一、表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建（论文文献综述）
李东丽[1]（2021）在《牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量PCR检测方法建立及IBRV NM8株的分离鉴定》文中研究指明
吉莉娜[2]（2021）在《基于CRISPR-Cas9技术构建表达狂犬病毒G蛋白的Ⅰ型牛疱疹病毒》文中研究说明狂犬病是一种严重危害人类的人畜共患病,每年报告约有59,000人死于狂犬病。目前,流浪狗已成为了狂犬病病毒（RABV）主要的传播途径之一,蝙蝠、狐、狼、鼬獾等野生食肉动物是RABV的天然宿主,这些狂犬病毒携带动物对人类和家畜存在潜在的公共卫生风险。为了从源头控制病毒传播,需为这些传播源接种疫苗。然而目前狂犬疫苗接种大多使用肌肉注射,此类接种方式成本高,在许多发展中国家未能广泛使用,另一方面目前狂犬疫苗的免疫效价仍有待提高。因此研究出一种既安全有效且又具有成本效益的口服狂犬病疫苗是十分必要的。牛疱疹病毒一型（Bovine herpes virus type Ⅰ,BHV-1）为双链DNA病毒,其中g E糖蛋白为病毒复制的非必须蛋白,缺失g E基因并不影响病毒复制及其免疫原性。当前缺失g E基因的BHV-1疫苗已在欧洲广泛使用,因此缺失g E基因的BHV-1作为构建重组狂犬病毒的载体具有安全性。本研究基于CRISPR-Cas9及同源重组技术,将牛疱疹病毒I型（Bovine herpes virus type Ⅰ,BHV-1）作为载体,构建缺失g E基因、并表达增强绿荧光蛋白基因（EGFP）、狂犬病毒G基因的重组病毒（BHV-1Δg E/EGFP+/G+）,利用小向导RNA（small guide RNA,sg RNA）将BHV-1Δg E/EGFP+/G+病毒基因组中的EGFP基因敲除,最终获得重组病毒BHV-1Δg E/G+。经测序及Western blot结果表明重组病毒构建成功且可稳定表达狂犬病毒G蛋白。体外生物学特性分析显示,BHV-1Δg E/G+与BHV-1生长特性相似。但在噬斑形态比较中BHV-1Δg E/G+的噬斑明显大于BHV-1,并通过细胞调亡实验证明重组病毒BHV-1Δg E/G+可促进细胞凋亡。通过流式细胞技术检测小鼠口服重组病毒后,其颌下淋巴结中DC、B细胞数量变化,结果表明DC、B细胞数量均上升,重组病毒可产生良好免疫反应。最后将重组病毒BHV-1Δg E/G+分别通过肌内注射和口服两种方式免疫小鼠,用RABV攻毒株（CVS-11）进行肌内注射攻毒。结果表明通过肌内接种与通过口服接种时小鼠存活率相同且存活率高达71%,并且重组病毒通过口服可产生有效中和抗体。以上研究结果表明,成功构建的重组病毒BHV-1Δg E/G+是用于人和动物的新一代口服重组狂犬病疫苗的优良候选物,BHV-1是口服疫苗的理想载体。
柳翠翠[3]（2020）在《牛疱疹病毒Ⅰ型抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用》文中提出牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR）又称"坏死性鼻炎"、"红鼻病"等,是I型牛疱疹病毒（BoHV-1）引起的一种牛呼吸道接触性传染病,是引起牛呼吸道疾病的一个重要的致病原。常呈现脑炎、结膜炎、呼吸道感染、产奶下降以及牛致病性细菌性肺炎等临床症状,BoHV-1受环境等因素影响感染率较高,犊牛较成年牛病死率较高。随着集约化养殖,从而使得该病迅速传播。由于该病在我国大部分地区流行传播,为我国二类动物疫病,也是进出口必检动物疫病。因此,积极开展BoHV-1的研究对于防控该病有重要意义。为适应我国诊断BoHV-1的需要,本研究克隆了gL、gG两个基因,并分别构建了gL、gG原核表达载体,获得了gL、gG的原核高效表达,建立了间接ELISA方法。本研究分为以下三个部分:1.BoHV-1 gL、gG基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达利用牛传染性鼻气管炎病毒（BoHV-1）接种牛肾细胞（MDBK）,提取病毒DNA为模板。根据其免疫原性和载体的要求设计对应引物,通过PCR方法扩增BoHV-1的gL、gG基因,PCR产物纯化后经Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切后,克隆到原核表达载体pET-32a,获得重组表达质粒pET32a-gL、pET32a-gG。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化表达菌BL21（DE3）,并构建了以BL21（DE3）为宿主菌株的原核表达系统,经大量摇菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE确定DNA序列gL、gG能在pET-32a/BL21（DE3）中表达,成功表达出了gL、gG蛋白,其分子量约分别为37kD、67kD,与预期结果相符,表达的重组蛋白分别为包涵体及上清表达,采用Ni-Agarose Resin方法纯化融合重组蛋白,取得较好的效果。Western blot分析,纯化的pET-gL、pET-gG重组融合蛋白与BoHV-1标准阳性血清呈现良好的反应性。2.gL-iELISA方法的建立以纯化后的pET-32a-gL为诊断抗原包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立了检测BoHV-1抗体的间接ELISA方法,优化反应各个条件为:抗原的最佳包被浓度为0.773 ug/mL,血清稀释度为1:20,4℃包被过夜,3%BSA封闭液封闭1h,血清室温孵育半小时,HRP标记兔抗牛IgG稀释度为1:3000,37℃孵育半小时,最佳底物反应条件为37℃5min,建立牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法,并确定阴阳性临界值。应用建立的gL-iELISA方法检测牛传染性鼻气管炎阳性血清、牛口蹄疫O型阳性血清及牛布鲁氏菌阳性血清,特异性良好;IBRV阳性血清按1:640稀释检测结果仍为阳性。检测171份临床血清,结果显示,67份为阳性,阳性率达39%。3.gG-iELISA方法的建立以纯化后的pET-32a-gG为诊断抗原包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立了检测BoHV-1抗体的间接ELISA方法,优化反应各个条件为:抗原的最佳包被浓度为0.1563 ug/mL,条件为室温1h+4℃过夜,1%BSA封闭1h,血清1:20稀释,37℃孵育30min,HRP标记兔抗牛IgG稀释度为1:15000,37℃孵育30min,最佳底物显色条件为37℃5min,建立牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法,并确定阴阳性临界值为。应用建立的gG-iELISA方法检测牛传染性鼻气管炎阳性血清、牛口蹄疫O型阳性血清及牛布鲁氏菌阳性血清,特异性良好;IBRV阳性血清按1:640稀释检测结果仍为阳性。检测171份临床血清,结果显示,69份为阳性,阳性率达40.35%。此研究可以用于BoHV-1感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测,为重组抗原ELISA试剂盒奠定了基础。
曹翀[4]（2020）在《牛疱疹病毒Ⅰ型立即早期蛋白BICP0负向调控TRAF6的作用机制研究》文中研究指明牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovine herpesvirusⅠ,BHV-1）又称为牛传染性鼻气管炎病毒（Bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV）,是导致牛传染性鼻气管炎（Bovine infectious rhinotracheitis,IBR）的病原。BICP0作为BHV-1的毒力蛋白在BHV-1的整个感染期都能持续性表达。大量的研究表明,BICP0的表达是导致BHV-1复苏及大量增殖的重要病因。TRAF6作为宿主体内多个天然免疫通路中的关键接头分子,能够介导NF-κB信号通路（经典通路和非经典通路）、MAPK通路（JNK1/2、ERK1/2、p38）、IRFs通路（IRF3、IRF4、IRF5和IRF7）以及PI3K通路,在宿主的炎症反应和天然抗病毒反应等方面发挥至关重要的作用。本研究通过对BICP0与TRAF6之间的相互作用机制和作用的结构基础进行研究,进一步地了解了BHV-1利用BICP0进行的免疫逃避机制,为BHV-1的防治提供理论支持和物质基础,主要的研究内容有如下几个方面:1.BICP0基因的扩增及重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的构建本研究以Gen Bank中BHV-1.1 Cooper毒株（USDA NVSL challenge 97-11）的序列信息（Gen Bank accession number:JX898220）为参考依据设计PCR引物对,以实验室保存的BHV-1毒株所制备的基因组为扩增模板进行PCR扩增。本研究成功获得BICP0的基因片段并构建了p EASY-Blunt Simple-BICP0重组质粒。随后通过使用商品化的Multi Bac Mam?系统,成功构建了重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG。作为有效的外源基因投递系统,重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG成功解决了MDBK细胞难以转染的问题,其通过在MDBK细胞中投递BICP0基因为独立研究BICP0的功能奠定了物质基础。另外,本研究在BICP0的羧基端引入了Flag标签序列,简化了BICP0的鉴定工作,为后续研究的顺利进行奠定了基础。2.重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的应用通过Reed-Muench法测得P3代RE-BICP0-FLAG的病毒滴度为2.7×106TCID50/100μL。利用梯度感染试验和Western Blot方法鉴定,确定了RE-BICP0-FLAG转导MDBK细胞的最佳使用剂量为1×106TCID50至2×106TCID50。随后通过对RE-BICP0-FLAG转导的MDBK进行荧光定量PCR鉴定,发现BICP0会降低IL-6、IL-8、ISG15和ISG56的转录水平,提示BICP0可能对MDBK细胞的炎症通路和抗病毒通路存在抑制作用。Western Blot鉴定结果表明BICP0会在蛋白水平导致TRAF6的减少。通过分别使用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯奎,本研究发现BICP0在MDBK细胞中导致的TRAF6减少是经由泛素-蛋白酶体途径而降解的。RE-BICP0-FLAG的成功应用,使本研究初步确认了BICP0在无其它病毒蛋白参与的情况下,可以通过水解宿主天然免疫相关分子——TRAF6实现免疫逃避的功能。3.BICP0对TRAF6的干扰作用研究为进一步研究BICP0对TRAF6的作用机制,构建了数个BICP0的重组表达载体:pc DNA3.1-BICP0-Flag、pc DNA3.1-△BICP0-Myc和pc DNA3.1-BICP0-Flag（13A/51A）。同时以牛肝组织中的c DNA为模板扩增了牛TRAF6基因,并成功构建了重组表达载体:pc DNA3.1-TRAF6-HA和pc DNA3.1-C71A-HA。利用瞬时转染的方式将上述质粒投递至HEK293T细胞中,一方面通过双荧光素酶活性检测方法对NF-κB启动子和IFNβ启动子的激活情况进行评估,结果表明BICP0能够抑制TRAF6对NF-κB启动子和IFNβ启动子的激活。另一方面,Western Blot鉴定结果表明在HEK293T中瞬时表达的BICP0也能发挥降解TRAF6的作用,并且这种作用可被BICP0的si RNA所抑制。更进一步的鉴定结果表明,BICP0氨基端的RING finger结构域具有的E3泛素连接酶活性是必不可少的,而羧基端（357-637aa）并不是其功能发挥所必需的。4.BICP0对TRAF6的修饰类型研究利用免疫沉淀技术将HEK293T细胞中瞬时表达的TRAF6-HA蛋白从全细胞裂解液中进行分离和纯化,应用Western Blot方法对TRAF6-HA蛋白进行鉴定。兔抗HA抗体的检测结果表明,BICP0存在对TRAF6的修饰作用。通过使用兔抗Ub抗体进行鉴定,确定了修饰作用为泛素化修饰。最后通过能特异性识别泛素链类型的兔抗K48-Ubiquitin抗体和兔抗K63-Ubiquitin抗体,明确了BICP0能促进TRAF6被K48连接形式的泛素链修饰。5.BICP0中关键氨基酸的鉴定利用免疫共沉淀方法对BICP0和TRAF6之间的相互作用进行鉴定,结果表明两者存在蛋白间的相互结合并且只有BICP0氨基端的1-356aa参与上述作用。随后通过构建BICP0的“346-PAERQY-351”基序突变体进行后续鉴定,Western Blot结果表明BICP0的“346-PAERQY-351”基序是其与TRAF6相互作用的结合部位,并且第351位的酪氨酸（Y351）是关键氨基酸。间接免疫荧光结果表明,BICP0会与TRAF6在细胞核中共定位,而Y351A突变体则未能观察到上述现象。双荧光素酶活性检测结果表明,Y351A突变体对TRAF6激活启动子的抑制作用也出现下降。6.BICP0抑制TRAF6对IRF7的激活通过双荧光素酶活性检测发现,BICP0能够抑制TRAF6和IRF7蛋白对IFNβ启动子的共激活。Western Blot结果表明BICP0抑制了TRAF6对IRF7的K63连接形式的泛素化修饰。本研究证明了BICP0能够通过负调控TRAF6从而发挥免疫逃避的功能,并较为深入地研究了BICP0与TRAF6之间相互作用的机制,进而发现了BICP0和TRAF6之间发生结合的结构基础。本研究成果能够为进一步探究BHV-1的免疫逃避机制提供理论支持,同时可为新型疫苗的研发提供理论依据和技术支持,并为深入研究BHV-1逃避宿主固有抗病毒免疫机饿制提供物质基础与技术平台。
杨飞[5]（2020）在《牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备和间接免疫荧光方法的建立》文中研究说明牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的牛的一种急性接触性传染病。临床上以高热、鼻炎和上呼吸道炎症为主要特征,并可引起脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、母牛的乳汁减少和流产等症状。IBRV感染后可在神经系统建立潜伏感染,形成持续性感染,病牛长期乃至终身带毒,使本病难以根除。我国1980年从新西兰进口奶牛中首次分离到该病毒,此后各地区均相继检测出抗体阳性牛,且从无临床表现的进口牛中也分离到了该病毒。流行病学调查表明,我国除香港、澳门、台湾和江西省外,其他的行政省市或自治区的牛群均感染了IBRV,说明IBR在我国各地已广泛传播,给我国养牛业带来了巨大的经济损失。gD蛋白是IBRV与细胞结合所必须的蛋白,可诱导产生体液免疫和细胞免疫,且抗gD蛋白的单克隆抗体具有中和病毒的能力。因此,gD蛋白是开发诊断试剂或抗病毒研究的重要蛋白。本研究利用CHO细胞表达的IBRV gD蛋白作为免疫原免疫8周龄BALB/c小鼠,无菌取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,经亚克隆筛选,获得了3株杂交瘤细胞株,分别命名为4G3D4、6E8B7、9D7A7,选取其中一株抗体效价最高的单克隆抗体4G3D4进行后续试验。单克隆抗体4G3D4纯化后的浓度为2.6 mg/mL;抗体亚类为IgG1;且能与IBRV全病毒发生反应,与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光;亲和常数测定试验、间接ELISA和间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）测定均表明分泌单抗4G3D4的杂交瘤细胞具有较好的遗传稳定性。利用大肠杆菌pET-28a原核表达系统,对IBRV gD蛋白进行截短表达,对单抗4G3D4识别的抗原表位进行鉴定,经Western Blot检测结果表明单抗4G3D4针对的抗原表位是线性表位,识别的抗原表位位于gD蛋白的315aa-348aa的氨基酸区域。抗原表位保守性分析表明,该抗原表位在IBRV各分离株中为相对保守。同时利用本研究制备的IBRV gD蛋白单克隆抗体4G3D4作为一抗,以FITC标记的山羊抗鼠IgG作为二抗,通过优化各个反应条件,建立间接免疫荧光方法（IFA）。通过与美国VMRD公司进口的IBRV gD蛋白单克隆抗体进行比较,检测IBRV不同的分离株、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）,检测结果均一致,符合率为100%。批内重复性试验与批间重复性试验结果表明,该方法具有良好的重复性。敏感性试验、特异性试验结果表明该间接免疫荧光方法敏感性高、特异性强,适用于临床检测IBRV抗原。综上,本研究获得了3株杂交瘤细胞株,选取了其中一株抗体效价最高的单克隆抗体4G3D4进行后续试验研究。该单抗稳定性强,与IBRV具有良好的反应性,对其抗原表位进行分析,结果鉴定出了一个抗原表位。同时以制备的单抗4G3D4作为一抗,初步建立了检测IBRV的IFA方法,以期用于牛及牛源性生物材料中IBRV抗原的检测。本研究为IBRV gD蛋白的生物学结构和IBRV的致病性的深入研究奠定了基础,也为IBRV的诊断和防控提供了新的技术支持。
马小静[6]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中指出牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
穆艳霞[7]（2019）在《基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其生物学特性初步鉴定》文中认为牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）可引发牛传染性鼻气管炎,对养牛业造成巨大经济损失。近年来,国内外均开展了牛鼻气管炎疫苗的研制。对于传统疫苗,灭活苗不能或很少引起细胞免疫而弱毒苗具有毒性和抗药性;对于新型疫苗,亚单位苗不能在体内复制,大多DNA疫苗也只能引起部分的体液免疫,然而,基因缺失疫苗具有免疫标识,利用缺失的基因可以进行野生型感染和疫苗免疫的诊断,已成为新型疫苗研究开发的主流。为了更高效地构建基因缺失疫苗,本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑与同源重组技术,构建带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）标记并缺失糖蛋白E基因（glycoprotein E,gE）的重组BHV-1病毒,命名为BHV-1 gE-/EGFP+。随后通过特异性的小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）敲除BHV-1 gE-/EGFP+病毒基因组中的EGFP基因,该gE基因缺失株命名为BHV-1ΔgE。利用脂质体法将pCas9-mCherry质粒转染MDBK、BTC、HEK293T和VERO细胞,通过观察红色荧光进行流式细胞仪半定量分析以及不同细胞感染BHV-1的情况,结果表明VERO细胞不仅转染效率较高,而且适合感染病毒BHV-1,所以选择VERO细胞对BHV-1的基因组进行编辑。重组病毒BHV-1 gE-/EGFP+和BHV-1ΔgE噬斑克隆筛选后PCR鉴定和测序结果显示,BHV-1 gE-/EGFP+在gE基因5’起始处缺失1134 bp,缺失病毒BHV-1ΔgE构建成功。生物学特性分析显示,BHV-1ΔgE与亲本BHV-1具有相似的生长特性和噬斑形态。虽然BHV-1可以作为牛携带外源抗原的活载体,但BHV-1的基因重组技术还没有得到改进,并且利用CRISPR/Cas9技术构建重组BHV-1病毒的研究目前尚无报道。本研究探索了利用CRISPR/Cas9系统进行BHV-1 gE基因的缺失编辑,提供了一种高效的BHV-1基因缺失毒株的构建方法,为今后IBR基因缺失疫苗的研制提供初步实验依据。
杨姣[8]（2019）在《BoHV-1双基因缺失株豚鼠试验和三基因缺失株兔体试验》文中指出牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotraeheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotraeheitis virus,IBRV）又称牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovine herpes virus type 1,BoHV-1）引起的一种的急性、热性、接触性传染病,表现为鼻炎、生殖道和呼吸道炎症、乳腺炎、结膜炎等,还能引起母牛流产、死胎。目前还没有一种针对此病的特效药,只能通过疫苗免疫控制流行。相对于常规灭活及减毒疫苗而言,基因工程疫苗有安全、稳定、免疫原性强等特点,且能够进行鉴别诊断,应用前景广泛。本研究基于BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失疫苗建立了豚鼠评价模型,以期通过与牛体试验结果进行比较,替代牛体试验成为IBR疫苗效力的初步评价方法。同时,对BoHV-1三基因缺失突变株BoHV-1 gN-/tk-/gG-的生物学特征与免疫效能进行了研究,为临床IBR新型疫苗的开发提供基础。主要研究内容和结果如下:1.BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失疫苗豚鼠免疫反应评价模型的建立（1）豚鼠IBR野毒感染试验参考OIE相关资料,通过对豚鼠直接进行野毒株攻毒来建立野毒感染模型,通过典型临床症状及体温、排毒情况、对组织的损害情况以及组织中病毒核酸的检测,确定了BoHV-1攻毒后能够引起豚鼠产生BoHV-1特征性临床症状,且能引起豚鼠向外排毒,并对组织造成损害,表明豚鼠能够作为牛传染性鼻气管炎感染模型。（2）BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失疫苗安全性试验为确定该双基因缺失疫苗在豚鼠体内的安全性,对疫苗免疫后豚鼠的免疫效果进行评价。疫苗接种后,对豚鼠的临床症状和体温变化、特异性抗体gB、中和抗体和细胞因子水平进行检测,结果显示,不论采用滴鼻还是肌肉注射接种途径,106TCID50、107TCID50和108TCID50三个剂量的BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失疫苗均能在豚鼠体内诱导免疫应答,疫苗组仅出现轻微临床症状、未检测到排毒、体温变化不显着、检测到特异性gB抗体、中和抗体及细胞因子的产生,实验结果也表明,高、中、低三个剂量之间存在量效关系,而且加强免疫能够极有效地促进抗体的产生,最后,从整体来看,肌肉注射诱导免疫应答强于滴鼻接种,由此,确定了BoHV-1gG-/tk-双基因缺失疫苗安全性良好。（3）BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失株的免疫效力试验采用BoHV-1 gG-/tk-双基因缺失疫苗以106TCID50、107TCID50和108TCID50剂量肌肉注射免疫、wt BoHV-1攻毒的模型,利用临床症状、体温变化、排毒情况、体液免疫抗体水平的测定、细胞免疫细胞因子等的测定以及组织的病毒核酸检测和病理变化观察等指标对豚鼠免疫/攻毒模型的保护效力进行了评价,各免疫攻毒组临床症状出现时间比未免疫攻毒组短,体温无显着性差异,从鼻拭子当中未分离到病毒。各组的抗体水平与攻毒时的抗体水平为正相关关系,即呈现量效关系。肺脏病变程度结果显示,病变程度与疫苗接种剂量呈现负相关,疫苗接种剂量越大,攻毒后病变程度越轻微。同时,佐剂对该疫苗免疫反应具有较大影响,在相同接种剂量和接种途径条件下,比较了加佐剂组和不加佐剂组的差异,结果表明,当疫苗混合佐剂时,诱导豚鼠更强烈的体液和细胞免疫反应,抗体水平包括特异性gB抗体和中和抗体均高于相同疫苗接种剂量的未加佐剂组,尤其是中和抗体。另外,佐剂也能促进IFN-γ的产生。2.三基因缺失突变株BoHV-1 gN-/tk-/gG-的生物学特征和免疫效能研究本试验通过重组病毒拯救、毒价的测定、噬斑大小以及生长曲线的测定等,对BoHV-1 gN-/tk-/gG-的生物学特征进行了验证,结果显示重组病毒拯救成功,重组毒株相较于野毒株噬斑变小,病毒滴度变小但无显着变化（p>0.05）。本试验也评价了该突变株在兔体内的免疫效能,以107TCID50为剂量,采用滴鼻和肌肉注射两种方式接种,28d后用野毒株wt BoHV-1攻毒,结果显示,与野毒组相比,突变株接种组临床症状和排毒的持续期均较短。接种后,肌肉注射组能够更快速的产生抗体,但相较于野毒组,其中和抗体滴度上升较慢,然而滴鼻组在攻毒前抗体均为阴性,只在攻毒后才转阳,滴度显着低于肌注组（p<0.001）。攻毒后肌注组抗体水平有显着性的提升,于49d达到最高值（1:114）,高于野毒组（1:79）,并于42d和49d时均极显着高于滴鼻组（p<0.001）。sIgA检测结果显示,野毒组sIgA浓度最高,与空白对照组在7d、21d形成极显着性差异（p<0.01）,在14d、28d形成显着性差异（p<0.05）,其余各组之间无显着差异（p>0.05）。细胞因子检测结果显示,肌肉注射接种组的TNF-α水平于7d、14d、21d均显着性高于空白组（p<0.05）,14d时也显着高于wt组（p<0.05）。滴鼻接种组与各组之间无显着性差异（p>0.05）。对比分析各组IFN-γ水平,无显着性差异（p>0.05）。说明三基因缺失突变株BoHV-1 gN-/tk-/gG-能够在兔体内诱导免疫应答,并能够在攻毒后提供保护力,减轻临床症状,减少排毒时间,综合各项指标,肌肉注射为最合适的接种途径。
高淼[9]（2019）在《吉林地区三种牛病毒性传染病的流行病学调查》文中指出为了解吉林省牛病毒性腹泻（BVD）、牛传染性鼻气管炎（IBR）和牛呼吸道合胞体病（BRS）3种病毒性传染病的流行情况,本研究应用商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）方法和实时定量PCR（RT-PCR）方法对采集自吉林省内9个地区的11个县（市）区内没有免疫的牛场（包括肉牛场、奶牛场、屠宰场、散养户）的2200份血清进行检测,其中每个县（市）区200份血清样本。应用ELISA试剂盒检测不同牛场中BVD、IBR、BRS抗体阳性率情况,结果显示:肉牛场、奶牛场、屠宰场、散养户中IBR抗体阳性率最高分别为31.2%、31.7%、24.5%、17.7%;各县（市）BVD、IBR及BRS抗体阳性率相关性进行分析,BVD的抗体阳性率与BRS的抗体阳性率在0.05水平上显着相关;系统聚类分析比较各县（市）地域之间的距离可发现,BVD、IBR及BRS抗体阳性率的差异与地域差异之间无规律可循;各县（市）BVD、IBR和BRS混合感染情况,BVD的抗体阳性率除与BRS的抗体阳性率显着相关外,还与BVD、IBR混合感染,BVD、BRS混合感染,IBR、BRS混合感染,BVD、IBR、BRS混合感染均显着相关;对不同地区的抗体阳性率统计分析,BVD、BRS的抗体阳性率呈西高东低趋势,且两种病在不同地区的抗体阳性率存在显着相关,半山区、平原区和牧区的比较差异显着。采用实时荧光RT-PCR检测方法复检不同牛场中抗体阳性血清样品是否含有病毒核酸。结果显示:IBR检测中奶牛场阳性率最高为26.8%;BVD检测中屠宰场阳性率最高为7.3%;BRS检测中奶牛场阳性率最高为8.3%。综合以上调查结果,具体地了解了吉林省IBR、BVD、BRS的流行情况,初步证实了这三种病在吉林地区的牛群中感染普遍,其中IBR的感染率较高。并提出相关的预防和控制建议,为减少这3种动物疫病的发生和流行提供数据支持,为这3种动物疫病的预防和控制提供了参考。
王雪伟[10]（2018）在《牛传染性鼻气管炎抗体胶体金免疫层析方法的建立》文中认为牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的一种急、热、接触性传染病,主要引起牛发热、严重的上呼吸道症状、母牛流产、死胎,以及生殖道炎症和犊牛脑炎。该病在世界范围内流行,在我国,牛传染性鼻气管炎的感染在牛群中普遍存在且处于较高水平,影响我国养牛业快速健康发展。寻求快速有效的诊断方法,结合综合性防控措施来降低IBRV的感染率是当前急需完成的工作。目前已有的用于检测牛传染性鼻气管炎的方法,其操作步骤繁杂、耗时较长、检测结果不准确、结果判断困难等缺点,使得这些方法不适用于基层兽医在牛场对牛传染性鼻气管炎直接大批量的检测。胶体金免疫层析技术因其简便、快速、灵敏、稳定、特异、结果易判等诸多优点,使其可以为IBR的现场快速诊断提供新的研究方向。本试验利用DNAstar分析软件分析、预测,筛选出牛传染性鼻气管炎的主要抗原gD中抗原性强、亲水性好、表面可及性优良、柔韧性强的3段抗原表位基因（gDa、gDb、gDc）,将融合基因序列合成于表达质粒中(pET-28a（+）-gDabc),然后将表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）plysS中,加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达,同时优化表达过程,获取足量的目的蛋白,对目的蛋白进行SDS-PAGE检测,其蛋白分子量大小约为37kDa,与预期目的蛋白分子量大小一致。通过Weatern-blot分析,证明pET-28a（+）-gDabc在大肠杆菌中成功获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。将获得的表达蛋白gDabc提纯、复性、浓缩后作为牛传染性鼻气管炎抗体胶体金试纸条的检测线的包被抗原划线于NC膜上,鸡抗SPA作为质控线的包被抗体划线于NC膜上,胶体金-SPA复合物以6μL/cm的浓度喷于玻璃纤维素膜上制得金标垫,组装试纸条;用已制得试纸条检测牛传染性鼻气管炎标准阳性血清,15 min内检测线于质控线均处出现红色反应线,检测阴性血清时试纸条检测线未出现红色反应线,质控线出现红色反应线,表明试纸条在检测阳性血清时呈阳性反应,检测阴性血清时呈阴性反应,并且结果有效;试纸条可检测出牛传染性鼻气管炎抗体的最适抗原包被浓度为0.6 mg/mL;试纸条检测牛传染性鼻气管炎阴性血清以及牛副结核血清、牛病毒性腹泻血清、牛布鲁菌血清、牛口蹄疫的标准阳性血清,结果都为阴性;将试纸条分别在室温和4℃保存6个月后,在随机抽取试纸条分别检测牛传染性鼻气管炎阳性和阴性血清,结果分别呈现阳性和阴性。将本试验所制备试纸条应用于临床,其快速、特异稳定性强的优点表现突出。可替代某国产ELISA试剂盒用于IBR的现场检测。
二、表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建（论文提纲范文）
（2）基于CRISPR-Cas9技术构建表达狂犬病毒G蛋白的Ⅰ型牛疱疹病毒（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 口服狂犬疫苗的研究进展 |
| 1 狂犬病概况 |
| 1.1 狂犬病毒基因组结构及蛋白功能 |
| 1.2 狂犬病病毒的分类 |
| 1.3 狂犬病毒的复制过程 |
| 1.4 狂犬病毒病程及症状 |
| 1.5 狂犬病毒的预防及治疗 |
| 1.5.1 狂犬病毒的预防 |
| 1.5.1.1 狂犬病毒的暴露前免疫 |
| 1.5.1.2 狂犬病毒的暴露后免疫 |
| 1.5.2 狂犬病毒的治疗 |
| 2 口服狂犬疫苗主要类型 |
| 2.1 减毒活疫苗 |
| 2.2 植物口服疫苗 |
| 2.3 病毒活载体疫苗 |
| 2.3.1 痘苗病毒载体 |
| 2.3.2 腺病毒载体 |
| 2.3.3 疱疹病毒载体 |
| 3 狂犬疫苗的制备方法 |
| 3.1 反向遗传学 |
| 3.1.1 Cre/LoxP基因编辑技术 |
| 3.1.2 细菌人工染色体系统 |
| 3.1.3 CRISPR-Cas9 基因编辑 |
| 4 结语 |
| 第二章 基于CRISPR-Cas9 技术构建表达狂犬病毒G蛋白的Ⅰ型牛疱疹重组病毒 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与耗材 |
| 1.1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.1.2 实验耗材 |
| 1.1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.2 病毒、细胞与实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞的培养 |
| 1.2.1.1 VERO及 MDBK细胞的传代 |
| 1.2.1.2 细胞的复苏 |
| 1.2.1.3 细胞的冻存 |
| 1.2.2 BHV-1及BHV-1ΔgE/G~+病毒的扩增 |
| 1.2.3 表达载体的构建及鉴定 |
| 1.2.3.1 表达载体的构建过程 |
| 1.2.3.2 载体的转化 |
| 1.2.3.3 表达载体的酶切鉴定 |
| 1.2.4 敲除载体的构建与鉴定 |
| 1.2.5 重组病毒的构建 |
| 1.2.6 重组病毒BHV-1ΔgE/EGFP~+/G~+的纯化 |
| 1.2.7 重组病毒BHV-1ΔgE/G~+的纯化 |
| 1.2.8 重组病毒的鉴定 |
| 1.2.9 Western Blotting检测重组病毒G蛋白表达 |
| 1.2.9.1 病毒蛋白样品的制备 |
| 1.2.9.2 蛋白免疫印迹(Western Blotting)过程 |
| 1.2.10 BHV-1与BHV-1ΔgE/G~+生物学特性的比较 |
| 1.2.10.1 噬斑形态的比较 |
| 1.2.10.2 病毒细胞凋亡率的比较 |
| 1.2.10.3 一步生长曲线 |
| 1.2.11 流式细胞技术检测口服重组病毒后小鼠中DC、B细胞数量 |
| 1.2.12 重组病毒动物保护率的鉴定 |
| 1.2.13 统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组病毒构建原理 |
| 2.2 敲除载体与表达载体的鉴定 |
| 2.2.1 CRISPR/Cas9 敲除载体的鉴定 |
| 2.2.2 表达载体的鉴定 |
| 2.3 重组病毒的鉴定与纯化 |
| 2.3.1 重组病毒的鉴定 |
| 2.3.2 重组病毒的纯化 |
| 2.4 重组病毒G蛋白表达的鉴定 |
| 2.4.1 western blot鉴定重组病毒G蛋白的表达。 |
| 2.5 BHV-1与BHV-1ΔgE/G~+的生物学特性分析 |
| 2.5.1 BHV-1与BHV-1ΔgE/G~+噬斑形态学比较 |
| 2.5.2 一步生长曲线 |
| 2.6 口服免疫重组病毒后DC、B细胞数量检测 |
| 2.7 肌内注射BHV-1ΔgE/G~+对小鼠的免疫保护效率 |
| 2.8 口服接种BHV-1ΔgE/G~+对小鼠的免疫保护效率 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）牛疱疹病毒Ⅰ型抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 分类、形态结构及特性 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 生物学特性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 分子生物学 |
| 1.4 诊断方法 |
| 1.4.1 病原学诊断 |
| 1.4.2 血清学诊断 |
| 1.4.3 分子生物学检测 |
| 1.5 防控 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 BoHV-1 gL,gG蛋白的原核表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要酶类及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要培养基及试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 MDBK细胞的培养 |
| 2.2.2 表位选择及引物设计、合成 |
| 2.2.3 蛋白的表达、可溶性分析及纯化 |
| 2.2.4 western-blot验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 目的基因gG,gL的扩增 |
| 2.3.2 原核表达重组质粒的鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白的诱导表达形式的鉴定 |
| 2.3.4 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.5 重组蛋白的Western Blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 间接ELISA方法的建立及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 试验主要试剂配制 |
| 3.2 试验与方法 |
| 3.2.1 间接ELISA方法的建立 |
| 3.2.2 临界值的确定 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 重复性试验 |
| 3.2.5 敏感性试验 |
| 3.2.6 临床样品检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 以重组蛋白gL为抗原建立间接ELISA |
| 3.3.2 以重组蛋白g G为抗原建立间接ELISA |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）牛疱疹病毒Ⅰ型立即早期蛋白BICP0负向调控TRAF6的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 牛传染性鼻气管炎概述 |
| 1.1.1 牛传染性鼻气管炎的流行病学 |
| 1.1.2 牛传染性鼻气管炎的临床症状 |
| 1.1.3 牛传染性鼻气管炎的诊断方法 |
| 1.1.4 防制措施 |
| 1.2 牛疱疹病毒Ⅰ型的概述 |
| 1.2.1 牛疱疹病毒Ⅰ型的基本生物学特征 |
| 1.2.2 牛疱疹病毒Ⅰ型的基因组 |
| 1.2.3 牛疱疹病毒Ⅰ型的主要功能蛋白 |
| 1.3 泛素化的概述 |
| 1.3.1 泛素的发现及结构特点 |
| 1.3.2 泛素化过程 |
| 1.3.3 泛素链的类型 |
| 1.4 E3泛素连接酶概述 |
| 1.4.1 HECT类E3泛素连接酶 |
| 1.4.2 RBR类E3泛素连接酶 |
| 1.4.3 RING类E3泛素连接酶 |
| 1.5 TRAF蛋白家族的概述 |
| 1.5.1 TRAF蛋白家族成员及功能 |
| 1.5.2 TRAF6的功能 |
| 1.6 牛疱疹病毒Ⅰ型的免疫逃避 |
| 1.6.1 牛疱疹病毒Ⅰ型编码的免疫逃避蛋白 |
| 1.6.2 BICP0的概述 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 菌株,载体和抗体 |
| 2.1.3 工具酶 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 重组质粒p EASY-Blunt Simple-BICP0 的构建 |
| 2.2.2 重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的构建及鉴定 |
| 2.2.3 BICP0对MDBK细胞的影响研究 |
| 2.2.4 BICP0 对 TRAF6 的干扰作用研究 |
| 2.2.5 si RNA对 BICP0 的干扰试验 |
| 2.2.6 BICP0对TRAF6 作用机制的研究 |
| 2.2.7 “PAERQY”中的关键氨基酸鉴定 |
| 2.2.8 BICP0 影响TRAF6对IRF7 的激活研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PEASY-BLUNT SIMPLE-BICP0 的构建 |
| 3.1.1 BICP0基因的克隆,回收与连接 |
| 3.1.2 重组质粒p EASY-Blunt Simple-BICP0 的鉴定 |
| 3.2 重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的构建及鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒p ACEMam1-BICP0-Flag的构建和鉴定 |
| 3.2.2 DH10EMBac VSVTM-BICP0-FLAG的构建和鉴定 |
| 3.2.3 重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG的鉴定 |
| 3.3 BICP0对MDBK细胞的作用研究 |
| 3.3.1 重组杆状病毒RE-BICP0-FLAG使用剂量的摸索 |
| 3.3.2 BICP0对天然免疫信号通路的影响 |
| 3.3.3 Western Blot鉴定TRAF6 的变化 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR鉴定TRAF6 m RNA水平的变化 |
| 3.4 BICP0 对 TRAF6 的干扰作用研究 |
| 3.4.1 pc DNA3.1-BICP0 及其突变体的构建 |
| 3.4.2 牛TRAF6基因的扩增及载体构建 |
| 3.4.3 双荧光素酶活性检测 |
| 3.4.4 Western Blot鉴定 |
| 3.5 SIRNA对 BICP0 的干扰试验 |
| 3.5.1 干扰载体的构建 |
| 3.5.2 si RNA对 BICP0 的干扰作用研究 |
| 3.6 BICP0对TRAF6 作用机制的研究 |
| 3.6.1 MG132 抑制BICP0对TRAF6 的降解 |
| 3.6.2 BICP0 促进TRAF6 发生K48 泛素化修饰 |
| 3.7 “PAERQY”中的关键氨基酸鉴定 |
| 3.7.1 免疫共沉淀鉴定 |
| 3.7.2 “PAERQY”突变体的构建 |
| 3.7.3 “PAERQY”突变体的免疫共沉淀鉴定 |
| 3.7.4 “PAERQY”突变体的间接免疫荧光鉴定 |
| 3.7.5 “PAERQY”突变体对TRAF6 功能的影响 |
| 3.8 BICP0 阻断TRAF6对IRF7 的激活研究 |
| 3.8.1 BICP0 抑制TRAF6和IRF7对IFNβ启动子的共激活 |
| 3.8.2 BICP0 抑制TRAF6对IRF7 的泛素化 |
| 3.8.3 BICP0 抑制TRAF6对IRF7的K63 泛素化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BICP0基因的扩增 |
| 4.2 重组杆状病毒的选择及构建 |
| 4.3 BICP0对MDBK细胞的作用研究 |
| 4.4 HEK293T中 BICP0对TRAF6 的作用研究 |
| 4.5 SIRNA干扰试验 |
| 4.6 BICP0与TRAF6 相互作用的机制研究 |
| 4.7 BICP0关键氨基酸的鉴定 |
| 4.8 BICP0 阻断TRAF6对IRF7 的激活研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备和间接免疫荧光方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病原学研究 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 形态及理化特性 |
| 1.1.3 IBRV基因组主要编码蛋白的结构与功能 |
| 1.2 流行病学及致病性研究 |
| 1.2.1 流行情况及危害 |
| 1.2.2 致病机理及临床症状 |
| 1.2.2.1 致病机理 |
| 1.2.2.2 临床症状 |
| 1.3 诊断方法研究 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.1.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.3.1.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.3.1.3 荧光定量PCR(q PCR) |
| 1.3.1.4 等温扩增技术 |
| 1.3.1.5 基因芯片技术 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.3.2.2 中和试验(VN) |
| 1.3.2.3 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 1.3.2.4 胶体金检测技术 |
| 1.4 疫苗研究进展 |
| 1.4.1 弱毒活疫苗 |
| 1.4.2 灭活疫苗 |
| 1.4.3 亚单位疫苗 |
| 1.4.4 DNA疫苗 |
| 1.4.5 基因缺失疫苗 |
| 1.5 防控 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 第二章 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 细胞株、病毒株、实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.4.1 免疫抗原的鉴定 |
| 2.2.4.2 动物免疫 |
| 2.2.4.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.2.4.4 间接免疫荧光方法(IFA)的建立 |
| 2.2.4.5 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆 |
| 2.2.5 单克隆抗体腹水制备、纯化及效价测定 |
| 2.2.5.1 腹水制备 |
| 2.2.5.2 腹水纯化和浓度测定 |
| 2.2.5.3 腹水效价及亲和力检测 |
| 2.2.6 单克隆抗体的生物学特性分析 |
| 2.2.6.1 抗体类及亚类鉴定 |
| 2.2.6.2 单克隆抗体纯度鉴定 |
| 2.2.6.3 单克隆抗体的Western Blot分析 |
| 2.2.6.4 单克隆抗体的IFA检测 |
| 2.2.7 杂交瘤细胞的核型及遗传稳定性分析 |
| 2.2.7.1 杂交瘤细胞的核型分析 |
| 2.2.7.2 杂交瘤细胞的遗传稳定性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫抗原的鉴定 |
| 2.3.2 三免后小鼠血清效价测定 |
| 2.3.3 腹水效价和浓度测定 |
| 2.3.4 亲和力测定 |
| 2.3.5 抗体类及亚类和纯度鉴定 |
| 2.3.6 单克隆抗体Western Blot分析 |
| 2.3.7 单克隆抗体的IFA检测 |
| 2.3.8 杂交瘤细胞的核型分析 |
| 2.3.9 杂交瘤细胞的遗传稳定性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 单克隆抗体4G3D4 的抗原表位区域的分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 gD蛋白截短表达方案 |
| 3.2.4 重组蛋白的表达 |
| 3.2.4.1 病毒的培养与基因组的提取 |
| 3.2.4.2 引物设计及目的片段扩增 |
| 3.2.4.3 目的基因的克隆及鉴定 |
| 3.2.4.4 各基因片段重组蛋白的表达 |
| 3.2.5 单克隆抗体靶抗原表位的初步判定(Western Blot) |
| 3.2.6 抗原表位的保守性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 单克隆抗体与重组gD蛋白的反应性 |
| 3.3.2 单克隆抗体4G3D4 的抗原表位的初步鉴定 |
| 3.3.2.1 各基因片段重组蛋白的表达 |
| 3.3.2.2 单克隆抗体4G3D4 的抗原表位的初步鉴定 |
| 3.3.3 抗原表位的保守性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 间接免疫荧光方法的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞株、毒株 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.2.4 IFA方法的初步建立 |
| 4.2.5 IBRV gD蛋白单克隆抗体最适工作浓度和孵育时间的确定 |
| 4.2.6 FITC标记的羊抗鼠Ig G荧光抗体最适工作浓度和孵育时间的确定 |
| 4.2.7 敏感性试验 |
| 4.2.7.1 病毒敏感性试验 |
| 4.2.7.2 单克隆抗体敏感度试验 |
| 4.2.8 特异性试验 |
| 4.2.9 重复性试验 |
| 4.2.10 符合率试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 IBRV gD蛋白单克隆抗体最适工作浓度和孵育时间的确定 |
| 4.3.1.1 IBRV gD蛋白单克隆抗体最适工作浓度的确定 |
| 4.3.1.2 IBRV gD蛋白单克隆抗体最佳孵育时间的确定 |
| 4.3.2 FITC标记的羊抗鼠Ig G荧光抗体最适工作浓度和孵育时间的确定 |
| 4.3.2.1 FITC标记的羊抗鼠Ig G荧光抗体最适工作浓度的确定 |
| 4.3.2.2 FITC标记的羊抗鼠Ig G荧光抗体最佳孵育时间的确定 |
| 4.3.3 敏感性试验结果 |
| 4.3.3.1 病毒敏感性试验结果 |
| 4.3.3.2 单抗敏感度试验结果 |
| 4.3.4 特异性试验结果 |
| 4.3.5 重复性试验结果 |
| 4.3.5.1 批内重复性试验结果 |
| 4.3.5.2 批间重复性试验结果 |
| 4.3.6 符合率试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 牛传染性鼻气管炎病毒 gD 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 5.2 单克隆抗体 4G3D4 的抗原表位区域的分析 |
| 5.3 间接免疫荧光方法的建立 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其生物学特性初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 牛鼻气管炎疫苗的研究进展 |
| 1 牛鼻气管炎概况 |
| 1.1 牛鼻气管炎病毒基因组结构和典型蛋白功能 |
| 1.2 牛鼻气管炎病毒的分型 |
| 1.3 牛鼻气管炎的致病机理 |
| 1.3.1 牛鼻气管炎的侵染过程 |
| 1.3.2 牛鼻气管炎的潜伏感染 |
| 1.4 牛鼻气管炎的流行现状 |
| 2 牛鼻气管炎的诊断与防控 |
| 2.1 牛鼻气管炎的诊断 |
| 2.1.1 病原学方面的检测手段 |
| 2.1.1.1 包涵体染色镜检检查 |
| 2.1.1.2 BHV-1病毒的分离与鉴定 |
| 2.1.1.3 分子技术诊断BHV-1 |
| 2.1.2 血清学检测 |
| 2.1.2.1 中和试验检测 |
| 2.1.2.2 间接血凝试验检测 |
| 2.1.2.3 琼脂扩散试验检测 |
| 2.1.2.4 酶联免疫吸附试验检测 |
| 2.2 牛鼻气管炎的防控 |
| 2.3 牛鼻气管炎疫苗的种类 |
| 2.3.1 常规疫苗 |
| 2.3.1.1 弱毒疫苗 |
| 2.3.1.2 灭活疫苗 |
| 2.3.2 新型疫苗 |
| 2.3.2.1 亚单位疫苗 |
| 2.3.2.2 DNA疫苗 |
| 2.3.2.3 基因工程疫苗 |
| 3 牛鼻气管炎基因工程疫苗的研制方法 |
| 3.1 同源重组技术 |
| 3.2 锌指核酸酶技术 |
| 3.3 转录激活样效应物核酸酶技术 |
| 3.4 Cre/LoxP系统 |
| 3.5 CRISPR/Cas9系统 |
| 4 结语 |
| 第二章 基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其生物学特性初步鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂耗材与实验仪器 |
| 1.1.1.1 试剂 |
| 1.1.1.2 耗材 |
| 1.1.1.3 仪器 |
| 1.1.2 细胞与病毒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 扩增gE基因并测序分析 |
| 1.2.2 敲除载体的构建 |
| 1.2.3 供体质粒的构建 |
| 1.2.4 病毒PCR产物的回收纯化 |
| 1.2.5 质粒DNA的提取 |
| 1.2.6 细胞冻存与复苏 |
| 1.2.7 筛选转染效率较高的细胞系 |
| 1.2.8 不同细胞中毒价的测定 |
| 1.2.9 荧光毒株与缺失毒株的拯救 |
| 1.2.10 重组病毒的筛选与鉴定 |
| 1.2.11 重组病毒的纯化与扩增 |
| 1.2.12 病毒基因组DNA的提取 |
| 1.2.13 病毒的生物学特性分析 |
| 1.2.13.1 病毒效价的测定 |
| 1.2.13.2 绘制病毒增殖曲线 |
| 1.2.14 数据分析标准 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 实验设计 |
| 2.2 BHV-1 gE基因的流行性分析 |
| 2.3 载体的构建与鉴定 |
| 2.3.1 敲除载体的构建与鉴定 |
| 2.3.2 供体质粒的构建与鉴定 |
| 2.4 编辑BHV-1细胞系的筛选 |
| 2.4.1 转染效率筛选 |
| 2.4.2 病毒复制能力筛选 |
| 2.5 重组病毒的筛选与纯化 |
| 2.5.1 重组病毒的筛选与鉴定 |
| 2.5.2 重组病毒的噬斑克隆纯化 |
| 2.6 亲本毒与目的毒株生物学特性比较 |
| 2.6.1 噬斑形成单位的测定与比较 |
| 2.6.2 增殖曲线的绘制 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞系的选择 |
| 3.2 sgRNA的筛选 |
| 3.3 重组病毒的筛选和外源蛋白的表达 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及硕士期间成果 |
（8）BoHV-1双基因缺失株豚鼠试验和三基因缺失株兔体试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 IBR的流行情况 |
| 1.2.1 国外流行情况 |
| 1.2.2 国内流行情况 |
| 1.3 IBR的防控 |
| 1.3.1 国际防控现状 |
| 1.3.2 我国防控现状 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.3.4 IBR疫苗评价动物模型 |
| 1.3.5 免疫保护评价标准 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒与菌毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 试剂盒 |
| 2.1.4 试剂的配制 |
| 2.1.5 实验器材 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的扩增 |
| 2.2.2 病毒的浓缩 |
| 2.2.3 病毒毒价的测定 |
| 2.2.4 病毒核酸的PCR检测 |
| 2.2.5 BoHV-1 gG~-/tk~-双基因缺失疫苗评价豚鼠模型的建立 |
| 2.2.6 三基因缺失突变株BoHV-1 gN~-/tk~-/gG~-的生物学特征和免疫效能研究 |
| 2.2.7 统计学分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BoHV-1 gG~-/tk~-双基因缺失疫苗评价豚鼠模型的建立 |
| 3.1.1 豚鼠IBR野毒感染试验 |
| 3.1.2 BoHV-1 gG~-/tk~-双基因缺失疫苗安全性试验 |
| 3.1.3 BoHV-1 gG~-/tk~-双基因缺失疫苗免疫效力试验 |
| 3.2 三基因缺失突变株BoHV-1 gN~-/tk~-/gG~-的生物学特征和免疫效能研究 |
| 3.2.1 三基因缺失突变株BoHV-1 gN~-/tk~-/gG~-的生物学特征研究 |
| 3.2.2 三基因缺失突变株BoHV-1 gN~-/tk~-/gG~-的免疫效能研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）吉林地区三种牛病毒性传染病的流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状及致病机制 |
| 1.4 检测技术 |
| 1.5 预防与控制 |
| 第二章 牛传染性鼻气管炎 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 临床症状及致病机制 |
| 2.4 检测技术 |
| 2.5 预防与控制 |
| 第三章 牛呼吸道合胞体病 |
| 3.1 病原学 |
| 3.2 流行病学 |
| 3.3 临床症状 |
| 3.4 检测技术 |
| 3.5 预防与防控 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 吉林部分地区3种牛病毒性传染病血清学检测 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 检测试剂盒 |
| 1.1.3 样品采集 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 蛟河市IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.2 柳河县IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.3 榆树市IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.4 农安地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.5 敦化地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.6 梅河口地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.7 长岭地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.8 梨树地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.9 通榆地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.10 公主岭地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.2.11 东丰地区IBR、BVD和 BRS抗体检测结果 |
| 1.3 统计与分析 |
| 1.3.1 各县(市)BVD、IBR及 BRS抗体阳性率结果分析 |
| 1.3.2 不同地理区域BVD、IBR及 BRS抗体阳性率相关性分析 |
| 1.3.3 各县(市)BVD、IBR及 BRS抗体阳性率相关性分析 |
| 1.3.4 各县(市)BVD、IBR和 BRS混合感染情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 各地区BVD流行情况分析 |
| 1.4.2 各地区IBR的流行情况分析 |
| 1.4.3 各地区BRS的流行情况分析 |
| 1.4.4 BVD、IBR、BRS相关性分析 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 吉林地区3种牛病毒性传染病分子生物学检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 样品来源 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）牛传染性鼻气管炎抗体胶体金免疫层析方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 牛传染性鼻气管炎研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 免疫机理 |
| 1.1.5 诊断 |
| 1.1.6 防治 |
| 1.2 胶体金标记技术研究进展 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 临床样品、血清和载体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂及材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 融合基因的合成及PET-28a(+)引物的合成 |
| 2.2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组表达载体的表达及表达蛋白的纯化 |
| 2.2.4 纯化蛋白的鉴定 |
| 2.2.5 胶体金免疫层析方法的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗原表位筛选、截取结果 |
| 3.2 原核表达载体的构建 |
| 3.2.1 pET-28a(+)-gD_(abc)质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.2 pET-28a(+)空载双酶切鉴定 |
| 3.2.3 pET-28a(+)-gD_(abc)基因特异性引物PCR扩增鉴定 |
| 3.2.4 pET-28a(+)-gD_(abc)菌液PCR鉴定 |
| 3.3 融合蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.1 pET-28a(+)-gD_(abc)阳性菌最佳诱导表达时间的确定 |
| 3.3.2 pET-28a(+)-gD_(abc)阳性菌表达蛋白可溶性的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3.3 纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.3.4 纯化蛋白gD_(abc)浓度测定结果 |
| 3.3.5 融合蛋白gD_(abc)的Westernblot鉴定结果 |
| 3.4 胶体金免疫层析方法的建立 |
| 3.4.1 SPA标记最适K_2CO_3添加量的确定的确定 |
| 3.4.2 胶体金最适SPA标记量的确定 |
| 3.4.3 金标垫喷金浓度的确定 |
| 3.4.4 T线划线蛋白gD_(abc)浓度的筛选结果 |
| 3.4.5 试纸条有效性的验证 |
| 3.4.6 试纸条交叉性试验结果 |
| 3.4.7 试纸条对临床样品的检测 |
| 3.4.8 试纸条重复性检测 |
| 3.4.9 试纸条稳定性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 抗原表位的筛选 |
| 4.2 连接肽的选择 |
| 4.3 大肠杆菌表达系统 |
| 4.4 试纸条的制备 |
| 4.4.1 试纸条制备材料的筛选 |
| 4.4.2 包被抗原的处理 |
| 4.4.3 胶体金免疫层析技术的不足与克服办法 |
| 4.4.4 胶体金免疫层析方法在IBRV综合防控上的应用前景 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 作者简历 |
| 致谢 |
四、表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建（论文参考文献）
- [1]牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量PCR检测方法建立及IBRV NM8株的分离鉴定[D]. 李东丽. 吉林农业大学, 2021
- [2]基于CRISPR-Cas9技术构建表达狂犬病毒G蛋白的Ⅰ型牛疱疹病毒[D]. 吉莉娜. 内蒙古大学, 2021(12)
- [3]牛疱疹病毒Ⅰ型抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用[D]. 柳翠翠. 河北科技师范学院, 2020(02)
- [4]牛疱疹病毒Ⅰ型立即早期蛋白BICP0负向调控TRAF6的作用机制研究[D]. 曹翀. 东北农业大学, 2020(04)
- [5]牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备和间接免疫荧光方法的建立[D]. 杨飞. 中国兽医药品监察所, 2020(09)
- [6]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [7]基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1 gE缺失株及其生物学特性初步鉴定[D]. 穆艳霞. 内蒙古大学, 2019(09)
- [8]BoHV-1双基因缺失株豚鼠试验和三基因缺失株兔体试验[D]. 杨姣. 华中农业大学, 2019(02)
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