一、原位杂交染色法检测SMAD4mRNA、P73mRNA在肝外胆管癌中的表达及临床意义（论文文献综述）
高健[1]（2020）在《基于TCGA数据库的肝癌基因表达谱分析及ARHGEF39在肝癌中表达模式及机制的研究》文中认为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,文中缩写为肝癌）是全球第三大癌症死亡原因。它归因于多种基因突变和表观遗传改变。乙型肝炎病毒（HBV）感染、酒精、黄曲霉毒素、肥胖和糖尿病是肝癌的其他危险因素。尽管肝癌的诊断和治疗有很多新方法,但由于高复发率和转移率,预后仍然较差。预后不良的一个重要原因是缺乏准确的HCC预后分级系统和有效的早期HCC筛查方法。因此,评估潜在的生物标志物在HCC诊断和治疗中的价值是合理的。本研究首先在癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中筛选肝癌预后相关的mRNA表达数据,然后对我院肝癌标本进行转录组测序基因分析,挖掘可能与预后相关的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,接着我们筛选到ARHGEF39作为候选基因并进行验证。ARHGEF39基因,又称C9orf100,是鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEFs）人类Dbl（Diffiuse B lymphoma）癌基因家族成员之一,是Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶（Rho GTPases）的重要激活因子。ARHGEF39在多种人类癌症中存在高表达,比如肺癌、胃癌和肝癌。这些数据表明,ARHGEF39可能在不同的癌症类型中频繁上调,并与肿瘤进展相关。既往有报道称,肝癌标本中ARHGEF39的mRNA水平较邻近非肿瘤组织明显上调。ARHGEF39基因水平表达上调和肝癌肿瘤数目及血清AFP高低呈正相关性。然而,我们对ARHGEF39蛋白在肝癌中的表达及预后相关性仍知之甚少。为了探究ARHGEF39在肝癌中的表达与临床病理特点及预后的关系,以及预测ARHGEF39与肝癌进程的关系,利用TCGA挖掘肝癌中ARHGEF39的表达信息和对应的临床病理资料,分析ARHGEF39在肝癌和癌旁组织中的表达情况以及与肝癌患者临床特征及预后的关系。并在我们肝癌标本中验证,结果显示ARHGEF39在肝癌组织中的表达高于癌旁组织（P<0.05）。ARHGEF39表达水平与TNM分期、血清甲胎蛋白（AFP）水平呈正相关P<0.05)。COX多因素分析显示ARHGEF39过表达、TNM分期、Child-Pugh评分是肝癌患者生存的独立预后指标。ARHGEF39可作为促癌基因在肝癌患者的肿瘤组织中呈高表达,提示肝癌患者预后不良,有望成为早期诊断肝癌的分子标志物和判断预后的指标。进一步地在前一部分研究的基础上,我们探讨ARHGEF39对肝癌生长和转移的影响及其潜在分子机制,长非编码RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）是一类细胞中大于200bp不具有编码蛋白功能的RNA.越来越多证据表明lncRNAs参与肿瘤细胞的多种调控过程,包括分化,增殖,凋亡,转移,干细胞特性等。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是属于基因进化历程中具有保守性的短非编码RNA,可以结合mRNA的3’端非翻译区（3’untranslated region,3’-UTR）对其进行转录后调控,MiRNAs也被报道在包括转移,凋亡,增殖,分化等多种细胞过程中起作用。研究报道lncRNA可作为竞争性内源RNA通过竞争性结合相同的miRNAs位点,抑制miRNAs对下游靶基因的靶向作用,提高靶基因的表达,从而调控肿瘤的进程。通过生物信息学分析及预测,我们提出了科学假说:ARHGEF39 通过与 lncRNA LINC00470 竞争 MicroRNA-4500（miR-4500）的活性位点来促进肝细胞癌的进展,于是我们通过体内细胞学及体外动物实验,证实LINC00470可通过吸附miR-4500上调ARHGEF39的表达;此外,解救实验显示,miR-4500抑制剂可以消除LINC00470抑制肝癌细胞进展的作用。因此,我们证明了 LINC00470可以作为miR-4500的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）,通过调控ARHGEF39的表达来促进肝癌的进展,这为肝癌患者的治疗提供了一个潜在的治疗靶点。第一部分基于TCGA数据库肝癌相关基因分析及筛选目的:肝癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一。本研究的目的是利用生物信息学分析,识别与肝癌发展相关的潜在中枢基因和失调通路。方法:1、基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库的肝癌组织mRNA表达谱分析,筛选肝癌预后相关的mRNA表达数据2、收集19对肝癌及癌旁组织的新鲜标本,随机选择5对进行转录组测序,并进行分析,寻找癌与癌旁DEGs,并绘制火山图和聚类图。3、我们筛选了两个平台的DEGs,通过选择这两个平台的交集,我们在来自TCGA数据库及本院肝癌标本队列的测序数据中找到了共同的DEGs。4、对交集的DEGs进行功能和通路富集分析。5、RT-qPCR验证候选基因在19对肝癌及癌旁组织中的表达情况。6、利用TCGA公共数据库中的肝癌数据进行Kaplan-Meier生存分析,了解候选基因与肝癌生存预后关系结果:1、利用TCGA数据库,筛选出肝癌及癌旁组织DEGs共1588个,其中在肝癌中高表达1520个,低表达68个;组织样本转录组测序共筛选出1281个DEGs,其中肝癌组织对比癌旁组织有873个mRNA表达呈上调趋势,有408个mRNA表达呈下调趋势。2、通过分别TCGA数据及本院组织样本转录组测序的数据交集联合分析,我们在肝癌中获得了 341个高表达的DEGs和31个低表达的DEGs。3、GO功能富集分析结果显示这些基因生物途径主要富集在浓缩核染色体外着丝点、Ndc80复合体、染色体乘客复合体等生物学过程。KEGG通路分析显示基因DNA复制、细胞周期等通路中富集。4、通过我们的分析,NT5DC2、ARHGEF39、SPSB2、SLC26A6、SLC52A2 被筛选作为候选基因。5、上述5个基因在我们的19例肝癌组织及相应的癌旁组织中的使用qPCR方法成功验证。6、TCGA数据分析显示候选基因的表达高低与肝癌患者的预后具有相关性。结论:本研究为肝癌发生的转录组解读和分子机制的研究提供了有用的信息,为开发新的生物标志物和进一步深入的研究提供了依据。第二部分ARHGEF39在肝细胞癌中的表达及其预后意义目的:既往研究报道ARHGEF39可能在不同的癌症类型中上调表达。然而,ARHGEF39表达水平与肝癌患者临床病理特点及预后的关系尚不清晰。因此,我们拟开展本部分实验对上述问题展开研究。方法:1、分析肝癌基因组图谱（TCGA）数据集中ARHGEF39的表达水平,通过TCGA数据库数据分析ARHGEF39与肝癌患者预后的关系。2、从基因和蛋白水平,分别验证我们收集的肝癌及癌旁组织中ARHGEF39的表达情况3、此外,我们还研究了 ARHGEF39表达与肝癌的临床病理特点及预后的关系。结果:1、TCGA数据显示,ARHGEF39在肝癌中呈高表达（P<0.05）。高水平的ARHGEF39是不良总生存（OS）的一个重要预后因素（TCGA,P=0.006）。2、肝癌标本中ARHGEF39 mRNA和蛋白的表达水平明显高于邻近肝标本（P<0.05）。3、我们调查了 ARHGEF39和患者的临床病理学特征之间的相关性,发现ARHGEF39高表达水平与肝癌的与血清甲胎蛋白（AFP）的水平（P=0.002,9.597）和 TNM stage（P=0.040,χ2=4.654）的显着正相关。4、进一步分析发现,高ARHGEF39水平与低OS（P<0.001）和短无病生存（DFS）（P<0.001）显着相关。Cox多因素分析显示,ARHGEF39是OS和DFS的一个独立的、不利的促进因素（P=0.000）。结论:ARHGEF39可能在肝癌的进程中作为癌基因发挥作用,可能是潜在的肝癌预后预测指标和治疗靶点第三部分LINC00470竞争性结合m i R-4500调节ARHGEF39的表达影响肝癌细胞恶性进展目的:基于第二部分研究,本部分研究旨在探究ARHGEF39在肝细胞癌中具体的功能和调控机制。方法:本部分主要通过分子生物学、生物化学的手段以及一系列体外细胞学功能实验（人肝癌细胞HepG2、Hep3B）和体内动物模型（人肝癌Hep3B细胞株）探究ARHGEF39在肝细胞癌中具体的功能和调控机制。1、通过qRT-PCR的方法检测ARHGEF39,miR-4500和LINC00470等相关基因的RNA水平;2、通过WB验证ARHGEF39的蛋白水平表达;3、MTT assay和克隆形成实验检测不同处理后细胞的体外生存能力;4、Caspase 3/7 activity assay 和 Nucleosome ELISA assay 检测细胞凋亡水平;5、Transwell assays检测细胞的体外迁移和侵袭能力;6、小鼠荷瘤体内动物实验评估对人肝癌Hep3B细胞ARHGEF39敲低后在体内肿瘤生长能力的影响;7、荧光素酶报告实验检测miR-4500对ARHGEF39和LINC00470的抑制作用;8、生物素标记的 RNA pulldown 技术检测 miR-4500 对 ARHGEF39 和 LINC00470的直接结合作用。结果:1、体外实验结果显示:下调ARHGEF39的表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭并促进其凋亡。2、敲低ARHGEF39抑制人肝癌Hep3B细胞株的体内肿瘤生长能力;3、ARHGEF39 在人肝癌细胞 HepG2、Hep3B 中被 miR-4500 负调控;ARHGEF39作为miR-4500靶基因,其表达水平可被miR-4500表达上调所抑制,表明在人肝癌细胞系中ARHGEF39-miR-4500负性调节关系的存在4、LINC00470扮演miR-4500的“海绵”角色调控ARHGEF39的表达;5、ARHGEF39对人肝癌细胞的恶性进程的效应依赖于LINC00470/miR-4500信号轴。结论:LINC00470通过吸附miR-4500促进ARHGEF39表达来调控肝癌的恶性进程,ARHGEF39至少部分通过LINC00470/miR-4500/ARHGEF39信号轴信号轴来促进人肝癌细胞HepG2、Hep3B的体外增殖,迁移和侵袭能力,以及抑制肝癌细胞体外凋亡能力。ARHGEF39,LINC00470,miR-4500可成为肝癌诊断和治疗的潜在靶标。
孟庆涛[2]（2019）在《外泌体穿梭miR-135在结直肠癌肝转移微环境中的机制研究》文中提出研究背景及目的结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是目前全球的第三大癌症死因,也是全球范围内因癌症死亡的主要原因之一。结直肠癌发病隐匿,多数确诊时已为晚期。结直肠癌患者死亡主要是由于转移发生,超过70%的患者会出现肝脏转移,肝转移是影响结直肠癌预后差的重要因素。阐释结直肠癌肝转移发生和发展的分子机制,探寻结直肠癌肝转移早期诊断标志物及有效的治疗靶点,是降低结直肠癌死亡率的关键。本研究中,通过microRNA微阵列芯片高通量筛选正常组织-腺瘤-结直肠癌发生和发展相关的差异miRNA,并通过进一步扩大样本量,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术验证并建立结直肠癌miRNA差异表达谱,筛选出在正常组织-腺瘤-结直肠癌中表达逐渐增加的miR-135a-5p进行后续的功能研究。结合结直肠癌患者及细胞外泌体分析,识别及验证外泌体miR-135a-5p调控的下游靶基因及相关信号通路,初步探讨外泌体穿梭miR-135a-5p在结直肠癌肝转移微环境中的作用机制,并进一步评价其作为结直肠癌诊断及预后标志物的诊断价值,为阐明结直肠癌肝转移的发病机理、发现早期诊断标志物及以miR-135a-5p为潜在干预靶点的个体化靶向治疗提供新的依据及策略。研究方法1.结直肠癌组织microRNA差异表达谱分析1.1招募经病理诊断确诊的来自不同样本的192例结直肠癌病人及192例腺瘤病人,所有患者术前均未经过放化疗治疗。所有结直肠腺瘤患者收集腺瘤组织。送检3例结肠癌患者组织样本（癌组织和癌旁组织）,3例直肠癌患者组织样本（癌组织和癌旁组织）,6例腺瘤患者组织样本。应用miRNA芯片筛选出在癌旁-腺瘤-癌组织中表达呈逐渐增加的miR-135a-5p做进一步的研究。采用qRT-PCR技术进一步在大样本中验证miR-135a-5p的表达水平。并采用ROC曲线评估组织中miR-135a-5p表达水平对于辅助诊断结直肠癌的效力。1.2应用组织芯片及原位杂交技术在已建立的具有10年随访资料的1078例结直肠癌患者组织芯片（也称组织微阵列,tissue microarrays,TMA）样本中进行miR-135a-5p的表达水平检测。多因素Cox回归分析对影响结直肠癌患者生存时间的因素（年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分级、TNM分期及miR-135a-5p表达水平）进行风险评估,进一步研究miR-135a-5p表达与结直肠癌患者发病风险及转移的关系。2.miR-135a-5p对结直肠癌转移的影响2.1利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建miR-135a-5p敲除的结直肠癌细胞,应用RNA原位杂交技术检测结直肠癌细胞中miR-135a-5p表达及肿瘤微环境缺氧对miR-135a-5p表达的影响。利用Transwell实验研究miR-135a-5p敲除后对结直肠癌细胞侵袭与迁移能力的影响。2.2将miR-135a-5p mimics转染结直肠癌细胞SW620,在构建裸鼠荷瘤模型中研究miR-135a-5p敲除及过表达对结直肠癌生长的影响。将构建的荧光素酶慢病毒感染SW620（野生型、miR-135a-5p KO）经尾静脉注射入裸鼠体内,酶标仪检测裸鼠荷瘤模型中的肿瘤、肝脏及肺组织组织匀浆的荧光强度,分析miR-135a-5p对结直肠癌细胞转移的影响。3.外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响及机制研究3.1利用差速离心法分离结直肠癌患者和健康对照人群血清中以及结直肠癌细胞SW620培养上清中的白色沉淀,通过透射电镜观察外泌体的形态。分析结直肠癌患者来源的血清中外泌体的数量与健康对照人群的差异及肿瘤微环境缺氧对结直肠癌细胞中外泌体分泌的影响。实时荧光定量qRT-PCR法检测外泌体中miR-135a-5p的表达,通过对结直肠癌样本进行分层分析探索结直肠癌患者外泌体中miR-135a-5p的表达水平与结直肠癌肝转移的相关性。构建Pre-niche（转移前微生态环境）肝转移小鼠模型,通过免疫荧光染色法对小鼠肝脏组织的外泌体表面标记分子（PKH26）及肝脏巨噬细胞（Kupffer细胞）表面标记分子（F4-80）进行检测。3.2构建Pre-niche肝转移小鼠模型,利用H&E染色分析血清中外泌体以及缺氧诱导的结直肠癌细胞上清外泌体中miR-135a-5p对小鼠肝组织的影响。3.3将SW620（WT,miR-135a-5p KO）细胞上清中的外泌体与人肝组织细胞共培养,利用转录组高通量测序技术分析miR-135a-5p作用在肝组织细胞上的下游靶基因,生物信息学分析筛选出淋巴细胞活化抗原CD30基因的3’UTR序列潜在性与miR-135a-5p结合,通过构建荧光素酶报告基因验证CD30与miR-135a-5p的结合作用。利用实时荧光定量qRT-PCR和Western blot法分别检测外泌体miR-135a-5p对CD30的mRNA和蛋白分子水平上的调控作用以及外泌体miR-135a-5p对CD30下游通路中免疫调控相关基因TNF受体关联因子2（TRAF2）、细胞核因子p65、人肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-2（IL-2）的表达调控。3.4利用生物信息学分析预测miR-135a-5p下游靶基因中与细胞粘附能力有关的基因大抑癌基因激酶2（LATS2）,构建荧光素酶报告基因验证LATS2与miR-135a-5p的结合,利用原位杂交及染色质免疫共沉淀（ChIP）法验证miR-135a-5p对LATS2下游通路中YAP1/TEAD/MMP轴的调控作用。3.5构建人源肿瘤异种移植模型（PDX模型）,采用实时荧光定量qRT-PCR检测PDX小鼠模型来源的肿瘤细胞外泌体对裸鼠肝组织中miR-135a-5p、CD30、TNFα、LATS2、Yes相关蛋白1（YAP1）及基质金属蛋白酶7（MMP7）基因的mRNA表达水平的影响。制备PDX单细胞进行细胞培养,分别转染miR-135a-5p mimics和miR-135a-5p knockdown质粒,利用Transwell实验检测miR-135a-5p对PDX模型中细胞迁移与侵袭能力的影响。构建结直肠癌细胞裸鼠肝转移模型,免疫荧光法检测PDX裸鼠模型来源外泌体miR-135a-5p对结直肠癌肝转移微环境的影响。4.血清miR-135a-5p应用于结直肠癌辅助诊断及预后评估的初步探索提取结直肠癌血清中总RNA,利用qRT-PCR方法检测同一结直肠癌患者发生肝转移前（2010年）以及发生肝转移后（2015年）血清中miR-135a-5p的表达水平,探索miR-135a-5p与结直肠癌患者发生肝转移的相关性。在本研究中,招募术前经过化疗的早期（I/II期）CRC患者样本探索miR-135a-5p对早期结直肠癌患者肝转移及预后的影响。将I/II期结直肠癌患者血清样本分为miR-135a-5p高表达组和miR-135a-5p低表达组,分析放化疗治疗对早期结直肠癌患者生存时间的影响。利用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）计算曲线下面积（area under the curve,AUC）来判断血清miR-135a-5p在CRC辅助诊断中的价值。主要研究成果1.结直肠癌组织miRNA差异表达谱的分析1.1结直肠癌患者组织中miRNA的差异表达分析miR-135a-5p在癌旁-腺瘤-癌组织中表达水平呈逐渐增加趋势,进一步在大样本中验证了miR-135a-5p的表达,差异均有统计学意义。miR-135a-5p单独诊断结直肠癌的AUC值在Testing样本、Valadation样本和combination样本中分别为0.73、0.77和0.74,表明肿瘤组织样本中miR-135a-5p的表达水平对结直肠癌的辅助诊断具有较高的效力。1.2 miR-135a-5p表达水平与结直肠癌发病风险研究TMA样本中miR-135a-5p的表达水平检测结果显示:Testing样本、Validation样本及Combination样本中结直肠癌组织中miR-135a-5p的表达水平显着高于癌旁组织。miR-135a-5p的表达与患者是否出现淋巴结转移、远端转移和肿瘤TNM分期有关（P<0.05）;患者年龄大于55岁、肿瘤恶性程度高、TNM为III/IV期以及高表达水平的miR-135a-5p是影响结直肠癌生存时间的危险因素（P<0.05）;miR-135a-5p高表达的结直肠癌患者的生存时间显着减少（P<0.0001）;miR-135a-5p的表达水平在肝转移的患者肿瘤组织与癌旁组织中的差异有统计学意义（P<0.001）,在除肝脏之外的其他器官转移的结直肠癌患者肿瘤组织与癌旁组织中miR-135a-5p的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）,提示miR-135a-5p与结直肠癌肝转移密切相关。2.miR-135a-5p对结直肠癌转移的影响2.1 miR-135a-5p在结直肠癌细胞中的功能研究缺氧微环境可以促进结直肠癌细胞中miR-135a-5p的表达。侵袭与迁移能力检测结果显示:miR-135a-5p过表达可以增加SW620、HCT116细胞的迁移和侵袭能力;缺氧对miR-135a-5p敲除后的SW620细胞的迁移和侵袭能力无显着影响。2.2 miR-135a-5p在体内实验中与结直肠癌肝转移的研究在裸鼠荷瘤模型中,miR-135a-5p敲除显着抑制了肿瘤的生长,miR-135a-5p过表达促进了肿瘤的生长。利用酶标仪检测裸鼠荷瘤模型中裸鼠的肿瘤组织、肝脏及肺组织的组织匀浆的荧光强度,发现miR-135a-5p敲除显着降低肿瘤组织及肝组织的荧光强度,miR-135a-5p过表达显着增加肿瘤组织及肝组织的荧光强度,不同处理组小鼠肺组织中的荧光强度无明显差异,提示miR-135a-5p可以促进结直肠癌的生长及肝转移的发生。3.外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响及机制研究3.1外泌体中miR-135a-5p在结直肠癌中的表达分析本研究在结直肠癌患者和健康对照人群血清中以及结直肠癌细胞SW620培养上清分离提取出白色沉淀,通过透射电镜观察发现白色沉淀物呈椭圆形或圆形,囊泡直径在30-50 nm,符合外泌体的形态学特征。结直肠癌患者来源的外泌体的数量明显多于健康对照人群,结直肠癌患者血清来源的外泌体中miR-135a-5p的表达水平高于健康对照组,并且肝转移的结直肠癌患者血清外泌体中miR-135a-5p的表达水平明显高于原发性的结直肠癌患者,缺氧促进SW620细胞中外泌体的分泌及外泌体中miR-135a-5p的表达。为了进一步研究外泌体是否进入肝脏组织中及在此过程中缺氧发挥的生物学作用,本研究构建了Pre-niche小鼠肝转移模型。发现结直肠癌来源的外泌体可进入肝脏组织,PKH26与F4-80的表达存在明显共定位现象。3.2外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响通过将结直肠癌肝转移病人血清来源外泌体经尾静脉注射入C57BL/6J小鼠体内,改变结直肠癌细胞外泌体微环境构建外泌体诱导小鼠肝转移模型（Pre-niche模型）,发现来源于结直肠癌肝转移病人血清外泌体处理的小鼠,注射SW620细胞后,肝脏组织出现明显的病理性改变,肝组织中出现明显的核分裂象的细胞即为肿瘤细胞,并且结直肠癌肝转移病人血清外泌体处理组的小鼠肝组织中miR-135a-5p的表达水平明显高于健康对照组。在小鼠的肺组织中未观察到明显的病理性改变。并且发现野生型SW620细胞上清外泌体诱导小鼠发生肝转移,而缺氧会促进肝转移的发生,同时肿瘤组织中miR-15a-5p的表达水平增加。相反,miR-135a-5p敲除的SW620细胞组小鼠肝组织未发现miR-135a-5p的表达,并且未发现明显的转移灶。3.3外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌免疫抑制的影响及机制研究筛选出miR-135a-5p作用在肝组织细胞上的靶基因,其中有13个基因在野生型SW620外泌体共培养的肝组织细胞中表达显着上调,8个基因表达显着下调。通过生物信息学分析发现只有CD30基因的3’UTR序列可以潜在性与miR-135a-5p结合。荧光素酶报告基因验证CD30 3’UTR区域序列可以与miR-135a-5直接结合,外泌体穿梭miR-135a-5p能够抑制CD30 mRNA和蛋白的表达。在体内实验中,外泌体穿梭miR-135a-5p可以抑制小鼠肝组织中CD30蛋白的表达。结合已有的文献报道,CD30可以与TRAF2蛋白相互作用从而激活NF-κB信号通路,参与机体的免疫调节,并且CD30可促进肿瘤坏死因子-a（TNF-α）与白介素-2（IL-2）的表达,进而调节CD4+T细胞的分化。本研究将野生型SW620上清来源的外泌体悬液经尾静脉注射入C57BL/6J小鼠体内,结果发现中外泌体处理组的小鼠肝组织中与CD30蛋白结合的TRAF2蛋白表达减少,NF-κB通路标签蛋白p65表达也相应减少,同样地,在HCT116细胞上清来源的外泌体处理组发现相似结果。外泌体中miR-135a-5p可以显着抑制小鼠血清中TNF-α的表达以及小鼠肝组织中IL-2的表达,从而抑制CD4+的分化,发挥抗肿瘤免疫作用。3.4外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌细胞粘附能力的影响及其机制研究利用9个miRNA靶基因分析网站预测,LATS2和SP3同时被9个网站预测可能与miR-135a-5p结合。已有研究指出,LATS2是调控细胞粘附能力重要的基因,与肝癌的发生发展与转移密切相关。因此,选取LATS2作为miR-135a-5p的下游靶基因进行后续的机制研究。构建荧光素酶报告基因验证了LATS2 3’UTR区域序列可以直接与miR-135a-5p结合。已有文献报道,LATS2通过与致癌性活化因子YAP1作用使其失活,YAP1/TEAD1作为转录因子调控基质金属蛋白MMP家族的转录表达,从而增强癌细胞的粘附能力。因此,我们进一步验证miR-135a-5p抑制LATS2的表达是否影响YAP1/TEAD/MMP/复合体的激活,从而为结直肠癌细胞转移至肝脏提供有力的转移前微环境。在动物实验中发现外泌体穿梭miR-135a-5p可以抑制小鼠肝组织中LATS2的转录,显着降低小鼠肝组织中LATS2的表达,从而促进YAP1的表达。外泌体穿梭miR-135a-5p可以显着增加小鼠肝组织中MMP7的表达。利用染色质免疫共沉淀法验证了转录因子YAP1/TEAD1可以与MMP7的启动子区结合,调控MMP7的转录翻译。且经含有miR-135a-5p表达的外泌体诱导后,小鼠肝组织细胞中YAP1/MMP7的结合增强,提示转录因子YAP1/TEAD1复合体可以调控MMP7的转录,外泌体穿梭miR-135a-5p可以增强YAP1/TEAD1与MMP7的结合作用,从而增加结直肠癌细胞在肝组织中的粘附能力。3.5 miR-135a-5p通过外泌体诱导促进PDX小鼠模型发生肝转移我们成功构建结直肠癌来源的PDX小鼠模型,发现与原位肿瘤来源的外泌体处理组相比,肝转移来源的外泌体处理组经SW620细胞注射后,小鼠肝组织中的miR-135a-5p、YAP1、MMP7的mRNA表达水平明显增加,肺转移来源的外泌体处理组小鼠肝组织中miR-135a-5p、CD30、TNFα、LATS2、YAP1及MMP7的mRNA表达水平无明显差异,表明外泌体miR-135a-5p可以调控结直肠癌肝转移发生过程中的免疫抑制通路及细胞粘附能力。miR-135a-5p在肝转移的PDX肿瘤组织中及PDX细胞上清外泌体中高表达,提示其与结直肠癌肝转移的发生密切相关,与前期结果相一致。细胞侵袭与迁移能力检测发现外泌体穿梭miR-135a-5p可以增强PDX模型中细胞迁移与侵袭能力,肝转移来源的PDX细胞恶性程度更高,具有较强的细胞侵袭与迁移能力。4.血清miR-135a-5p对结直肠癌肝转移筛查的初步探索在Testing样本、Validation样本以及Combination样本中,结直肠癌患者血清中的miR-135a-5p的表达水平显着高于健康对照人群,血清中miR-135a-5p单独诊断结直肠癌的AUC值在Testing样本、Valadation样本和combination样本中分别为0.83、0.71、0.74。结直肠癌患者发生肝转移后血清中miR-135a-5p的水平明显高于发生肝转移前。对于血清中miR-135a-5p高表达的I/II期早期结直肠癌患者,接受放化疗可明显增加患者的生存时间。提示血清中miR-135a-5p对结直肠癌的辅助诊断和预后评估具有一定的指导意义。研究结论1.miR-135a-5p在癌旁组织-腺瘤组织-结直肠癌组织中表达逐渐增加,与结直肠癌患者肝转移的发生和生存时间有关联。2.miR-135a-5p可以增强结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,促进结直肠癌肝转移的发生。3.外泌体穿梭miR-135-5p经Kupffer细胞吞噬进入肝脏,诱导肝转移前Pre-niche机制的形成,通过以下通路促进结直肠癌肝转移的发生:1)抑制肝组织中TNF-α和血清中IL-2的表达,从而抑制CD4+T细胞的分化,发挥抗肿瘤免疫作用;2)调节LATS2/YAP1/TEAD1/MMP7轴,增加结直肠癌细胞在肝组织中的粘附能力。4.血清中miR-135a-5p对结直肠癌患者辅助诊断和预后评估具有一定的指导意义。
朱凯[3]（2019）在《HBx基因调控S100A4蛋白促进肝癌细胞增殖及其临床预后相关性研究》文中研究表明[研究目的]乙型肝炎病毒（HBV）感染是人类肝细胞癌（HCC）发展的主要危险因素之一。在85%的HBV相关的HCC中都可以观察到HBV的DNA整合到基因组中。虽然大多数HBV基因在HCC组织中不表达,但在大多数HBV相关的HCC组织中检测到HBV-X（HBx）蛋白,表明HBx蛋白在HBV相关HCC的发展中起重要作用。HBx蛋白是一种多功能调节因子,与肝细胞癌的发病机制密切相关。然而,HBx蛋白致癌作用的分子机制仍未完全了解。本研究的目的是寻找与HBx调节肝癌发病相关的基因并确定其在肝癌发病机制中的临床意义,同时对干扰素IFN-α2b治疗乙型肝炎或HCC的机理进行研究,探讨IFN-α2b是否是通过抑制了 HBx相关基因的表达来对疾病进行治疗。[实验方法]1.HBx高表达细胞系的建立将携带HBx基因的慢病毒转入肝癌细胞系BEL7404使其高表达,并对其细胞功能变化进行验证,如体外增殖速度变化,体内成瘤速度变化,炎性因子释放量变化。2.HBx表达与S100A4蛋白表达水平关系验证使用基因转录组测序技术来分析高表达组与阴性对照组细胞差异表达基因。通过蛋白质印迹实验验证差异基因表达蛋白水平。将在HBx高表达细胞系中表达上调的S100A4蛋白进行shRNA敲低处理并检测细胞功能变化,以证明该差异基因与细胞功能的相关性。同时选用HBV全基因组转入的HepG2.2.15细胞系对HBV基因和S100A4的表达调控关系以及S100A4和细胞功能的关系进行进一步验证。3.分析S100A4与肝细胞癌临床预后的相关性利用免疫组化技术在180例肝细胞癌病人的癌组织中进行S100A4表达量检测,结合病人生存期验证S100A4与肝癌病人预后的相关性。[实验结果]1.HBx慢病毒转染:将携带HBx基因的慢病毒转入原代肝癌细胞中,经细胞增殖实验和裸鼠成瘤实验检测HBx高表达的细胞增殖速度明显快于对照组,且炎性因子的释放如IL-1β也呈上升趋势。2.差异基因分析:根据转录组测序分析结果筛选差异表达的基因。HBx高表达组肝癌细胞上调的基因有S100A4、IRF-7、RPS-27等;3.S100A4高表达及其功能验证3.1蛋白质印迹技术验证S100A4基因表达:S100A4是S100家族蛋白的重要成员,其功能是增加肿瘤进展和转移。经检测S100A4蛋白在HBx高表达的肝癌细胞中表达上调,提示该蛋白的高表达可能与细胞增殖速度变快有关。3.2 S100A4表达强度与细胞功能的关系:将HBx高表达组肝癌细胞中的S100A4使用shRNA进行敲低,随后进行功能验证,显示S100A4敲低后的肝癌细胞增值速度明显变慢。随后更换肝癌细胞系进行验证,得出相同的结果。3.3 S100A4表达强度与肝癌病人预后的关系:S100A4在肝癌患者的癌组织胞浆中高表达,且表达强度预生存期呈明显负相关关系。[研究结论]1.肝癌细胞中HBx过表达可以加快细胞增殖,并且转录组测序结果显示HBx过表达可以上调S100A4蛋白的表达。2.S100A4的表达与细胞增殖速度呈显着相关性,使用shRNA敲低S100A4可以导致细胞增殖变慢。提示S100A4可能有加快癌细胞增殖的作用,同时提示HBx基因可能通过调节S100A4蛋白的表达来改变细胞功能。3.S100A4在癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且与肿瘤体积大小、PD-L1的表达有显着相关性。S100A4的表达与肝癌病人的临床预后有显着相关性,提示S100A4可以成为治疗肝细胞癌的良好的靶点。
魏芳强[4]（2018）在《探索肝内胆管癌微创治疗可行性及胆管细胞驱动肝再生机制》文中认为第一部分:探索肝内胆管癌微创治疗可行性目的:肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是少见的肝脏恶性疾病。目前,微创手术（即腹腔镜手术）用于治疗ICC的相关研究较少,且都集中在小孤立ICC病灶治疗的研究上。微创手术治疗大（≥5cm）或者多发（≥2）ICC最主要的担忧是在腹腔镜下:是否能完整切除ICC病灶、留下足够的切缘,肿瘤是否容易发生破裂,是否会发生不可控制的出血及肿瘤种植,以及能否完成淋巴结清扫等。本部分研究旨在探索微创手术在治疗大或多发ICC的可行性、疗效和肿瘤学效益。方法:选取2004年5月至2016年1月间接受肝切除术的50例ICC患者。其中12例患者接受微创手术治疗大（≥5cm）或者多发（≥2）ICC（A组）,18例接受微创手术治疗小孤立ICC患者（B组）,20例接受开放手术治疗大或者多发ICC（C组）。比较各组围手术期结果及长期肿瘤学疗效。结果:与B组相比,A组患者T1肿瘤患者比例更低（58.3 vs.100%;P = 0.006）,术后住院时间更长（14 vs.9天;P=0.039）;两组在手术时间,术后出血,手术切缘大小,接受淋巴结清扫术比例,中转开腹率及发病率等无显着差异。微创手术治疗ICC过程中并未发现危及生命的严重并发症,也没有观察到病死率。术中无肿瘤破裂或弥散,术后无切口肿瘤种植发生。在中位随访22个月后,两组在3年总生存率（56.3 vs.59.5%;P>0.05）及无复发生存率（43.8 vs.50%;P>0.05）均无显着差异。相似地,A组和C组在围手术结果及长期疗效均无显着性差异。结论:微创手术用于治疗大或者多发ICC,在技术上是安全、可行的,并且肿瘤学疗效良好。未来更大的设计良好的临床试验值得被期待来研究这个话题。第二部分:探索胆管细胞驱动肝再生机制目的:在一般肝再生过程中,新生成的肝细胞来源于先前存在的肝细胞。然而,当肝细胞复制严重受损时,胆管上皮细胞（biliary epithelial cells,BECs）将去分化成肝脏前体细胞（liverprogenitorcells,LPCs）,后者继而分化为肝细胞或胆管细胞,帮助肝脏体积恢复,这个过程也叫胆管细胞驱动肝再生。目前,胆管细胞驱动肝再生机制仍不清楚。通过运用斑马鱼胆管细胞驱动肝再生模型,我们进行了基因和化学药物筛选,进而探索胆管细胞驱动肝再生过程中相关机制。方法:运用Tg（fabp10a:CFP-NTR）转基因背景鱼,以及利用RNA-seq数据,我们筛选了在胆管细胞驱动肝再生过程上调的9个基因,这些基因包括basp1,egfra,erbb2,dusp5,hbegfahbegfb,pprc1,tfe3a和TWEAK。同时我们筛选探索了 4种不同化合物在胆管细胞驱动过程中的潜在作用。通过Tg（Tp1:H2B-mCherry）及Tg（Tp1:VenusPEST）转基因来显示胆管细胞。肝脏体积大小用fabp10a:CFP表达情况定量。肝脏标记物用免疫荧光及整胚原位杂交显示。结果:上述9个基因的突变体在胆管细胞驱动肝再生过程中并未能呈现出任何表型缺陷。有趣的是,一种PI3K抑制剂LY294002可抑制肝再生过程。结论:运用斑马鱼胆管细胞驱动肝再生模型可进行基因和化学药物筛选;PI3K抑制剂可抑制胆管细胞驱动肝再生过程。未来更多的实验值得被期待来进一步探索PI3K/Akt信号通路如何调控胆管细胞驱动肝再生。
朱纯超[5]（2016）在《可切除胃癌的临床病理特征分析及胃癌肝转移相关全外显子组测序研究》文中指出【目的】通过对3121例仁济医院（东院）胃肠外科胃腺癌手术患者的临床病理资料分析,整理和总结胃癌患者临床特征、病理特征和手术方式等因素对预后的影响;通过对我院胃肠外科专业化调整前后胃癌手术资料的对比进行疗效分析,研究胃癌治疗专业化对胃癌手术疗效的影响;总结1142例D2根治手术、且淋巴结分组送检患者的转移淋巴结转移数据,分析不同部位胃癌的淋巴结转移情况;对其中23例肝转移患者的手术标本进行外显子测序研究,揭示肝转移性胃癌外显子突变的特点,并通过细胞迁移实验初步验证这些基因变化的功能。【方法】（1）收集2005年12月至2014年12月之间仁济医院普外科/胃肠外科收治的3121例胃癌切除手术患者的完整临床病理、围手术期和预后资料,以及其中1142例D2根治手术患者的分组淋巴结转移资料,对其中所包含的数据进行统计学分析。（2）对其中23例胃癌肝转移患者的原发肿瘤组织、肝转移组织及对照正常组织的石蜡包埋组织进行外显子测序研究,分析胃癌肝转移病例原发病灶和转移病灶中发生的相关点突变及插入缺失突变。并通过生物学通路分析研究原发病灶和转移病灶存在的通路突变。（3）采用Transwell小室空穿实验对外显子测序筛选出的胃癌肝转移原发灶中TGF-β通路相关的突变基因ACVR2A、SMAD4、INHBA,和转移灶中的肿瘤微环境相关突变基因ASPN、MST1的改变对胃癌细胞的迁移能力影响进行验证。【结果】（1）本组3121例患者中男性2125人（68.1%）,女性996人（31.9）;平均年龄为62.16±11.65岁,中位年龄62岁;行肿瘤根治性切除术2919例（93.5%）,姑息性切除患者202例（6.5%）;全胃切除849例（27.2%）,胃次全切除者2272例（72.8%）;开腹胃癌切除手术2835例（90.8%）,腹腔镜手术286例（9.2%）;134例患者行联合脏器切除。胃上部癌596例（19.1%）,胃中部癌662例（21.2%）,胃下部癌1473例（47.2%）,全胃癌362例（11.6%）,残胃癌28例（0.9%）;肿瘤大小均值为4.9±3.1cm,中位数为4.5cm;Lauren分型弥漫型1507例（48.3%）,肠型1614例（51.7%）;肿瘤分化程度高分化149例（4.8%）,中分化716例（22.9%）,低分化2256例（72.3%）;早期胃癌567例（18.2%）,进展期胃癌2554例（81.8%）;Bormann分型Ⅰ型（隆起型）119例（4.7%）,Ⅱ型（溃疡型）351例（13.7%）,Ⅲ型（浸润溃疡型）1726例（67.6%）,Ⅳ型（弥漫浸润型）358例（14.0%）;术后TNM分期ⅠA期494例（15.9%）,ⅠB期235例（7.5%）,ⅡA期338例（10.8%）,ⅡB期431例（13.8%）,ⅢA期391例（12.5%）,ⅢB期567例（18.2%）,ⅢC期484例（15.5%）,Ⅳ期181例（5.8%）。本组病例平均淋巴结送检数目为23.4±8.5枚,中位淋巴结送检数目为22枚,其中送检淋巴结数≥15枚的为2719例（87.1%）;平均淋巴结转移数目为5.0±7.0枚,中位数淋巴结转移数目为2枚;全组1、3、5年总生存率分别为86.9%、63.0%、53.7%,其中根治性切除患者1、3、5年生存率分别为88.9%、66.7%、57.2%;不同病理分期患者的五年生存率分别为:ⅠA期为92.4%,ⅠB期为87.6%,ⅡA期为75.7%,ⅡB期为63.2%,ⅢA期为50.1%,ⅢB期为33.7%,ⅢC期为20.2%;Ⅳ期8.8%。单因素分析显示患者年龄（P<0.001）、肿瘤部位（P<0.001）、肿瘤大小（P<0.001）、Lauren分型（P<0.001）、Bormann分型（P<0.001）、手术根治性（P<0.001）、T分期（P<0.001）、N分期（P<0.001）、M分期（P<0.001）、受检淋巴结数（P<0.001）、分化程度（P<0.001）、神经侵犯（P<0.001）、脉管侵犯（P<0.001）对胃癌患者总生存期影响有统计学意义;Cox回归分析显示肿瘤大小、手术根治性、T分期、N分期、M分期和脉管侵犯是患者生存的独立影响因素。专业化调整后术后腹腔内出血、吻合口漏和腹腔内感染及围手术期总并发症的发生率较专业化前下降,吻合口梗阻的发生略上升,但没有统计学差异;专业化调整后术后胰漏的发生率较专业化前显着上升;专业化调整前后患者在手术出血量、淋巴结清扫数目和术后出院时间数据上有明显差异,1、3年总生存率有显着提升;1142例淋巴结分组送检的胃癌D2根治术患者中,胃上部癌、胃中部癌和胃下部癌患者在No.1、No.2、No.3、No.4sb、No.4d、No.5、No.6和No.12a组淋巴结转移的发生率有显着差异;263例早期胃癌分析结果显示,不同部位的早期胃癌可发生不同组别的淋巴结转移;181例Ⅳ期胃癌中术后后是否有肿瘤残留对Ⅳ期胃癌切除手术患者的术后生存率存在差异;57例肝转移患者中肝转移是否可切除对预后影响有显着差异。（2）23例胃癌肝转移病例外显子测序结果显示原发灶和转移灶中中最特征性的碱基变换是C>T的变换,其中密码子ACG>ATG、CCG>CTG、GCG>GTG、TCG>TTG的变换频率最高。胃癌原发灶中共鉴定了19227个体细胞突变,其中单个核苷酸变异16986个,插入/缺失突变2241个;所有突变中位于蛋白编码区的共有11456个,其中非同义突变7577个,同义突变3330个,非翻译区突变549个。肝转移灶中共鉴定了9885个体细胞突变,其中单个核苷酸变异共8998个,插入/缺失突变共887个;所有突变中位于蛋白编码区的共有5856个,其中非同义突变4010个,同义突变1556个,非翻译区突变290个;原发灶驱动突变基因计算结果显示,TP53是最为显着的驱动突变基因,其他在原发灶中被显着计算出的驱动基因（P<0.01）包括ACVR2A、CNTN6、SMAD4、CCDC62、SULT1B1、NELL2、ACY3、OR51M1、VIP、和INHBA等;肝转移灶中显着的驱动突变基因（P<0.01）包括TP53、CTCFL、ASPN、PLD5、MST1、CEBPE、KLK5、GRAP2、ARHGAP42和FAM9A等;23例肝转移性胃癌较24例TCGA中非远处转移的胃癌样本中有更高的TP53突变率（70%VS38%）;生物功能和信号通路富集肝转移性胃癌和非远处转移的胃癌突变基因所在通路在脂肪酸合成、ABC转运、赖氨酸降解、核糖体合成、RNA转运、RNA降解、甘油酯代谢、过氧化物酶体、叶酸参与的一碳单位代谢、鞘脂类代谢、胆汁分泌、溶酶体、mRNA检查通路、氨基酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢途径、Notch信号通路、三聚体G蛋白信号通路、Rho-GTP酶的细胞骨架调节、葡萄糖剥夺的p53通路、白细胞间信号通路和TGF-β信号通路一有显着差异。原发灶和肝转移灶的共同突变占原发灶所有突变的5%-52.3%,平均27.7%;占转移灶共有突变的4.7%-60.0%,平均33.0%。（3）对外显子测序筛选出的相关基因的细胞迁移功能验证试验中显示:瞬转干扰ACVR2A基因表达后,NCI-N87和AGS细胞的空穿迁移能力明显弱于对照组（P<0.001）;瞬转干扰SMAD4基因表达后,NCI-N87和MKN-45细胞的空穿迁移能力明显强于对照组（P<0.01）;瞬转干扰INHBA基因表达后,NCI-N87和BGC-823细胞的空穿迁移能力明显弱于对照组（P<0.01）;瞬转干扰ASPN基因表达后,NCI-N87和BGC-823细胞的空穿迁移能力明显弱于对照组（P<0.01）;瞬转干扰MST1基因表达后,NCI-N87和MKN45细胞的空穿迁移能力明显强于对照组（P<0.05）。【结论】（1）患者年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、Lauren分型、Bormann分型、手术根治性、T分期、N分期、M分期、受检淋巴结数、分化程度、神经侵犯、脉管侵犯对胃癌患者总生存率影响差异有统计学意义。肿瘤大小、手术根治性、T分期、N分期、M分期和脉管侵犯是患者长期生存的独立影响因素。我院胃肠外科专业化改革后胃癌的疗效得到提高,表现在围手术期并发症率的降低、微创手术率的提高和预后的改善。胃癌D2根治手术患者的不同组别淋巴结转移和肿瘤部位有关。IV期胃癌手术后是否有肿瘤残留、肝转移患者能否治愈性切除对患者的预后有显着影响。（2）胃癌肝转移患者原发灶基因突变和非远处转移患者的突变有相似也有特别之处,TP53突变率显着较高,且TGF-β信号通路相关基因发生突变的患者比率显着高于非远处转移性胃癌。原发灶和肝转移灶发生的突变显着富集到细胞运动、肿瘤微环境、染色体重构等生物学通路中。（3）通过外显子测序筛选出的TGF-β信号通路相关基因ACVR2A、SMAD4和INHBA,以及肿瘤微环境相关蛋白编码基因ASPN和MST1的改变均可以显着影响胃癌细胞的迁移能力。
林海[6]（2013）在《胰腺癌中OCT4、PTTG1、TAGLN2的表达及TGF-β信号通路对TAGLN2在胰腺癌转移中的作用》文中认为胰腺癌（Pancreatic carcinoma）的发病率在世界范围内呈上升趋势,因其恶性程度高,是目前预后最差的消化道肿瘤。尽管医疗诊断水平不断提高,手术技术不断改进及肿瘤靶向药物治疗不断发展,但胰腺癌的治疗效果并没有明显改善,5年生存率没有明显提高。因此,进一步探索胰腺癌的发生、发展、增殖、侵袭转移机制、寻找新的诊断标记物和治疗靶点是提高胰腺癌治疗疗效的关键。目的1.探讨OCT4在胰腺癌组织和癌旁组织（距癌边缘≥2cm）中的表达和临床病理特征之间的关系以及OCT4与胰腺癌细胞的增殖、分化和侵袭的关系；2.研究PTTG1蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织（距癌边缘≥2cm）中的表达及其与胰腺癌临床病理特征的关系；3.研究TGF-β1和TAGLN2蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织（距癌边缘≥2cm）中的表达及其与临床病理特征的关系和二者之间的相关性；探讨维汉民族胰腺癌中TGF-β1和TAGLN2蛋白表达的差异。方法1.应用免疫组织化学方法半定量检测人胰腺癌的组织芯片中OCT4表达水平；应用Real-time PCR方法定量检测OCT4和AKT mRNA在胰腺癌细胞上的表达水平,用2-△△Ct方法计算AKT mRNA的表达；Western blot试验定量检测胰腺癌组织中OCT4蛋白表达；并应用MTT法检测感染Lv-shOCT4的细胞的增殖能力、碳酸脂膜侵袭实验测定感染Lv-shOCT4的细胞的侵袭能力。2.应用免疫组织化学方法检测胰腺癌组织中PTTG1蛋白的表达；并对PTTG1蛋白表达水平与患者的临床病理特征关系进行分析。3.应用免疫组织化学染色检测106例石蜡包埋切片胰腺癌组织中TAGLN2、 TβRⅡ、p-Smad2/3的表达；对TAGLN2、TβRⅡ、p-Smad2/3的表达与胰腺癌临床病理特征进行分析；对其中46例液氮冷冻的新鲜组织标本-80℃冰箱保存的胰腺癌组织、癌旁组织标本应用Western blot方法检测‘TAGLN2、TPRⅡ、p-Smad2/3的表达。结果第一部分（1）OCT4在胰腺癌组织和癌旁组织主要位于细胞核中,胰腺癌组织中的表达强于癌周组织,两者间有统计学差异（P<0.05）；（2）应用Real-time PCR和Western blot assays检测不同分化程度胰腺癌细胞（Bxpc3, Panc-1和Mia PaCa-2）中OCT4的表达,在Panc-1细胞中OCT4的表达显着高于其他两型细胞中；（3）OCT4表达与胰腺癌患者临床病理特征的关系中,与肿瘤的分化程度相关（P<0.05）,与肿瘤大小、部位、远处转移、年龄、性别无关（P>0.05）;（4）胰腺癌Panc-1细胞经转染成Lv-shOCT4后,应用Real-time PCR和Western blot试验检测OCT4和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的mRNA和蛋白表达水平。与NC和CON组相比,在Lv-shOCT4组中OCT4和AKT的表达明显下降（P<0.01,每组）；（5）胰腺癌Panc-1细胞经转染成Lv-shOCT4后,使用MTT法连续3天检测细胞增殖能力；发现与NC和CON组比较,Lv-shOCT4组中OCT4以时间依赖的方式明显抑制了Panc-1细胞的增殖活力（P<0.01）；（6）通过Transwell实验,与NC和CON组比较,Lv-shOCT4组Panc-1细胞的侵袭潜能明显减弱（P<0.01）, OCT4具有下调细胞侵袭能力的作用。第二部分（1）胰腺癌组织中和癌旁组织中PTTG1蛋白主要在细胞质中有不同程度的阳性表达,胰腺癌组织明显强于癌旁组织,两者间有差异性（P<0.05）；PTTG1表达与胰腺癌患者的性别有相关性,与肿瘤的分化程度、大小、位置、患者年龄、临床分期、远处转移无相关性（P>0.05）。第三部分（1）胰腺癌组织中TAGLN2、TβRⅡ、p-Smad2/3的染色主要位于细胞质中,癌组织表达强于癌旁组织,两者间差别有统计学意义（P<0.05）；（2）免疫组化显示,胰腺癌组织中TAGLN2、TβRⅡ、p-Smad2/3的蛋白表达与肿瘤组织分化程度、神经侵润、肿瘤分期有关（P<0.05）; TβRⅡ、p-Smad2/3的蛋白表达还与肿瘤远处转移有关;（3） Western-blot验证了癌组织TAGLN2、TβRⅡ、p-Smad2/3蛋白表达水平与肿瘤组织分化程度、神经侵润、肿瘤分期有关（P<0.05）；（4）并且胰腺癌组织中TAGLN2与TPRⅡ、p-Smad2/3蛋白表达均具有正相关性；维汉民族胰腺癌组织中胶转蛋白2、TβRⅡ和p-Smad2/3表达无差异（P>0.05）；结论第一部分（1）OCT4在胰腺癌中的表达水平与肿瘤的分化程度有关,与肿瘤的大小、淋巴结转移于否无关；下调OCT4表达,可抑制胰腺癌细胞的增殖、分化和侵袭性；OCT4可能通过AKT信号传导通路影响胰腺癌的发生发展；第二部分PTTG1蛋白在人胰腺癌组织中高表达,其表达水平与胰腺癌患者的性别有关,与肿瘤位置、大小、分化程度、神经浸润、远处转移、年龄无关。第三部分（1） TβRⅡ、p-Smad2/3、TAGLN2在胰腺癌组织中存在蛋白的高表达；（2） TβRⅡ、p-Smad2/3、TAGLN2与胰腺癌的局部侵犯、肿瘤分化程度、肿瘤分期相关,与维汉民族、肿瘤大小、部位、性别、年龄无关；（3） TAGLN2和TGF-β有正相关性,在胰腺癌的发生、增殖和转移中,可能具有协同作用；
陆新升[7]（2013）在《盐霉素抗膀胱癌T24细胞作用机制及对Mta-1基因及Smad4基因表达的影响》文中研究表明目的：膀胱癌是我国泌尿外科最常见的恶性肿瘤。是一种严重威胁患者生命安全的疾病。目前对非浸润性膀胱癌最主要的治疗手段是经尿道膀胱肿瘤电切手术加术后灌注化疗。术后灌注化疗可以有效的降低膀胱癌的复发率,但是目前膀胱灌注化疗的药物毒性较大,副作用多,很多患者无法耐受而导致终止灌注化疗。盐霉素是一种典型的具有特殊环状结构的离子载体抗生素,属于聚醚类一元羧酸。本身是一种具有低毒、低残留特性的抗球虫剂及促生长素。然而2009年美国科研人员发现其是一种可以直接瞄准杀死肿瘤干细胞的的化合物,其不但可以直接杀灭肿瘤干细胞,还可以抑制肿瘤干细胞分化出新生的肿瘤细胞及减缓肿瘤的生长速度。本实验通过研究盐霉素对膀胱癌T24细胞的体外抗肿瘤作用及从分子生物学角度阐述盐霉素对膀胱癌T24细胞基因的影响,力图揭示盐霉素对膀胱癌的抗肿瘤作用机制,对将盐霉素应用于临床膀胱癌术后灌注化疗提供理论依据。方法：（1）体外传代培养人类膀胱癌T24细胞系；（2）应用四氮噻唑蓝（MTT）法测定盐霉素对膀胱癌T24细胞增殖的影响；（3）应用光镜及流式细胞仪观察测定盐霉素对膀胱癌T24细胞凋亡的影响；（4）应用RT-PCR, Western-blot方法探讨盐霉素对癌基因Mta-1及抗癌基因Smad-4基因表达的影响。结果及讨论：（1）盐霉素能诱导人膀胱癌T24细胞凋亡,随着盐霉素作用时间和浓度的增加,T24细胞的凋亡明显增加,统计学分析表明药物浓度和作用时间与细胞凋亡率呈正相关；盐霉素抑制人膀胱癌T24细胞增殖,随着盐霉素作用时间和浓度的增加,T24细胞的增殖明显受到抑制,统计学分析表明药物浓度和作用时间与细胞凋亡率呈负相关；（2）盐霉素作用于膀胱癌T24细胞,可以抑制膀胱癌T24细胞Mta-1基因的表达,通过这种抑制作用可能降低膀胱癌T24细胞的侵袭力及转移力,从而降低膀胱癌术后复发率；（3）盐霉素作用于膀胱癌T24细胞,可以增加膀胱癌T24细胞Smad4基因的表达,通过这种作用机制可以抑制膀胱癌细胞增殖及促进凋亡,可能是盐霉素抗膀胱癌的作用机制之一。
常颜信[8]（2013）在《胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究》文中研究指明第一部分胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究研究背景和目的胆囊癌是胆系恶性肿瘤中最常见的肿瘤，近年来其发病率上升较快，其发病率在胃肠道肿瘤里占第5位。胆囊癌被认为是侵袭性和致死性最高的恶性肿瘤之一，其较强的侵犯特性使得胆囊癌即使行外科手术切除后预后也非常差。早期胆囊癌无症状或仅有上腹部不适感，发病隐匿，诊断困难，常被忽视或漏诊，至晚期可出现腹痛、黄疸及消瘦等症状，但多数患者已无手术机会，进展期胆囊癌预后效果较差，术后5年存活率约为5%。近几十年来关于胆囊癌的研究有了一定的进展，但是胆囊癌高转移、高侵袭特性的分子机制尚未被完全阐明。microRNA（miRNA）是一种只有18-22个碱基左右的小分子非编码RNA，通过转录后调控机制影响基因表达。miRNA几乎参与了与肿瘤相关的所有过程，包括增殖、分化、凋亡、转移、血管生成、免疫应答等，并且功能研究表明其在肿瘤中起着致癌或者抑癌基因的作用，在肿瘤的诊断、发生发展、预后中具有重要的意义。但是目前关于miRNA在胆囊癌中的相关研究未有系统报道。miR-20a定位在染色体13q31，是miRNA17-92簇的成员之一。研究表明17-92簇的miRNAs成员在多种肿瘤里起着癌基因的作用。但是，miR-20a却鲜见研究和报道。本研究从高内涵筛选出发，系统性筛选胆囊癌转移相关的miRNAs，筛选出包含miR-20a在内的17个miRNAs，继而通过胆囊癌、癌旁差异性表达确定miR-20a为研究对象，在胆囊癌细胞株、稳定表达细胞系和动物水平研究miR-20a的促进肿瘤生长和促进肿瘤转移功能，继而通过生物学预测的方法去研究miR-20a的靶基因，通过多种生物学方法确定Smad7为miR-20a的靶基因，然后明确Smad7在miR-20a促进胆囊癌生长和转移中的依赖作用，进一步阐明Smad7通过影响β-catenin的转录活性和下游基因的表达是miR-20a促进胆囊癌生长、转移的分子机制，并结合临床样本明确miR-20a和Smad7在胆囊癌中的预后作用。实验方法1.通过高内涵成像和分析系统，用人的miRNAs库mimics转染胆囊癌细胞系GBC-SD，通过F-actin染色，筛选出胆囊癌转移相关的miRNAs；2.通过Real-tim PCR和miRNA原位杂交的方法检测胆囊癌冰冻组织、正常胆囊粘膜组织中17个转移相关的miRNAs的差异性表达，确定miR-20a为最终的研究对象。3.体内观察抑制miR-20a后胆囊癌生长和转移特性的变化：（1）miR-20a和胆囊癌生长特性的关系——裸鼠皮下荷瘤模型；（2）miR-20a和胆囊癌转移和侵袭的关系——脾脏注射肝转移模型。4. miR-20a的靶基因的确定：miRanda and TargetScan等生物学预测工具寻找可能的靶基因、 pGLO-Smad7dual luciferase report gene assay检测miR-20a对靶基因3’UTR的binding作用、Western blot和Real-time PCR检测miR-20a在蛋白和mRNA水平对靶基因的抑制作用，Real-time PCR检测在胆囊癌和裸鼠皮下荷瘤模型样本中Smad7和miR-20a的表达以及相关性。5. Smad7在胆囊癌中的作用：（1）Smad7在胆囊癌和正常胆囊组织中的表达情况：Real-time PCR，免疫组化；（2）Smad7对胆囊癌细胞生长中的影响——CCK8assay；（3）Smad7对胆囊癌细胞转移和侵袭的影响：Transwell assay、Matrigel assay、Western blot、Real-time PCR。6. Smad7作为miR-20a的直接靶基因在miR-20a的生物学功能中的作用（1）Smad7在miR-20a对胆囊癌细胞促生长中的作用——Smad7表达质粒和miR-20a共转染后进行CCK8assay；（3）Smad7在miR-20a对胆囊癌细胞促转移和侵袭中的作用：Smad7表达质粒和miR-20a共转染后进行Transwell assay、Matrigelassay、Western blot。7. Smad7下游靶基因β-catenin的相关研究：（1）miR-20a、Smad7对β-catenin转录活性的影响——β-catenin报告基因活性检测、β-catenin蛋白核转位Western blot检和免疫荧光检测；（2）β-catenin转录活性在胆囊生物学功能中的作用——LiCl刺激胆囊癌细胞后Transwell assay、Matrigelassay、Real-time PCR检测。8. miR-20a及靶基因在临床样本中和预后的关系：miRNA原位杂交检测miR-20a在石蜡样本中的表达、免疫组化检测Smad7基因等。9. miR-20a诱导的Smad7抑制在TGF-β1通路中的作用：Transwell assay、Matrigelassay、Western blot等。实验结果1.通过人类miRNA库mimic转染胆囊癌细胞进行F-actin测定的高内涵系统筛选出17个可以明显上调F-actin的miRNAs，即胆囊癌转移相关miRNAs。通过胆囊癌差异性表达检测确定miR-20a为核心的胆囊癌转移相关miRNA；2. miR-20a过表达通过上皮细胞间制化促进胆囊癌细胞的转移、侵袭，并促进胆囊癌细胞的生长；3.动物模型证实抑制miR-20a可以明显抑制胆囊癌的生长和转移；4. Smad7被证实为miR-20a的直接靶基因；5. Smad7在胆囊癌中起抑癌基因作用，并且其在miR-20a的促癌作用中起关键作用；6. Smad7通过影响β-catenin的转录活性发挥作用；7. miR-20a的过表达和胆囊癌患者的生存明显呈负相关；8. TGF-β1可以诱导miR-20a表达升高，miR-20a在TGF-β1诱导的EMT过程中起重要作用。结论本研究通过高内涵的方法筛选出了和胆囊癌转移相关的miRNAs，体内外证实miR-20a通过靶向Smad7在胆囊癌的转移和生长中起关键作用，miR-20a过表达、Smad7低表达患者有较差的预后，结果提示：干预miR-20a可能成为胆囊癌治疗的重要部分。第二部分自噬在肝母细胞瘤中的功能和机制研究研究背景和目的肝母细胞瘤是3岁以下儿童最常见的肝脏恶性肿瘤，占全部儿童恶性肿瘤的1%，占小儿肝脏恶性肿瘤的90％。约70%的儿童在发现肿瘤时可以成功切除，早期的肝母细胞瘤可以有约90%的1年生存率和65%的5年生存率。辅助化疗和肝移植术为肝母细胞瘤提供了手术切除意外的保障。其发生发展是多因素综合作用的结果，包括基因组和环境等因素。近年来，研究表明染色体11p15区的缺失突变，IL-1β和IL-6，β-catenin/Wnt通路的异常等都和肝母细胞瘤密切相关。但是该肿瘤机制尚未完全明了，治疗和预后仍面临诸多问题。自噬是一种革命性的新发现，它是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程，在清除无用的、累积的蛋白质聚集物、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。自噬调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。近几年自噬有了较大的发展，多种自噬相关基因（ATGs）被发现，但对其深层次机制的认识上尚需进一步的研究和发现。近年来研究表明，自噬和多种肿瘤的发生发展有密切联系。但是目前其对肿瘤是保护还是抑制作用是有较大分歧的，可以认为自噬抑制肿瘤的发生，却促进了肿瘤的进展。在某些肿瘤中，自噬减弱最终会导致癌基因的突变和对肿瘤的易感性。如鼠的BECN1经过断裂突变处理后发现淋巴瘤、肺癌和肝癌高发，表明了自噬的抑癌作用。相反地，在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中，抑制自噬可以显着提高肿瘤最化疗的敏感性，此时自噬是促进肿瘤发展的。然而自噬是否参与肝母细胞瘤的发生发展并在其中发挥重要作用目前国内外未见相关报道。本实验首先观察自噬相关基因ATG5、BECN1在人肝母细胞瘤组织中的表达情况，然后在肝母细胞瘤细胞中通过饥饿和化疗两种方式去诱导自噬的发生，并检测自噬相关基因的变化，确定在肝母细胞瘤中的起主要作用的自噬相关基因，进一步通过自噬特异性抑制剂和siRNA干扰技术，明确自噬在肝母细胞瘤自然生长和化疗中的作用，最终在动物模型中去进一步验证自噬在肝母细胞瘤中的作用。实验方法1.通过电镜、Western blot、Real-time PCR、免疫组化等方法检测肝母细胞瘤中自噬活性及相关基因的表达；2.通过饥饿的方法诱导肝母细胞瘤细胞产生自噬，检测其中自噬相关基因的变化，并在饥饿同时加入自噬抑制剂，观察自噬在饥饿刺激中的作用；3.通过化疗药物刺激的方法诱导肝母细胞瘤细胞产生自噬，检测其中自噬相关基因的变化，并在化疗药物刺激同时加入自噬抑制剂，观察自噬在肝母细胞瘤化疗敏感性中的作用；4.通过siRNA干扰和自噬抑制剂确定肝母细胞瘤自噬相关基因和相关信号通路；5.裸鼠皮下荷瘤注射自噬抑制剂进一步明确自噬在肝母细胞瘤中的生物学功能。实验结果1.自噬在肝母细胞瘤中高度激活；2.自噬保护了肝母细胞瘤中饥饿诱导的自噬性凋亡；3.自噬保护了肝母细胞瘤中化疗诱导的自噬性凋亡，抑制自噬可以提高其化疗敏感性；4. BECN1/PI3K通路在肝母细胞瘤自噬中起关键作用；5.抑制自噬可以抑制肝母细胞瘤的生长。结论本研究发现自噬在肝母细胞瘤中被激活，并发现自噬在饥饿和化疗诱导的细胞凋亡中起保护作用，抑制自噬可以抑制肝母细胞瘤的生长，并提高其对化疗药物的敏感性。其中BECN1/PI3K通路起关键作用。本研究为深入理解自噬在肝母细胞瘤中的作用和机制提供新的线索，并为该病的治疗提供新的潜在靶点和策略。
刘薇[9]（2011）在《外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的生物学作用及其分子机制的研究》文中研究说明第一部分外源性IL-6对QBC939细胞凋亡及BcI-2 mRNA表达的影响背景胆管癌是一种来源于胆管上皮的,具有去分化及侵略性特征的恶性肿瘤,它的发病经过一个从正常胆管上皮细胞转变为炎症胆管上皮细胞,然后去分化自主增生成为癌前病变最后癌变的过程,炎症因子在这个过程中发生了重要的作用。IL-6被认为是与胆管癌的发生发展密切相关的炎症因子,IL-6能够刺激炎性胆管上皮细胞和胆管癌细胞增殖,并且在其他细胞如CD34-造血干细胞、肝脏星状细胞、肾癌细胞株等的实验研究中发现IL-6能够通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Mcl-1、Bax、Bcl-xL等的表达从而达到抗凋亡的作用。bcl-2是一种有抑制凋亡作用的癌基因,在多种肿瘤中已经证实了bcl-2与肿瘤细胞逃避凋亡相关。将正常胆管细胞长期与感染性胆汁接触可增加Bcl-2的表达,这提示细胞因子持续刺激与Bcl-2表达的改变之间可能存在联系。目的观察外源性IL-6对胆管癌细胞系QBC939凋亡以及Bcl-2 mRNA的影响。方法1、用MTT法观察外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939增殖的作用；2、通过Annexin V/FITC和PI染色流式细胞分析检测外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响。3、用RT-PCR检测外源性IL-6对Bcl-2 mRNA表达的影响。结果1、外源性IL-6处理后,QBC939增殖较对照组增高,差异有统计学意义（P＜0.01）,在一定剂量范围内,外源性IL-6促进QBC939增殖的效应有浓度依赖性,且剂量效应呈对数关系（P＜0.05）；2、外源性IL-6处理后QBC939凋亡率比对照组下降,差异有统计学意义（P＜0.01）；3、Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL外源性IL-6培养QBC939细胞24小时后,RT-PCR检测Bcl-2 mRNA含量逐渐增加,统计学差异有显着性（P＜0.01）并且与浓度正相关（r=1）。结论1、在体外试验中,外源性IL-6在一定剂量范围内呈浓度依赖方式促进QBC939细胞生长,并抑制QBC939细胞凋亡2、外源性IL-6抑制QBC939细胞凋亡可能与上调Bcl-2基因表达相关。第二部分外源性IL-6调控胆管癌细胞QBC939 Bcl-2基因表达的分子机制研究背景目前已知IL-6可以通过与广泛分布于胆管癌细胞膜表面的IL-6受体（IL-6 receptor, IL-6R）相结合形成IL-6/IL-6R复合物,激活如下两条信号通路：JAK/STAT和Ras/MAPK。IL-6/IL-6R复合物可直接激活JAK蛋白酪氨酸激酶,然后进入JAK/STAT通路激活信号分子STAT和Tec。这些信号传导途径调节凋亡相关基因的表达,从而发挥IL-6的促细胞生长、分化和抗凋亡作用。另一方面,IL-6/IL-6R复合物可诱导Src同源胶原蛋白与生长因子受体结合蛋白-2（SHP2）复合物形成和活化,然后与鸟嘌呤核苷酸交换因子结合,激活Ras蛋白。活化的Ras转导信号参与丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途径。正常胆管细胞长期与感染性胆汁接触可增加Bcl-2的表达,且胆管癌Bcl-2的表达增加,这提示细胞因子持续刺激与Bcl-2的表达改变之间存在可能的联系。2000年,Michel等用IL-6、干扰素-a、胰岛素样生长因子-1 （insulin-like growth factor 1）处理骨髓瘤细胞,结果发现IL-6能上调Mcl-1表达,2007年有研究者在另外一项CD34+造血干细胞的实验中研究发现IL-6可以通过JAK/STAT通路上调Bcl-2表达。目的分别阻滞JAK/STAT和Ras/MAPK途径,探讨外源性IL-6调控胆管癌细胞系QBC939Bcl-2 mRNA表达的分子机制。方法1、采用IL-6刺激人胆管癌细胞QBC939使Bcl-2mRNA表达上调,再分别用JAK/STAT拮抗剂AG490及MEK/ERK拮抗剂UO126处理；2、MTT法检测细胞的增殖状态,Annexin V/FITC和PI染色流式细胞仪分析凋亡情况；3、RT-PCR检测Bcl-2 mRNA水平；4、Western印迹法检测p-STAT3和p-ERK1的表达水平。结果1、U0126和AG490处理后,QBC939细胞增殖程度较IL-6组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）；2、U0126和AG490处理后,QBC939细胞凋亡率分别提高为18.8±4.13%和20.3±3.88%,与IL-6组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,但两组间无明显差异（P>0.05）；3、AG490处理后,Bcl-2 mRNA含量比IL-6组明显减少,差异有统计学意义（P＜0.01）4、对照组QBC939细胞有p-STAT3和p-ERK表达；IL-6作用于QBC939细胞株后,p-STAT3和p-ERK1含量均较对照组明显升高；AG490作用后,p-STAT3含量明显下降；UO126作用后,p-ERK1含量明显下降。结论1、IL-6可同时激活JAK/STAT和Ras/MAPK途径；2、主要通过JAK/STAT途径调节QBC939细胞Bcl-2 mRNA表达。第三部分外源性IL-6对QBC939裸鼠移植瘤生长的影响背景BALB/C裸小鼠是一种近交系小鼠,后代基因纯合程度高,个体间差异小,此种小鼠先天无毛无胸腺,T淋巴功能完全缺乏,对异种移植不发生排斥反应,因此特别适用于建立移植瘤模型。移植后的人体肿瘤在裸小鼠体内仍保持有原有组织形态、免疫学特点及特有的染色体组型。目前建立裸鼠移植瘤模型是一种较为理想的研究肿瘤在体内的生物学特性及调控机制的模型系统。目的建立QBC939裸鼠移植瘤模型,观察外源性IL-6在体内对胆管癌细胞系QBC939生长的影响。方法1、采用皮下注射法建立裸鼠移植瘤模型；2、分别使用IL-6及AG490进行腹腔注射给药,观察移植瘤生长情况。结果1、本实验成功建立裸鼠体内胆管癌皮下移植瘤模型；2、移植瘤在无药物干预时有自主生长,IL-6干预后移植瘤生长明显增快,差异有统计学意义（P＜0.05）；3、AG490组移植瘤生长较对照组明显减慢,但死亡率较高。结论外源性IL-6能够促进QBC939细胞移植瘤生长。
杨盈赤[10]（2010）在《DMBA诱导SD大鼠胰腺癌发生发展过程中的机理研究》文中进行了进一步梳理目的：胰腺癌的发病率逐年上升,其致死率已经位居消化道恶性肿瘤的第二位。胰腺癌早期诊断非常困难,治疗效果及预后极差,根本原因在于目前对其细胞起源、发生和发展等机制尚不清楚。在本实验室的前期研究,诱导建立的大鼠胰腺癌模型是接近人胰腺导管腺癌的体内模型,通过观察其胰腺癌发生过程的形态及组织学变化,为认识胰腺癌细胞起源提供了最新的实验证据。但为了进一步探讨胰腺癌发生和发展过程的细胞分子生物学调控机制,本课题拟在诱导大鼠胰腺癌模型过程中,收集不同时间点组织标本,通过基因芯片技术探讨胰腺癌形成和发展过程中相关基因表达调控的动态改变,以期能从细胞分子生物学水平阐明胰腺癌细胞发生和发展机制,并可以为胰腺癌的早期诊断和基因治疗提供新的线索。方法：1.通过化学致癌剂二甲基苯并蒽（DMBA）胰腺原位包埋诱导建立SD大鼠胰腺癌动物模型。2.利用Affymetrix大鼠全基因组表达谱芯片（Genechip Rat Expression Set 230）对胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的胰腺组织进行检测,初步筛选其差异表达基因。3.应用Genespring软件对差异表达基因进行功能分析,根据Gene Ontology （GO）对所筛选出的差异表达基因进行分子功能及生物学过程的分类,并根据其基因表达的模式运用层次聚类分析的方法进行分析。按照固定顺序对差异表达基因进行自组织映射（SOM）聚类分析。4.应用Mann-Kendall单调趋势检验分析基因芯片检测原始数据,并通过将人类全基因组和大鼠全基因组进行对比,筛查胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的人鼠同源的差异表达基因。5.分别采用荧光实时定量PCR技术及免疫组织化学染色方法对芯片检测结果中经过分析确定的有重要意义的基因进行：mRNA及蛋白表达水平的验证,以确定芯片检测结果的可靠性。结果：1.采用5mg剂量的二甲基苯并蒽（DMBA）直接置入胰腺被膜下的实质内的方法成功诱导大鼠胰腺癌发生,成癌率高,非实验性意外死亡率低。DMBA实验组术后1个月癌发生率达到80%（12／15）并伴有2例高级别]PanIN。DMBA实验组术后3个月大鼠癌发生率为100%（14／14）,死亡率仅为6%（1／15）。2.基因芯片技术对比检测正常胰腺、DMBA实验组7天、2周、1月和3月组间基因总体表达水平的改变情况。在所检测的22000个转录本中,共有661条基因在5组中表达差异均有统计学意义（P<0.05）,经组间两两比较显示,随着差异倍数的增加,差异基因的数目随之减少。3.根据GO分类,所筛选出的661条差异表达基因涉及不同的分子功能分类,并参与了多个生物学过程。根据差异表达基因表达谱的相似性,通过双向层次聚类分析,能从基因表达谱上完全区分开正常胰腺、急慢性胰腺炎、Pan IN和早期及进展期胰腺癌五组样本。其中正常胰腺和进展期胰腺癌的分叉最远,说明相似度最低,提示这些差异表达基因与胰腺癌发生之间有非常高的相关性。4.只保留25%样本表达量超过100个荧光单位且在所有样本范围内IQR超过0.5的2,786个探针。进行Mann-Kendall单调趋势检验,获得上调基因（探针）11个,下调基因（探针）142个（P<0.05）。成功筛查出了胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的人鼠同源的差异表达基因。5.采用荧光实时定量PCR技术及免疫组织化学染色方法对CXCR7、ATP6vlg2和UBe2c分别进行了mRNA及蛋白水平的验证,显示实时定量PCR的结果与芯片结果具有良好的一致性,蛋白表达水平也与芯片检测结果基本一致。进一步证实了本研究中基因芯片检测数据及分析的可靠性。结论：1.可在短期内获得较高发生率的大鼠胰腺癌模型从而获得胰腺癌发生过程中不同时期的大鼠胰腺癌组织标本,使动态研究胰腺癌发生发展过程中细胞分子生物学的调控机理成为可能。2.应用大鼠全基因组的表达谱芯片,高通量、动态地筛选出胰腺癌发生及发展过程中差异表达的基因。3.结合胰腺癌大鼠动物模型建模过程中不同时间点的病理状态,通过对部分已知基因表达相关功能的分析,发现胰腺癌发生中涉及到炎症反应、趋化因子、细胞应激反应的增加及抗氧化损伤能力的增强、肿瘤细胞凋亡的抑制、调控增殖与生长抑制的信号途径的失衡、细胞周期及有丝分裂的紊乱以及细胞骨架结构变化等众多遗传学改变,并且这些改变在胰腺癌发生发展过程的不同时段有不同的特点,其共同作用的结果可能与胰腺癌发生密切相关。4.筛查了大鼠胰腺癌发生和发展过程中动态的基因表达差异。并通过Blast对比成功筛查出了胰腺癌大鼠动物建模过程中的各时间点的人鼠同源的差异表达基因,对于将研究过渡到人类胰腺癌细胞株层面进一步实现对胰腺癌患者的研究有重要意义。5.通过实时定量PCR检测结果和蛋白表达的检测结果表明利用基因芯片技术可完成本实验要求的基因差异表达的筛查工作。同时验证了CXCR7和UBe2c与肿瘤的发生密切相关,并可促进细胞增殖和恶性转化,提示CXCR7和UBe2c可能与胰腺癌的发生和进展相关,对这些基因的进一步研究将可能为胰腺癌发生的细胞分子机理及治疗提供新的线索。
二、原位杂交染色法检测SMAD4mRNA、P73mRNA在肝外胆管癌中的表达及临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原位杂交染色法检测SMAD4mRNA、P73mRNA在肝外胆管癌中的表达及临床意义（论文提纲范文）
（1）基于TCGA数据库的肝癌基因表达谱分析及ARHGEF39在肝癌中表达模式及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 研究背景(全文) 肝癌的现状 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于TCGA数据库肝癌相关基因分析及筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图表-1(第一部分实验结果图表) |
| 参考文献(第一部分实验) |
| 第二部分 ARHGEF39在肝癌中的表达及其预后意义 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图表-2(第二部分结果图表) |
| 参考文献(第二部分研究) |
| 第三部分 LINC00470竞争性结合miR-4500调节ARHGEF39的表达影响肝癌细胞恶性进展 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图表-3(第三部分实验结果图表) |
| 参考文献(第三部分研究) |
| 全文总结 |
| 附录：文中所用所有寡核苷酸序列信息 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Original article Ⅰ |
| Original article Ⅱ |
（2）外泌体穿梭miR-135在结直肠癌肝转移微环境中的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一章 结直肠癌组织microRNA差异表达谱的分析 |
| 第一节 结直肠癌患者组织中miRNA的差异表达分析 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第二节 miR-135a-5p表达水平与结直肠癌发病风险研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 miR-135a-5p对结直肠癌转移的影响 |
| 第一节 miR-135a-5p在结直肠癌细胞中的功能研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第二节 miR-135a-5p在体内实验中与结直肠癌肝转移的研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响及机制研究 |
| 第一节 外泌体穿梭miR-135a-5p在结直肠癌中的表达分析 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第二节 外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌肝转移的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第三节 外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌免疫抑制的影响及机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第四节 外泌体穿梭miR-135a-5p对结直肠癌细胞粘附能力的影响及其机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 第五节 外泌体穿梭mi R-135a-5p促进PDX小鼠模型发生肝转移 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 血清miR-135a-5p应用于结直肠癌辅助诊断及预后评估的初步探索 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 本章小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）HBx基因调控S100A4蛋白促进肝癌细胞增殖及其临床预后相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分: HBx过表达肝癌细胞体内外功能验证及转录组测序分析 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验仪器和材料 |
| 2.1.1 肝癌细胞系 |
| 2.1.2 HBx过表达慢病毒 |
| 2.1.3主要试剂和相关仪器 |
| 2.1.4 裸鼠 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 BEL7404肝癌细胞的培养操作 |
| 2.3.2 建立HBx稳定表达的BEL7404肝癌细胞系 |
| 2.3.3 测定HBx过表达后的细胞体外增殖与迁移变化 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验测定HBx过表达后炎性因子释放变化 |
| 2.3.5 裸鼠成瘤实验 |
| 2.3.6 转录组测序及生物信息学分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 构建HBx高表达的BEL7404肝癌细胞系 |
| 3.2 HBx高表达可加快肝癌细胞的体外增殖 |
| 3.3 HBx高表达可影响部分炎性因子的释放 |
| 3.4 裸鼠荷瘤实验 |
| 3.5 转录组测序结果及生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分: HBx上调S100A4蛋白表达影响肝癌细胞体外功能的研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 实验仪器和材料 |
| 2.1.1 细胞培养 |
| 2.1.2 S100A4 敲低shRNA |
| 2.1.3 主要试剂和相关仪器 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Western Blot筛选高表达蛋白 |
| 2.3.2 IFN-α抑制S100A4蛋白表达 |
| 2.3.3 构建HBx高表达S100A4低表达的BEL7404细胞系 |
| 2.3.4 S100A4蛋白敲低后的功能验证（增殖实验） |
| 2.3.5 使用HBV全基因组转入的HepG2.2.15细胞系进行验证 |
| 三、结果 |
| 3.1 Western Blot验证高表达蛋白 |
| 3.2 IFN-a2b抑制S100A4蛋白表达 |
| 3.3 使用shRNA构建HBx高表达S100A4低表达的BEL7404细胞系 |
| 3.4 S100A4蛋白敲低后的功能验证 |
| 3.5 使用HepG2.2.15细胞系进行重新验证 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 第三部分 临床肝癌病人随访信息与S100A4蛋白表达数据关联分析 |
| 一、前言 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 肝癌组织芯片选择 |
| 2.2 免疫组化测定S100A4表达水平的实验方法 |
| 2.3 生存分析图的统计学方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 0 前言 |
| 1 S100A4蛋白的结构与功能 |
| 2 S100A4在不同恶性肿瘤中的作用 |
| 3 展望 |
| 4 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及科研项目情况 |
| 致谢 |
（4）探索肝内胆管癌微创治疗可行性及胆管细胞驱动肝再生机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Absract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 探索肝内胆管癌(ICC)微创治疗可行性 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 手术方法 |
| 2.3 术后处理及随访情况 |
| 2.4 统计方法及数据处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 微创治疗大或多发ICC vs.小孤立ICC |
| 3.2 微创治疗vs.开放手术治疗大或多发ICC |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 微创治疗ICC的可行性 |
| 4.2 微创治疗ICC的疗效 |
| 4.3 淋巴结清扫必要性探讨 |
| 4.4 预后探讨 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 探索胆管细胞驱动肝再生机制 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 胆管细胞驱动肝再生研究意义 |
| 1.2 模式生物斑马鱼简介 |
| 1.3 斑马鱼胆管细胞驱动肝再生研究模型(MTZ-NTR模型) |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 斑马鱼相关操作 |
| 2.3 DNA相关操作方法 |
| 2.4 RNA相关操作方法 |
| 2.5 蛋白质相关操作方法 |
| 2.6 图像采集、处理及统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 斑马鱼MTZ-NTR模型可进行基因筛选 |
| 3.2 斑马鱼MTZ-NTR模型可进行药物筛选 |
| 3.3 PI3K抑制剂抑制胆管细胞驱动肝再生 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 运用斑马鱼MTZ-NTR模型进行基因和药物筛选 |
| 4.2 PI3K抑制剂抑制胆管细胞驱动肝再生过程 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 不同品系斑马鱼及全称 |
| 附录二: 基因型鉴定相关信息 |
| 综述一 肝内胆管癌诊治进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝再生研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（5）可切除胃癌的临床病理特征分析及胃癌肝转移相关全外显子组测序研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 3121例可切除胃腺癌的临床病理特征的分析研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 资料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二部分 胃癌肝转移的全外显子测序研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三部分 胃癌肝转移相关基因的细胞迁移功能验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 小结 |
| 附:博士期间其他工作—胃癌c-Met表达异质性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（6）胰腺癌中OCT4、PTTG1、TAGLN2的表达及TGF-β信号通路对TAGLN2在胰腺癌转移中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分：OCT4的表达与胰腺癌的分化程度、增殖和侵袭的关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究材料 |
| 1.3 研究方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分：人垂体瘤转化因子1在胰腺癌中的临床意义 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要研究试剂 |
| 1.3 研究方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分：TGF-β信号通路在TAGLN2促进胰腺癌细胞转移中作用的 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）盐霉素抗膀胱癌T24细胞作用机制及对Mta-1基因及Smad4基因表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 盐霉素抑制膀胱癌T24细胞增殖及诱导凋亡的实验研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论及意义 |
| 第二章 盐霉素对人膀胱癌T24细胞Mta-1以及Smad4基因表达的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 1. 盐霉素作用于膀胱癌T24细胞对Mta-1基因表达的影响 |
| 2. 盐霉素作用于膀胱癌T24细胞对Smad4基因表达的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（8）胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 胆囊癌转移相关 miRNAs 的高内涵筛选及功能和机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第一部分小结 |
| 第二部分 自噬在肝母细胞瘤中的作用和机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分小结 |
| 附录一 |
| 文献综述（一） |
| 参考文献 |
| 文献综述（二） |
| 参考文献 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（9）外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的生物学作用及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响及其和Bcl-2mRNA表达的关系 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939 Bcl-2表达的影响及其的可能分子机制 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 外源性IL-6对QBC939裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（10）DMBA诱导SD大鼠胰腺癌发生发展过程中的机理研究（论文提纲范文）
| 中英文名词及缩写对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 DMBA诱导SD大鼠胰腺癌发生发展过程的实验病理学研究 |
| 实验材料 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SD大鼠胰腺癌发生发展过程中基因调控和表达差异的实验研究 |
| 实验材料 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SD大鼠胰腺癌发生发展过程中相关差异基因的验证研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤发生演进过程中基因调控和表达变化的研究进展 |
| 致谢 |
四、原位杂交染色法检测SMAD4mRNA、P73mRNA在肝外胆管癌中的表达及临床意义（论文参考文献）
- [1]基于TCGA数据库的肝癌基因表达谱分析及ARHGEF39在肝癌中表达模式及机制的研究[D]. 高健. 山东大学, 2020(05)
- [2]外泌体穿梭miR-135在结直肠癌肝转移微环境中的机制研究[D]. 孟庆涛. 东南大学, 2019
- [3]HBx基因调控S100A4蛋白促进肝癌细胞增殖及其临床预后相关性研究[D]. 朱凯. 昆明医科大学, 2019(06)
- [4]探索肝内胆管癌微创治疗可行性及胆管细胞驱动肝再生机制[D]. 魏芳强. 浙江大学, 2018(08)
- [5]可切除胃癌的临床病理特征分析及胃癌肝转移相关全外显子组测序研究[D]. 朱纯超. 上海交通大学, 2016(03)
- [6]胰腺癌中OCT4、PTTG1、TAGLN2的表达及TGF-β信号通路对TAGLN2在胰腺癌转移中的作用[D]. 林海. 新疆医科大学, 2013(02)
- [7]盐霉素抗膀胱癌T24细胞作用机制及对Mta-1基因及Smad4基因表达的影响[D]. 陆新升. 中南大学, 2013(02)
- [8]胆囊癌转移相关miRNAs的高内涵筛选及功能和机制研究[D]. 常颜信. 第二军医大学, 2013(04)
- [9]外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的生物学作用及其分子机制的研究[D]. 刘薇. 中南大学, 2011(12)
- [10]DMBA诱导SD大鼠胰腺癌发生发展过程中的机理研究[D]. 杨盈赤. 中国协和医科大学, 2010(09)