一、兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测（论文文献综述）
孔德生[1]（2015）在《不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定》文中研究指明兔出血症病毒（Rabbit Haemorrhagic Disease Virus,RHDV）隶属于嵌杯病毒科兔病毒属,是成年兔急性、烈性、高度接触性传染病,即兔病毒性出血症（Rabbit Haemorrhagic Disease,RHD）的病原体。2010年在法国的家兔和野兔中发现了一种新型的RHDV突变体,并命名为RHDV2。研究表明,RHDV1（传统的RHDV）和RHDV2有着不同的抗原性和遗传特性,系统进化树分析RHDV2为一个独立的分支,可能为兔病毒属的一个新的成员。在我国还没有对RHDV2的报道,加强对RHDV的病原学、流行病学、诊断方法和预防措施的综合性研究显得十分必要和紧迫。VP60蛋白是RHDV的主要衣壳蛋白,在机体诱导抗病毒感染的免疫反应中起着重要的作用,是RHDV的免疫保护性抗原。本实验首先设计引物扩增RHDV1 TP株（登录号:AF453761.1）的VP60序列,并克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达载体p ET-R1-VP60。合成Gen Bank中已发表RHDV2 10-32株（登录号:HE800532.1）的VP60序列并将其克隆至原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达载体p ET-R2-VP60。阳性质粒分别转化E.coli BL21 Star（DE3）p Lys S表达菌,经IPTG诱导后两种亚型的VP60重组蛋白p VP60-1和p VP60-2均得到大量表达。KCl染色后切胶纯化VP60重组蛋白,Western blot检测表达的p VP60-1和p VP60-2均具有良好的抗原性。将纯化的p VP60-1和p VP60-2分别与佐剂混合作为免疫原分别免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤融合技术将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。通过比对RHDV1和RHDV2的氨基酸序列,合成了6段差异性多肽。以p VP60-1和p VP60-2、合成的差异肽以及RHDV1 TP株作为检测抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌抗RHDV1及抗RHDV2单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞。通过有限稀释法进行3次亚克隆,共筛选到20株稳定分泌抗RHDV1的单抗株,其中有3株仅能识别RHDV1,分别命名为1D6、1H2、3F2;筛选到15株稳定分泌抗RHDV2的单抗株,其中有4株仅能识别RHDV2,分别命名为1G2、2C1、3B7、5D6。为了进一步鉴定这7株MAb的差异识别性,应用真核表达的VP60重组蛋白对7株MAb进行间接免疫荧光（IFA）和Western blot分析。首先采用体内诱生腹水法制备7株MAb的单克隆抗体。利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,将表达RHDV1 vp60基因的重组杆状病毒（Bac-R-VP60）和表达RHDV2 vp60基因的重组杆状病毒（Bac-R2-VP60）接种Sf9细胞,分别表达了s VP60-1蛋白和s VP60-2蛋白,对7株MAb进行IFA鉴定。以真核表达载体pc DNA3.1（+）为骨架构建pc DNA-R1-VP60和pc DNA-R2-VP60重组质粒,转染hela细胞分别表达了RHDV1型VP60蛋白e VP60-1蛋白和RHDV2型e VP60-2蛋白,对7株MAb进行Western blot和IFA鉴定。IFA和Western blot结果表明1D6、1H2和3F2单独识别RHDV1 VP60蛋白,其中1D6的抗原表位为256RWNGQ260,1H2和3F2的抗原表位相同均为312VLQFW316;1G2、2C1、3B7和5D6单独识别RHDV2 VP60蛋白,其中2C1的抗原表位为324ADNPIS329,1G2、3B7和5D6的抗原表位相同均为294AIDHD298（倾斜字体为不同亚型中表达差异的氨基酸）。将鉴定的抗原表位与NCBI发布的兔病毒属成员VP60蛋白的氨基酸序列比对分析的结果表明只针对RHDV1 VP60蛋白单抗的抗原表位同源性为98%,而只针对RHDV2 VP60蛋白单抗的抗原表位同源性为100%。以上结果表明筛选得到的差异识别单抗的差异识别性比较稳定,能够区分不同亚型的RHDV,为型特异性单抗。本研究通过杂交瘤融合技术制备了RHDV病毒型特异性单克隆抗体,并鉴定出了特异性单抗的抗原表位。型特异性单抗株的制备为RHDV的鉴别诊断建立奠定了基础,对RHDV的流行病学调查,遗传进化分析及防控具有重要的意义。
肖跃强[2]（2014）在《兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用》文中研究表明采用动物回归实验分离了4株RHDV毒株，命名为SQ-1、SQ-2、DB-1、BJ-1株，其中SQ-1株不能凝集人“O”型红细胞。克隆病毒VP60蛋白基因，核苷酸序列进化树分析显示，4毒株同属RHDVa变异群，其中SQ-2株位于RHDVa群进化树分支最底端，氨基酸序列进化树分析显示，SQ-2株病毒独立位于RHDVa进化树与原始毒株进化树分支之外，并位于最底端；序列同源性比对分析显示，SQ-1、SQ-2、DB-1、BJ-1株与其它毒株核苷酸序列同源性分别在89.5%-98.0%、91.4%-95.6%、90.2%-98.7%、89.7%-97.6%之间，氨基酸序列同源性分别在94.1%-99.3%、94.8%-96.5%、94.4%-99.5%、94.0%-99.3%之间；通过与血凝性、无血凝性毒株氨基酸序列分析比对发现，SQ-1株VP60蛋白第432、480位氨基酸残基可能对该毒株血凝特性产生一定影响；根据流行年代分析了RHDVa已经发生的变异流行趋势与未来可能的变异方向，304、305、414、425与432氨基酸位点已经演变，近期流行毒株开始出现13、237、299、309、324、346、348与351氨基酸位点变异；RHDVa与原始群毒株存在12个氨基酸残基差异及多个交互变异位点。根据已发表及本研究所克隆VP60蛋白的核苷酸序列，设计合成特异性引物，经反应条件的优化，建立了基于SYBR Green I荧光染料的RHDV Real-timeRT-PCR检测方法。通过敏感性、重复性、标准曲线建立等表明，该方法可检出的最低拷贝数为101，较普通RT-PCR敏感性高一个数量级。实际应用结果显示，Real-time RT-PCR方法检测阳性率为74.8%，而普通RT-PCR方法检测阳性率为65.5%。同时，建立了RT-LAMP检测方法，通过评价特异性、敏感性、检出时间以及临床应用等指标，证实该方法能够特异、敏感的检测RHDV感染，酶切扩增产物证实，该方法能够特异性的扩增；其敏感性高，可检出的拷贝数在102以上，而且临床检出阳性率较普通RT-PCR高；扩增反应可在30min内完成，缩短了检测耗时；动物攻毒试验证实，以上两种方法的检出阳性率均为100%。利用原核表达技术获得了RHDV重组截短的VP60蛋白，并以重组VP60蛋白为诊断抗原，建立了检测RHDV抗体的ELISA诊断方法，检测RHDV阳性血清的最低抗体效价高稀释比例为1:6400，并具有良好的特异性，批内、批间重复变异系数分别小于4.9%、6.9%，与血凝抑制试验（HI）的符合率为94.4%；检测河南、山东、河北等地采集的1710份兔血清样品，检测阳性率为81.5%。同样，利用原核表达体系表达VP60完整蛋白，纯化可溶性部分，利用胶体金标记技术，根据免疫层析原理，以胶体金标记的SPA（金黄色葡萄球菌蛋白A）作为探针，以纯化得到的VP60重组蛋白和纯化的兔IgG分别作为检测线和质控线的捕获试剂，研制并建立了RHDV抗体免疫胶体金快速检测方法。该方法特异性强，敏感性高，较血凝抑制方法高4倍；批间、批内重复均无差异性，临床应用显示，胶体金试纸条检测抗体阳性率为90.0%，而血凝抑制检测抗体阳性率为68.3%，大幅度提高了敏感性。综上，在分析4株RHDV分离毒株遗传变异趋势、进化来源与SQ-1株病毒丢失“O”型红细胞凝集特性诱因的同时，建立了RHDV抗原Real-time RT-PCR与RT-LAMP、抗体间接ELISA与免疫胶体金快速检测方法，通过与相应经典检测方法比对与临床应用，证明所建立的检测方法能够用于临床检测，具有良好的应用前景，为该病的防控提供了理论依据与技术保障。
肖跃强,张文倩,吴信明,管宇,苗立中,王艳,沈志强[3]（2012）在《无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达》文中认为分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒（RHDV）,命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta（DE3）中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株（RHDVa）,所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。
刘行波[4]（2012）在《表达兔出血症病毒VP60蛋白重组牛疱疹病毒的构建及免疫原性分析》文中提出牛疱疹病毒1型（Bovine hepervirus-1，BHV-1）为α疱疹病毒，基因组为135kb左右的双链DNA，像其它疱疹病毒一样，BHV-1基因组中有许多病毒复制非必需基因，可允许插入外源DNA，且BHV-1具有感染宿主范围小，弱毒株致弱背景明确的优点，是最有望成为构建多价牛传染病疫苗的理想载体，现已有很多外源病毒DNA成功地插入到了BHV-1基因组中。兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease RHD）1984年首先发现于中国，对家兔和野兔是一种急性致死性疾病。本病发病率致死率高给养兔业带来了极大损失。病原为兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus RHDV），为无囊膜小RNA病毒隶属于杯状病毒科兔病毒属。由于RHDV没有找到适合生长的细胞系，现在预防RHD只能免疫兔的肝脏灭活苗。因此通过将VP60蛋白在载体中表达做疫苗是取代灭活苗的理想方法。国内外研究人员大多数利用VP60做为免疫保护抗原研制基因工程疫苗。本研究目的在于构建表达兔出血症病毒（RHDV）主要结构蛋白VP60的牛疱疹病毒1型重组病毒并对其部分生物学特性和免疫原性进行分析。本实验成功建立了检测兔出血症病毒的荧光定量方法，采用两步法将VP60基因插入转移载体中构建成含有VP60基因表达盒的转移载体pGEM-gI-vp60-gEsn，转移载体和亲本病毒基因组在BL细胞上进行了同源重组收获重组病毒进行反向噬斑筛选获得纯化的重组病毒rBHV-1-VP60，经western blot、 IFA、PCR鉴定vp60基因正确重组进入牛疱疹病毒载体中去，获得了正确表达。通过小鼠免疫试验证明，重组病毒在小鼠体内能够诱导机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，病毒在小鼠心肝肺气管肌肉中增殖呈先升后降的趋势，与其它活载体疫苗在体内增值情况相同，病理切片显示心、肝、脾、肺、肾、无病理变化证明本重组病毒对小鼠是安全的。为下一步兔体免疫保护实验积累材料和数据。
穆亚芳[5]（2011）在《兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定》文中研究指明兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的危害3月龄以上青年兔和成年兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病。该病于1984年在中国首次报道后,在世界各地相继发生。迄今,RHD已成为兔的一种毁灭性传染病,给养兔业带来了巨大的经济损失。从1984年RHD首次报道至今,关于RHDV的研究已经取得了很大的发展,但国内外的研究学者至今仍未发现一株能进行RHDV稳定繁殖的细胞系,故而就缺少一个可以从分子水平研究病毒的技术平台,这严重阻滞了对RHDV的研究,因此,RHDV致病的分子机理至今仍不十分清楚。在RHD的发生发展过程中,肝脏是病毒增殖的主要器官。临床病理解剖中肝脏的病理变化最为严重,并且在RHDV大量制备纯化的方案中,病死兔的肝脏往往是病毒的重要来源,研究者直接取肝脏匀浆后提取病毒,所以从肝脏细胞出发,寻找与RHDV相互作用的细胞表面蛋白具有重要意义,现已有研究证实RHDV可感染原代兔肝脏细胞。VP60是RHDV的主要衣壳蛋白,研究表明VP60蛋白与RHDV的致病性和免疫原性有着密切关系,故研究能与VP60蛋白相互作用的兔肝细胞表面蛋白,对了解RHDV致病的分子机制以及RHD的防控具有重要意义。本研究拟采用SMART技术,将兔肝脏cDNA定向克隆到pEXP-Lib载体中,构建兔肝脏细胞的真核表达文库。采用表达克隆法筛选文库,以纯化的VP60为诱饵蛋白,从真核表达文库中筛选能与VP60蛋白发生相互作用的蛋白。通过免疫共沉淀试验、血凝抑制试验,体外验证蛋白之间的相互作用;借助激光共聚焦试验技术证明蛋白在细胞内的共定位。实验结果表明,兔肝脏细胞真核表达文库的鉴定结果显示插入片段分布在0.3 kb 2.0kb之间,重组率约为86%,表明获得了高质量的兔肝脏细胞真核表达文库。筛选结果显示有26个EST片段与兔功能基因有较高的同源性,序列分析以及对蛋白的功能性分析,膜突蛋白（Moesin）可与VP60发生相互作用,故对Moesin进行进一步的相互作用验证以及功能性研究。以兔肝脏cDNA为模板,扩增Moesin部分片段基因688nt2157nt,分别连接到载体pET-30a和pEGFP-N1上,构建Moesin的原核表达载体pET-30a-Msn和真核表达载体pEGFP-N1-Msn。将pET-30a-Msn重组表达载体转化E.coli感受态细胞,诱导表达并纯化获得可溶性Moesin蛋白,通过免疫共沉淀试验和血凝抑制试验验证Moesin与VP60的相互作用。同时,将pEGFP-N1-Msn与pcDNA3.1-VP60重组表达载体共转染HEK293T细胞,采用激光共聚焦试验技术对Moesin与VP60在细胞内的共定位进行分析,证明了Moesin与VP60在哺乳动物细胞内能够通过相互作用达到共定位。本研究通过表达克隆法从兔肝细胞真核表达文库中筛选到Moesin基因,并在体外成功表达了Moesin部分片段基因,证明了其与RHDV VP60蛋白之间存在相互作用,为RHDV致病机理的研究奠定了基础。
田浪[6]（2009）在《禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究》文中提出禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位（主要是中和抗原表位）和T细胞表位（主要是CTL抗原表位）,同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7（S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA）。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5’端引入Kozak序列,3’端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a（+）,转化E.coli Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗（HRP标记兔抗鸡IgG）最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高（血清稀释度可达1∶300）、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。4、采用本课题组获得专利（专利授权号为200410081443.4）的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价,二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率;同时对pVAX1-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d,与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显着（P＜0.05）。ELISA抗体效价结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d,与pcDNA-F疫苗组相比差异均显着（P＜0.05）。攻毒结果表明,pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80%、80%和75%,前两者优于常规灭活疫苗（75%）。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85%、90%和85%,表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-1β和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示,pVAX1-F免疫接种后24h,在血液和所有检测的组织中检测到质粒,免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗,研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫,免疫鸡攻毒保护率为80%,高于常规IBV灭活疫苗（75%）;与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90%;该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好,未检测到与宿主基因组整合的现象。本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究,在国内外未见报道,该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。
杨龙圣[7]（2008）在《幼兔病毒性出血症免疫失败原因及防制措施的研究》文中提出兔出血症是家兔的一种烈性传染病,以发病急、传播速度快、死亡率高为特点,并主要感染3月龄以上成年兔,曾给养兔业造成巨大的经济损失。几年以前,通过疫苗注射可较好地控制本病。但是近年来,3月龄以下、甚至2月龄以下幼兔时有发病,给该病的防控提出了新问题。究竟是抗原变异的原因还是免疫程序的问题需要进一步研究。本研究首先对华东三省RHD的病原进行了分子流行病学调查,对三个分离毒株的基因序列、致病性和免疫原性进行了比较,研究了幼兔出血症的免疫程序,并探讨了中药佐剂对疫苗的免疫增强作用和作用机理。本研究的目的,旨在寻找理想的免疫程序和疫苗佐剂,为幼兔出血症的防控提供理论依据。具体内容为以下五个部分:试验Ⅰ、华东三省RHDV的分子流行病学调查为了弄清兔出血症病毒的流行规律,从2005年到2007年对山东、江苏、安徽三个养兔大省的家兔的带毒情况进行了调查。首先建立了RHDV RT-PCR检测方法,按照GenBank上公布的RHDV基因序列设计一对引物,以RHDV发病兔的新鲜兔肝为材料,提取总RNA,进行cDNA的合成和PCR扩增,对扩增产物进行克隆测序,扩增出与预期的269bp大小一致的片段,该产物序列与公布的RHDV基因序列有95.8%～98.5%的同源性。然后对RT-PCR方法的敏感性、特异性和RHDV的脏器分布进行试验。结果表明,RT-PCR方法的敏感性是HA的1×104倍,对RHD发病死亡兔,能从除粪便以外的各种脏器中检测到病毒。运用建立的RT-PCR方法对采集的不同日龄段的兔鼻拭样品和出入境兔肉产品进行检测,同时选择数个分离毒株进行测序和序列比较。结果,400份出入境兔肉产品中没有发现阳性样品,512份鼻拭子中有48份阳性样品,表明兔出血症病毒在华东三省广泛存在,不同日龄段兔之间的带毒率存在显着性差异;而不同年份、不同省份兔之间带毒率差异不显着;序列比较结果发现三株不同序列,其与Genbank上已公布序列的同源性为93.7%～99.6%。试验Ⅱ、幼兔RHDV三个分离株的基因序列、致病性和免疫原性比较为了研究幼兔RHDV与疫苗株RHDV的区别,应用RT-PCR技术对幼兔RHDV的3个分离株（HN、SH、DY株）和疫苗对照FY株进行RT-PCR扩增,同时进行VP60序列测定、序列比对和蛋白质同源性分析;用4个毒株对兔只进行攻毒,记录死亡时间和死亡率,比较致病性差异;用4个毒株制成疫苗,免疫家兔,比较其免疫原性。结果,3个分离株的基因序列同源性为95.2%～97.4%,氨基酸同源性为95.8%～99.3%;4个毒株的致死率、致病病程和病毒血凝性没有显着性差异;4个疫苗免疫后产生的抗体为同一血清型,各个疫苗均可以抵抗其它毒株的攻击,表明幼兔RHDV的3个分离株与疫苗株之间的免疫原性无显着差异。试验Ⅲ、免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平产生的影响试验1通过攻毒实验比较了新西兰家兔0、1、2、3和4log2 5种抗体水平对的病毒性出血症（RHD）的保护效果,结果表明,抗体效价高于3 log2时可产生100%的保护,2 log2的保护率仅为50%。试验2测定了30、35、40、45、50、55和60日龄非免疫兔的母源抗体效价和用RHD组织灭活苗免疫后8周内血清抗体效价的动态变化,结果发现,母源抗体与日龄呈负相关,在30日龄时最高,可以产生有效的保护,在40日龄后已无保护作用;免疫日龄与抗体峰值和有效保护时间呈正相关,30日龄免疫,抗体效价不但不升、反而显着下降,无保护作用;35日龄免疫,抗体峰值较低,有效保护时间仅为2周;大于40日龄免疫,抗体峰值较高,有效保护时间延长。试验Ⅳ、幼兔出血症免疫程序的研究试验1选择35、40、45三种日龄新西兰家兔各30只,每个日龄兔随机均分为5组,对照组注射生理盐水,4个试验组分别注射4种剂量（1mL、2mL、3mL、4mL）的兔病毒性出血症疫苗,对照组注射生理盐水,分别于免疫前及免疫后1～7周内采血测定血清抗体效价的动态变化。结果表明,各日龄兔的2mL、3 mL、4 mL剂量组的抗体上升速度和有效抗体维持时间均显着大于同日龄的1 mL剂量组;35日龄兔的2 mL、3 mL、4 mL剂量组的抗体峰值显着高于1 mL剂量组。35日龄一次性注射疫苗2mL,其抗体效价在多数时间点显着高于二次注射1mL疫苗的抗体效价。试验2比较两种免疫程序的免疫效果,结果表明,1次性免疫2mL组的抗体水平在大多数时间点显着高于两次免疫1mL组。以上结果提示35日龄免疫、注射剂量2 mL为最佳免疫程序。试验Ⅴ、中药佐剂对RHD疫苗的免疫增强作用为了增强兔出血症疫苗的免疫效果,选择4中药成分（黄芪多糖,淫羊藿多糖,蜂胶黄酮,人参皂甙）组成2个复方,分别与兔出血症疫苗混合后免疫幼兔,以铝胶苗和无佐剂苗为对照,分别于免疫后7、14、21、28、35、49天采血,用微量血凝法测定血清抗体的动态变化,用MTT法测定外周血T、B淋巴细胞转化的动态变化;于免疫后63天测定免疫器官指数并进行攻毒试验。结果表明,复方1在部分时间点能显着提高血清抗体效价,复方2在多数时间点能显着提高血清抗体效价;两个复方在第7天显着促进T淋巴细胞转化,在第7～21天显着促进B淋巴细胞转化;两个复方显着增大圆小囊、肠淋巴结器官指数,提高保护率。试验Ⅵ、中药佐剂对淋巴细胞的转化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响为了进一步证实两个中药成分复方佐剂的免疫增强作用,并探讨其作用机理,比较了两个复方对培养的兔外周血淋巴细胞增殖的作用,运用荧光定量RT-PCR方法比较了两个复方对兔外周血淋巴细胞IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响。结果表明,两个中药成分复方在一定的浓度下可以显着促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-10 mRNA的表达。这可能是两个中药佐剂增强免疫的机理之一。
马海利[8]（2008）在《O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫》文中研究指明在分析FMDV抗原表位和免疫特性的基础上,结合FMD的流行特点,设计了O型FMDV复合表位与CTB的融合基因CTB-Th2-VP1和CTB-VP1-2A-Epi,将其克隆入表达载体pGEX-6P-1,在BL21中获得诱导表达,表达的融合蛋白以包涵体形式存在,具有O型FMDV和CTB双重反应原性。融合蛋白复性后具有CTB的生物活性,腹腔接种小鼠后可诱导产生特异性的体液、细胞和黏膜免疫,其中CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白产生的免疫水平高于或接近灭活疫苗。将CTB-VP1-2A-Epi融合基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体pBC38C中,构建了CTB-VP1-2A-Epi重组枯草芽孢杆菌,免疫小鼠可产生O型FMDV特异性的细胞免疫和黏膜免疫。将重组枯草芽孢杆菌与重组鸡痘病毒vUTAL3CP1、核酸疫苗pIRES3CP1及O型FMDV灭活苗以不同的组合方式联合免疫小鼠。结果显示,重组枯草芽孢杆菌能够增强这三种疫苗的免疫效果,其中以核酸疫苗首免、重组鸡痘病毒加强免疫,结合重组枯草芽孢杆菌灌服的免疫策略的免疫效果最佳,可诱导机体产生较高水平的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。研究结果表明设计和表达的CTB-VP1-2A-Epi融合蛋白具有良好的FMDV免疫原性和CTB佐剂作用,为研制和使用新型、高效的FMD基因工程疫苗奠定基础。
宁玲忠[9]（2007）在《兔瘟病理学研究》文中研究指明本实验通过感染兔瘟Y8504毒株后发病的死亡兔,进行解剖后,了解病毒对各系统的损害及各脏器的临床病理变化,对其脑、心脏、肺脏、胰、肾脏、肾上腺、胃、肠等组织切片的病理学变化进行了观察。结果表明,病毒影响血液的凝固性,造成全身多个脏器严重出血而发生缺氧和广泛性坏死,最终导致各器官急性功能衰竭而死亡。观察了47例实验感染急性兔瘟神经系统病理组织学变化,均出现不同程度的病变。中枢神经系统最常见的变化是脑脊髓不同程度的淤血、血停滞、微血栓形成以及脑实质小灶状出血,少数病例出现神经细胞变性、胶质细胞“卫星”现象、以及微坏死灶。外周神经的病变表现为较轻的脱髓鞘现象。这些变化都是非特定性的,可认为是血液循环障碍导致的组织缺氧和营养不良。极少数病例中发生的淋巴细胞型脑膜脑炎应属于病毒感染的结果。弥散性血管内凝血（DIC）由兔瘟病毒直接损伤器官及血管壁所致。组织学证实DIC占63%,DIC的主要分布部位,在肾小体和皮质部间质,肺泡壁,心肌间质,肾上腺皮质部,肝静脉窦。出现DIC的器官比无DIC者,其病变加重,同时伴发出血。这提示DIC在加重急性兔瘟发病过程中有重要作用,它们导致肾上腺、肺和肾出血是本病的重要致死原因之一。应用特异性强、敏感性高、简单方便的套式PCR技术检测RHDV以快速确诊兔瘟,根据GenBank登录的兔瘟病毒的VP60基因序列,设计了2对引物,建立了检测兔瘟病毒的套式PCR检测方法。先用外引物扩增一段389 bp的DNA片断,继而用内引物以扩增产物为模板进行第2次扩增（即套式PCR）,提高了结果的准确性,避免一次性PCR的假阳性结果。对12份RHD样本进行检测,确诊率为100%。
李传山,杨颖,张守涛,杨增岐,郭蔼光[10]（2007）在《兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白（VP60）基因的克隆和生物信息学分析》文中研究指明应用RT-PCR方法从兔出血症病毒（RHDV）西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册（登录号为DQ530363）。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区（西北、华东、东北、西南）的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。
二、兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测（论文提纲范文）
（1）不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 兔出血症概述 |
| 1.1.1 病毒学分类与形态结构 |
| 1.1.2 RHDV的基因组研究 |
| 1.1.3 RHDV主要结构蛋白VP60的研究 |
| 1.1.4 流行病学 |
| 1.1.5 临床症状和病理变化 |
| 1.1.6 RHDV的变异与进化 |
| 1.1.7 RHDV诊断及防控 |
| 1.2 RHDV VP60表位研究进展 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 RHDV不同亚型VP60蛋白的原核表达和抗原性检测 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、感受态细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液和培养基的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 序列比对 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 RHDV VP60基因的扩增 |
| 2.2.4 VP60蛋白原核表达载体的构建 |
| 2.2.5 VP60蛋白的原核表达以及SDS-PAGE分析 |
| 2.2.6 原核表达VP60蛋白的切胶纯化 |
| 2.2.7 原核表达VP60蛋白的抗原性鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 序列比对 |
| 2.3.2 RHDV VP60基因的扩增 |
| 2.3.3 原核重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.3.4 原核表达VP60蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 不同亚型RHDV VP60蛋白的真核表达和抗原性检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体、感受态细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液和培养基的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 RHDV VP60基因的扩增 |
| 3.2.3 VP60蛋白真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 转染 |
| 3.2.5 VP60蛋白的真核表达及抗原性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RHDV VP60基因的扩增 |
| 3.3.2 真核重组质粒的PCR及双酶切鉴定 |
| 3.3.3 真核表达VP60蛋白的IFA检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 不同亚型RHDV VP60蛋白在昆虫杆状病毒中的表达和抗原性检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 载体、病毒、感受态细胞 |
| 4.1.2 主要试剂和主要仪器 |
| 4.1.3 主要溶液和培养基的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 RHDV2 VP60基因的扩增 |
| 4.2.3 重组转移载体的构建 |
| 4.2.4 重组杆粒的构建及鉴定 |
| 4.2.5 重组杆状病毒的获得和扩增 |
| 4.2.6 重组杆状病毒VP60蛋白的表达及抗原性鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RHDV2 VP60基因的扩增 |
| 4.3.2 真核重组质粒的PCR及双酶切鉴定 |
| 4.3.3 重组杆粒的PCR鉴定 |
| 4.3.4 重组杆状病毒的获得 |
| 4.3.5 昆虫杆状病毒系统表达VP60蛋白的IFA检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 不同亚型RHDV VP60蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞和病毒 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 主要溶液和培养基的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 动物免疫 |
| 5.2.2 小鼠免疫血清效价的测定 |
| 5.2.3 细胞融合 |
| 5.2.4 不用亚型RHDV阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞的亚克隆，冻存和复苏 |
| 5.2.6 杂交瘤细胞腹水的制备 |
| 5.2.7 不同亚型RHDV MAb的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 杂交瘤细胞株识别RHDV亚型的鉴定 |
| 5.3.2 不同亚型RHDV MAb的Western blot鉴定 |
| 5.3.3 不同亚型RHDV MAb的亚类鉴定 |
| 5.3.4 不同亚型RHDV MAb的IFA鉴定 |
| 5.3.5 不同亚型RHDV MAb腹水效价的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 不同亚型RHDV VP60蛋白抗原表位的鉴定 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 RHDV1亚型MAb的表位鉴定 |
| 6.2.2 RHDV2亚型MAb的抗原表位鉴定 |
| 6.2.3 不同亚型RHDV MAb抗原表位保守性分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 RHDV1亚型MAb的表位鉴定 |
| 6.3.2 RHDV2亚型MAb的表位鉴定 |
| 6.3.3 不同亚型RHDV MAb抗原表位保守性分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 兔出血症研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 第2章 RHDV 分子生物学、遗传生态学研究进展 |
| 2.1 RHDV 分子生物学 |
| 2.2 病毒生命周期 |
| 2.3 机体抵抗 RHD 的机制 |
| 2.4 遗传多样性/ RHDV 的进化 |
| 2.5 病毒与宿主共进化 |
| 2.6 防控与免疫 |
| 2.7 展望 |
| 第3章 兔出血症抗原抗体检测方法研究进展 |
| 3.1 血凝(HA)、血凝抑制(HI) |
| 3.2 间接血凝(IHA)、间接血凝抑制(IHI) |
| 3.3 免疫琼脂扩散试验（ID） |
| 3.4 对流免疫电泳 |
| 3.5 中和试验 |
| 3.6 免疫荧光技术 |
| 3.7 SPA 菌体免疫扫描电镜法 |
| 3.8 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 3.9 免疫电镜捕获双装饰法 |
| 3.10 实时荧光定量 RT-PCR 方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 RHDV 的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 RHDV Real-time RT-PCR检测方法的建立与应用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 RHDV RT-LAMP 快速检测方法的建立与应用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 RHDV 抗体检测间接 ELISA方法的建立与应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 RHDV 抗体检测胶体金免疫层析方法的建立与应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株和抗体 |
| 1.2 主要工具酶与试剂 |
| 1.3 RT-PCR引物的设计与合成 |
| 1.4 病毒的分离与鉴定 |
| 1.5 RHDV VP60基因的克隆 |
| 1.6 VP60基因的测序与序列分析 |
| 1.7 VP60蛋白原核表达载体的构建 |
| 1.8 VP60蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 1.9 VP60蛋白可溶性表达产物的纯化 |
| 1.10 表达产物的Western-blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 VP60基因的克隆 |
| 2.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.4 VP60基因的测序与分析 |
| 2.5 VP60蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.6 表达产物的Western-blot分析 |
| 3 讨论 |
（4）表达兔出血症病毒VP60蛋白重组牛疱疹病毒的构建及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 兽用基因工程疫苗的研究概况 |
| 1.2 牛疱疹病毒 I 型（Bovine Herpes virus-1)活载体疫苗的研究进展 |
| 1.3 兔出血症病毒概述 |
| 1.4 荧光定量技术概述 |
| 第二章 检测兔出血症病毒荧光定量方法的建立 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 表达兔出血症病毒 VP60 基因重组牛疱疹病毒构建及在小鼠体内免疫原性分析 |
| 3.1 材料、方法 |
| 3.2 重组病毒在小鼠体内免疫原性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 概况 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病毒学分类与结构特性 |
| 1.2.2 理化特性 |
| 1.2.3 基因组结构 |
| 1.2.4 基因编码蛋白及功能研究 |
| 1.3 临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 流行病学特性 |
| 1.5 诊断方法 |
| 1.5.1 电镜观察法 |
| 1.5.2 血凝和血凝抑制试验 |
| 1.5.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.4 反转录-聚合酶链式反应 |
| 1.6 防控 |
| 1.7 蛋白与蛋白相互作用研究的相关技术 |
| 1.7.1 酵母双杂交系统 |
| 1.7.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.7.3 噬菌体展示技术 |
| 1.7.4 串联亲和纯化技术 |
| 1.8 膜突蛋白的研究进展 |
| 1.9 兔出血症病毒相互作用蛋白的研究进展 |
| 1.10 本研究的目的及意义 |
| 第二章 兔肝脏CDNA 文库中VP60 相互作用蛋白的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 兔肝脏总RNA 的提取 |
| 2.1.6 兔肝脏cDNA 真核表达文库的构建 |
| 2.1.7 兔肝脏cDNA 真核表达文库的质量鉴定 |
| 2.1.8 转染用cDNA 文库重组质粒的制备 |
| 2.1.9 SP2/0 细胞的嘌呤霉素MLD 的测定 |
| 2.1.10 兔肝脏cDNA 文库重组质粒转染细胞试验 |
| 2.1.11 细胞筛选试验 |
| 2.1.12 重组质粒特异表达序列的鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 兔肝脏总RNA 的含量及纯度 |
| 2.2.2 ds cDNA 的鉴定 |
| 2.2.3 文库质量的鉴定 |
| 2.2.4 SP2/0 细胞的嘌呤霉素最小致死浓度的测定 |
| 2.2.5 筛选的阳性SP2/0 细胞中重组表达质粒的PCR 鉴定 |
| 2.2.6 重组表达质粒的序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 兔肝脏cDNA 真核表达文库的构建 |
| 2.3.2 兔肝脏cDNA 真核表达文库的筛选 |
| 第三章 VP60 与膜突蛋白相互作用的验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒、菌株、质粒、抗体、细胞 |
| 3.1.2 试剂与药品 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 Moesin 部分片段基因的克隆与表达 |
| 3.1.5 RHDV 的纯化 |
| 3.1.6 VP60 与Moesin 相互作用的免疫共沉淀验证 |
| 3.1.7 VP60 与Moesin 相互作用的血凝抑制试验验证 |
| 3.1.8 VP60 与Moesin 相互作用的细胞内共定位验证 |
| 3.1.9 Moesin 介导RHDV 进入细胞的初步探索 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Moesin 部分片段基因的克隆 |
| 3.2.2 Moesin 部分片段基因的表达与纯化 |
| 3.2.3 RHDV 的纯化 |
| 3.2.4 VP60 与Moesin 相互作用的免疫共沉淀验证结果 |
| 3.2.5 VP60 与Moesin 相互作用的血凝抑制试验验证结果 |
| 3.2.6 Moesin 真核表达载体的构建 |
| 3.2.7 VP60 真核表达载体的构建 |
| 3.2.8 VP60 在 HEK293T 细胞内表达的 IFA 分析结果 |
| 3.2.9 VP60 在 HEK293T 细胞内表达 Western blot 分析结果 |
| 3.2.10 激光共聚焦显微镜观察 VP60 与 Moesin 的细胞内共定位结果 |
| 3.2.11 Moesin 介导 RHDV 进入细胞的初步探索结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 Moesin 部分片段基因的克隆与表达 |
| 3.3.2 VP60 与 Moesin 相互作用的验证 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 附录 Ⅲ |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 选题背景 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 3.多表位DNA疫苗的研究概况 |
| 4.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 5.细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 本研究前期工作基础 |
| 存在的问题 |
| 本研究的内容及目的意义 |
| 本研究的技术路线 |
| 第一章 禽传染性支气管炎病毒S1、S2、N蛋白抗原表位预测筛选及多表位嵌合基因克隆 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 数据库、生物信息学软件 |
| 2.1.2 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.3 工具酶及试剂及主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的预测分析 |
| 2.2.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的确定 |
| 2.2.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因的获取 |
| 2.2.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接 |
| 2.2.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的克隆及鉴定 |
| 2.2.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV S1、S2、N蛋白B细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.2 IBV S1、S2、N蛋白T细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因片段的选择及合成 |
| 3.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接结果 |
| 3.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的鉴定结果 |
| 3.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的结构特征分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于IBV的免疫机理 |
| 4.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的分析及选择 |
| 4.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位的获取及嵌合基因的拼接 |
| 4.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的构建策略 |
| 4.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学特征 |
| 5.小结 |
| 第二章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因原核表达及ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 IBV多表位嵌合基因的原核诱导表达 |
| 2.2.3 IBV多表位嵌合基因原核表达产物的鉴定 |
| 2.2.4 IBV多表位嵌合基因原核表达条件的优化 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体pET-32a-F的鉴定 |
| 3.2 IBV多表位嵌合基因表达产物的SDS-PAGE及Western blots |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因原核表达诱导时间、浓度、温度的筛选 |
| 3.4 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布及纯化 |
| 3.5 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 4.讨论 |
| 4.1 IBV多表位嵌合蛋白的表达系统 |
| 4.2 IBV多表位嵌合蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 IBV多表位嵌合蛋白的回收及活性 |
| 4.4 关于IBV多表位嵌合蛋白的间接ELISA方法 |
| 5.小结 |
| 第三章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗构建及真核表达检测 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 鸡白介素IL-1β/2/18真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒的鉴定 |
| 3.2 pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-18质粒的鉴定 |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因及鸡白介素真核表达转录产物RT-PCR检测 |
| 3.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒表达产物的间接免疫荧光检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于多表位DNA疫苗 |
| 4.2 不同载体于体外表达IBV多表位嵌合基因 |
| 4.3 关于IBV多表位嵌合基因真核表达质粒的体外转染 |
| 4.4 影响外源基因表达的因素 |
| 4.5 IBV结构蛋白多表位嵌合基因的体外表达的检测 |
| 5.小结 |
| 第四章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗配制和免疫研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备、转染效率的检测 |
| 2.2.3 DNA疫苗的配制 |
| 2.2.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F、pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗免疫组的攻毒保护性实验 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.2 脂质体的转染效率检测 |
| 3.3 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.3.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.4 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.4.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.5 攻毒实验结果 |
| 3.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 DNA疫苗的配制和免疫 |
| 4.2 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.3 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.4 关于攻毒保护性试验 |
| 4.5 关于DNA疫苗的分布和整合可能性 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展 |
| 3.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 4.多表位疫苗的研究概况 |
| 5.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 6.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 |
| 7.DNA疫苗的组织分布 |
| 8.DNA疫苗的整合可能性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:英汉缩略名词对照表 |
| 在读博士期间发表的论文情况 |
（7）幼兔病毒性出血症免疫失败原因及防制措施的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 文献综述 |
| 第一章 兔出血症研究进展 |
| 1 兔出血症的病原 |
| 1.1 病毒的分类 |
| 1.2 病毒的生物学特性 |
| 1.3 病毒的致病力 |
| 2 兔出血症的诊断 |
| 2.1 病理学检查 |
| 2.2 电镜检查 |
| 2.3 红细胞凝集试验 |
| 2.4 间接血凝试验(IHA) |
| 2.5 免疫学方法 |
| 2.6 核酸检测 |
| 2.7 其它方法 |
| 3 兔出血症的防控 |
| 3.1 组织灭活苗 |
| 3.2 细胞培养疫苗 |
| 3.3 基因工程苗 |
| 3.4 免疫程序 |
| 参考文献 |
| 第二章 兔出血症疫苗佐剂和中药佐剂的研究进展 |
| 1 免疫佐剂的分类 |
| 2 兔出血症疫苗的常用佐剂 |
| 2.1 铝盐佐剂和油佐剂 |
| 2.2 中药类免疫增强剂 |
| 2.3 囊素类免疫增强剂 |
| 2.4 其它类免疫增强剂 |
| 3 中药佐剂的研究进展 |
| 3.1 多糖 |
| 3.2 皂甙 |
| 3.3 黄酮 |
| 参考文献 |
| 第三章 本研究的选题和目的意义 |
| 1 幼兔出血症免疫程序研究的迫切性 |
| 2 中药作为免疫佐剂的可能性 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 试验研究 |
| 第四章 华东三省RHDV的分子流行病学调查 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 RT-PCR方法的建立 |
| 1.4 流行病学调查 |
| 1.5 数据分析 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 RT-PCR方法的建立 |
| 2.2 兔肉产品的检测 |
| 2.3 兔鼻拭子样品的阳性检出率 |
| 2.4 分离三株毒株的分子流行病学 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于兔出血症病毒(RHDV)在华东三省的分子流行病学调查分析 |
| 3.2 RT-PCR方法的建立 |
| 参考文献 |
| 第五章 幼兔RHDV三个分离株的基因序列、致病性和免疫原性比较 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试剂配置 |
| 1.4 病毒的处理 |
| 1.5 疫苗的制备 |
| 1.6 病毒RNA的提取 |
| 1.7 RHDV VP60基因序列的比较 |
| 1.8 分离毒株的致病性比较 |
| 1.9 分离毒株的免疫原性试验 |
| 1.10 血清交叉血凝试验 |
| 1.11 数据处理 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 测序结果 |
| 2.3 核苷酸和氨基酸同源性比较 |
| 2.4 各毒株之间的遗传进化树 |
| 2.5 分离毒株的致病性比较 |
| 2.6 分离毒株的免疫原性比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 幼兔出血症发病状况 |
| 3.2 分离毒株的基因序列和氨基酸序列比较 |
| 3.3 分离毒株的致病性比较 |
| 3.4 分离毒株的免疫原性比较 |
| 参考文献 |
| 第六章 免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平产生的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 攻毒试验 |
| 1.3 不同日龄兔母源抗体水平的测定 |
| 1.4 不同日龄兔免疫试验 |
| 1.5 抗体效价测定方法 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 不同抗体效价水平的保护效果 |
| 2.2 不同日龄兔母源抗体效价的动态变化 |
| 2.3 不同日龄兔免疫后抗体效价的动态变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 抗体效价与保护率的关系 |
| 3.2 母源抗体的动态变化 |
| 3.3 免疫日龄对抗体峰值和有效保护时间的影响 |
| 参考文献 |
| 第七章 幼兔出血症(RHD)免疫程序的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 不同免疫剂量和日龄免疫试验 |
| 1.3 免疫程序比较试验 |
| 1.4 抗体效价测定方法 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 35日龄兔不同剂量组抗体效价的变化 |
| 2.2 40日龄兔不同剂量组抗体效价的变化 |
| 2.3 45日龄兔不同剂量组抗体效价的变化 |
| 2.4 不同免疫程序的抗体效价比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 免疫剂量和免疫日龄对抗体效价的影响 |
| 3.2 不同免疫程序对抗体效价产生的影响 |
| 参考文献 |
| 第八章 中药佐剂对RHD疫苗的免疫增强作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 中药佐剂、疫苗和试剂 |
| 1.2 动物及分组处理 |
| 1.3 淋巴细胞转化试验 |
| 1.4 抗体效价测定方法 |
| 1.5 免疫器官指数的测定 |
| 1.6 数据处理 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.2 血清抗体效价的动态变化 |
| 2.3 免疫器官指数的变化 |
| 2.4 攻毒保护效果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中药佐剂对淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.2 中药佐剂对抗体效价的影响 |
| 3.3 中药佐剂对免疫器官指数的影响 |
| 3.4 关于半量抗原中药佐剂的免疫效果 |
| 参考文献 |
| 第九章 中药佐剂对兔淋巴细胞转化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 中药佐剂、试剂和仪器 |
| 1.2 试剂配置 |
| 1.3 淋巴细胞增殖的测定 |
| 1.4 Real-time PCR检测IFN-γ、IL-10 mRNA方法的建立 |
| 1.5 IFN-γ、IL-10 mRNA表达的测定 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 淋巴细胞增殖的变化 |
| 2.2 Real time PCR检测IFN-γ、IL-10 mRNA方法的建立 |
| 2.3 淋巴细胞IFN-γ、IL-10 mRNA表达的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 中药佐剂对体外淋巴细胞增殖的影响 |
| 3.2 中药佐剂对细胞因子mRNA的影响 |
| 3.3 关于荧光定量RT-PCR检测方法 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文目录 |
（8）O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 动物新型疫苗研究进展 |
| 1 现代分子生物学技术与新型疫苗研究 |
| 2 新型免疫原与疫苗 |
| 3 载体与疫苗 |
| 4 结语 |
| 第二章 霍乱毒素研究进展 |
| 1 CT 的结构特性 |
| 2 CTB 黏膜免疫佐剂研究 |
| 3 小结 |
| 第三章 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 1 口蹄疫传统疫苗研究 |
| 2 口蹄疫新型疫苗研究 |
| 3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合基因的分子设计 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合基因的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 O 型FMDV 复合表位与CTB 融合蛋白的实验免疫 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 O 型FMDV 复合表位/CTB 重组枯草芽孢杆菌 构建与实验免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 O 型FMDV 复合表位/CTB 重组枯草芽孢杆菌 与多种FMDV 基因重组体联合实验免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（9）兔瘟病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 病原学 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状 |
| 4 病理变化 |
| 5 诊断 |
| 6 综合防制 |
| 第一章 常规病理形态学观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 动态病理形态学观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 病理DIC的观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 套式PCR快速确诊兔瘟 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图片附录 |
| 符号表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白（VP60）基因的克隆和生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒材料 |
| 1.2 质粒、工程菌和工具酶 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒RNA的提取 |
| 1.5 病毒VP60基因的RT和PCR |
| 1.6 RT-PCR产物的克隆及测序 |
| 1.7 VP60基因的生物信息学分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 YL株VP60基因的扩增和重组质粒的鉴定 |
| 2.2 YL株VP60基因的序列测定和编码蛋白分子特征 |
| 2.3 RHDV VP60基因的生物信息分析 |
| 2.3.1 VP60基因的核酸序列系统进化树构建和氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 四个不同大地区代表性分离株的VP60蛋白二级结构预测分析 |
| 2.3.3 四个不同大地区代表性分离株的VP60蛋白抗原性预测分析 |
| 3 讨 论 |
四、兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测（论文参考文献）
- [1]不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定[D]. 孔德生. 中国农业科学院, 2015(01)
- [2]兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用[D]. 肖跃强. 吉林大学, 2014(01)
- [3]无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达[J]. 肖跃强,张文倩,吴信明,管宇,苗立中,王艳,沈志强. 中国兽医科学, 2012(10)
- [4]表达兔出血症病毒VP60蛋白重组牛疱疹病毒的构建及免疫原性分析[D]. 刘行波. 黑龙江八一农垦大学, 2012(10)
- [5]兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定[D]. 穆亚芳. 中国农业科学院, 2011(10)
- [6]禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究[D]. 田浪. 四川农业大学, 2009(07)
- [7]幼兔病毒性出血症免疫失败原因及防制措施的研究[D]. 杨龙圣. 南京农业大学, 2008(08)
- [8]O型FMDV复合表位/CTB重组枯草芽孢杆菌构建与实验免疫[D]. 马海利. 吉林大学, 2008(11)
- [9]兔瘟病理学研究[D]. 宁玲忠. 湖南农业大学, 2007(07)
- [10]兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白（VP60）基因的克隆和生物信息学分析[J]. 李传山,杨颖,张守涛,杨增岐,郭蔼光. 畜牧兽医学报, 2007(07)