一、LONG-TERM EFFICACY AND IMMUNOLOGICAL MEMORY OF PLASMA-DERIVED HEPATITIS B VACCINE 11 YEARS AFTER INITIAL INOCULATION（论文文献综述）
刘秋霞[1]（2020）在《肠道菌群影响小鼠乙肝疫苗应答能力的机制研究》文中认为目的:由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染引起的乙型肝炎仍是世界范围内的一个公共问题。预防接种乙肝疫苗是降低HBV感染并阻断HBV传播的有效方法。无乙肝表面抗体保护的人群有感染HBV的风险,目前关于乙肝疫苗无应答的机制尚无明确解释。研究表明,肠道微生态可影响固有免疫和适应性免疫,通过粪菌移植将健康供体粪便微生物转移至患病个体胃肠道可调节肠道菌群。本研究旨在通过抗生素混合物干预小鼠肠道菌群和通过粪菌移植重建肠道菌群后,探讨肠道菌群对小鼠乙肝疫苗应答能力的影响并初步探讨其发生机制。方法:本研究采用的实验方法包括:1.用抗生素混合物干预成年小鼠和幼年小鼠的肠道菌群,给其注射乙肝疫苗后用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血浆中乙肝表面抗体Ig G的浓度。2.使用16S r DNA高通量测序检测小鼠肠道菌群的组成情况。3.使用液相色谱-质谱联用技术的方法检测小鼠肠道菌群代谢产物。4.使用粪菌移植的方法将幼年健康小鼠粪便或抗生素混合物干预过的幼年小鼠粪便移植给已由抗生素混合物干预过肠道菌群的幼年小鼠,注射乙肝疫苗后用ELISA技术检测小鼠血浆中乙肝表面抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a浓度。5.流式细胞技术检测小鼠外周血和脾脏中浆细胞、浆母细胞和生发中心B细胞（Germinal center B cell,GC B）的比例。结果:实验结果表明:1.幼年小鼠经抗生素混合物干预肠道菌群后,其对乙肝疫苗的应答能力下降;而成年鼠经抗生素混合物干预肠道菌群后,其对乙肝疫苗的应答能力不受影响。2.使用抗生素混合物导致幼年小鼠肠道菌群组成发生了明显改变,门水平上,厚壁菌门、变形菌门和放线菌门相对丰度降低,拟杆菌门和螺旋体菌门相对丰度升高;属水平上,乳酸杆菌属的相对丰度明显降低。3.抗生素混合物干预导致幼年小鼠粪便内代谢产物总数减少,检测到差异代谢产物包括维生素、氨基酸、脂肪酸等。经KEGG功能注释后发现差异代谢产物涉及的代谢途径主要包括辅助分子和维生素代谢、氨基酸代谢和能量代谢等。4.通过粪菌移植重建肠道菌群后,小鼠受损的乙肝疫苗应答能力恢复,血浆中乙肝表面抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a浓度均升高。5.粪菌移植重建肠道菌群后,因抗生素混合物干预引起减少的外周血及脾脏内浆细胞和浆母细胞比例升高。6.幼年小鼠脾脏中GC B细胞在抗生素混合物干预肠道菌群后比例减少,重建肠道菌群后生GC B细胞比例增加。结论:本研究表明:1.抗生素混合物干预肠道菌群导致幼年小鼠体液免疫能力受损,使其对乙肝疫苗的应答能力降低。2.抗生素混合物干预肠道菌群导致厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和乳酸杆菌属相对丰度降低,同时引起维生素代谢、氨基酸代谢、能量代谢失衡,与幼年小鼠对乙肝疫苗低应答有关。3.粪菌移植重建肠道菌群可改善幼年小鼠受损的乙肝疫苗应答能力。抗生素混合物干预或粪菌移植可影响脾脏和外周血中浆细胞和浆母细胞比例并可影响脾脏中GC B细胞比例,是肠道菌群影响小鼠乙肝疫苗应答能力的机制之一。
朱珍妮[2]（2012）在《早期应用抗病毒药物联合DNA疫苗对旱獭WHV感染过程的影响》文中认为目的1.研究不同地区旱獭对WHV的易感性，了解不同毒株、不同剂量的WHV接种旱獭后的自然经过，完善WHV感染的旱獭模型，。2.建立旱獭T淋巴细胞免疫应答的检测方法。3.研究恩替卡韦联合DNA疫苗pWHcIm对WHV感染的早期干预作用。方法1.捕获来自不同地区的旱獭，静脉接种含有WHV病毒的血清，观察其对WHV的易感性；用不同的WHV毒株接种易感地区的旱獭，观察不同毒株的影响；分别用高，中，低剂量的WHV59毒株接种易感地区的旱獭，观察不同剂量的WHV接种后的自然经过。2.分离旱獭PBMC，建立旱獭T细胞应答的检测方法，包括CFSE染色检测旱獭PBMC增殖，CD107a检测旱獭特异性CTL应答，PD1，PDL1，FOXP3染色及其免疫应答相关分子mRNA表达的real-time RT-PCR的方法。3.野外捕获的成年旱獭24只，体重在2-3kg。经足背静脉接种含有WHV59病毒的血清，病毒接种后24小时，18只旱獭分别经过如下三种处理：口服抗病毒药物恩替卡韦，0.5mg/kg/day，持续服用8周；在接种病毒后的第1,4,7周用表达WHV核心抗原的质粒免疫；口服恩替卡韦联合质粒免疫。余下6只旱獭作为空白对照。20周后，旱獭接种WHV0908毒株。选择2只健康旱獭作为此次病毒接种的对照。应用ELISA、real-time-PCR检测旱獭血清WHV感染标志物的动态变化：WHsAg、WHsAb、WHcAb和WHV DNA。real-time-RT-PCR检测旱獭PBMC中免疫应答相关分子的表达。结果1.来自1，3地区的喜马拉雅旱獭对WHV易感，病毒呈现高复制；WHV59毒株使喜马拉雅旱獭出现急性感染，而WHV59的传代毒株（stock0908和stock0925）使旱獭同样出现急性感染；中剂量WHV59接种后旱獭出现病毒血症的时间延迟，而低剂量WHV接种旱獭后不能出现病毒血症。2.新鲜分离的旱獭PBMC进行CFSE染色，5μg/ml的ConA刺激旱獭淋巴细胞5天，CFSEdim CD4+细胞百分比高达92.15%。新鲜分离急性WHV感染旱獭的PBMC，2μg/ml WHc96-110的肽段特异性刺激3天后，CD3+CD4-CD107a的表达为3.98%，相比2μg/ml CMV无关多肽刺激（0.85%）和空白对照（0.67%）有明显的增高。在病毒血症高峰期，CD4-细胞的PD-1表达达到高峰，阳性细胞百分比达到13.77%，CD4+细胞的FOXP3的表达为4.44%，PD-L1在病毒血症晚期CD4+和CD4-T细胞均有短暂上调，其百分比分别为2.17%和6.05%，病毒清除后降至正常水平。3.24只成年旱獭初次WHV感染后，所有仅用DNA疫苗免疫的旱獭均出现病毒血症和核心抗体，与未处理的对照旱獭相似。除仅用恩替卡韦处理的2只旱獭未出现WHcAb外，恩替卡韦联合质粒免疫及仅用恩替卡韦处理的所有旱獭均出现WHcAb而未出现病毒血症。再次病毒接种后，所有的质粒免疫旱獭，恩替卡韦联合质粒免疫的旱獭以及未处理的对照动物及其部分仅用恩替卡韦处理的旱獭（4/6）均不出现病毒血症。结论1.旱獭的遗传背景及病毒的接种剂量影响WHV感染的结局，传代病毒接种产生与原代病毒感染类此的感染结局。2.建立了旱獭T细胞应答的检测方法，为旱獭WHV感染模型应用于HBV感染的免疫发病机制研究及评估免疫治疗策略提供研究手段。3.早期应用抗病毒药物和/或抗病毒药物联合DNA疫苗，可以抵御WHV的初次感染，且部分或全部旱獭产生了有效的保护性免疫应答，可以抵御WHV的再次感染。本研究的创新点及意义1.旱獭广泛分布在我国西北特别是青藏高原，与土拨鼠种系（线粒体DNA序列分析）发生十分接近，近年已经报道中国旱獭对WHV有易感性，因此WHV感染旱獭模型非常适合于研究嗜肝病毒的急慢性感染。2.首次在旱獭WHV感染模型体内建立T淋巴细胞应答的检测方法，包括CFSE染色检测淋巴细胞增殖，CD107a及流式细胞术分析特异性CTL应答，real-timeRT-PCR检测细胞因子表达，为旱獭模型的进一步推广应用提供研究手段。3.首次利用WHV感染旱獭模型研究早期应用抗病毒药物和/或抗病毒药物联合DNA疫苗对WHV感染过程的影响，为探讨HBV感染后的早期免疫应答及保护性免疫应答的产生提供重要的实验依据，并为HBV意外或针刺暴露者提供新的干预方案。
娄海波[3]（2011）在《乙型肝炎病毒表面抗原特异性全人单克隆抗体的制备研究》文中指出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染仍然是一种严重影响人类健康的传染性疾病,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。我国现有的慢性HBV感染者约9300万,其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者约2000万。自从1992我国卫生部将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理后我国HBV感染率逐渐下降,但是我国慢性HBV感染者中约有30-50%是通过母婴传播形成的,对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性母亲的新生儿,应在出生后24小时内尽早（最好在出生后12小时）注射乙型肝炎免疫球蛋白（Hepatitis B Immunoglubulin, HBIG）。肝移植是治疗终末期肝病的有效手段,而目前我国接受肝移植的患者中90%以上患有HBV感染相关性疾病,由于肝移植不能清除肝外脏器血液及单核细胞等处的HBV,术后乙型肝炎容易复发,并且由于器官受体在术后处于免疫抑制状态,CHB复发后肝炎进展速度较术前明显加快,可导致急性肝功能衰竭、纤维性胆汁淤积性肝炎、肝硬化,2年病死率高达50%,拉米夫定联合HBIG是目前预防HBsAg （+）肝移植术后病人HBV再感染的有效方法。另外医务工作者等意外接触HBV感染者的血液和体液后,如未接种过乙型肝炎疫苗,或虽接种过乙型肝炎疫苗,但乙型肝炎病毒表面抗原的抗体（抗-HBs）<10mIU/mL或抗-HBs水平不详者,也应立即注射HBIG。HBIG是利用抗-HBs阳性的个体血浆制备而成的,含高浓度特异性抗-HBs的免疫球蛋白。该药为血源制品,不便大量制备,也有传播其他血源性疾病的风险,且该药个体差异较大,是多克隆制剂,均一性欠佳。本研究采用EBV永生化以及用分子生物学方法构建抗体基因库后从全长抗体基因库中筛选的技术,探索制备性质均一的单克隆抗-HBs。一、应用EBV永生化技术制备抗-HBs方法（1）制备EBV:培养B95-8细胞,制备EBV悬液。（2）准备CpG及环孢素：由上海英俊生物技术有限公司合成B细胞多克隆激活剂CpGDNA（序列：TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT）;购买环胞菌素A （cyclosporin A, CyA）。（3）获取强化免疫健康志愿者的PBMC：给予3位已进行全程计划免疫的20～25岁健康志愿者加强接种重组乙型肝炎疫苗1次,1周后抽取静脉血30ml,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）层,计数细胞数目,用含20%FBS的RPMI-1640完全培养基混悬细胞,调整密度为1×106个/ml。（4） EBV转化PBMC建立永生化的B淋巴细胞系：将上述PBMC种入24孔板,每孔加1 ml,含1×106个细胞,每孔再加入1 ml制备的EBV悬液,使EBV感染其中的B细胞。37℃、5%CO2培养18～24小时后,用含有CpG2.5μg/ml和环孢素A2μg/ml的完全RPMI-1640培养基半换液；1周后首次换液,调整CyA浓度为1μg/ml,此后每周半换液,雅培方法检测细胞培养上清中的抗-HBs抗体滴度。（5）制备饲养细胞：一个月后取部分永生化的B淋巴细胞以10 Gy剂量的γ射线照射1分钟后作为饲养细胞。（6）有限稀释法培养：在96孔板中每孔加入饲养细胞5×104个,然后加入培养上清抗-HBs阳性的永生化B淋巴细胞,做1个/孔,2个/孔,10个/孔三种细胞梯度各20个孔,每孔完全培养基200u1,另做5孔只加入饲养细胞做对照。培养7-14天后,选择抗-HBs阳性孔中的单细胞重新种入96孔板中,重复此过程培养2次,直至100%为抗-HBs分泌细胞。（7）免疫细胞化学染色（ICC）检测永生化的B淋巴细胞：超敏生物素-链霉亲和素SP法,DAB显色。缓冲液代替一抗作阴性对照；HBV感染的肝组织作阳性对照。CD20和CD138按说明书操作；检测乙肝表面抗体时,封闭后除去血清,每张切片加1：50稀释的重组HBsAg 50μl,室温下孵育60分钟,其余步骤按试剂盒说明书进行。结果三例健康志愿者PBMC与EBV共孵育24小时后,即可见细胞形态呈母细胞样改变,倒置显微镜下观察可见细胞体积增大,细胞质丰富,呈球形。3～5天后可见增殖的细胞集落,悬浮或略贴壁生长,集落间散在的细胞逐渐减少,3-4周集落明显增大。细胞在液氮中保存4周～3个月后多次复苏活性良好,台盼蓝法计数,活细胞比率>95%,复苏的细胞可继续培养和传代,建立的永生化B淋巴细胞系可连续传代培养3个月以上。三例健康志愿者PBMC经EBV转化后,用雅培方法动态检测细胞培养上清中的抗-HBs滴度,细胞培养上清抗-HBs的滴度维持在较高水平可持续2周左右,3周后逐渐降低以至消失。永生化B细胞培养2个月后,细胞甩片做免疫细胞化学染色,CD20阳性棕黄色颗粒主要见于细胞膜,着色强度+～++；CD138阳性可见于细胞膜/细胞浆,呈团状、块状及线团状或弥散分布,着色强度++；抗-HBs阳性可见于细胞膜,着色强度+,细胞核未见阳性着色；阴性对照细胞则无明显的棕黄色着色颗粒。结论（1）采用改进的EBV永生化技术,联合应用B细胞多克隆刺激剂CpG可以高效转化志愿者乙肝疫苗强化接种后的PBMC,成功实现B细胞的永生化,经有限稀释克隆化培养可以成功获得单克隆B淋巴细胞。（2）永生化的B淋巴细胞培养上清抗-HBs滴度维持较高水平2周左右,之后逐渐降低。由于EBV永生化的B淋巴细胞随着培养时间的延长抗体分泌功能减退,进一步,我们尝试应用基因工程技术构建抗体基因库,从中表达并筛选全长人源抗-HBs单克隆抗体。二、应用哺乳动物细胞表面展示技术从抗体基因库中筛选抗-HBs方法：获取乙肝疫苗全程免疫成功且抗-HBs高滴度的健康志愿者的PBMC,提取总RNA,设计并合成引物,扩增得到全套IgG1链可变区基因（VH）和K型轻链全长基因（LCK）,应用SfiⅠ酶切真核表达载体pDGB-HC-TM（本课题组已构建好）和LCK基因,应用BsmBⅠ酶切真核表达载体pDGB-HC-TM和VH基因,T4DNA连接酶连接过夜,化学转化感受态大肠杆菌TOPO10,接种于含有氨苄青霉素的平皿。轻、重链各随机挑选10个克隆接种扩增后送Invitrogen公司测序,根据长出的克隆数计算轻链或重链抗体基因库库容量,收集混合所有菌落即为轻链或重链抗体基因库。应用BstXⅠ酶切轻链基因库,BsmBⅠ酶切重链基因库,应用BstXⅠ和BsmBⅠ先后酶切pDGB4-FCS,T4DNA连接酶做四片段连接,化学转化感受态大肠杆菌TOPO10,接种于含有氨苄青霉素的平皿,挑选10个单克隆接种扩增,计算库容量,收集混合所有菌落即得到同时含有IgG1-Kappa型轻链、重链的完整抗体基因库。将随机挑选的10个轻链单克隆质粒DNA与pDGB-HC-TM（此质粒经鉴定已证实可以表达全长的重链）匹配瞬时转染FCHO细胞,将随机挑选的10个重链单克隆质粒DNA与pDGBCZR1（此质粒经鉴定已证实可以表达全长的轻链）匹配瞬时转染FCHO细胞；轻链抗体基因库与重链抗体基因库匹配瞬时转染FCHO细胞；将完整抗体基因库稳定转染FCHO细胞。流式细胞仪分析IgG1-Kappa型抗体及抗-HBs在FCHO细胞表面的表达,由FCS Express V3软件对流式细胞仪产生的数据进行分析。流式细胞仪分选表达抗-HBs的细胞群及单细胞,分选富集到的细胞群及单细胞培养后进一步检测抗-HBs表达状况,收集单细胞的培养液ELISA检测抗-HBs的表达。结果：利用本课题组已经构建的载体,以全程免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞为材料,应用哺乳动物细胞表面展示技术建立了库容量分别为1.7×105的抗体重链基因库（IgG1）和1.2×105的抗体轻链基因库（Kappa链）。从中随机挑选单克隆抗体基因测序分析,发现10个重链克隆均含有10个含有正确的VH编码序列,编码10个特异的氨基酸序列；10个轻链克隆有9个含有正确的LCκ编码序列,编码9个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到1.836×10170。流式细胞仪分析显示7/10的轻链克隆、10/10的重链克隆可成功表达抗体,重链抗体基因库与轻链抗体基因库配对转染FCHO后,66.53%细胞表面可以检测到抗体表达,最高可表达库容量达1.428×1010。将全套轻、重链基因一起插入同步表达载体中,构建了库容量达7.27x104的IgG1-Kappa型乙肝特异性完整抗体基因库,稳定转染FCHO细胞后流式细胞仪检测到1.73%的细胞表达抗-HBs。经一轮流式细胞仪分选富集,抗-HBs阳性率可提高5倍以上,流式分选最终共筛选到26个单克隆细胞,培养后流式检测其中11个单克隆细胞抗-HBs阳性,经ELISA检测得到3个抗-HBs阳性单克隆细胞。结论应用哺乳动物细胞表面展示技术可构建大容量乙肝特异性全长人源抗体基因库,联合流式细胞技术可有效分选富集表达抗-HBs特异性抗体的细胞群,从中成功筛选得到抗-HBs单克隆细胞。
宋新强[4]（2007）在《含编码鸡Ⅱ型胶原基因的新型DNA Tolerizing疫苗的研制及其在治疗大鼠类风湿关节炎中的疗效观察》文中提出类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是严重危害人类身体健康并影响劳动力的慢性全身性多发性、常见性自身免疫性疾病。国际上总患病人数约为6000万-1.1亿，我国总患病人数也逾400-600万左右。仅就美国而言，仅2000年一年耗费在骨关节炎医疗、保健和劳资方面造成的经济损失就高达14904亿美元。针对国际社会RA发病率和致残率日益增多的严峻形势，WHO于2000年向全世界提出了“骨与关节10年”计划，号召要“大力开展对骨关节病预防、诊断和治疗的研究”以及“不断开发和应用有改变病情效果并减少副作用的药物”。因此，深入研究RA的发病机制、治疗药物及其治疗方案就显得尤为重要和迫切。鉴于RA病人的滑膜炎症和关节破坏变形与免疫功能的改变密切相关，自上世纪九十年代以来国际上对RA新的免疫治疗策略进行了广泛深入探索。其中基因或DNA治疗性疫苗就是最受关注和推崇的策略之一，也是近年来免疫学和临床医学界研究最活跃、最富有成效的领域之一。在短短不到十年的发展历程中却已取得了举世注目的进展。目前国际上至少已有四个不同的基因治疗性疫苗获批进行临床Ⅰ/Ⅱ实验。然而，目前国际上探索用于RA研究的DNA疫苗仅限于T细胞疫苗或T细胞肽疫苗以及TCR疫苗，尚无针对特异性抗原的治疗性疫苗。业已证实，Ⅱ型胶原是人类RA最关键的自身抗原之一，在RA患者的血清及关节腔中均可发现大量的抗Ⅱ型胶原抗体和自身反应性T细胞。据此，我们在国际上首先原创性地提出研制基于鸡Ⅱ胶原蛋白（CCII）耐受原表位能有效治疗RA的新型DNA Tolerizing治疗性疫苗的设想，我们前期的初步实验结果表明了该思路的科学性和实践的可行性。其坚实的理论基础在于：1)．美国科学家首次发明“口服耐受”治疗策略，并且采用CCII治疗某些RA患者获得肯定疗效。该研究结果发表《Science》上，目前欧美发达国家整的进行口服耐受CCII治疗RA的Ⅲ期临床实验研究；2)．历经长期不懈努力，我们在国际上首次克隆成功编码CCOL2A1全长基因，首先申报了中国发明专利，专利申请号为：02149375.8；随后又申报了国际PCT发明专利，专利申请号为PCT/CN03/0096，新近国际局作出“专利性国际初步报告”表明：支持PCT/CN03/00967所提出的1-10全部条款的新颖性、创造性和工业实用性的权利要求，并于2006年5月14日前进入美、英、德、法、日五国国家阶段。由此为我们原创性研制成功能有效治疗RA的新型基因Tolerizing治疗性疫苗奠定了坚实的基础和保障。本课题是将口服免疫耐受与基因治疗性疫苗两大策略充分进行有机结合以期创新性研制全新型DNA Tolerizing治疗性疫苗，通过RA动物模型系统评价该疫苗的体内治疗疗效，并探索该疫苗疗效的作用机制尤其是T细胞耐受机制。勿庸置疑，本研究的关键是能否构建成功在真核细胞中高效表达的CCOL2A1基因疫苗。鉴于我们前期的工作已将CCOL2A1基因构建于原核表达载体中，为此，我们根据真核表达载体pcDNA3.1上的酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ以及CCOL2A1全长cDNA上的信号肽序列设计引物，同时还在引物上添加了Kozak序列和信号肽序列，PCR扩增测序正确后连接到pcDNA3.1上，即获得本实验所需要的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1。为了检证所构建的真核表达载体pcDNA3.1-CCOL2A1能否在体外有效地表达，我们将其转染到COS-7细胞（106）中。经G418筛选后，培养阳性克隆，收获、浓缩、真空干燥培养液，然后再溶解在0.1 mol／L的乙酸中。产物经15％SDS-PAGE电泳检测，在143kD左右处可见一电泳条带，经Western-Blot分析证明，在约143kD左右亦可见到特异性反应条带，与质粒pcDNA3.1-CCOL2A1基因表达的CCII蛋白相对应。而仅转染pcDNA3.1空载体的细胞培养液中则没见特异性条带出现。由此证明pcDNA3.1-CCOL2A1能在COS-7细胞中有效表达CCII多肽链的α亚单位，而且是分泌型表达。我们知晓，胶原蛋白的表达是一个非常复杂的过程，涉及到翻译后加工、糖基化、羟基化等多种步骤，至少需要8种酶的参与，其中脯氨酸羟化酶P4Hα、β两个亚基的羟基化作用尤为重要，它能特异的使胶原三肽重复序列Gly-X-pro中的脯氮酸残基羟基化。而羟化脯氨酸对于在生理条件下形成稳定的胶原三螺旋结构是必需的，并且P4H的活性与胶原的合成呈平行关系，胶原表达量的提高有赖于P4H与其的共表达。为了验证我们所构建的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表达的CCII是否是羟基化的氨基酸，我们采用MALDI-TOF-MS进行了相关分析。将SDS-PAGE中特异性条带切割下来，经过胶内酶切后进行肽质量指纹谱的鉴定，然后选取肽段进行ESI-MS/MS分析。串联质谱图经Micromass专用软件MaxEnt3处理后，用Spectrum通过Mascot查淘NCBI、SWISSPROT等数据库进行比对，结果证明该产物的确为alpha 1 typeⅡprocollagen[Gallus gallus]，即鸡Ⅱ型胶原蚩白α链；其中脯氨酸（Pro）未被修饰，m/z为416.19。由此提示，基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表达的CCII至少有部分没有被羟基化，因为我们所挑选的肽段中的脯氨酸并没有被羟基化。那么，这种缺乏脯氨酸羟化酶P4Hα、β的pcDNA-CCOL2A1基因疫苗所表达的产物是否具有生物学功能?尤其是在RA大鼠体内能否诱导有效的免疫耐受?则是我们最为关注的大问题。因此我们采用天然CCII在Wistar大鼠中建立了标准的CIA大鼠RA模型。CIA的发病率高达73％（45/62）。经四肢关节肿胀程度评分、放射影象学和组织病理学验证，该模型与文献报道的一致，完全符合CIA大鼠RA模型体内实验治疗的标准要求。我们的体内实验结果表明，空载体组和20μg/kg基因疫苗治疗组对CIA大鼠四肢关节肿胀程度无任何治疗作用；200μg/kg基因疫苗治疗组可明显减轻四肢关节肿胀程度，与其他所有组比较差异有统计学意义（*P＜0.05），尤其是与目前临床上用于治疗RA病人的“金标准”治疗MTX组的疗效几近相同；而400μg/kg高剂量基因疫苗组却可使关节炎指数略有升高。随后的组织病理学检查及其评分结果显示，注射200μg/kg pcDNA3.1对照组其后足有明显的血管翳形成，滑膜增生和大量淋巴细胞浸润，关节软骨变薄且失去完整性，几乎观察不到完整的骨小梁，骨髓腔部为分布有大量破骨细胞；20μg／kg及400μg／kg治疗组与关节炎对照组的结果相类似；而200μg/kg治疗组和MTX治疗组关节软骨及其下的骨小梁结构与正常组接近，但关节滑膜亦有一定程度的增生。由此表明在所选择的20μg/kg、200μg/kg、400μg／kg 3种基因疫苗治疗剂量中，200μg/kg剂量组对CIA大鼠后足踝关节的炎症以及软骨和骨的破坏的抑制作用最为明显，可使炎症分数下降为对照组的50％（*P＜0.05）。对CIA大鼠后足踝关节X光放射学表现及评分结果进一步分析表明：在关节炎对照组可见软组织肿胀，骨关节边缘模糊，软骨破坏；而在所选择的三种治疗剂量组中，只有200μ／kg治疗组治疗效果最明显（*P＜0.05），可使软组织肿胀减轻，关节间隙清晰，MTX治疗组效果与200μg／kg治疗组治疗效果接近：而20μg／kg和400μg／kg治疗组的关节软骨表面和骨密度与关节炎组比较变化不明显；此外，20μg／kg治疗组的放射学分数与空载体组类似，而400μg/kg治疗组的放射学分数却稍有升高。特别应该指出的是，200μg／kg基因疫苗组象MTX治疗组一样能显着降低CIA大鼠血清中的抗CII抗体水平（P＜0.05），而20μg／kg基因疫苗组与空载体组相比变化不大（P＞0.05），但400μg／kg基因疫苗组却显着升高（P＜0.05）。因为业已证实，抗CII抗体水平反映了RA早期阶段炎症和骨质破坏的程度，被认为是揭示关节炎严重程度最可靠的指标。由此证明了pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗对CIA大鼠关节炎有显着的治疗作用，在缺乏外源脯氨酸羟化酶P4Hα、β的情况下并未影响pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗的体内治疗效应。为了探索pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治疗CIA大鼠的相关机制，我们较为系统的观察了CIA大鼠注射pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗后4周脾细胞培养液中Th1和Th2因子如TGF-β1、TNF-α、IL-10、IL-4浓度的变化，CIA大鼠脾淋巴细胞特异性和非特异性增殖能力，CIA大鼠外周血中Th1／Th2细胞比例，CIA大鼠外周血中CD4+CD25+ Treg细胞占PBMC的比例以及大鼠外周血DC占PBMC的比例等指标。结果表明：200μg／kg基因疫苗组的TGF-β和IL-10水平明显增高（P＜0.05），TNF-α浓度显着降低（P＜0.05），而IL-4的浓度水平各组之间无明显变化（P＞0.05）；20μg／kg和400μg／kg基因疫苗组以及空载体组间则无显着变化（P＞0.05）。脾淋巴细胞增殖试验结果显示：200μg／kg基因疫苗组和MTX治疗组的特异性脾淋巴细胞增殖能力明显下降，与空载体组比较具有统计学意义（P＜0.05），400μg／kg基因疫苗组的脾淋巴细胞增殖能力较空载体组却有升高现象，其余3组差别不明显（P＞0.05）；当加入PHA进行非特异性刺激后，各治疗组的淋巴细胞都发生非特异性增殖，各组之间差别无统计学意义（P＞0.05）。在检测CIA大鼠外周血中Th1／Th2比例时发现，Th1:Th2的比率在正常组平均为0.06（范围是0.03-0.09），200μg／kg治疗组为0.08（范围是0.06-0.11），MTX治疗组为0.08（范围是0.05-0.16），它们都显着比空载体对照组低（P＜0.05），表明了一个显着的Th1→Th2细胞的“shift”；而此比率在20μg／kg与400μg／kg治疗组以及空载体对照组之间没有明显区别（P＞0.05）。鉴于CD4+CD25+Treg在参与免疫调控尤其是自身免疫反应的重要作用，我们还比较了正常组与各治疗组以及空载体对照组中CD4+淋巴细胞中CD4+CD25+Treg细胞所占的比例。结果发现：200μg／kg DcDNA3.1-CCOL2A1和MTX治疗组中CD4+CD25+Treg细胞比例明显高于对照组（P＜0.05）；20μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治疗组中的CD4+CD25+Treg细胞比例和对照组比几乎没有变化；而400μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治疗组CD4+CD25+Treg细胞比例虽然比对照组高，但没有统计学意义。除此之外，我们又观察了基因疫苗治疗后CIA大鼠外周血DC占PBMC的比例，结果显示，正常组中OX-62阳性细胞（DC）占外周血单个核细胞的比例为0.93±0.35％，CIA大鼠经pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗治疗4周后而各个治疗组中的OX-62阳性细胞占外周血单个核细胞的比例分别为1.48±0.70％，1.02±0.61％，1.18±0.31％，1.07±0.25％and 1.04±0.33％，200μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治疗组与其它治疗组、正常组及对照组之间的差异有统计学意义，其余各个治疗组与正常组及对照组之间的差异都没有统计学意义（P＞0.05）。尽管目前我们还没完全清晰pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治疗CIA大鼠的确切机制，但我们的上述结果高度提示，pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗可能通过增加机体内CD4+CD25+Treg，以降低T细胞对CII的特异性增殖反应，由此诱导了Th1→Th2细胞的“shift”，从而有效下调Th1-因子并上调了Th2因子。总之，本研究在国际上原创性地研制成功了能有效治疗RA大鼠模型的新型Tolerizing性基因治疗性疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1，并较系统深入地探索了其治疗的相关机理，该系列研究结果已申报了中国发明专利，受理号为200610111396.2。为今后进一步利用DNATolerizing治疗性疫苗策略治疗RA奠定了坚实的基础。从理论上讲，这既能增强治疗的特异性，又能克服一般免疫抑制剂以及非类固醇类抗炎药或DMARDs的严重毒副作用，还不会导致耐药性的产生。
黎耀强[5]（2004）在《中医治疗艾滋病研究》文中认为艾滋病的最早病例是美国疾病控制中心于1981年所报告，1982年命名为：获得性免疫缺陷综合征，亦即艾滋病；1984年美国国立肿瘤研究所分离出了一种逆转录病毒，1986年统一命名为人类免疫缺陷病毒，亦即艾兹病毒，此后，艾滋病的研究便突飞猛进。本文的第一部份是综述这一曲折的过程。 因为种错纵复习的因素，艾兹病仍然在世界各地蔓延着，尤以发展中国家为甚；我国自1985年亦发现首例艾滋病患。第二部份是综述艾滋病在全球的流行概况。 我国自发现首例艾滋病病例以来，先后分别在全国各省、市及地区检测出艾滋病带原者，临床上亦先后发现艾滋病患。随着我国经济政策的改变，人民观念亦有所改变，加速着艾兹病的蔓廷。第三部份作为专章，综述艾滋病在我国流行的概况与持点。 艾滋病病毒，在结构方面的研究己经有很好的成绩，其基因序列亦己十分清楚，第四部份是综述艾滋病病毒的特性。 艾滋病的诊断，以实验室诊断为主。艾滋病的实验室诊断，亦即以抗原或抗体为至的诊断方法，目前还有不少问题尚待解决，第五部份是综述艾滋病实验室诊断的现况。 艾滋病的临床诊断，因各国国情及经济条件不同，病人的年龄等差异，目前尚没有一个统一的方案，我国亦因本国国情不同而有我国自己的方案。第六部份是综述各个不同方案的异同。 艾滋病的治疗，以主流医学，即西医为主，但目前尚没有可靠的药物；目前能用的药物都仅能作局部控制病情，但副作用很多、药价也不便宜。再者，目前用药方案也尚未统一。第七个部份是综述目前西医西药治疗艾兹病的概况。 中医中药在几千年防治各种急性传染病和慢性病方面积累了十分丰富的经验和理论，许多事实说明了中医中药治疗艾滋病有很大的优势；我国部份医疗工作人员，十多年前就有用中医中药，包括针炙，在非洲治疗艾滋病的经验，本人亦于十三年前开始，用中医中药方法，配合西医方法，治疗第一位艾滋病病患，至今亦巳有数十例，大部份病者情况都常稳定，实验室指针也很正常，中医中药治疗可能是是艾滋病患的契机，同时也这可能是中医中药的契机。第八个部份作为重点，综述目前中医中药治疗艾滋病的概况。 目前，尚未寻找到治疗艾滋病病毒感染的有效药物，也还没有找到可以用来预防艾滋病病毒感染的有效疫苗。预防控制的主要方法是通过健康教育，加强自我保护意识和能力，提高个人对社会应承担责任的意识。从而使那些有高危险行为的人改变其危险行为，使那些没有高危险行为的人避免将来发展成为有高危险泛行为的人。 治疗是最后手段，中医一向强调<冶未病，不治己病>鞣揭窖б嘤幸?一套较完整的预防操拖。第九部份是综述重点在艾滋病的预防策略。 国家政策，对国计民生起主导作用，面对艾滋病，非得由国家力量通盘考虑，要达到有效治疗与控制是有困难的。作为本文的最后附录部份，包括国家有关部会的政策性指令，作为参考，本文才算完整。
二、LONG-TERM EFFICACY AND IMMUNOLOGICAL MEMORY OF PLASMA-DERIVED HEPATITIS B VACCINE 11 YEARS AFTER INITIAL INOCULATION（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、LONG-TERM EFFICACY AND IMMUNOLOGICAL MEMORY OF PLASMA-DERIVED HEPATITIS B VACCINE 11 YEARS AFTER INITIAL INOCULATION（论文提纲范文）
（1）肠道菌群影响小鼠乙肝疫苗应答能力的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 抗生素混合物干预幼年小鼠肠道菌群影响其对乙肝疫苗的应答 |
| 1 引言 |
| 2.实验材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 粪菌移植改善肠道菌群紊乱导致的乙肝疫苗低应答 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肠道微生态与免疫 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
（2）早期应用抗病毒药物联合DNA疫苗对旱獭WHV感染过程的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 WHV 感染旱獭模型的建立和完善 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 恩替卡韦联合 DNA 疫苗对 WHV 感染的早期干预 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）乙型肝炎病毒表面抗原特异性全人单克隆抗体的制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 B细胞永生化制备人源性乙型肝炎病毒表面抗原特异性抗体 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 采用哺乳动物细胞表面展示技术筛选全长人抗-HBs |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略语表 |
| 攻读学位期间主要成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（4）含编码鸡Ⅱ型胶原基因的新型DNA Tolerizing疫苗的研制及其在治疗大鼠类风湿关节炎中的疗效观察（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 pcDNA-CCOL2A1基因Tolerizing疫苗的构建及其鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 pcDNA-CCOL2A1基因Tolerizing疫苗治疗CIA模型的疗效观察 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 pcDNA-CCOL2A1基因Tolerizing疫苗治疗大鼠CIA的机理研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 博士期间发表及撰写投稿的论文 |
| 专利 |
| 综述 |
| 附录 博士期间发表的论文 |
（5）中医治疗艾滋病研究（论文提纲范文）
| 第一篇 概述:艾滋病病毒之发现，命名及现状 |
| 第二篇 艾滋病的流行概况 |
| 第三篇 中国艾滋病的流行概况 |
| 第四篇 艾滋病病毒 |
| 第五篇 HIV感染的诊断与临床 |
| 第六篇 艾滋病的临床 |
| 第七篇 艾滋病的治疗 |
| 第八篇 中医治疗艾滋病探索 |
| 第九篇 艾滋病的预防对策 |
| 附录 |
四、LONG-TERM EFFICACY AND IMMUNOLOGICAL MEMORY OF PLASMA-DERIVED HEPATITIS B VACCINE 11 YEARS AFTER INITIAL INOCULATION（论文参考文献）
- [1]肠道菌群影响小鼠乙肝疫苗应答能力的机制研究[D]. 刘秋霞. 浙江大学, 2020(01)
- [2]早期应用抗病毒药物联合DNA疫苗对旱獭WHV感染过程的影响[D]. 朱珍妮. 华中科技大学, 2012(07)
- [3]乙型肝炎病毒表面抗原特异性全人单克隆抗体的制备研究[D]. 娄海波. 南方医科大学, 2011(08)
- [4]含编码鸡Ⅱ型胶原基因的新型DNA Tolerizing疫苗的研制及其在治疗大鼠类风湿关节炎中的疗效观察[D]. 宋新强. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
- [5]中医治疗艾滋病研究[D]. 黎耀强. 南京中医药大学, 2004(04)