,而Y2、Y3、Y4可不同程度的提高心肌细胞活力,保护其免受或少受缺糖缺氧的损伤,其中Y3的效果最佳。又继续探索了不同浓度益气活血药对各组细胞LDH和ROS的影响,结果显示益气活血药可降低缺糖缺氧心肌细胞LDH、ROS水平,其中Y3显示出更好的效果,故在本课题接下来的实验中,选用300μg/ml的益气活血药浓度进行机制探究。我们继续观察了 C、M、Y（300μg/ml）、4-PBA和Y（300μg/ml）+4-PBA五组心肌细胞的细胞存活率和LDH表达水平。结果显示,与C组相比,M组细胞存活率显着降低（p<0.01）,平均降至40%左右。在药物和抑制剂的干预下细胞存活率都明显增加（p<0.05）。虽然Y、4-PBA和Y+4-PBA三个组的细胞存活率程增加趋势,但三者没有统计学差异（p>0.05）。模型组细胞上清中LDH量显着增高（p<0.01）,平均可达400U/L左右。Y、4-PBA和Y+4-PBA干预后都可明显减少LDH的释放（p<0.01）,Y组与Y+4-PBA组相比,差异具有统计学差异（p<0.01）,Y+4-PBA组LDH的减少程度更佳显着。8.心肌细胞细胞焦亡率的情况。采用Hoechst 33342/PI双染后可见C组细胞淡蓝染,细胞密度高,细胞大小正常,基本没有红染细胞。M组细胞核蓝染高亮,细胞密度降低,细胞体积增大,大量红染细胞。而使用抑制剂和中药干预后,都可以降低焦亡细胞比率,细胞密度也较M组增加。9.益气活血药对缺糖缺氧心肌细胞内质网应激和细胞焦亡相关蛋白的影响。与S组相比,M 组 GRP78、（p）IRE1a、（p）PERK、TXNIP、NLRP3、GSDMD、IL-1β、Caspase-1、cleaved Caspase-1/11蛋白表达水平都显着增高（p<0.01）,益气活血药和抑制剂干预都可降低相关指标的表达,而抑制剂作用更佳显着。当益气活血药与抑制剂联用时,可进一步降低其表达水平（p<001）。研究结论:1.益气活血药可通过改善缺血心肌细胞超微结构损伤而提高心梗后心功能,改善心梗后的收缩功能,减小梗死面积。2.益气活血药通过调节内质网应激和细胞焦亡相关蛋白,减少心肌细胞死亡,挽救缺血心肌。3.内质网应激抑制剂4-PBA可显着抑制心肌细胞焦亡相关指标表达,表明细胞焦亡可以由内质网应激途径触发并加重细胞焦亡的损伤作用,该作用可能与TXNIP/NLRP3途径有关。而益气活血药可通过抑制内质网应激TXNIP/NLRP3途径,缓解内质网应激抑制细胞焦亡,减轻心肌细胞损伤,且从研究结果显示,益气活血药的作用机制与IRE1 α诱导的相关途径密切相关,这将是进一步研究该课题的重点方向。4.益气活血药减轻内质网损伤,改善了“气虚”的状态,提高了受损心脏功能运行的动力,为从现代科学角度阐释中医“气血”理论提供了研究基础。
李新宇[4]（2019）在《SMAD4与SIVA1、USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制》文中指出SMAD4作为SMAD家族的重要成员和细胞核质间的穿梭蛋白,在介导TGF-β通路信号转导和调控靶基因转录过程中发挥关键性作用,并参与生物体内多种细胞过程。本实验室前期研究证实SMAD4是猪卵泡闭锁和颗粒细胞功能的重要调节因子,不仅可以促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡,而且还参与颗粒细胞类固醇激素合成的调控。进一步分析发现SMAD4可通过调控微小RNAs（miRNAs）生成和长链非编码RNAs（lncRNAs）表达等表观遗传途径调控猪卵巢颗粒细胞功能。本文利用猪卵巢颗粒细胞SMAD4敲减的转录组数据鉴定了一个猪的新基因SIVA1,其编码蛋白为泛素连接酶。同时,发现去泛素化酶USP9X受其底物SMAD4调控。因此,本文以泛素连接酶SIVA1和去泛素化酶USP9X为研究对象,分析SMAD4与SIVA1、USP9X间的相互调控机制,以及协同调控猪卵巢颗粒细胞凋亡的机制,在实验室前期研究的基础上继续探索SMAD4通过泛素化/去泛素化这一表观遗传途径调控猪卵巢颗粒细胞凋亡的机制。本文主要研究结果如下:1、SMAD4与泛素连接酶SIVA1互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡本文对实验室前期获得的猪卵泡颗粒细胞SMAD4敲减的转录组数据进行分析,结果发现一个SMAD4敲减的猪卵泡颗粒细胞中显着上调的新转录本,qRT-PCR证实SMAD4是新转录本的抑制者。利用RACE技术获得了新转录本的全长mRNA序列（长度为646 by）,包括101bp的5’-UTR、379 by的编码区序列和166 bp的3’-UTR。同源性比对发现新转录本编码区核苷酸序列与人SIVA1基因的相似度为81.79%,编码蛋白氨基酸序列的相似度为77.14%,因此将其命名为猪SIVA1。组织表达谱分析发现SIVA1基因存在于猪卵巢、肌肉、大脑、肝脏、胃、心肌、大肠和脾脏等组织中,并且在卵巢组织中高表达。荧光原位杂交和免疫组化分析发现SIVA1在不同发育阶段的猪卵泡壁层和游离的颗粒细胞中表达,特别是在闭锁卵泡中表达增强。qRT-PCR和Western blot方法证实SIVA1基因mRNA和蛋白在猪闭锁卵泡中表达水平显着高于健康卵泡。FACS分析发现敲减SIVA1后猪卵泡颗粒细胞凋亡率下降,而过表达SIVA1后颗粒细胞凋亡率上升。这些结果说明新基因SIVA1是猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的促进因子。为了分析SMAD4抑制猪卵泡颗粒细胞中SIVA1基因转录的分子机制,本文克隆了猪SIVA1基因5’调控区序列,并成功鉴定了其核心启动子区。结果在猪SIVA1基因核心启动子区发现了 4个SMAD结合元件（SBE）,荧光素酶报告基因系统和染色质免疫沉淀技术（ChIP）证实SMAD4可与猪SIVA1基因核心启动子区SBE结合,抑制SIVA1基因的启动子区活性。FACS分析和Western blot进一步证实SMAD4可抑制猪卵泡颗粒细胞中SIVA1蛋白表达及其介导的颗粒细胞凋亡。同时,过表达和敲减SIVA1后,猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白水平显着下调或上调,说明SIVA1可反馈调控SMAD4。SIVA1具有泛素连接酶作用,染色质免疫共沉淀技术（Co-IP）显示过表达SIVA1增加猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白泛素化水平,相反敲减SIVA1降低猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白泛素化水平,说明SIVA1通过泛素化机制调控SMAD4蛋白表达。上述结果表明在猪卵泡颗粒细胞中SMAD4与SIVA1形成一个负反馈调控环路即SMAD4-SIVA1环路。FACS结果发现SMAD4-SIVA1环路能够调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。为了进一步探索SMAD4-SIVA1环路调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制,本文对SMAD4和SIVA1下游因子进行了分析,结果发现凋亡标志基因BCL2是两者共同下游因子,且在猪卵泡闭锁过程中下调,因此被选作目标基因（蛋白）进行深入研究。Western blot证实过表达或敲减SMAD4和SIVA1,猪卵泡颗粒细胞中BCL2蛋白水平发生显着变化。ChIP分析显示SMAD4能够直接与猪BCL2基因启动子区SBEs结合,促进BCL2基因转录。Co-IP分析显示过表达SIVA1可上调猪卵泡颗粒细胞中BCL2蛋白的泛素化水平,而敲减SIVA1可下调BCL2蛋白的泛素化水平。另外,SMAD4-SIVA1环路调控猪卵泡颗粒细胞BCL2的表达,从而通过BCL2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。这些结果表明,BCL2是SMAD4-SIVA1环路的共同靶标,SMAD4-SIVA1环路可通过BCL2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。2、SMAD4与去泛素化酶USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡实验室前期研究证实去泛素化酶USP9X能够促进猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白表达,但作用机制尚不清楚。本文利用Co-IP技术分析发现敲减USP9X基因后猪卵泡颗粒细胞中SMAD4蛋白泛素化水平升高;FACS分析发现过表达SMAD4可抑制USP9X敲减诱导的猪卵泡颗粒细胞凋亡,说明USP9X通过促进SMAD4蛋白去泛素化提高其蛋白水平,进而影响猪卵泡颗粒细胞凋亡。另外,SMAD4过表达或敲减后猪卵泡颗粒细胞中内源性USP9X基因mRNA表达量和蛋白表达量显着上调或下调,说明在猪卵泡颗粒细胞中SMAD4和USP9X可以形成一个新的调控环路即SMAD4-USP9X环路。进一步分析发现SMAD4可作为转录因子直接与猪USP9X基因启动子区上的SBE结合调控USP9X基因的转录活性。FACS分析显示特异性敲减USP9X后可有效降低SMAD4过表达抑制的猪卵泡颗粒细胞凋亡率,说明去泛素化酶USP9X可介导SMAD4对猪卵泡颗粒细胞凋亡起到调控作用。实验室前期研究证实LRH-1可通过CYP19A1调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。本文进一步发现LRH-1可与CYP19A1基因启动子区直接结合,在猪卵泡颗粒细胞中形成LRH-1/CYP19A1轴。生物信息学分析发现猪LRH-1基因启动子区含有SBEs,利用荧光素酶报告基因系统、染色质免疫沉淀技术（ChIP）、qRT-PCR和western blot证实SMAD4可与LRH-1基因启动子区上SBE结合,上调LRH-1基因转录活性,促进猪卵巢颗粒细胞中LRH-1表达。同时,敲减USP9X可抑制猪卵泡颗粒细胞中LRH-1/CYP19A1轴,Co-IP发现LRH-1蛋白泛素化水平升高,说明USP9X通过促进LRH-1蛋白去泛素化激活LRH-1/CYP19A1轴。SMAD4和去泛素化酶USP9X可通过对方调控LRH-1/CYP19A1轴,并且都可以通过LRH-1对猪卵泡颗粒细胞凋亡起到调控作用。这些结果表明LRH-1/CYP19A1轴是SMAD4-USP9X环路的共同靶标,SMAD4-USP9X环路通过LRH-1/CYP19A1轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。miRNAs作为一类重要的表观调控因子,能够在猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法分别预测到214个和320个调控USP9X基因和SMAD4基因的潜在靶向miRNAs,其中在猪卵泡闭锁过程中差异表达的分别为14个和16个,其中有11个为两者共同的潜在miRNAs。荧光素酶活性分析发现9个在猪卵泡闭锁过程中上调的miRNAs中,miR-26b/27b/30c/195/320a同时靶向SMAD4和USP9X。功能分析发现miR-26b靶向抑制猪卵泡颗粒细胞中SMAD4-USP9X环路,及其介导的猪卵泡颗粒细胞功能（细胞凋亡）。进一步分析发现miR-26b通过靶向抑制SMAD4-USP9X环路,从而抑制猪卵泡颗粒细胞中LRH-1/CYP1 9A1轴。上述结果表明在猪卵泡颗粒细胞中SMAD4和USP9X拥有共同的调控miRNAs,这些miRNAs可通过靶向抑制SMAD4-USP9X环路和LRH-1/CYP19A1轴,促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。综上所述,本文鉴定了一个猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡相关新基因SIVA1,其具有泛素连接酶作用,并发现SMAD4可与泛素连接酶SIVA1形成负反馈环路,通过凋亡标志基因BCL2调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。同时,本文还证实SMAD4可与去泛素化酶USP9X形成正反馈环路,通过LRH-1/CYP19A1轴调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制。
乔雪[5]（2019）在《海南湍蛙肽HN-1抗乳腺癌活性及作用机制研究》文中指出近年来癌症的发病率和死亡率呈现逐渐上升的趋势,是威胁人类生命的主要疾病之一。而乳腺癌是女性中诊出率最高的癌症,同时也是威胁女性生命的头号杀手。目前,乳腺癌的治疗手段主要是外科手术和放化疗并辅以其他补充疗法,这些手段有效地提高了乳腺癌女性的生存率,但是由于癌细胞的转移和耐药性的高发,乳腺癌仍是女性中死亡率最高的癌症。化学药物治疗是目前肿瘤治疗中非常重要的分支,传统的化疗药物通常是通过干扰细胞的快速增殖而发挥作用,因此不可避免地产生一些副作用,如诱发系统性毒性,产生药物耐药性等,可见肿瘤的药物治疗期待着新的突破。抗癌肽（Anticancerpeptides,ACPs）即具有抗肿瘤活性的生物活性肽,其广泛存在于多种生物体内,包括哺乳动物、两栖类动物、昆虫、植物和微生物等。相较于传统化学抗癌药物,抗癌肽具有众多优势,如分子量低、结构简单、更高的抗癌活性、高选择性、较少的副作用、多种给药方式、不易引起多药耐药性等。另外,抗癌肽还可以与其他传统癌症治疗方法或抗癌分子联合使用,通常能够提高肿瘤治疗效果。近年来,肿瘤的免疫治疗药剂的兴起在肿瘤药物治疗领域引起了广泛关注,包括细胞因子、抗体类药物等,特别是免疫检查点抑制剂。另外,将免疫治疗药剂与放化疗结合的联合免疫治疗干预也是肿瘤治疗的热门研究方向。本文通过研究抗癌肽HN-1的抗乳腺癌作用机制和免疫调节机理,以期为新型肽类抗肿瘤药物的研发提供一定的基础理论依据。具体研究成果如下:（1）HN-1具有体内外的抗肿瘤活性并且毒性较小。实验中通过对HN-1的体外抗肿瘤作用筛选,发现HN-1对多株癌细胞具有不可逆的杀伤作用,其中对MCF-7细胞最为敏感,并且对阿霉素抗性的乳腺癌细胞MCF-7/ADR也有显着的抑制作用,但是HN-1对正常细胞的毒副作用却很小。不仅如此,HN-1显着性抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的增长,并对内脏结构破坏较小。利用裸鼠建立MCF-7细胞的移植瘤,通过HN-1治疗,发现HN-1显着性地抑制了肿瘤的增长,并且H&E染色显示HN-1对内脏的毒性较小。（2）HN-1在体内外诱导caspase非依赖性凋亡。实验发现HN-1诱导MCF-7细胞凋亡,随后通过ELISA,Western blot等实验发现HN-1诱导的凋亡不依赖于caspase的激活。并且HN1激活p53/Bax/Bcl-2信号通路,进而导致AIF的核转移。通过Western blot、siRNA转染、流式细胞术和免疫荧光等实验证明了 HN-1诱导MCF-7细胞中p53的表达,进而影响Bcl-2家族蛋白的表达,从而导致线粒体膜电位的缺失,最后释放AIF进入细胞核导致DNA的片段化,并且ROS-MAPK和NF-κB信号通路也参与到HN-1诱导的caspase非依赖性凋亡中。（3）HN-1激活乳腺癌荷瘤小鼠体内免疫应答。利用BALB/c小鼠建立4T1乳腺癌模型,HN-1显着性抑制了肿瘤的增长,同时降低了患癌小鼠的脾指数。通过流式细胞术分选、ELISA和免疫组化等实验发现HN-1显着性提高了小鼠脾脏中CD4+T细胞亚群的数量,提高了血液中抗肿瘤相关细胞因子的水平,有效调节了肿瘤中CD4+T细胞和巨噬细胞的浸润,并且抑制肿瘤的血管新生。（4）HN-1在体内分布安全。通过小动物活体成像,证明FITC-HN-1在体内主要分布于肿瘤、脾脏、肠道、肾脏和膀胱中,而其他的脏器包括肝脏、心脏、肺部等,未见强荧光分布。说明了 FITC-HN-1能够靶向作用于4T1乳腺实体瘤,并降低在正常组织中的药物积累。综上所述,本文成功揭示了抗癌肽HN-1的抗乳腺癌作用及其分子机制,并且证明其在发挥抗肿瘤作用的同时还能够调节患癌个体体内的免疫调节作用,这些发现为乳腺癌的药物治疗提供了新的模板,同时也为肽类药物治疗提供更多的潜在作用靶点。
王栎雯[6]（2019）在《CHOP过表达对肝癌细胞增殖和凋亡及对Cdc25C的影响》文中指出目的:通过研究CHOP过表达后对小鼠肝癌细胞增殖和凋亡及对Cdc25C的影响,初步探讨CHOP、Cdc25C和肝癌之间的关系,为深入研究Cdc25C在肝癌发生和发展中的作用机制提供依据。方法:（1）构建CHOP慢病毒载体（LV-CHOP）,用于转染小鼠肝癌Hepa1-6细胞系作为实验组（LV-CHOP-Hepa1-6）,转染慢病毒空载体的Hepa1-6细胞作为阴性对照组（LV-Hepa1-6）,未转染的Hepa1-6细胞作为空白对照组（Hepa1-6）,通过RT-PCR和Western blot技术检测各组Hepa1-6细胞中CHOP的表达。（2）通过CCK-8法和划痕修复实验检测各组Hepa1-6细胞的增殖和迁移能力。（3）通过流式细胞术检测各组Hepa1-6细胞的细胞周期。（4）流式细胞术和Western blot法检测各组Hepa1-6细胞的凋亡情况。（5）通过Western blot法检测各组Hepa1-6细胞中内质网应激反应标志物GRP78蛋白的表达。（6）qRT-PCR法检测各组Hepa1-6细胞中Cdc25CmRNA的表达;Westerm blot和免疫荧光染色检测各组Hepa1-6细胞中Cdc25C蛋白质表达。结果:（1）成功构建了 LV-CHOP慢病毒载体,转染小鼠肝癌Hepa1-6细胞后,CHOP基因及其蛋白质表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组,获得CHOP过表达的小鼠肝癌细胞。（2）CCK-8法检测结果显示,上调CHOP表达后,可抑制小鼠肝癌细胞的增殖。与两种对照组比较,差异具有显着性统计学意义（P<0.01）;（3）划痕修复实验中三组小鼠肝癌Hepa1-6细胞培养12h时,细胞修复率无明显差异（P>0.05）;在培养24h时,LV-CHOP-Hepa1-6实验组细胞修复率低于Hepa1-6和LV-Hepa1-6对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）;（4）流式细胞术检测细胞周期的结果显示,CHOP表达上调后,G0/G1期细胞增加（P<0.05）,S期细胞明显减少（P<0.01）,G2/M期细胞所占百分比无统计学差异（P>0.05）;（5）流式细胞术检测结果显示,CHOP表达上调后,可明显促进小鼠肝癌细胞凋亡（P<0.01）;Western blot结果显示,CHOP表达上调后,凋亡蛋白caspase-3、Bax蛋白质表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白质表达减少（P<0.05）。（6）Western blot法检测结果显示CHOP表达上调后,内质网应激反应标志物GRP78蛋白质表达增加（P<0.05）。（7）qRT-PCR法检测发现LV-CHOP-Hepa1-6实验组小鼠肝癌Hepa1-6细胞中Cdc25C mRNA水平低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Westerm blot和免疫荧光细胞化学染色法检测发现,LV-CHOP-Hepa1-6实验组小鼠肝癌Hepa1-6细胞中Cdc25C蛋白质表达低于对照组（P<0.05）。结论:内质网应激反应特异性转录因子CHOP过表达时,可减弱小鼠肝癌细胞的增殖和迁移,通过诱发内质网应激反应促进细胞凋亡,并降低肝癌相关抗原Cdc25C的表达。
谢吐秀[7]（2019）在《NLRP3炎症小体介导小鼠心肺复苏后细胞焦亡的研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:心搏骤停是最常见的临床急危重症之一,心肺脑复苏作为其有效的救治手段,一直在不断的改进,但心搏骤停患者的预后并未得到显着的改善。心搏骤停心肺复苏后的幸存者普遍存在不同程度的神经功能障碍。众所周知,炎症反应在脑缺血/再灌注损伤过程中扮演着至关重要的角色。然而,心搏骤停心肺复苏后全身缺血/再灌注损伤过程中,脑缺血/再灌注损伤所致的炎症反应机制尚不明确。细胞焦亡作为一种程序性死亡方式,已成为近年来研究的热点。本研究旨在探讨NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在心搏骤停心肺复苏后脑缺血/再灌注损伤过程中的作用及相关机制。方法:1.采用C57BL/6小鼠和NLRP3-/-小鼠制备高钾合并窒息心搏骤停心肺复苏模型,根据复苏后取材时间点的不同,将这两种品系的小鼠分别分为复苏前组、复苏后2h组、复苏后12h组和复苏后24h组。评估这两种小鼠的总体复苏情况,并记录各组小鼠的神经功能评分。通过免疫印迹法（Western blot,WB）检测脑组织中NLRP3、炎性Caspase-1、细胞焦亡的执行蛋白GSDMD的表达。应用免疫荧光观察复苏后不同时间点海马回区NLRP3和GSDMD的表达趋势和定位。2.培养人脑胶质瘤细胞U87细胞,用NLRP3 RNAi慢病毒和空载慢病毒分别感染U87细胞,并用嘌呤霉素进行筛选,得到U87 NLRP3 RNAi和U87空载的稳定细胞系。接着,对正常U87细胞、U87 NLRP3 RNAi细胞以及U87空载细胞进行糖氧剥夺12h/复氧12h。最后,倒置显微镜下观察各组细胞的细胞形态,用WB检测细胞焦亡相关蛋白的表达,用CCK8试剂检测各组U87细胞的细胞活力,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组U87细胞上清液中IL-1β的浓度。结果:1.与C57BL/6小鼠相比,NLRP3-/-小鼠心搏骤停心肺复苏后的自主循环恢复率、自主呼吸恢复率和2小时存活率均显着提高（P<0.05）,而其自主循环恢复时间和自主呼吸恢复时间均显着缩短（P<0.05）。此外,NLRP3-/-小鼠复苏后2h、复苏后6h、复苏后12h和复苏后24h的神经功能评分均分别高于C57BL/6小鼠复苏后2h、复苏后6h、复苏后12h和复苏后24h的,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.C57BL/6小鼠和NLRP3-/-小鼠在心搏骤停心肺复苏后脑缺血/再灌注损伤过程中都发生了细胞焦亡。C57BL/6小鼠脑组织中NLRP3蛋白、Caspase-1蛋白以及细胞焦亡的执行蛋白GSDMD的表达在复苏后6h达到高峰,随后逐步降低,在复苏后24h仍未恢复至基线水平（P<0.001）;与复苏后同时间段的C57BL/6小鼠相比,NLRP3-/-小鼠在心搏骤停心肺复苏后脑缺血/再灌注损伤过程中,脑组织中NLRP3蛋白不表达,其下游的Caspase-1蛋白和GSDMD蛋白呈显着低表达（P<0.001）。3.NLRP3蛋白表达定位于海马回区细胞质,GSDMD蛋白表达定位于海马回区细胞膜。4.正常U87细胞在糖氧剥夺12h/复氧12h后,细胞形态明显发生改变,细胞贴壁能力和细胞活力均显着降低,而NLRP3、炎性Caspase-1和GSDMD蛋白的表达水平会显着上调（P<0.001）,并产生大量的炎性因子IL-1β（P<0.001）;U87 NLRP3 RNAi稳定细胞经过糖氧剥夺12h/复氧12h处理后,细胞形态明显改善,细胞贴壁能力和细胞活力均显着增强,而NLRP3、炎性Caspase-1和GSDMD蛋白的表达水平均显着降低（P<0.001）,产生的炎性因子IL-1β也明显减少（P<0.001）。结论:（1）NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在心肺复苏后海马回区缺血/再灌注损伤过程中扮演着重要的角色;（2）沉默或者敲低NLRP3基因可抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD这条介导细胞焦亡信号轴的激活,改善细胞形态、增强细胞贴壁能力和细胞活力、降低炎性因子水平,继而显着提高小鼠心肺复苏后2h存活率、自主循环恢复率、自主呼吸恢复率,显着缩短心肺复苏后自主循环恢复时间和自主呼吸恢复时间,显着改善小鼠心肺复苏后的神经功能评分
仲海荣,邹纯朴,胥孜杭[8]（2019）在《天然醌类化合物抗肺癌机制研究进展》文中认为肺癌是常见恶性肿瘤,具有高发病率、高死亡率的特点,放化疗目前仍是其主要治疗方式,但是放化疗带来的副作用不容忽视,亟需寻找毒性低,作用强并且对癌细胞具有靶向性的抗癌化合物,于是数量众多的天然产物来源化合物的抗癌作用受到越来越多的关注。他们结构多样,种类丰富但比天然植物成分简单,作用明确,这利于研究并且在应用时,富集的成分比天然植物的药理作用和临床疗效更强。醌类化合物属于天然生物活性分子,广泛存在于100多种高等和低等植物的各个部位中,包括萘醌、菲醌、苯醌和蒽醌,大多数具有抗肿瘤作用,它在许多癌症中都有应用和研究,其中在肺癌中的研究已经有很多,作用机制涉及多种途径,发挥促进凋亡、抑制增殖,诱导自噬,抑制血管生成和细胞侵袭迁移等多种作用,有些药物在与其他药物联用时还具有增强抗肿瘤作用的效果。随着研究的增多,许多合成的结构类似的醌类衍生物也增加了抗肺癌醌类化合物的多样可选性,醌类化合物在肺癌中具有广泛的应用前景。在查阅大量文献的基础上,现对目前醌类化合物抗肺癌的分子机制研究进行综述,总结不同作用的常见研究靶点,分析醌类化合物药理作用与抗肺癌作用之间的关系,提出可深入研究方向的思考,为后续其他醌类化合物的研究和开发作参考。
王嘉[9]（2017）在《蚂蟥冬眠期间生理适应性研究》文中研究表明蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）是原始的无脊椎变温动物,其干燥全体是一种重要的中药,蚂蟥目前在中国被广泛养殖。研究发现,蚂蟥冬眠一般从11月开始,持续到来年4月,当环境温度上升到在一定高度时就会自然苏醒,但冬眠时期的体重下降和长时间的持续冬眠严重影响蚂蟥的养殖生产效率。冬眠是动物为了在低温下长期生存产生的节能策略的自适应机制。在恒温和变温动物中都存在,其特征是低体温下抑制代谢节省能量。冬眠期间动物为了长期生存必需具备两个条件:首先,代谢和生理的调整必须支持组织或生物体的代谢需求使用和备用。第二,冬眠的生存需要特定的变化,避免和延迟细胞死亡在进入冬眠抑制状态和从冬眠苏醒的代谢旺盛状态。与恒温动物冬眠,变温动物冬眠不存在间歇觉醒,在此期间动物会产热几个小时内来维持正常体温。蚂蟥冬眠基础研究有限,本研究在对蚂蟥冬眠期间能量代谢和自我保护机制探索的基础上,通过TMT标记技术,对蚂蟥肠道差异蛋白质与差异蛋白磷酸化在蚂蟥冬眠前后的表达变化进行比较。本论文主要由四部分组成,分别为:1.冬眠动物的一个显着特征就是能量代谢被抑制,且这种抑制在动物从冬眠中苏醒时被迅速解除。本研究通过检测蚂蟥冬眠期间5个不同时期肠道能量代谢的关键酶酶活性和表达量以及能量代谢中关键物质的含量变化,发现蚂蟥冬眠期间不同时期能量代谢差异显着。实验结果表明:蚂蟥深冬眠期间糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化过程的关键酶（HK、PK、PDH、IDH、SDH、MDH、UQCR和COX）的酶活性和表达量显着下降,同时ATP、AMP、ADP、NAD+和NADH含量降低。在蚂蟥出冬眠苏醒时,糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化过程的关健酶酶活性和表达量同时升高,ATP、AMP、ADP、NAD+和NADH含量上升。结果表明,蚂蟥冬眠时能量代谢过程（糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化过程）显着下降,降低ATP的产量,出冬眠时能量代谢则迅速恢复,提高ATP的产量。蚂蟥具有一套严格完善的冬眠调控体系,确保各时期能量代谢的供应。2.根据蚂蟥冬眠期间5个不同时期肠道抗氧化酶活性和表达量的检测结果发现深冬眠期间蚂蟥由于生理活动受抑制,抗氧化能力也下降（酶活性和表达量下降）;入冬眠时由于受到低温的胁迫,抗氧化能力上升;出冬眠时受活性氧胁迫,抗氧化能力上升。这些结果说明蚂蟥冬眠期间不同阶段有不同抗氧化体系。通过测定Caspase3和Caspase8的酶活性和表达量,结合凋亡诱导因子AIF1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量,发现蚂蟥冬眠期间肠道组织细胞凋亡受到抑制,出冬眠和入冬眠过程中,细胞凋亡升高。本实验还通过比较蚂蟥冬眠不同时期的热休克蛋白的表达量,探索热休克蛋白在蚂蟥冬眠过程中的变化规律。本研究中,蚂蟥深冬眠时期肠道HSP27、HSP60和HSP70的表达量较正常时期显着上升。入冬眠时,三种热休克蛋白表达量上升;出冬眠时,三者表达量显着高于正常时期,其中HSP27出冬眠时期显着高于其他时期。3.本研究运用TMT和LC MS/MS技术,定性和定量检测了蚂蟥冬眠期间的差异蛋白,揭示蚂蟥冬眠适应机制。实验结果表明:在三个组别中（活跃期、深冬眠期和苏醒初期）定性检测到3580个蛋白,定量检测到2184个蛋白,其中390个有显着差异。通过生物信息学分析,深冬眠时与脂肪分解相关蛋白升高,与糖类和蛋白分解蛋白下降,说明冬眠期间蚂蟥脂肪代谢上升,糖和蛋白分解被抑制。除此之外,蛋白合成、能量代谢、跨膜运输相关蛋白在深度冬眠时显着下调,而细胞骨架蛋白和热休克蛋白相关蛋白上升。我们推测蚂蟥在冬眠期间可能通过减弱跨膜运输和蛋白合成降低能量需求,增加细胞骨架蛋白重组细胞骨架维持细胞结构稳定来保护肠道细胞。4.本研究运用TMT标记和LC-MS/MS定量技术,分析了蚂蟥冬眠前后蛋白磷酸化变化规律。实验结果显示:在三个组别中（活跃期、深冬眠期和苏醒初期）定性检测2596个蛋白上有3474个磷酸化位点,其中定量检测到1388个蛋白上有2598个磷酸化位点。不同的磷酸化蛋白构成了蚂蟥蛋白磷酸化互作图,涉及信号转导、能量代谢、蛋白质合成、细胞保护等,这些过程多参与蚂蟥冬眠过程组织的自我保护。对相关蛋白活性检测证实了磷酸化变化对这些蛋白活性的调控。这些可逆的蛋白磷酸化变化通磷酸化级联反应调控下游蛋白活性,从而调控不同生理活动来适应冬眠不同阶段的环境。综上所述,对蚂蟥冬眠期间能量代谢和自我保护方面的研究可以发现,深冬眠期蚂蟥肠道能量代谢受到明显抑制,此时抗氧化能力也下降,但热休克蛋白表达量上升;入冬眠时,由于受到低温胁迫,抗氧化能力和热休克蛋白上升;苏醒时,由于能量代谢的迅速上升,抗氧化能力和热休克蛋白同样升高。通过对蚂蟥冬眠前后的差异蛋白表达及蛋白磷酸化水平整体比较,发现差异蛋白和磷酸化蛋白都涉及能量产生、蛋白合成、转录和翻译、抗应激、细胞稳态维持等,这些过程与能量代谢和细胞自我保护相关,进一步表明蚂蟥冬眠期间具有调节能量代谢和细胞自我保护机制来适应冬眠时期恶劣环境的能力。
李春春[10]（2017）在《砷致细胞恶性转化过程中转录因子Nrf2对细胞凋亡的作用》文中提出【目的】观察1.0μmol/L亚砷酸钠（NaAsO2）长期作用于永生化人支气管上皮细胞（HBE细胞）、永生化人皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）,致使细胞发生恶性转化过程中,细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的动态变化趋势,并探讨转录因子Nrf2在此过程中所起的作用,为砷致癌机制的深入研究提供必要的基础资料。【方法】1.细胞模型:以本实验室前期建立的HBE、HaCaT细胞恶性转化模型为研究对象。用0.0和1.0μmol/L NaAsO2的DMEM高糖培养基传代培养HBE、HaCaT细胞分别至43代和35代,此时细胞已发生恶性转化。分别以染毒HBE细胞0、1、8、15、22、29、36、43代,HaCaT细胞0、1、7、14、21、28、35代,以及同代对照作为动态监测点。2.NaAsO2致细胞恶性转化过程中细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的检测:采用流式细胞仪检测HBE、HaCaT细胞恶性转化过程中染毒组各个监测点细胞凋亡率的变化;采用蛋白免疫印记法（Western blot）检测HBE、HaCaT细胞恶性转化过程中各个监测点的凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Caspase-8、Cleaved-caspase-8、Caspase-12、Cleaved-caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、Mcl-1蛋白的表达情况。3.转录因子Nrf2在NaAsO2致细胞恶性转化过程中对细胞凋亡的影响:分别取染毒43代的HBE细胞和染毒35代的HaCaT细胞进行软琼脂克隆,将软琼脂克隆实验中阳性（≥30个细胞）集落中的单个克隆细胞挑出,继续扩大培养,分别命名为恶性转化的HBE细胞（T-HBE Cells）及恶性转化的HaCaT细胞（T-HaCaT Cells）。再分别用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞,使细胞中的Nrf2表达降低,同时设立相应的同代对照组、恶性转化对照组、转染Con si RNA组,分别作为阴性对照组、阳性对照组和空白对照组。采用Western blot验证T-HBE和T-HaCaT细胞内Nrf2蛋白的沉默效果后,采用流式细胞仪检测Nrf2蛋白沉默后细胞凋亡率的变化;采用酶标仪检测Nrf2蛋白沉默后细胞内活性氧中的过氧化氢（H2O2）水平变化;同时再采用Western blot检测Nrf2蛋白沉默后细胞内的凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Caspase-3、Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12、CHOP、Bcl-2、Bax、Mcl-1蛋白的表达变化情况。【结果】1.NaAsO2致细胞恶性转化过程中细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的变化（1）分别培养各个监测点的HBE、HaCaT细胞检测凋亡率的变化,结果显示与对照组0代细胞相比较,HBE细胞在染毒22代及以后、HaCaT细胞在染毒7代及以后,细胞凋亡率都呈明显的下降趋势,差异均具有统计学意义（P<0.05）。（2）分别培养各个监测点的HBE、HaCaT细胞进行蛋白检测,结果显示Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白及Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达在HBE、HaCaT细胞中都有明显的下降趋势。在HBE细胞中,与对照组0代细胞及同代对照组细胞相比较,Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白都在染毒22代及以后,Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达分别在染毒15代及以后、染毒29代及以后,呈过低的表达状态（P<0.05）。在HaCaT细胞中,与对照组0代细胞及同代对照组细胞相比较,Caspase-3蛋白、Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达都在染毒21代及以后,Cleaved-caspase-3蛋白分别在染毒14代及以后、染毒21代及以后,呈过低的表达状态（P<0.05）。（3）分别培养各个监测点的HBE、HaCaT细胞进行各个凋亡通路的蛋白检测,结果显示在HBE、HaCaT细胞恶性转化过程中Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12蛋白及Cleaved-caspase-8/Caspase-8、Cleaved-caspase-12/Caspase-12的表达并没有发生明显的改变。在HBE细胞中,与对照组0代及同代对照组细胞相比较,CHOP蛋白在染毒15代及以后、Bax蛋白在染毒29代及以后,呈明显的下降趋势（P<0.05）;Bcl-2、Mcl-1蛋白在染毒15代及以后呈明显的上升趋势（P<0.05）。在HaCaT细胞中,与对照组0代及同代对照组细胞相比较,CHOP、Bax蛋白在染毒21代及以后呈明显下降的过低表达状态;Bcl-2蛋白分别在染毒7代及以后和染毒14代及以后、Mcl-1蛋白在染毒14代及以后呈明显上升的过高表达状态（P<0.05）。2.转录因子Nrf2在NaAsO2致细胞恶性转化过程中对细胞凋亡的影响（1）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后检测沉默效果。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞的Nrf2蛋白表达均明显上升（P<0.05）;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞Nrf2蛋白表达均明显下降（P<0.05）。（2）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后进行检测。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞的凋亡率、活性氧中的H2O2水平均明显下降（P<0.05）;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞的凋亡率、H2O2水平均明显上升（P<0.05）。（3）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后进行检测。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞Cleaved-caspase-3、Caspase-3蛋白及Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达均明显下降（P<0.05）;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞Cleaved-caspase-3、Caspase-3蛋白及Cleaved-caspase-3/Caspase-3表达均明显上升（P<0.05）。（4）用Nrf2 si RNA转染T-HBE和T-HaCaT细胞使Nrf2基因沉默后进行检测。结果显示,相较于同代对照组的HBE和HaCaT细胞,T-HBE和T-HaCaT细胞的CHOP、Bax蛋白表达均明显下降,Bcl-2、Mcl-1蛋白表达均明显上升（P<0.05）,而Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12蛋白及Cleaved-caspase-8/Caspase-8、Cleaved-caspase-12/Caspase-12表达均未发生明显的改变;而相较于转染Con si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞,转染Nrf2 si RNA的T-HBE和T-HaCaT细胞CHOP、Bax蛋白表达均明显上升,Bcl-2、Mcl-1蛋白表达均明显下降（P<0.05）,而Cleaved-caspase-8、Caspase-8、Cleaved-caspase-12、Caspase-12蛋白及Cleaved-caspase-8/Caspase-8、Cleaved-caspase-12/Caspase-12表达仍未发生明显的改变。【结论】1.1.0μmol/L NaAsO2长期作用于HBE、HaCaT细胞致使其发生恶性转化过程中,细胞的凋亡率明显下降。2.NaAsO2可能通过抑制内质网和线粒体凋亡途径来抑制HBE、HaCaT细胞的正常凋亡,致使其发生恶性转化。3.Nrf2可能作为上游基因参与NaAsO2对HBE、HaCaT细胞凋亡的抑制作用。
二、AMID, an AIF homologous protein, induces caspases-independent apop-tosis（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、AMID, an AIF homologous protein, induces caspases-independent apop-tosis（论文提纲范文）
（1）鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 凋亡素 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.3 癌症干细胞研究进展 |
| 1.3.1 癌症干细胞的概念 |
| 1.3.2 CSCs的鉴定 |
| 1.3.3 CSCs的特征 |
| 1.3.4 CSCs转录因子的标志 |
| 1.3.5 CSCs与癌症转移 |
| 1.3.6 CSC与临床治疗 |
| 1.3.7 CSCs与细胞凋亡 |
| 第二章 乳腺癌干细胞干性特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂和材料 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳腺癌干细胞MCF7-CSC分选培养与传代 |
| 2.2.2 MCF7-CSC血清诱导分化 |
| 2.2.3 细胞克隆形成能力 |
| 2.2.4 Western Blot检测MCF7-CSC干细胞调控因子表达水平 |
| 2.2.5 PCR Array检测人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.2.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MCF7-CSC分选培养 |
| 2.3.2 MCF7-CSC血清诱导分化能力 |
| 2.3.3 MCF7-CSC细胞克隆形成能力 |
| 2.3.4 MCF7-CSC干细胞调控因子表达 |
| 2.3.5 MCF7-CSC人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.3.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒对MCF7-CSC的抑制作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒制备、纯化与毒价测定 |
| 3.2.2 重组腺病毒对MCF7-CSC干性抑制 |
| 3.2.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.2.4 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.2.5 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组腺病毒对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 3.3.2 CFSE检测重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.3.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.3.4 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组腺病毒对MCF7-CSC的小鼠体内抑制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株和动物 |
| 4.1.2 试剂和材料 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的抑制 |
| 4.2.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内肿瘤杀伤作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的检测 |
| 4.3.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC的小鼠体内杀伤作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Ad-VT与 MCF7-CSC药物敏感性 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株和动物 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 仪器和设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.2.2 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.2.3 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.2.4 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.2.5 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内肿瘤形成能力抑制 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.3.2 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.3.3 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.3.4 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.3.5 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内成瘤能力抑制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）半夏泻心汤对APP/PS1双转基因小鼠海马神经元早期自噬影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 半夏泻心汤干预阿尔茨海默病的研究进展 |
| 1 阿尔茨海默病的病因病机 |
| 2 阿尔茨海默病的治则治法 |
| 3 半夏泻心汤治疗阿尔茨海默病的中医应用 |
| 4 半夏泻心汤针对阿尔茨海默病发病机制的研究 |
| 5 半夏泻心汤有效成分对阿尔茨海默病的干预作用 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬与阿尔茨海默病发生发展的研究进展 |
| 1 自噬的正常功能及过程 |
| 2 自噬调节通路 |
| 3 自噬-溶酶体系统 |
| 4 自噬功能障碍与阿尔茨海默病 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 半夏泻心汤对APP/PS1双转基因小鼠认知行为学的影响 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 半夏泻心汤对APP/PS1双转基因小鼠海马神经元和自噬体超微结构的影响 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 半夏泻心汤对APP/PS1双转基因小鼠海马自噬相关蛋白的影响 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 益气活血类中药保护缺血性心肌病的作用机制及在内质网应激方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 心肌细胞死亡形式及其在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 益气活血药对心梗大鼠心脏功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血药对心肌梗死大鼠内质网应激和细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 益气活血药对缺血缺氧诱导的H9c2心肌细胞活力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 益气活血药对缺糖缺氧诱导的H9c2心肌细胞内质网应激和细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）SMAD4与SIVA1、USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 SMADs蛋白家族 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 SMAD家族生物学功能 |
| 2 凋亡诱导因子SIVA1 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 SIVA1主要作用机制 |
| 3 去泛素化酶USP9X |
| 3.1 去泛素化酶 |
| 3.2 USP家族 |
| 3.3 USP9X对Smad4泛素化和去泛素化机制的研究进展 |
| 3.4 USP9X与细胞凋亡 |
| 第二章 SMAD4与泛素连接酶SIVA1互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪新基因SIVA1的鉴定与序列分析 |
| 2.2 SIVA1与猪卵泡闭锁有关 |
| 2.3 SIVA1过表达促进猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.4 SIVA1干扰抑制猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.5 SMAD4调节猪卵泡颗粒细胞中SIVA1表达和功能 |
| 2.6 SMAD4通过直接结合SIVA1基因启动子调节其转录 |
| 2.7 SMAD4与SIVA1形成调控环路 |
| 2.8 SIVA1通过SMAD4调控猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.9 BCL2是SMAD4-SIVA1环路的共同靶标 |
| 2.10 BCL2是SMAD4-SIVA1环路的直接靶标 |
| 2.11 SMAD4-SIVA1环路通过BCL2控制猪卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 SMAD4与去泛素化酶USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.2 寡核苷酸的合成 |
| 1.3 质粒构建 |
| 1.4蛋白质印迹分析 |
| 1.5 染色质免疫沉淀分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 去泛素化酶USP9X参与猪卵泡闭锁和卵泡颗粒细胞凋亡 |
| 2.2 USP9X通过SMAD4去泛素化增强SMAD4的表达 |
| 2.3 USP9X和SMAD4形成正反馈环路 |
| 2.4 LRH-1/CYP19A1轴是SMAD4-USP9X环路的潜在靶标 |
| 2.5 SMAD4通过与LRH-1启动子结合调节LRH-1/CYP19A1轴 |
| 2.6 LRH-1是USP9X的直接功能靶标 |
| 2.7 SMAD4-USP9X环路调控LRH-1/CYP19A1轴 |
| 2.8 USP9X和SMAD4拥有共同的调节miRNA |
| 2.9 miR-26b靶向SMAD4-USP9X环路 |
| 2.10 miR-26b通过SMAD4-USP9X环调节LRH-1/CYP19A1途径 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）海南湍蛙肽HN-1抗乳腺癌活性及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 癌症的治疗手段概述 |
| 1.1.1 传统癌症治疗手段 |
| 1.1.2 肿瘤的分子靶向治疗 |
| 1.1.3 肿瘤的免疫治疗现状 |
| 1.2 抗癌肽概述 |
| 1.2.1 抗癌肽的基本特征 |
| 1.2.2 抗癌肽的作用机制 |
| 1.2.3 抗癌肽的应用前景 |
| 1.2.4 抗癌肽药物研发所面临的挑战和解决方案 |
| 1.3 本文选题依据和研究内容 |
| 1.3.1 选题依据 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 HN-1的体内外抗肿瘤作用研究以及毒性的初步评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与材料 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 细胞 |
| 2.2.5 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HN-1的化学合成 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 体外抗癌活性和毒性检测 |
| 2.3.4 乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测 |
| 2.3.5 细胞集落形成实验 |
| 2.3.6 HN-1和阿霉素(adriamycin,ADR)联合用药实验 |
| 2.3.7 裸鼠MCF-7乳腺癌模型建立与HN-1治疗 |
| 2.3.8 内脏组织石蜡切片 |
| 2.3.9 苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 HN-1的体外抗肿瘤活性筛选 |
| 2.4.2 HN-1对阿霉素抗性MCF-7(MCF-7/ADR)细胞的毒性检测 |
| 2.4.3 HN-1与阿霉素(ADR)的联合用药检测 |
| 2.4.4 HN-1对接种MCF-7细胞荷瘤裸鼠的治疗作用 |
| 2.4.5 HN-1在体内的毒性初步评价 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 HN-1的抗肿瘤作用分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与材料 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 细胞 |
| 3.2.5 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 SEM观察细胞形态变化 |
| 3.3.3 HN-1的结构分析 |
| 3.3.4 Annexin V-FITC和PI双染实验 |
| 3.3.5 DAPI核染实验 |
| 3.3.6 TUNEL染色实验 |
| 3.3.7 线粒体膜电位(△Ψm)检测实验 |
| 3.3.8 caspase活性检测实验 |
| 3.3.9 细胞和肿瘤组织全蛋白提取 |
| 3.3.10 细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度定量 |
| 3.3.12 Western bloting |
| 3.3.13 siRNA和过表达质粒转染 |
| 3.3.14 裸鼠MCF-7乳腺癌模型建立与HN-1治疗 |
| 3.3.15 石蜡切片 |
| 3.3.16 免疫荧光实验 |
| 3.3.17 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 HN-1对MCF-7细胞形态的影响 |
| 3.4.2 HN-1的结构信息 |
| 3.4.3 HN-1对MCF-7细胞核形态的影响 |
| 3.4.4 HN-1诱导MCF-7细胞凋亡 |
| 3.4.5 HN-1诱导MCF-7细胞DNA片段化 |
| 3.4.6 HN-1破坏MCF-7细胞线粒体膜电位 |
| 3.4.7 HN-1激活Caspase非依赖性的凋亡通路 |
| 3.4.8 HN-1激活AIF的核转移 |
| 3.4.9 敲除MCF-7细胞中AIF对HN-1抗肿瘤作用的影响 |
| 3.4.10 HN-1激活裸鼠体内MCF-7移植瘤内的AIF核转移 |
| 3.4.11 HN-1改变Bcl-2家族蛋白的表达 |
| 3.4.12 敲除Bax和过表达Bcl-2对HN-1作用的影响 |
| 3.4.13 HN-1激活MCF-7细胞抑癌基因p53的表达 |
| 3.4.14 敲除p53对HN-1激活凋亡通路的影响 |
| 3.4.15 HN-1诱导MCF-7细胞中活性氧提升 |
| 3.4.16 HN-1激活MCF-7细胞中MAPK和NF-κB信号通路 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 HN-1的抗肿瘤免疫调节作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与试剂 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与材料 |
| 4.2.3 试剂配置 |
| 4.2.4 细胞 |
| 4.2.5 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT检测HN-1对4T1细胞的杀伤作用 |
| 4.3.3 细胞集落形成实验 |
| 4.3.4 体外细胞因子和趋化因子检测 |
| 4.3.5 Real-time quantitative PCR(RT-qPCR) |
| 4.3.6 体内细胞因子和趋化因子检测 |
| 4.3.7 BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型建立和HN-1治疗 |
| 4.3.8 血清中细胞因子和趋化因子的检测 |
| 4.3.9 脾脏中CD4+、CD8+T细胞亚群的测定 |
| 4.3.10 内脏和肿瘤组织石蜡切片 |
| 4.3.11内脏组织石蜡切片HE染色 |
| 4.3.12 肿瘤组织免疫组化 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 HN-1对4T1荷瘤BALB/c小鼠的治疗效果 |
| 4.4.2 HN-1对小鼠体内细胞因子和趋化因子的影响 |
| 4.4.3 HN-1对小鼠脾脏中CD4+和CD8+T细胞亚群数量的影响 |
| 4.4.4 HN-1对肿瘤浸润免疫细胞和血管新生的影响 |
| 4.4.5 HN-1对肿瘤转移和内脏结构的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 HN-1在荷瘤小鼠体内的药物分布初步检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与试剂 |
| 5.2.1 仪器 |
| 5.2.2 实验试剂与材料 |
| 5.2.3 试剂配置 |
| 5.2.4 细胞 |
| 5.2.5 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 FITC-HN-1的化学合成 |
| 5.3.2 FITC-HN-1在细胞中分布实验 |
| 5.3.3 BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型建立 |
| 5.3.4 FITC-HN-1在动物体内的实时分布实验 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 FITC-HN-1在MCF-7细胞中分布 |
| 5.4.2 FITC-HN-1在动物体内的实时分布 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
（6）CHOP过表达对肝癌细胞增殖和凋亡及对Cdc25C的影响（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文缩略词索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（7）NLRP3炎症小体介导小鼠心肺复苏后细胞焦亡的研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 NLRP3 炎症小体介导小鼠心肺复苏后细胞焦亡 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计分析 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 NLRP3 炎症小体在糖氧剥夺过程中介导U87 细胞焦亡 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间主要科研成果 |
| 致谢 |
（8）天然醌类化合物抗肺癌机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 醌类化合物的资源分布 |
| 2 研究现状 |
| 2.1 影响肺癌生长增殖, 诱导肺癌细胞凋亡或坏死 |
| 2.2 诱导自噬 |
| 2.3 抗血管生成, 抑制肺癌迁移和侵袭 |
| 2.4 醌类化合物增强其他药物的抗肺癌作用 |
| 3 讨论与展望 |
（9）蚂蟥冬眠期间生理适应性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 蚂蟥生物学研究进展 |
| 1.1 形态特征研究 |
| 1.2 生活习性研究 |
| 1.3 生殖繁育研究 |
| 1.4 生理研究进展 |
| 2. 动物冬眠研究进展 |
| 2.1 冬眠的定义 |
| 2.2 动物冬眠生理研究进展 |
| 2.2.1 动物冬眠能量代谢的研究 |
| 2.2.2 动物冬眠抗应激能力的研究 |
| 2.2.3 动物冬眠组织凋亡情况研究进展 |
| 2.3 动物冬眠分子机理的研究 |
| 3. 冬眠动物蛋白组学研究进展 |
| 3.1 蛋白质组学的概念 |
| 3.2 蛋白组学技术的研究进展 |
| 3.3 蛋白组学在动物冬眠研究应用研究进展 |
| 4. 本论文研究目的与意义 |
| 第二章 蚂蟥冬眠期间能量代谢变化研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和组织的获取 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 ADP、ATP、AMP含量测定 |
| 1.4 NAD(H)含量测定 |
| 1.5 能量代谢关键酶酶活性测定 |
| 1.6 能量代谢关键酶基因表达测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 ADP、ATP、AMP及能荷变化 |
| 2.2 NADH和NAD~+含量分析 |
| 2.3 能量代谢关键酶酶活力分析 |
| 2.4 能量代谢关键酶基因表达分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 腺苷酸和能荷变化 |
| 3.2 糖酵解途径 |
| 3.3 三羧酸循环 |
| 3.4 氧化磷酸化过程 |
| 3.5 NAD(H)含量 |
| 第三章 蚂蟥冬眠期间细胞保护机制的研究 |
| 第一节 蚂蟥冬眠期间抗氧化防御研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 抗氧化防御关键酶酶活性检测 |
| 1.4 NADP(H)含量及G6PDH活性测定 |
| 1.5 抗氧化防御关键酶基因表达测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 抗氧化防御关键酶酶活力测定 |
| 2.2 NADPH和NADP~+含量及G6PDH活性测定 |
| 2.3 抗氧化防御关键酶基因表达研究 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 蚂蟥冬眠期间细胞凋亡研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 Caspase 3和Caspase 8的活性测定 |
| 1.4 细胞凋亡相关基因表达测定 |
| 1.5 数据分析 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 Capase 3和Capase 8活性测定 |
| 2.2 细胞凋亡相关基因表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 进冬眠时期 |
| 3.2 深冬眠时期 |
| 3.3 出冬眠苏醒时期 |
| 第三节 蚂蟥冬眠期间热休克蛋白基因表达变化研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 热休克蛋白基因表达测定 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HSP27 mRNA表达分析 |
| 2.2 HSP60 mRNA表达分析 |
| 2.3 HSP70 mRNA表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 基于TMT技术的冬眠蚂蟥蛋白组学研究 |
| 第一节 基于TMT技术的冬眠蚂蟥差异蛋白组学研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 组织样品制备 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.3 蛋白提取 |
| 1.4 胰酶酶解 |
| 1.5 TMT标记 |
| 1.6 HPLC分级 |
| 1.7 液相色谱-质谱联用技术 |
| 1.8 生物信息学分析 |
| 1.9 基因表达验证 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 差异蛋白组学整体分析 |
| 2.2 差异蛋白的分类和功能分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 基于TMT技术的冬眠蚂蟥磷酸化蛋白组学研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 组织样品制备 |
| 1.2. 材料与试剂 |
| 1.3. 蛋白提取 |
| 1.4. 胰酶酶解 |
| 1.5 TMT标记 |
| 1.6. HPLC分级 |
| 1.7. 富集 |
| 1.8. 液相色谱-质谱联用技术 |
| 1.9 数据库搜索 |
| 1.10 生物信息学分析 |
| 1.11 相关酶活性检测 |
| 2. 结果与讨论 |
| 2.1 差异磷酸化蛋白组学整体分析 |
| 2.2 差异磷酸化蛋白的分类和功能分析 |
| 3 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 申请专利情况 |
| 致谢 |
（10）砷致细胞恶性转化过程中转录因子Nrf2对细胞凋亡的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 亚砷酸钠致细胞恶性转化过程中对凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 NaAsO_2致细胞恶性转化过程中细胞凋亡率的变化情况 |
| 2.2 NaAsO_2致细胞恶性转化过程中Caspase-3、Cleaved-caspase-3 蛋白的表达情况 |
| 2.3 NaAsO_2致细胞恶性转化过程中死亡受体凋亡通路中Caspase-8、Cleaved-caspase-8 蛋白的表达情况 |
| 2.4 NaAsO_2致细胞恶性转化过程中内质网凋亡通路中Caspase-12、Cleaved -caspase-12、CHOP蛋白的表达情况 |
| 2.5 NaAsO_2致细胞恶性转化过程中线粒体凋亡通路中Mcl-1、Bcl-2、Bax蛋白的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 转录因子Nrf2在NaAsO_2致细胞恶性转化中对细胞凋亡的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nrf2 siRNA转染T-HBE、T-HaCaT细胞后Nrf2蛋白的表达情况 |
| 2.2 Nrf2 siRNA转染T-HBE、T-HaCaT细胞后细胞凋亡率的表达情况 |
| 2.3 Nrf2 siRNA转染T-HBE、T-HaCaT细胞后H_2O_2水平的变化情况 |
| 2.4 Nrf2 siRNA转染T-HBE、T-HaCaT细胞后Caspase-3、Cleaved-caspase-3 蛋白的表达情况 |
| 2.5 Nrf2 siRNA转染T-HBE、T-HaCaT细胞后Caspase-8、Cleaved-caspase-8 蛋白的表达情况 |
| 2.6 Nrf2 siRNA沉默T-HBE、T-HaCaT细胞后Caspase-12、Cleaved-caspase-12、CHOP蛋白的表达情况 |
| 2.7 Nrf2 siRNA转染T-HBE、T-HaCaT细胞后Mcl-1、Bcl-2、Bax蛋白的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：细胞凋亡相关通路研究现状 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章及科研经历 |
| 致谢 |
四、AMID, an AIF homologous protein, induces caspases-independent apop-tosis（论文参考文献）
- [1]鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究[D]. 李文杰. 广西大学, 2021(01)
- [2]半夏泻心汤对APP/PS1双转基因小鼠海马神经元早期自噬影响[D]. 巩卓彦. 北京中医药大学, 2021(08)
- [3]基于TXNIP/NLRP3途径研究益气活血药对心梗后内质网应激诱发细胞焦亡的影响[D]. 王惠. 北京中医药大学, 2021(02)
- [4]SMAD4与SIVA1、USP9X互作调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制[D]. 李新宇. 南京农业大学, 2019
- [5]海南湍蛙肽HN-1抗乳腺癌活性及作用机制研究[D]. 乔雪. 大连理工大学, 2019(06)
- [6]CHOP过表达对肝癌细胞增殖和凋亡及对Cdc25C的影响[D]. 王栎雯. 广西医科大学, 2019(08)
- [7]NLRP3炎症小体介导小鼠心肺复苏后细胞焦亡的研究[D]. 谢吐秀. 武汉大学, 2019(06)
- [8]天然醌类化合物抗肺癌机制研究进展[J]. 仲海荣,邹纯朴,胥孜杭. 中国实验方剂学杂志, 2019(14)
- [9]蚂蟥冬眠期间生理适应性研究[D]. 王嘉. 南京农业大学, 2017(06)
- [10]砷致细胞恶性转化过程中转录因子Nrf2对细胞凋亡的作用[D]. 李春春. 苏州大学, 2017(05)