一、弓形虫保种的实验观察（论文文献综述）
占云[1]（2017）在《弓形虫感染对小鼠疼痛行为影响的研究》文中认为目的:刚地弓形虫是一种拥有广泛中间宿主的胞内寄生原虫。其生活史包括无性和有性生殖阶段。其中,有性生殖阶段必须在唯一的终末宿主猫科类动物的小肠上皮细胞内进行。有研究表明,弓形虫感染可以引起宿主出现一系列行为改变及神经精神疾病的发生,从而有利于其完成整个生活史过程。然而,弓形虫感染对宿主的疼痛行为影响的研究却鲜有报道。因此,本文拟进行弓形虫感染对小鼠疼痛行为影响的研究。方法:1.经口食入Prugniaud（Pru）株弓形虫包囊,建立Pru株弓形虫感染小鼠模型,观察小鼠发病情况以及进行病原学的检测。2.成功建立Pru株弓形虫感染小鼠模型后,分别测量Pru株弓形虫感染后0周、4周、8周和12周时小鼠的疼痛阈值。3.在完成疼痛阈值测量后,立即分别采集Pru株弓形虫感染后4周、8周和12周小鼠血清,并取小鼠脑组织制作脑组织匀浆液,镜下查找包囊,确定Pru株弓形虫感染成功后,再运用ELISA方法检测分析其血清中疼痛相关物质的含量变化。4.在完成疼痛阈值测量后,立即经心脏灌流固定Pru株弓形虫感染后8周小鼠脑组织,石蜡包埋制作脑组织切片,运用免疫组织化学的方法检测分析脑组织海马区内、皮质区内、下丘脑区内和杏仁核区内疼痛相关物质的含量变化。实验结果:1.Pru株弓形虫感染小鼠后第10天开始,小鼠出现一系列发病症状,如体重下降、眼部疾病、脾肿大、肝脏病变、腹水、弓背耸毛、萎靡不振、食欲减退,到第25天后症状开始减轻,提示成功地建立了Pru株弓形虫感染小鼠模型。2.Pru株弓形虫感染小鼠后0周、4周、8周和12周时小鼠的由机械刺激诱发的机械痛痛阈值和热刺激诱发的热痛痛阈值与正常对照组小鼠比较,痛阈值均显着升高。3.Pru株弓形虫感染小鼠后4周、8周和12周时小鼠血清中P物质（SP）、β-内啡肽（β-EP）和5-羟色胺（5-HT）的含量与正常对照组小鼠比较,无明显变化。4.与正常对照组小鼠比较,Pru株弓形虫感染后8周时小鼠脑组织海马区内SP和β-EP的含量均降低,而5-HT含量无明显变化;脑组织皮质区内SP含量下降和β-EP含量升高,而5-HT含量无明显变化;脑组织下丘脑区内SP、β-EP和5-HT含量均升高;脑组织杏仁核区内5-HT和β-EP的含量均升高,而SP含量无明显变化。结论:1.Pru株弓形虫感染小鼠后,感染小鼠出现一系列发病症状,提示我们成功地建立了Pru株弓形虫感染小鼠模型。2.Pru株弓形虫感染小鼠后0周、4周、8周和12周时小鼠由机械刺激诱发的机械痛痛阈值和热刺激诱发的热痛痛阈值均升高,提示,Pru株弓形虫感染影响了小鼠的疼痛行为,小鼠表现出对疼痛不敏感。3.Pru株弓形虫感染4周、8周和12周时小鼠血清中SP、β-EP和5-HT的含量与正常对照组小鼠比较,无明显变化。提示,Pru株弓形虫感染小鼠疼痛阈值升高可能与血清中SP、β-EP和5-HT的含量变化无关。4.Pru株弓形虫感染8周时小鼠脑组织海马区内SP和β-EP以及皮质区内SP含量均降低,同时下丘脑区内SP、5-HT和β-EP、皮质区内β-EP和杏仁核区内β-EP与5-HT含量均升高,由此我们推测:Pru株弓形虫感染小鼠疼痛阈值升高可能与调节脑组织海马区、皮质区、下丘脑区和杏仁核区内SP、β-EP和5-HT的含量有关。
朱勇[2]（2015）在《过氧化氢诱导弓形虫RH株速殖子凋亡的初步研究》文中认为刚地弓形虫病是一种在全球内普遍流行的人兽共患寄生虫病。不仅对孕妇和胎儿构成了极大的威胁,近年来又成为AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。目前抗弓形虫药物大部分都存在长期治疗效果差、难根治、高费用且对免疫功能缺陷患者基本无治疗效果等诸多缺点,研发新型治疗弓形虫病药物很有必要。药物研究依赖于高效稳定的弓形虫体内和体外培养模型,建立弓形虫培养模型不仅可用于筛选新型抗弓形虫药物,还可用于抗弓形虫药物的作用机理研究。过氧化氢（Hydrogen Peroxide,H2O2）对细胞的活力和增殖力均具有抑制和/或杀伤作用,然而有关H2O2能否诱导弓形虫凋亡的作用机制仍然不清楚。近年来,不少数据表明,H2O2可以诱导众多细胞凋亡,本文以H2O2是否能诱导弓形虫速殖子凋亡作探讨,旨在进一步阐明H2O2诱导弓形虫RH株凋亡的机制,为弓形虫病的免疫预防和临床治疗新方案的设计提供理论和实验依据。复苏刚地弓形虫RH株速殖子,注射接种小鼠腹腔;建立虫体与小鼠巨噬细胞（RAW264.7）细胞的共同培养体系,依次以不同比例的虫体接种细胞,观察虫体在细胞内的增殖情况,确定适宜的虫体与细胞感染比例及培养时间。以滤膜过滤法纯化体内培养和体外培养模型获得速殖子。采用吉姆萨染色、琼脂糖凝胶电泳、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）、流式细胞技术测定DNA含量检测H2O2处理弓形虫速殖子凋亡的特征;检测凋亡过程中胞内钙离子浓度变化。RH株速殖子可在RAW264.7细胞内增殖,接种72h后细胞能完全被破坏释放出大量虫体,虫体在细胞内增殖速度和传代间隔稳定、形态典型,未见毒力明显减弱。两种滤膜对体内白细胞清除率无明显差异,对红细胞清除效果随滤膜孔径增大依次降低,小鼠体内速殖子的回收率随着孔径增大依次升高。两种滤膜对RAW264.7细胞的清除率无明显差异,体外培养的速殖子的回收率随着滤膜孔径增大而升高,并且两者间差异有统计学意义。光镜下观察H2O2处理弓形虫后,虫体失去典型形态,活力明显下降。琼脂糖凝胶电泳测定H2O2处理速殖子后的DNA未见片段化条带,以流式细胞仪检测H2O2处理速殖子凋亡程度,发现存在凋亡,随时间增大其凋亡程度扩大。流式细胞仪分析速殖子以H2O2处理后DNA含量的变化,发现H2O2组速殖子数少,DNA含量降低。测定H2O2处理速殖子过程中胞浆钙离子浓度随着时间增长以及处理浓度增高而增高。成功建立刚地弓形虫RH株速殖子体外培养模型。初步研究发现H2O2能诱导弓形虫速殖子凋亡及其过程中胞浆钙离子浓度升高。
王旗[3]（2015）在《金丝桃素抗弓形虫效果的研究》文中研究表明目的:1.实验研究金丝桃素对体外培养的弓形虫速殖子的杀伤作用,以及金丝桃素对弓形虫形态结构、超微结构影响。2.探讨金丝桃素对体外培养的弓形虫细胞逸出现象的影响。3.探讨金丝桃素对急性弓形虫感染小鼠的治疗作用及其可能的细胞免疫调节机制。方法:1.调整虫体密度为1×106个/ml/孔于24孔板中,设4个实验组:生理盐水组、金丝桃素5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml浓度组,定容至1ml/孔。37℃孵育,2h、4h、6h分别取各组样本液,进行台盼蓝和姬姆萨染色,光镜下观察虫体着色情况和虫体结构。电镜观察药物浓度为500μg/ml作用2h、4h、6h后,虫体的超微结构的变化。2.用RH-YFP弓形虫模拟方法1实验方案利用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测金丝桃素对弓形虫的杀伤作用;分离小鼠腹腔巨噬细胞,建立弓形虫与巨噬细胞共培养体系,实验分4组:巨噬细胞+弓形虫组、巨噬细胞+弓形虫+金丝桃素组（金丝桃素浓度:100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）,分别在培养1h、2h、3h后用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测,检测感染细胞、游离速殖子在不同药物浓度及不同时间比例的变化。3.利用弓形虫RH株（1×103个/只）建立小鼠弓形虫体内感染模型,实验分成空白组、感染组、金丝桃素组、金丝桃素治疗组4个实验组。感染12小时后金丝桃素对照组和治疗组开始给药,连续治疗7天。观察小鼠存活时间,利用流式细胞仪检测7天后小鼠脾脏中T淋巴细胞亚群的变化。结果:1.金丝桃素和弓形虫速殖子共培养后,随着时间的变化,同一浓度组台盼蓝着色率不断升高,在相同的时间段内,随着药物浓度的增加,虫体台盼蓝着色率也在升高。吉姆萨染色实验,其中500μg/ml浓度组2h虫体内部出现空泡,4h后虫体膨胀,核质分不清,6h后虫体染色进一步加深。透射电镜下速殖子超微结构的变化,生理盐水组虫体轮廓清晰,电子密度高,内容物清楚,6h内基本维持正常形态。金丝桃素处理组2h后,虫体开始肿胀,钝圆,胞质内开始出现空泡,核固缩。4h后虫体变圆,空泡变大,胞膜出现孔洞,有内容物溢出。6h后虫体轮廓消失,不见细胞膜,内部结构基本呈溶解样改变,电子密度很低。2.弓形虫对照组6h内虫体数目形态基本没有变化,500μg/ml作用2h虫体开始钝圆,荧光轮廓变小,4h后荧光速殖子明显减少,6h后基本不见荧光;巨噬细胞组金丝桃素干预3h细胞形态未发生明显改变。与巨噬细胞+弓形虫组相比,巨噬细胞+弓形虫+金丝桃素组随着药物浓度增加和时间的延长胞内速殖子数量下降明显,游离速殖子也在减少且荧光强度不断降低。流式细胞仪检测结果,弓形虫对照组6h内阳性区域比例变化不明显,药物处理2h,500μg/ml药物浓度,游离速殖子阳性区域比例开始小于0.1%;巨噬细胞+弓形虫+药物组随着时间的延长和药物浓度增加,游离/胞内弓形虫的比值开始不断升高直到400μg/ml作用3h才开始下降,各时间段实验组与对照组比较均显着升高。3.对40只小鼠进行连续7天干预治疗后,金丝桃素组,金丝桃素治疗组,空白组30只小鼠全部存活,感染组小鼠只存活了5只。7天后处死小鼠进行腹水检查发现,金丝桃素治疗组小鼠腹腔速殖子含量较感染组少。小鼠脾淋巴细胞检查结果发现金丝桃素对照组和治疗组CD4+T淋巴细胞比例较其他2组显着升高,而感染组小鼠脾CD8+T淋巴细胞比例较其他3组也显着升高。CD4+/CD8+T淋巴细胞比例金丝桃素对照组和治疗组显着高于空白对照组与感染组。结论:1.在体外培养环境下,金丝桃素对弓形虫速殖子有显着的杀伤作用,500μg/ml浓度4h就可以达到95%以上的杀伤效果,与同一浓度4h在荧光显微镜下虫体荧光消失和电镜下虫体超微结构变化相一致。2.体外药物实验证实了金丝桃素能够诱导弓形虫速殖子从宿主细胞逸出,降低宿主细胞的感染率,同时对逸出的游离速殖子具有杀灭作用。3.通过金丝桃素治疗小鼠弓形虫病的体内实验表明,金丝桃素可以影响弓形虫感染小鼠体内CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群比例的变化,延长了感染弓形虫小鼠的存活时间。
谭峰[4]（2011）在《弓形虫核苷三磷酸脱氢酶功能分析及疫苗候选靶标的研究》文中指出刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的机会致病性原虫,在人和动物的有核细胞内寄生和繁殖,引起人兽共患的弓形虫病。尤其对于孕妇、婴儿和免疫低下者感染后危害极大。目前已成为发展中国家乃至全世界关注的机会感染性疾病之一。弓形虫在宿主体内快速增殖以及所产生的炎症反应可导致宿主机体出现严重的组织损伤和临床症状。虽然许多抗生素对急性弓形虫病治疗有效,但这些药物本身会对患者产生一定的副作用。因此,找到一种新药,特别是一种既能抑制弓形虫增殖又几乎不会产生副作用的药物成为弓形虫病治疗的当务之急。弓形虫侵入宿主细胞后位于一个由纳虫泡膜包绕的纳虫泡内,位于纳虫泡内的虫体可通过分泌一些蛋白成分修饰纳虫泡内环境,从而维持自身生长发育需求。其中,核苷三磷酸脱氢酶（nucleoside triphosphate hydrolase, NTPase）是弓形虫适应宿主细胞内环境获得嘌呤的寄生机制而产生,对弓形虫在寄生、繁殖方面具有重要意义。由于弓形虫属于嘌呤营养缺陷型,无法通过从头途径合成嘌呤碱基,因此,为了生存和繁殖,弓形虫只能通过补救合成途径直接从宿主细胞获取嘌呤。弓形虫NTPase蛋白存在于速殖子体膜表面,但当速殖子侵入宿主细胞不久,NTPase即分泌入纳虫泡的网状管腔系统内,在二巯基化合物（如DTT）的激活作用下,能连续水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷至单磷酸形式。感染宿主细胞的弓形虫速殖子即是利用NTPase分解宿主细胞来源的ATP,以合成维持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。弓形虫NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ两种亚型。编码NTPase基因组DNA无内含子,由3个连续排列的开放读码框架（ORF）组成,分别为NTP1、NTP2和NTP3。其中NTP2不具备编码蛋白的能力,而NTPase-Ⅰ、NTPase-Ⅱ是分别与编码基因NTP3和NTP1相对应的一组同工酶。其中NTPase-Ⅰ仅存在于有毒株,而NTPase-Ⅱ几乎存在于所有弓形虫虫株。显而易见,以NTPase-Ⅱ蛋白作为药物或疫苗靶点将比NTPase-Ⅰ蛋白具有更广泛地应用前景。本研究将以原核表达的NTPase-Ⅱ蛋白免疫BALB/c小鼠,制备特异性抗弓形虫核苷三磷酸水解酶（NTPase）Ⅱ型重组蛋白（rTgNTPase-Ⅱ）单克隆抗体,观察所获单克隆抗体的保护作用,阐明弓形虫NTPase-Ⅱ在RH株速殖子生长发育中的作用。同时观察rTgNTPase-Ⅱ免疫后,BALB/c小鼠体内所产生的免疫反应类型及免疫保护作用,为寻找新的疫苗靶点提供实验依据。1.弓形虫NTPase-Ⅱ的基因克隆和蛋白表达采用PCR方法扩增得到刚地弓形虫RH株NTPase基因,克隆入pGEM-T Easy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,成功构建原核表达载体pBAD-HisB-NTPase,转入E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量（Mr）约70 kDa,与理论值相近。使用Ni离子亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白,SDS-PAGE鉴定纯度约为84%. Western blotting和ELISA分析结果显示,纯化的重组蛋白可被鼠抗重组蛋白血清特异性识别,具有良好的免疫反应性和免疫原性。2.抗弓形虫rNTPase-Ⅱ单克隆抗体的制备及其功能分析通过制备特异性抗弓形虫核苷三磷酸水解酶（NTPase）Ⅱ型重组蛋白（rTgNTPase-Ⅱ）单克隆抗体,观察所获单克隆抗体的保护作用,以此阐明弓形虫NTPase-Ⅱ在RH株速殖子生长发育中的作用。将rTgNTPase-Ⅱ抗原（50μg/100μl）以福氏完全佐剂等体积混合后皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,并以同样剂量的rTgNTPase-Ⅱ抗原等体积混合福氏不完全佐剂后每隔2周进行1次加强免疫,一共进行3次加强免疫。最后一次加强免疫后3天取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞进行细胞融合,细胞融合率为92.71%（534/576）。利用纯化的rTgNTPase-Ⅱ作为包括抗原,以间接ELISA法进行筛选。对于筛选到的阳性克隆株以有限稀释法进行3次亚克隆,最终得到2株高亲和力杂交瘤细胞系,分别命名为MNT1与MNT2。将得到的单克隆抗体注射经降植烷处理的BALB/c小鼠腹腔,收集腹水以亲和层析法进行单抗纯化。2.1单克隆抗体的鉴定：采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定单克隆抗体的免疫球蛋白类别和亚类,证实2株单克隆抗体均为IgG2a亚类。间接ELISA法测定杂交瘤细胞株培养上清与小鼠腹水效价,检测结果表明,MNT1与MNT2细胞培养上清效价分别为1：12 800 and 1：6 400,而小鼠腹水效价分别为1：51200与1：12 800。同时将杂交瘤细胞株连续传代三个月及液氮冻存一个月后复苏,不同时间取其培养液上清,用间接ELISA法检测其抗体效价,测定抗体分泌的稳定性。结果发现,细胞连续传代三个月,分泌抗体的能力稳定。液氮冻存一个月后复苏,对细胞上清进行检测,抗体仍为阳性。以Western Blot法鉴定单克隆抗体的特异性,结果表明,两株单克隆抗体与rTgNTPase-Ⅱ蛋白在约70kDa处出现反应条带,与弓形虫RH株速殖子全虫抗原在约63kDa处出现反应条带,均与预期结果相符。而与阴性对照（含pBAD-HisB载体的DE3细菌裂解液）之间未出现反应条带。最后,将纯化的弓形虫RH株速殖子分别与单克隆抗体或阴性对照反应后,加入FITC标记的羊抗鼠IgG,利用间接荧光抗体实验（IFAT）于激光共聚焦显微镜下观察NTPase-Ⅱ在速殖子中的定位,发现2株单克隆抗体均与弓形虫RH株速殖子出现荧光反应。2.2单克隆抗体保护性实验2.2.1单克隆抗体抑制虫体入侵与胞内生长发育情况：将纯化的弓形虫RH株速殖子与单克隆抗体孵育后按照虫株数：细胞数为2：1的比例,对COS-7宿主细胞进行体外细胞培养。并于感染后3小时、9小时与15小时分别取出不同处理组于油镜下进行计数观察。其中与单抗孵育3h的细胞培养孔中观察100个宿主细胞中被速殖子感染的细胞数量（感染率）,评价单抗对弓形虫RH株速殖子入侵宿主细胞的抑制作用。同时分别计数与单抗孵育3h、9h、15h的细胞培养孔中100个感染速殖子的阳性细胞中弓形虫虫体数量（感染度）,评价单克隆抗体对弓形虫RH株在宿主细胞内生长发育的抑制作用。感染3小时后的感染率检测结果表明：MNT1、MNT2、IgG2a与完全培养液处理后的感染率分别为12%,10%,12%与13%,各组之间结果无统计学差异（χ2=0.458,P=0.928）,表明2株单克隆抗体无抑制弓形虫RH株速殖子入侵COS-7宿主细胞的能力。然而在速殖子感染9h（χ2=19.741,P=0.000）与15h（χ2=44.974,P=0.000）后,各处理组间感染度均存在显着性差异,其中MNT1单克隆抗体处理组抑制虫体在COS-7细胞中增殖的效果最好,MNT2单克隆抗体处理组次之。表明2株单克隆抗体均可显着抑制弓形虫RH株速殖子在宿主细胞内的生长发育。且MNT1单克隆抗体抑制作用更显着。2.2.2单克隆抗体抑制酶活性情况：将纯化的弓形虫RH株速殖子与单克隆抗体孵育后接种于细胞培养板中,以DTT刺激10分钟后加入Triton X-100,对于速殖子裂解液上清进行酶活性检测,观察单抗对酶活性的抑制作用。由于NTPase可水解ATP至ADP,同时释放出无机磷（Pi）。通过检测Pi浓度发现,与对照组相比,MNT1单克隆抗体处理组（P=0.002）与MNT2单克隆抗体处理组Pi浓度均显着降低（P=0.035）,表明NTPase酶活性可被2株单克隆抗体显着抑制。2.2.3单克隆抗体被动免疫保护性实验：将30只BALB/c小鼠随机分为6组,分别标记为MNT1-1、MNT1-2、MNT2-1、MNT2-2、IgG2a-1、IgG2a-2。将MNT1-1与MNT1-2两组BALB/c小鼠均以腹腔接种0.2ml（500μg/ml）单克隆抗体MNT1,MNT1-1组于腹腔接种单克隆抗体当天用200个RH株速殖子进入攻击感染,而MNT1-2组于接种48h后以同样数量速殖子攻击感染。MNT2组与IgG2a组根据组名接种不同单抗,其余操作步骤同上。密切观察、记录各组小鼠的死亡时间,评价单克隆抗体的被动免疫保护作用。结果表明,当天攻击感染的不同处理组间,其生存时间存在显着性差异（χ2=14.708,P=0.001）,与对照组相比,MNT1单克隆抗体处理组（P=0.004）和MNT2单克隆抗体处理组（P=0.018）小鼠的生存时间均显着延长,而且,MNT1单克隆抗体处理组与MNT2单克隆抗体处理组中小鼠生存时间亦具有显着性差异（P=0.004）;同样,48h后攻击感染的不同处理组间的生存时间亦存在显着性差异（χ2=6.531,P=0.038）。然而,尽管MNT1单克隆抗体处理组在48h后攻击感染其生存时间比对照组显着延长（P=0.030）,MNT2单克隆抗体处理组与对照组之间无显着性差异（P=0.189）,表明应用MNT1被动免疫后产生的免疫保护效果更好,可显着延长小鼠生存时间。本实验为进一步研发新弓形虫疫苗提供了实验依据。3. rTgNTPase-Ⅱ对弓形虫感染的免疫保护及作用机制通过观察rTgNTPase-Ⅱ免疫后,BALB/c小鼠体内所产生的免疫反应类型及免疫保护作用,为寻找新的疫苗靶点提供实验依据。将纯化的rTgNTPase-Ⅱ蛋白进行去内毒素处理,并通过凝胶法检测蛋白样品中内毒素含量,待样品中内毒素含量低于试剂盒最低检测量0.03EU/ml时对SPF级BALB/c小鼠进行免疫。小鼠分为3组：联合免疫组、rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组以及对照组,每组各20只。其中联合免疫组以10μg的rTgNTPase-Ⅱ吸附0.5mg氢氧化铝佐剂进行联合免疫,对照组为PBS混合氢氧化铝佐剂进行免疫。初次免疫后每隔2周进行一次加强免疫,共加强免疫3次。待加强免疫结束后2周,对各免疫组小鼠进行特异性IgG抗体实验、细胞免疫反应实验及免疫保护作用研究。3.1.体液免疫反应评价：以5μg/ml的rTgNTPase-Ⅱ为包被抗原建立间接ELISA法,检测各免疫组小鼠血清中特异性总IgG抗体与IgG1、IgG2a两个抗体亚类。结果显示,联合免疫组中抗rTgNTPase-Ⅱ总IgG抗体比rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.000）和对照组（P=0.000）均显着升高,而rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组与对照组相比亦显着升高（P=0.000）。此外,与对照组相比,联合免疫组小鼠血清中IgGl抗体亚类与IgG2a抗体亚类水平比rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.005,P=0.005）和对照组（P=0.000,P=0.000）均显着升高,而rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组与对照组相比亦显着升高（P=0.000,P=0.000）,提示rTgNTPase-Ⅱ所诱导产生的免疫反应可能为Th1/Th2混合型免疫反应。然而,通过计算各rTgNTPase-Ⅱ免疫组中IgG1与IgG2a比值,我们可以发现,rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组中所诱导产生的为Thl型细胞免疫应答（IgG2a/IgG1>1）,而联合免疫组中所诱导产生的为Th2型细胞免疫应答（IgG2a/IgG1<1）,表明佐剂具有增强体液免疫反应的作用。3.2.细胞免疫反应评价3.2.1淋巴细胞增殖实验：最后一次加强免疫后2周,每组各取5只小鼠脾淋巴细胞,悬浮后按3×105/孔加入96孔细胞培养板,随后以rTgNTPase-Ⅱ（10μg/ml）刺激体外培养的免疫小鼠脾淋巴细胞,待孵育72小时后以CCK-8法检测各孔吸光度,按以下公式计算刺激指数：刺激指数（SI）=刺激孔均值/对照组均值。以ConA作为阳性对照,完全培养液作为阴性对照。与对照组相比,联合免疫组（P=0.000）与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.002）中,小鼠脾淋巴细胞均对rTgNTPase-Ⅱ刺激出现了显着的淋巴细胞增殖反应,但两个免疫组之间差异并无显着性（P=0.295）。3.2.2细胞因子检测：按上述方法得到小鼠脾淋巴细胞后,以5×106/孔铺入24孔细胞培养板,待孵育24小时后检测培养上清中IL2、IL-4浓度,72小时后检测IL-10浓度,96小时后检测IFN-γ浓度。与对照组相比,联合免疫组（P=0.000）与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.000）中小鼠脾淋巴细胞均对rTgNTPase-Ⅱ刺激产生了IFN-γ。同样,联合免疫组（P=0.002）与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.013）中小鼠脾淋巴细胞均对rTgNTPase-Ⅱ刺激产生了IL-2。然而却只有联合免疫组的细胞培养上清中IL-10含量与对照组（P=0.021）和rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.031）相比均出现显着升高,而所有免疫组中均未检测出IL-4。3.2.3 T细胞亚群分析：按之前操作步骤分别获取各免疫组5只小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,调整细胞浓度约106/50μ1/管,每管加入3株荧光标记的单克隆抗体：CD4（RM4-5）-FITC Rat Anti-Mouse、CD8a（53-6.7）-PE Rat Anti-Mouse和CD3e-PE-CYTM5 Hamster Anti-Mouse 20μl。暗室孵育后于流式细胞仪上计数10000个细胞,记录CD3+CD4+CD8"和CD3+CD4-CD8+细胞百分数。结果发现,联合免疫组（P=0.000）与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.000）中CD3+CD4+双阳性T细胞/CD3+CD8+双阳性T细胞的比值均显着低于对照组。3.3免疫保护作用评价3.3.1急性攻击感染：为观察免疫小鼠对弓形虫急性感染的免疫保护作用,在免疫结束后2周用1000个弓形虫强毒株RH株速殖子于腹腔攻击感染各免疫组小鼠,每组各感染5只,记录各组小鼠生存时间。与对照组相比,联合免疫组（P=0.021）与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.020）小鼠生存时间均显着延长。3.3.2慢性攻击感染：为观察各免疫组小鼠对弓形虫慢性感染所产生的免疫保护作用,将各组最后剩下的10只小鼠以弓形虫弱毒株PRU株包囊经口喂食攻击感染,每只小鼠感染20个包囊。攻击感染5周后,计数各免疫组小鼠脑组织中包囊数。结果显示联合免疫组（P=0.008）与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组（P=0.014）脑组织包囊数均显着减少,下降率分别为62.9%和57.6%。从而证实rTgNTPase-Ⅱ可诱导BALB/c小鼠产生特异性免疫反应,该免疫反应以Thl型细胞应答为主。由rTgNTPase-Ⅱ诱导产生的免疫反应可为BALB/c小鼠提供部分的免疫保护作用。
葛璞[5]（2010）在《刚地弓形虫培养上清对卵巢癌细胞SKOV-3的影响》文中研究说明研究背景及目的:卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,及早发现可以有效提高病人生存率,但由于发病隐匿,无明显症状,往往病情会被忽视,因此,卵巢癌又称为“沉默杀手”。据统计,在100 000个妇女中,就有3.8位死于此病。虽然近20年来在卵巢癌治疗方面取得了长足进展,但均未能显着改善患者的长期生存率。因此,针对能有效抑制肿瘤细胞生长的新抗癌药的不断开发应用,是十分迫切的任务。目前抑制肿瘤细胞的生长主要通过两个方面:一方面可以通过改变细胞的周期,使其不能进行正常的有丝分裂,另外一方面可以通过促进细胞凋亡,通过改变凋亡相关蛋白表达水平来增加了肿瘤细胞凋亡率,抑制肿瘤细胞的增殖和集落形成能力,提高肿瘤细胞化疗药物和放疗的敏感性。弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫,其寄生于宿主细胞过程中,虫体与细胞的生物学特性均会发生改变:研究二者间的联系,一直是国内外关注的焦点。业已证实的是弓形虫在寄生过程中可以抑制宿主细胞增值,引起细胞周期改变,并且诱导宿主细胞凋亡。本文利用液氮保种小鼠传代及CF-11纤维素纯化的方法提取制作弓形虫培养上清液,将其视为一种生物制剂在体外条件下人卵巢癌细胞SKOV-S细胞共培养,来观察弓形虫培养上清液对SKOV-S细胞生物学行为影响。方法:1.采用四甲基氮噻唑蓝（MTT）法检测空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的吸光度（A490值）并按公式计算卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖抑制率。2. PI染色后,上流式细胞仪技术检测空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的细胞周期。3. Annexin-v-FITC/PI染色后,上流式细胞仪技术检测空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的细胞凋亡率。4.荧光显微镜观察空白对照组与刚地弓形虫培养上清处理组的细胞在不同时项形态改变情况。5.采用琼脂糖凝胶电泳观察培养上清处理组的凋亡DNA条带。6.采用western blot,对培养上清处理前后,卵巢癌细胞SKOV-3细胞周期蛋白cyclinB1、cdc2及凋亡蛋白bcl-2及bax表达量进行检测。结果:1. MTT法检测结果显示卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖抑制率随着刚地弓形虫速殖子培养上清浓度和作用时间增加均明显增大,弓形虫速殖子培养试验组抑制率与对照组之间比较差异均有统计学意义（p﹤0.05）。2.培养上清作用于卵巢癌细胞SKOV-3细胞48h后,对照组与3×107、6×107、12×107 / mL数量的弓形虫速殖子培养上清组的卵巢癌细胞SKOV-3细胞G2/M期细胞比例分别为（22.43±3.78）%、（35.56±5.22）%、（38.76±3.19）%、（44.95±4.74）%,以12×107 / mL数量组增加最为明显,差异具有显着性意义（n=5, p<0.05）,提示培养上清具有诱导卵巢癌细胞SKOV-3细胞G2/M期停滞的作用,且有一定剂量依赖性。3.以浓度为12×107 / mL弓形虫速殖子培养上清作用后24、36、48、72h后的卵巢癌细胞SKOV-3细胞用Annexin-v-FITC与PI双染后,FCM分析细胞凋亡,结果表明其凋亡率分别为15.23℅、16.12℅、18.23℅、17.64℅,与空白对照组0.64℅、0.83℅、1.56℅、2.67℅比较有显着差异（p﹤0.05）。4.选择与数量为12×107 / ml弓形虫速殖子培养上清作用不同时间段的细胞置荧光显微镜下观察,可见2种细胞形态:早期凋亡细胞,细胞膜着绿色,核拒染;凋亡中晚期细胞与坏死细胞,核着红色,细胞膜着绿色,空白对照组的正常细胞不着色。5.以浓度为12×107/ml弓形虫速殖子培养上清作用细胞不同时间后的琼脂糖凝胶电泳均出现了相差约180-200bp的典型的细胞凋亡的DNA梯形条带。6.弓形虫速殖子培养上清作用前卵巢癌细胞SKOV-3细胞可见周期蛋白cyclinB1、cdc2与凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达的表达。上清作用48h后,与对照组相比,不同处理组的cyclinB1表达量（表达积分光密度值,下同）为0.86+0.04、0.73+0.06、0.60+0.05 ;cdc2蛋白表达量为0.98+0.02, 0.84+0.05、0.65+0.06;cyclinB1蛋白表达量为0.97+0.05, 0.81+0.02和0.78+0.05;cdc2蛋白表达量为1.23+0.03, 1.54+0.04、1.75+0.02,与对照组相比均有显着性差异（p<0.05）,以12×107 / mL数量的弓形虫速殖子组最为明显（p﹤0.05）。结论:弓形虫速殖子培养上清对体外培养卵巢癌细胞SKOV-3细胞增殖有明显的抑制作用,其途径可能与调节周期蛋白cyclinB1、cdc2等蛋白表达或活性改变引起细胞株G2/M期阻滞有关;同时,弓形虫速殖子培养上清还可通过上调凋亡相关蛋白Bax表达和下调Bcl-2表达来促使卵巢癌细胞SKOV-3细胞凋亡。
沈海英[6]（2010）在《弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究》文中提出目的:（1）探讨弓形虫速殖子体外培养、冻存和纯化的方法,为后续开展弓形虫的相关研究提供丰富而纯化的速殖子。（2）比较5种常用弓形虫速殖子DNA提取方法,为后续实验弓形虫速殖子DNA提取筛选高效简便的方法。（3）建立和优化LAMP反应体系,为弓形虫病的诊断建立一种灵敏度高、特异性强、简单快速的弓形虫DNA检测方法。方法:（1）将弓形虫速殖子接种至Hela细胞,动态观察速殖子在Hela细胞中增殖的体外培养过程。（2）速殖子中加入7%二甲亚砜和15%的乙二醇于-76℃冻存,观察6个月内两种防冻剂对速殖子的冻存保护效果。（3）比较3、5、8μm3种规格的滤膜对体内外培养的速殖子的纯化效果。（4）分别以试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法和盐析法提取10倍系列稀释的弓形虫速殖子DNA,通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR比较其效果。（5）采用环介导等温扩增技术建立了检测弓形虫DNA的方法,并对反应体系进行了优化,在此基础上进行特异性、敏感性评估,并与传统PCR进行了比较。结果:（1）弓形虫速殖子能在Hela细胞中较好的生长增殖,并且在96～144h增殖达到高峰,这个时间段收集速殖子产量较高,Hela细胞基本被破坏,含Hela细胞较少。（2）用7%二甲亚砜和15%的乙二醇-76℃冻存速殖子,第1个月末两者防冻效果没有明显差异（P >0.05）,第3个月末和第6个月末7%二甲亚砜的防冻效果优于15%的乙二醇（P<0.05）。随着时间的推移速殖子的存活率下降,但在6个月末两种方法冻存的速殖子都能成功感染小鼠。（3）在体内培养的速殖子纯化时,3、5、8μm3种规格的滤膜对白细胞的清除率无差别（P >0.05）;对红细胞的清除率随滤膜孔径的增加而降低,三者之间具有显着差异（P<0.05）;速殖子的回收率随孔径的增加而增加,三者间具有显着差异（P<0.05）。在体外培养的速殖子纯化时,3、5、8μm3种规格的滤膜对Hela细胞的清除率无差别（P >0.05）,速殖子的回收率随孔径的增加而增加,三者间具有显着差异（P<0.05）。（4）酚-氯仿法提取的DNA纯度最高,煮沸法、盐析法、直接裂解法和试剂盒法依次降低;琼脂糖凝胶电泳可检测出由直接裂解法、酚-氯仿法、盐析法提取1×106个速殖子的基因组DNA;试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法、盐析法提取的DNA经PCR扩增可检测最少速殖子的数量依次为1×104 ,无目的条带,1×102,1×101,1×103个。（5）通过对建立的LAMP扩增弓形虫DNA反应体系的优化,发现25μl体系以1.2 mM dNTPs,6mM MgSO4,8U Bst DNA聚合酶为佳,反应温度在63℃为佳,反应时间可根据需要选择30～60min之间,用琼脂糖凝胶电泳检测未能发现加入环引物能加快反应温度。甜菜碱对反应影响不大。特异性评估表明仅弓形虫检测阳性。LAMP的灵敏度比常规PCR高10倍,即每毫升可检测到个位数的速殖子数。在检测弓形虫感染小鼠组织标本时,两者特异性无差别。除琼脂糖凝胶电泳检测反应结果外,还可以通过比浊仪,离心后肉眼观察沉淀及加入荧光染料后在紫外灯下观察LAMP结果。结论:Hela细胞可用于弓形虫速殖子的体外培养增殖,速殖子在加入防冻剂的情况下可在-76℃冰箱保存半年以上,可以根据后续实验选择不同孔径的滤膜用于弓形虫速殖子的纯化。经典的酚-氯仿法体取速殖子DNA纯度高,但操作比较繁琐,直接煮沸法操作方便,能满足一般实验对DNA的提取要求。本研究建立的LAMP检测弓形虫基因组DNA方法,特异性强、敏感性高、简便快速且成本低,通过不断的改进,有望成为一种新的诊断弓形虫的方法。
陈雪艳[7]（2008）在《弓形虫依钙蛋白酶相关蛋白基因的cDNA克隆及重组蛋白表达》文中研究说明目的:利用RT-PCR扩增弓形虫RH株依钙蛋白酶相关蛋白（calpain-related）基因的cDNA片段,通过RNA点杂交和Northern blot鉴定该虫体calpain-related mRNA分子大小;构建原核表达载体并表达重组蛋白,为弓形虫的疫苗研究提供后选分子。方法:通过感染BALB ?c小鼠收集刚地弓形虫速殖子,提取虫体总RNA;根据弓形虫网络数据库(（http://www.toxodb.org）提供的推测calpain-related mRNA序列设计PCR扩增引物,用RT-PCR技术扩增弓形虫calpain-related cDNA片段,所获得的cDNA片段植入pGEM-T载体,提取重组质粒,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切法及测序鉴定cDNA序列;再经双酶切将该cDNA片段插入原核表达质粒pET32-a,重组表达载体经SalⅠ和BamHⅠ酶切及测序鉴定后,转化E. coli BL21感受态宿主菌,并以IPTG诱导表达calpain- related重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量及蛋白表达量。用calpain-related cDNA片段制备核酸杂交探针,用RNA点杂交（Dot-blot）和Northern blot观察该基因在弓形虫体内表达及calpain-related mRNA分子大小。结果:琼脂糖凝胶电泳分析表明所提取的弓形虫总RNA28SrRNA与18SrRNA的比值大于1,条带清楚。用calpain-related特异引物经RT-PCR扩增后获得弓形虫RH株calpain-related cDNA片段约500bp,与预期值相符。将该cDNA片段植入pGEM-T载体后经双酶切和测序鉴定,该cDNA片段长500bp, DNA序列与弓形虫网络数据库提供的推测calpain-related mRNA序列完全一致。所构建的pET32a?calpain-related表达载体经双酶切和测序鉴定表明表达载体框架和序列正确,该表达载体转化E. coli BL21宿主菌后在IPTG的诱导下可大量表达重组蛋白,所表达的重组蛋白分子量约26kD,与预期分子量相符。宿主菌所表达的重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖亲和层析分离柱纯化后获得大量重组蛋白。RNA Dot-blot结果表明calpain-related基因在虫体内表达;Northern blot结果提示弓形虫calpain-related mRNA的大小约6800bp。结论:本研究成功克隆出弓形虫calpain-related cDNA片段,并成功构建pET32a-calpain-related重组表达载体,该表达载体可在E. coli BL21宿主菌中大量表达重组蛋白,该重组蛋白将用于弓形虫疫苗免疫注射实验。
文秋嘉[8]（2006）在《胡桃楸提取物抗寄生虫作用及其机理的研究》文中研究表明本文应用胡桃楸提取物的有效成分,进行其抗弓形虫及其抗阴道毛滴虫机制的研究。首先,将胡桃楸树皮用酒精浸泡,然后经过减压蒸馏,再根据极性大小依次经有机物石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取,最后将乙酸乙酯萃取物过C60型硅胶柱,出现五条色带,洗脱,分别收集五条色带的流份,将各个流份分别做预实验,结果红色色带的洗脱流份具有明显的抑制弓形虫速殖子和阴道毛滴虫滋养体增殖作用。本实验将红色色带的洗脱流份作为胡桃楸抗弓形虫和阴道毛滴虫的有效成分。然后进行胡桃楸提取物的体内抑制弓形虫实验,观察实验过程中小鼠的一般状态和体重,最后处死小鼠,取胸腺及脾脏,称取重量计算胸腺指数和脾指数;剖取脑、肝脏、称重后,通过200目的钢网研磨成匀浆,计算弓形虫速殖子在脑、肝脏、脾脏的分布密度;用脾细胞悬液测定淋巴细胞转化功能,从器官和细胞因子水平研究胡桃楸的免疫调节机制。结果显示,胡桃楸提取物可显着抑制小鼠体内弓形虫的生长,而且可调节机体细胞免疫活性。另外,选用巨噬细胞作为体外弓形虫培养的的宿主细胞,用胡桃楸提取物刺激巨噬细胞内培养的弓形虫速殖子,进行了一系列测定速殖子增殖的实验,结果胡桃楸提取物对弓形虫速殖子有不同程度的抑制作用。为了避免受到提取物酸碱度、渗透压、鞣质和无机盐等非特异性理化因素的干扰,导致实验结果出现假阳性。于是,本实验进行了血清药理学实验,即在小鼠灌胃给药三天后经眼球采血分离血清,由此含药血清进行体外的虫体增殖实验。结果显示胡桃楸提取物的含药血清对弓形虫
张洪花,辛福敏,贾凤菊,岳继娥,李怀菊[9]（2000）在《弓形虫保种的实验观察》文中研究指明
谢霖崇,许世锷,陆秀君,郭衍[10]（1996）在《乙二醇保护剂冻存弓形虫速殖子的保种方法》文中提出本实验采用弓形虫小鼠腹水加入１５％乙二醇保护剂，分别置４℃和－２０℃冰箱冻存。按不同冷冻时间，分别经小鼠腹腔接种，结果在感染小鼠腹水中发现大量形态典型的弓形虫速殖子。实验证明，冻存于４℃的腹水保种效果较好，冷冻８５ｄ仍使小鼠发病致死；而冻存于－２０℃的腹水，４０ｄ仍有感染力。
二、弓形虫保种的实验观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、弓形虫保种的实验观察（论文提纲范文）
（1）弓形虫感染对小鼠疼痛行为影响的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviations) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：弓形虫感染小鼠模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：弓形虫感染对小鼠疼痛行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分：弓形虫感染小鼠血清中疼痛相关物质含量变化的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分：弓形虫感染小鼠脑组织中疼痛相关物质含量变化的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述：刚地弓形虫感染对宿主行为学的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）过氧化氢诱导弓形虫RH株速殖子凋亡的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要内容中英文缩写 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 实验材料 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 虫体，小鼠及细胞株 |
| 2.3 主要试剂盒 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 试剂配制 |
| 2.6 生物信息学软件 |
| 2.7 其它 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 弓形虫速殖子培养模型的建立 |
| 3.1.1 速殖子的复苏以及传种 |
| 3.1.2 速殖子小鼠体内的传代 |
| 3.1.3 速殖子液氮保种 |
| 3.1.4 RAW264.7 细胞系复苏、传代及保种 |
| 3.1.5 弓形虫速殖子毒力的检测 |
| 3.1.6 在 RAW264.7细胞内弓形虫速殖子连续传代保种 |
| 3.2 弓形虫速殖子的纯化 |
| 3.3 过氧化氢诱导弓形虫凋亡检测 |
| 3.3.1 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.2 弓形虫速殖子凋亡吉姆萨染色形态学观察 |
| 3.3.3 流式细胞术检测弓形虫速殖子凋亡率 |
| 3.3.4 弓形虫速殖子DNA含量的测定 |
| 3.3.5 凋亡过程中胞浆游离钙浓度的测定 |
| 3.4 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 弓形虫速殖子的体内培养及毒力检测 |
| 4.2 弓形虫速殖子的体外培养及毒力检测 |
| 4.3 两种孔径滤膜纯化速殖子结果比较 |
| 4.4 弓形虫速殖子凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.5 弓形虫速殖子凋亡的吉姆萨染色 |
| 4.6 H_2O_2对弓形虫速殖子凋亡程度的时间影响 |
| 4.7 H_2O_2对弓形虫凋亡过程中DNA含量的变化 |
| 4.8 H_2O_2诱导速殖子凋亡过程中游离钙变化 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者攻读学位期间的科研成果 |
| 本研究受以下基金资助 |
| 致谢 |
（3）金丝桃素抗弓形虫效果的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分：刚地弓形虫RH株体内和体外培养模型的建立 |
| 1）材料和方法 |
| 2）结果 |
| 3）小结 |
| 第二部分：金丝桃素体外抗弓形虫速殖子的实验研究 |
| 1）材料和方法 |
| 2）结果 |
| 3）小结 |
| 第三部分：金丝桃素对小鼠弓形虫病的影响 |
| 1）材料和方法 |
| 2）结果 |
| 3）小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录A 英中文术语缩略语对照表 |
| 附录B 常用试剂配制 |
| 附录C 个人简历及发表论文 |
| 附录D 综述 |
| 参考文献 |
（4）弓形虫核苷三磷酸脱氢酶功能分析及疫苗候选靶标的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 弓形虫NTPase-Ⅱ的基因克隆和蛋白表达 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、参考文献 |
| 第二章 抗弓形虫rNTPase-Ⅱ单克隆抗体的制备及其功能分析 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、参考文献 |
| 第三章 rTNTPase-Ⅱ对弓形虫感染的免疫保护及作用机制 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、参考文献 |
| 总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（5）刚地弓形虫培养上清对卵巢癌细胞SKOV-3的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 刚地弓形虫培养上清的提取与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 弓形虫培养上清对卵巢癌细胞SKOV-3 的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（6）弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 刚地弓形虫速殖子的体外培养、冻存与纯化 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 5 种方法提取弓形虫速殖子DNA 的效果比较 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 LAMP 法反应体系的建立优化及与PCR 法检测速殖子DNA 效果的比较 |
| 一、材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）弓形虫依钙蛋白酶相关蛋白基因的cDNA克隆及重组蛋白表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 第一章、弓形虫的培养和保种 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、结论与讨论 |
| 第二章 calpain-related 基因克隆及鉴定 |
| 一、calpain-related cDNA 片段的克隆 |
| 材料与方法 |
| 二、calpain-related cDNA 的原核表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 三、RNA Dot Blot、Northern Blot 鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 本章讨论与结论 |
| 1 讨论 |
| 2 结论 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 已发表论文 |
（8）胡桃楸提取物抗寄生虫作用及其机理的研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 研究一 胡桃楸提取物抗弓形虫作用及其机理的研究 |
| 技术路线 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 小结 |
| 研究二 胡桃楸提取物抗阴道毛滴虫体外作用的研究 |
| 实验流程 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
（9）弓形虫保种的实验观察（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 4℃存放对弓形虫感染力的影响 |
| 2 应用保护剂低温存放不同时间后弓形虫的存活率 |
| 结 果 |
| 1 4℃存放对弓形虫感染力的影响 |
| 2 应用保护剂低温存放不同时间后弓形虫的存活率见表2。 |
| 讨 论 |
四、弓形虫保种的实验观察（论文参考文献）
- [1]弓形虫感染对小鼠疼痛行为影响的研究[D]. 占云. 华中科技大学, 2017(03)
- [2]过氧化氢诱导弓形虫RH株速殖子凋亡的初步研究[D]. 朱勇. 南华大学, 2015(04)
- [3]金丝桃素抗弓形虫效果的研究[D]. 王旗. 蚌埠医学院, 2015(04)
- [4]弓形虫核苷三磷酸脱氢酶功能分析及疫苗候选靶标的研究[D]. 谭峰. 南方医科大学, 2011(05)
- [5]刚地弓形虫培养上清对卵巢癌细胞SKOV-3的影响[D]. 葛璞. 重庆医科大学, 2010(05)
- [6]弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究[D]. 沈海英. 苏州大学, 2010(01)
- [7]弓形虫依钙蛋白酶相关蛋白基因的cDNA克隆及重组蛋白表达[D]. 陈雪艳. 汕头大学, 2008(03)
- [8]胡桃楸提取物抗寄生虫作用及其机理的研究[D]. 文秋嘉. 吉林大学, 2006(05)
- [9]弓形虫保种的实验观察[J]. 张洪花,辛福敏,贾凤菊,岳继娥,李怀菊. 中国寄生虫病防治杂志, 2000(04)
- [10]乙二醇保护剂冻存弓形虫速殖子的保种方法[J]. 谢霖崇,许世锷,陆秀君,郭衍. 中国人兽共患病杂志, 1996(02)