一、CHITINASE（论文文献综述）
张宇阳,周雪,刘灵艺,许吴俊,任旭琴,王广龙,熊爱生[1]（2022）在《大蒜几丁质酶基因AsCHI1的鉴定及其对盐胁迫的响应》文中研究说明本研究旨在研究大蒜几丁质酶基因的序列特征及其对盐胁迫的响应,鉴定其抗逆功能。以大蒜品种‘苍山四六瓣’为研究材料,通过RT-PCR技术分离得到AsCHI1基因。采用BioXM 2.6、ProtParam、DNAMAN、SignalP 5.0、SOPMA、SWISS-MODEL、NCBI和MEGA5等软件分析核苷酸及其编码的氨基酸序列特征,利用荧光定量PCR技术检测其在不同组织以及盐胁迫下的表达特性。该基因开放阅读框全长933 bp,编码310个氨基酸,其编码的蛋白属于几丁质酶Class I类,同时隶属于GH19家族成员。氨基酸序列分析显示,AsCHI1在N端含有大多数几丁质酶具备的信号肽区域,在C端与其他物种CHI氨基酸序列一致性较高。在亲缘关系上与同属百合科的麝香百合LlCHI （QBZ68892.1）以及山茶科的茶CsCHI（XP028075045.1）较为接近。实时荧光定量PCR技术分析表明,AsCHI1基因在大蒜根、蒜瓣和叶片中均有表达,但在根中表达最高。另外,盐胁迫能显着诱导AsCHI1基因在各组织内的表达。说明该基因可能在大蒜植株抵御盐胁迫的过程中发挥重要作用。
吴锋,周叶波,姜路辛,孙小宝,尹尚军,钱国英,王佳堃,王正东,张慧恩,王谦[2]（2022）在《苏云金芽胞杆菌几丁质酶BtCHI1的原核表达与性质分析》文中进行了进一步梳理几丁质酶（chitinase, CHI）是一类能降解几丁质底物、生成几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖（Nacetylglucosamine, GlcNAc）的糖苷水解酶。本研究从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringensis）中克隆获得几丁质酶基因BtCHI1,利用大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）plysS进行异源表达,研究重组蛋白的酶学性质、多底物动力学和底物降解性质。结果显示,重组BtCHI1蛋白的分子量约为75 kD,最适反应温度和pH分别为40℃和7.0。该酶热稳定性较差,在50℃下处理1 h后仅能保留20.11%残余活性;但pH稳定性较好,在pH 3.0～10.0范围内处理1 h后,残余活性均超过80%。底物动力学分析显示,重组蛋白BtCHI1能有效降解几丁质、胶体几丁质和壳聚糖,Vmax分别为（4.62±0.46）、（0.52±0.03）和（0.22±0.02）μmol/（min·mg）;而BtCHI1对羟丙基壳聚糖和乙二醇几丁质则无降解作用。此外,0.5～10 mmol/L的Na+、Al3+或EDTA对酶活性无影响（P>0.05）,但经0.5～10 mmol/L Ca2+或5～10 mmol/L SDS处理1 h后,酶活性显着下降（P<0.01）。薄层色谱和高效液相色谱分析显示,该酶能从几丁质和胶体几丁质底物中释放几丁二糖,并将其进一步降解为单糖。之后,将重组BtCHI1用于降解天然虾、蟹壳底物,反应12 h后,该酶（0.28 U）能分别从天然虾壳或蟹壳底物中释放（1.00±0.04） mg/mL或（1.71±0.11） mg/mL还原糖。本研究为功能性几丁寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖制备和天然几丁质底物资源化利用提供参考。
李妍,李家磊,师献雪,张俊丽,胡淼[3]（2021）在《昆虫几丁质酶功能研究、酶学性质及应用研究进展》文中研究表明昆虫几丁质酶参与昆虫生长发育的各个阶段,近年来随着技术的更新,RNAi技术的广泛应用,人们对昆虫几丁质酶的结构、功能、生物学特性及应用方面取得了新的研究成果。文章主要分析几丁质酶家族基因的分类研究中功能的探究、酶学性质和应用方面,主要通过果蝇、赤拟谷盗、褐飞虱等昆虫生长发育中的功能比较分析及应用开发新型杀虫剂或杀菌剂,同时为全面认识昆虫几丁质酶家族基因的功能,并利用几丁质酶基因防治害虫奠定基础。
孔德颖,蔡燕飞[4]（2021）在《海洋溶珊瑚弧菌VcChit56几丁质酶的蛋白质工程改造》文中认为外泌几丁质酶在溶珊瑚弧菌生活史中发挥重要作用。本研究从蛋白质序列角度分析了多种来源于溶珊瑚弧菌的几丁质酶,并选其中蛋白质结构相对简单,容易进行序列改造和大肠杆菌重组表达、纯化的几丁质酶开展研究:（1）在保留野生型弧菌C端几丁质结合域的同时,N段增加陆生微生物几丁质结合域;（2）获得高表达重组几丁质酶的大肠杆菌菌株,采用一步层析柱工艺,重组蛋白纯度达90%以上;（3）不经过复杂脱盐换液处理,几丁质酶活性仍维持较高水平。经过对以上条件的优化,本研究确立了几丁质酶重组表达的工艺路线,分析了此重组酶活性匹配的含盐缓冲液条件,为今后几丁质酶大规模生产积累理论研究基础。
王神云[5]（2021）在《甘蓝抗根肿病种质资源鉴定及抗性相关基因挖掘》文中研究指明结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata L.,简称甘蓝）属十字花科芸薹属甘蓝变种,是我国栽培的主要叶菜类蔬菜之一,在蔬菜供应和进出口中占有重要的地位。由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）引起的甘蓝根肿病在世界范围肆虐,严重危害甘蓝等十字花科蔬菜的生产,造成产量和质量大幅降低。然而,由于抗病资源相对匮乏及病原菌生理小种复杂等原因,使得抗病研究和品种选育进展缓慢。本研究在采集我国甘蓝根肿病重病区的芸薹根肿菌和鉴定其生理小种的基础上,鉴定和筛选甘蓝抗根肿病资源,利用抗、感病材料接种后表达谱的差异、全基因组鉴定和过表达分析,挖掘抗性相关基因。主要研究结果如下:（1）采集湖北省利川市汪营镇和宜昌市火烧坪乡根肿病病发严重区域的病土和病根,分离病原菌,通过显微观察其形态特征,根据芸薹根肿菌ITS序列设计引物对其进行PCR鉴定,确定病原菌为芸薹根肿菌。筛选出Plasmo3-4特异引物可以直接快速的用于甘蓝、白菜、油菜等其他十字花科作物根肿病病原菌检测。随后利用欧洲根肿病鉴别系统（European clubroot differential set,ECD）结合苗期菌土接种法确定了这两个地区根肿菌的生理小种:汪营镇的病原菌为ECD16/4/0,火烧坪乡的病原菌为ECD17/31/13,前者致病力一般,后者致病力极强。因此,以致病力强的火烧坪芸薹根肿菌为接种源,采用苗期菌土人工接种鉴定与成株期自然诱发鉴定相结合的方法,对88份甘蓝种质资源进行抗性鉴定和筛选,大部分材料在两个时期的抗性表现相对一致,其中CR21两个时期的抗性表现均最强,CR55和CR54分别在苗期和成株期表现最弱。（2）利用已鉴定出的甘蓝抗病和感病高代自交系材料CR21和CR54,在室内幼苗水培接种芸薹根肿菌,采集根部通过显微镜检查,发现根肿菌在根毛附着和穿透主要发生在侵染后3天（3 DAI）,是RNA-Seq取样的时间。根部组织进行转录组测序分析后发现,在CR21和CR54中分别找到了1,057个和4,741个差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）。在CR21中541个DEGs表达量上调,而这些基因在CR54中或没有明显变化或表达量下调,通过GO注释和功能富集分析表明,大部分DEGs参与代谢、转运、信号转导和防御反应,鉴定到165个DEGs与抗病响应相关,包括病原相关分子模式激发免疫（PAMPs-triggered immunity,PTI）相关基因和效应子激发免疫（Effector-triggered immunity,ETI）相关基因。主要有伤口反应基因（Bo3g135780）、呼吸爆发氧化酶类（RBOHB）、转录因子（WRKY28）、TIR-NBS-LRR类抗病基因（RPS4等）,病程相关基因（Pathogenesis-related,PR,Bo 7g005050）,脂质转运蛋白类（LTP1）,几丁质酶（B04g020930）;植物激素响应相关基因,乙烯信号转导（类HRE1和EIN3）、ABA信号转导（PP2C和PYL13）等;细胞壁修饰相关基因（EXP17、PME44）。综上所述,这一研究揭示了 CR21和CR54响应芸薹根肿菌早期侵染的组学差异,并确定了抗病相关候选基因。（3）全基因组共鉴定到61个脂质转运蛋白（BonsLTPs）,不均等地分布在9条染色体上,根据8个半胱氨酸残基（ECM）间残基的相似性,将其中59个归为10个类型。组织转录组分析发现除BonsLTPIX2和BonsLTPXL3外,其他59个基因在不同的组织器官中有表达,部分BonsLTPs基因在花蕾、角果、茎、叶、愈伤组织中有特异表达现象。根肿菌侵染转录组与结构分析相结合鉴定到7个BonsLTPs基因（BonsLTPI.1、BonsLTPI.5、BonsLTPI.9、BonsLTPI.10、BonsLTPI.14、BonsLTPIV.1和BonsLTPIV.6）与根肿病抗性相关,BonsLTPI.5和BonsLTPI.14在拟南芥中过表达后不同程度提高了寄主对P.brassica的抗病性,BonsLTPI.14极显着降低了寄主的发病率和病情指数,BonsLTPI.5显着降低了寄主的病情指数。通过启动子响应元件分析表明它们可能通过加强第一道抵御防线增强抗病性,或者通过细胞内信号转导途径增强抗病性或对水分或营养缺乏间接响应而增强抗病性。（4）全基因组共鉴定到40个几丁质酶（BoChiAs）,不均等地分布在7条染色体上,根据这些基因编码蛋白质序列和结构特性,划分为Ⅰ-Ⅴ五个类型,其中Ⅲ、Ⅴ类型属于家族GH18。组织转录组分析发现11个BoChiAs（类型Ⅳ成员9个）在不同的组织器官中均没有表达,BoChiAⅣ.12在叶中特异表达,16个BoChiAs基因在不同的组织器官中有表达。根肿菌侵染转录组与结构分析相结合鉴定到3个BoChiAs基因（BoChiAⅣ.6、BoChiAⅣ.14、BoChiAⅣ.22）与根肿病抗性相关,BoChiAⅣ.6和BoChiAⅣ.14在拟南芥中过表达后和几丁质寡糖处理表明两个基因一定程度提高了寄主对P.brassica的抗病性,几丁质寡糖处理极显着降低了寄主的发病率和病情指数,两个基因降低了寄主的发病率和病情指数,其中BoChiAⅣ.14极显着减轻了寄主的发病程度。通过亚细胞定位和启动子响应元件分析表明上述基因可能通过直接降解病原菌几丁质或被抗病信号诱导降解病原菌几丁质而增强寄主抗病性。本研究鉴定了目前中国甘蓝根肿病最严重区域之一的病原菌生理小种,有针对性地筛选抗性资源,通过转录组分析、BonsLTPs和BoChiAs基因家族鉴定、基因过表达和抗性鉴定研究,获得甘蓝抗根肿病相关基因,可为抗根肿病研究提供参考,还可为抗病品种的选育提供优异材料和新的思路,为根肿病防治策略制定提供理论依据。
张奇,王一兵,申乃坤,姜明国[6]（2021）在《产几丁质酶菌株GXUN-20的筛选、鉴定及其产酶条件优化》文中进行了进一步梳理为了提高虾蟹等海产品废弃物利用率及其附加值,从广西合浦县大神木海鸭场附近滩涂沉积物（虾蟹及贝壳废弃物）中分离、纯化、筛选出一株产几丁质酶菌株GXUN-20,经过生理生化鉴定以及16S rDNA序列构建系统发育树,初步判断该菌株为厚壁溶杆菌（Lysobacter firmicutimachus）。以几丁质酶活力为指标,对GXUN-20菌株进行发酵条件单因素优化,在单因素优化结果较显着的4因素（氮源浓度、发酵液初始pH、几丁质粉末浓度、接种量）基础上进行4水平正交试验及正交实验方差分析。结果显示:氮源浓度对产酶影响显着（P=0.013<0.05）,在氮源为1 g/L黄豆饼粉,几丁质粉末为20 g/L,接种量为3%,发酵液初始pH8.4,30℃、200 r/min发酵6 d的条件下,发酵液中几丁质酶活力最大,达到0.965 U/mL,是优化前酶活力的6.89倍。本研究结果为GXUN-20菌株产几丁质酶进一步开发与应用提供了基础数据和实验方法。
林秋妹,王霞,赵东方,贾彩红,王静毅,刘菊华,徐碧玉,张玄兵,王卓[7]（2022）在《香蕉几丁质酶基因家族的鉴定及在枯萎病侵染时的表达分析》文中认为几丁质酶（CHi,Chitinase）是一种能够催化真菌细胞壁中几丁质水解的病程相关蛋白,在植物与真菌互作中起着重要的作用。本研究以拟南芥几丁质酶基因的蛋白序列为查询序列,在香蕉A基因组数据库中进行BLASTp比对,鉴定出23个香蕉几丁质酶（MaCHi,Musa chitinase）基因家族成员。根据其染色体上的位置,分别命名为MaCHi01～MaCHi23。系统进化树分析表明23个MaCHis可分为糖苷水解酶18（GH18,glycosyl hydrolase 18）和糖苷水解酶19（GH19,glycosyl hydrolase 19）2个亚家族。转录组数据分析表明接种尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种（Foc TR4,Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4）后MaCHi05、MaCHi06、MaCHi07、MaCHi11、MaCHi19和MaCHi20基因在感病品种巴西蕉中显着下调或不表达,在抗病品种GCTCV-119中显着上调。利用RT-qPCR技术对MaCHi05、MaCHi06、MaCHi07、MaCHi11和MaCHi19在抗病和感病品种接种Foc TR4中进行表达分析,结果发现在抗病品种中这些基因的表达都被激活,而在感病品种中没有激活,且在抗病品种中的相对表达量远大于感病品种,表明这些基因以正调控方式参与香蕉抗枯萎病过程。本研究结果为进一步解析MaCHi基因家族成员在香蕉抗枯萎病过程中的功能提供理论参考。
黄金凤,李波,白莹,冯礼燊,李文笙,孙彩云[8]（2021）在《吉富罗非鱼胃肠道几丁质酶的克隆、组织分布和纯化》文中研究指明【目的】几丁质酶是重要的水解酶,能通过水解β-1,4-糖苷键来降解鱼类食物中虾蟹壳所含的几丁质,帮助鱼类消化。了解几丁质酶在罗非鱼不同组织中的表达状况,以及从罗非鱼胃中所提取几丁质酶的特性。【方法】从吉富罗非鱼胃和肠组织中克隆获得3种几丁质酶tChit1a、tChi3和tChit的开放阅读框序列进行序列分析,并通过Real-time PCR检测其组织分布状况;通过几丁质亲和层析法纯化罗非鱼胃组织中的几丁质酶,并通过4-MU法检测酶活性。【结果】tChit1a、tChi3和tChit几丁质酶基因分别编码453、453和473个氨基酸,同源比对结果显示tChit1a与t Chi3的相似度为83.66%,而tChit与tChit1a、tChi3的相似度则较低,分别为49.89%和50.11%。进化树分析结果显示,这3种几丁质酶是鱼类三型几丁质酶,为非酸性几丁质酶。组织分布结果显示,tChit1a、tChi3和tChit分别在罗非鱼中肠、前肠和中肠后表达量最高。纯化罗非鱼胃几丁质酶的结果显示,SDS-PAGE胶在40 ku附近有两条明显条带,但用斜带石斑鱼1型几丁质酶多克隆抗体检测,没有检测到同源性高的条带。检测纯化产物几丁质酶的活性,结果显示,在最适pH值为5时,纯化产物降解4MU-（GlcNAc）2和4MU-（GlcNAc）3分别为1.73、4.89 U/g。【结论】罗非鱼胃组织中所提取的几丁质酶表达量和活性均较低,这可能与罗非鱼为杂食且偏素食的食性有关。
丁志雯,刘耀东,黄志发,程钰,杨光,侯晓月,刘姝,房耀维[9]（2021）在《产几丁质酶海洋细菌Dyadobacter sp.CZW019的筛选、鉴定及酶学性质研究》文中认为有关具转糖苷活性的几丁质酶研究目前鲜有报道,挖掘新型具转糖苷活性产几丁质酶的菌株并进行相关研究具有重要意义。从海泥中筛选几丁质酶产生菌,对菌株进行了鉴定和酶学性质研究。从连云港海域沙泥中筛选获得具有转糖苷活性几丁质酶产生菌CZW019,通过形态学、生理生化及16SrDNA序列分析将菌株鉴定为Dyadobacter sp.。对CZW019几丁质酶酶学性质进行研究,结果表明该几丁质酶水解几丁质生成几丁单糖和几丁二糖,并具有转糖苷活性。该酶最适反应温度为35℃,最适pH为7.0,金属离子Mg2+和Zn2+对酶活有显着促进作用,Hg2+对酶活有显着抑制作用。α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质作为底物时,以胶体几丁质作为底物酶活最高。
包文化[10]（2021）在《基于PTA技术的抗虫转基因玉米的培育及玉米黏虫的RNAi机理研究》文中研究指明玉米黏虫（Mythimna separata）是属于鳞翅目夜蛾科的农业害虫,主要危害玉米等粮食作物。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是研究基因功能的重要方法,而基于RNAi技术的寄主诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing,HIGS）为培育抗虫转基因植物开辟了新途径。大多数鳞翅目昆虫的RNAi效率较低,因此提高RNAi效率是基于RNAi的鳞翅目害虫控制措施的关键所在。Ms Chi1和Ms Chi2是玉米黏虫中编码几丁质酶（Chitinase）的两个基因。本研究中,首先获得了过表达hp Ms Chi1和hp Ms Chi2的转基因水稻,评价了其对受试昆虫的HIGS效应,并利用小RNA高通量测序进一步分析了HIGS触发的si RNA的类型和特征。另一方面,本研究建立了一种基于人工micro RNA（Artificial micro RNA,ami RNA）的PTA（Polycistronic-t RNA-ami RNA）表达系统,将其稳定转化并获得了同时干扰玉米黏虫多个基因的转基因玉米。比较分析了PTA和hp RNA技术诱导的RNAi效率。最后,对Ms AGO2、Ms Dcr2和Ms SID1等RNAi机制核心蛋白进行了生化特性分析,为玉米黏虫的RNAi机制提供了理论基础。主要研究结果如下:1.玉米黏虫中的HIGS效应及其si RNA特征分析本研究首先获得了稳定表达Ms Chi1和Ms Chi2基因hp RNA表达盒的转基因水稻hp Ms Chi1-Ox和hp Ms Chi2-Ox。通过靶基因表达量、死亡率统计、体重和体长的测量来评估取食转基因水稻后玉米黏虫的RNAi效应。结果表明,hp Ms Chi2-Ox水稻比hp Ms Chi1-Ox水稻对玉米黏虫产生更显着的RNAi效应。利用小RNA高通量测序技术分析了取食转基因水稻后的Ms Chi2基因特异性的si RNA的丰度和特征。在hp Ms Chi2-Ox水稻和取食hp Ms Chi2-Ox水稻的玉米黏虫肠道中均有效积累了Ms Chi2特异的si RNA,其20-24 nt的si RNA具有以下几个特点:（1）主要分布在导入区;（2）以22 nt类型si RNA居多;（3）具有正义链偏好性。2.Ms Chi2的表达特征及其编码蛋白的生物活性分析表达谱分析结果显示,Ms Chi2基因主要在玉米黏虫体壁和肠道组织中高表达,这可能与玉米黏虫蜕皮时几丁质的降解有关。几丁质酶活性实验显示,Ms Chi2蛋白具有水解几丁质的活性。为了验证几丁质酶在玉米黏虫幼虫生长发育中的作用,我们将几丁质酶抑制剂（Psammaplin A）与人工饲料混合饲喂玉米黏虫,同时以ds Chi2与人工饲料混合饲喂作为平行对照。实验结果表明,与ds Chi2饲喂效果相似,几丁质酶抑制剂对玉米黏虫表现出明显的杀虫活性。3.PTA表达系统提高玉米黏虫靶基因的沉默效率ami RNA是根据mi RNA的表达特点和作用原理设计的一种新型RNAi技术。本研究首次引入了针对多个靶基因进行干扰的基于ami RNA的PTA表达系统。构建了针对玉米黏虫Ms Chi2、Ms Actin和Ms REase等基因的PTA表达盒,并获得了稳定表达PTA的转基因玉米PTA-Ox。与hp Ms Chi2-Ox水稻相比,取食PTA-Ox玉米的玉米黏虫表现出更高且更持久的RNAi效应,同时能够同时沉默三个靶基因。取食PTA-Ox玉米的玉米黏虫在不同生长阶段和不同器官中表现出更明显的发育异常的表型。我们推测这种发育异常可能与Ms Chi2基因的系统性沉默有关。上述结果证明了我们建立的多靶基因沉默系统的有效性。4.玉米黏虫RNAi核心基因的功能验证为了进一步探讨玉米黏虫RNAi机制,我们对Ms AGO2、Ms Dcr2和Ms SID1等RNAi机制蛋白进行了生化活性分析。在凝胶迁移实验中,Ms AGO2蛋白通过浓度依赖性方式结合并阻滞了32P标记的ss RNA迁移率。Ms SID1也以剂量依赖的方式与32P标记的ds RNA的特异性结合,而这种ss RNA/ds RNA结合活性被未标记的竞争物所消除。Ms Dcr2蛋白将ds RNA切割成大小为20-24 nt的si RNAs,而对照组GST蛋白没有表现出这种活性。上述RNAi机制核心蛋白的生化活性可能是玉米黏虫体内存在系统性RNAi的主要原因。综上所述,我们通过对si RNA特征和RNAi机制成分的分析,为玉米黏虫RNAi机制的存在提供了有力的理论基础,并且PTA系统为提高鳞翅目害虫的RNAi防治具有重要研究意义。
二、CHITINASE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CHITINASE（论文提纲范文）
（1）大蒜几丁质酶基因AsCHI1的鉴定及其对盐胁迫的响应（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料和试验设计 |
| 1.2 大蒜RNA提取及cDNA合成 |
| 1.3 AsCHI1基因的克隆 |
| 1.4 序列分析 |
| 1.5 实时荧光定量PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大蒜AsCHI1基因的克隆 |
| 2.2 大蒜AsCHI1的氨基酸序列及理化性质分析 |
| 2.3 大蒜AsCHI1的二级结构与三级结构预测 |
| 2.4 AsCHI1的系统进化树分析 |
| 2.5 AsCHI1基因在盐胁迫下的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）苏云金芽胞杆菌几丁质酶BtCHI1的原核表达与性质分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 基因克隆与序列分析 |
| 1.3 重组几丁质酶的表达与电泳分析 |
| 1.4 酶学性质分析 |
| 1.5 Bt CHI1对金属离子、SDS和EDTA的耐受能力 |
| 1.6 底物降解分析 |
| 1.7 天然虾蟹壳底物降解 |
| 1.8 数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt CHI1基因克隆与序列分析 |
| 2.2 蛋白表达与电泳分析 |
| 2.3 重组Bt CHI1的酶学性质 |
| 2.4 Bt CHI1对金属离子、SDS和EDTA的耐受能力 |
| 2.5几丁质降解产物分析 |
| 3讨论 |
| 4 结论 |
（3）昆虫几丁质酶功能研究、酶学性质及应用研究进展（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1.1 昆虫几丁质酶的生理功能 |
| 1.2 昆虫几丁质酶的分类及功能研究 |
| 2 昆虫几丁质酶的酶学性质 |
| 2.1 昆虫几丁质酶的基本性质 |
| 2.2 几丁质酶活性测定方法 |
| 3 昆虫几丁质酶的应用 |
| 3.1 几丁质酶在生物防治方面的应用 |
| 3.2 昆虫几丁质酶在转基因植物中的应用 |
| 4 结语与展望 |
（4）海洋溶珊瑚弧菌VcChit56几丁质酶的蛋白质工程改造（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 几丁质酶序列改造 |
| 1.3 Vc Chit56原核表达载体的构建与诱导表达 |
| 1.4 Vc Chit56层析纯化 |
| 1.5 不同盐离子浓度下Vc Chit56酶活分析 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 Vc Chit56氨基酸序列分析 |
| 2.2 Vc Chit56原核表达与纯化 |
| 2.3 Vc Chit56酶活分析 |
| 3 结论 |
（5）甘蓝抗根肿病种质资源鉴定及抗性相关基因挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 十字花科作物根肿病概况 |
| 1.1.1 甘蓝的重要性 |
| 1.1.2 十字花科根肿病的发生以及危害 |
| 1.1.3 根肿病的病症 |
| 1.1.4 病原菌芸薹根肿菌的分类及鉴定 |
| 1.1.5 芸薹根肿菌的生理小种鉴定 |
| 1.1.6 芸薹根肿菌侵染规律 |
| 1.1.7 芸薹根肿菌侵染对寄主植物的影响 |
| 1.2 甘蓝类作物抗根肿病的研究进展 |
| 1.2.1 甘蓝类作物抗根肿病种质资源筛选 |
| 1.2.2 甘蓝类作物根肿病抗性研究进展 |
| 1.2.3 抗根肿病组学研究进展 |
| 1.3 植物nsLTPs的研究进展 |
| 1.3.1 植物nsLTPs的基本特征 |
| 1.3.2 nsLTPs的生物学功能 |
| 1.4 植物几丁质酶的研究进展 |
| 1.4.1 植物几丁质酶的特征特性 |
| 1.4.2 几丁质酶的生物学功能 |
| 1.5 研究技术路线 |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 第二章 甘蓝抗根肿病种质资源的筛选与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 芸薹根肿菌休眠孢子的收集和显微观察 |
| 2.1.3 芸薹根肿菌分子鉴定 |
| 2.1.4 特异条带回收测序 |
| 2.1.5 芸薹根肿菌生理小种鉴定 |
| 2.1.6 甘蓝种质资源抗性鉴定及筛选 |
| 2.1.7 甘蓝种质资源抗性评价 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 土壤和病根芸薹根肿菌镜检 |
| 2.2.2 芸薹根肿菌分子鉴定 |
| 2.2.3 病原菌生理小种鉴定 |
| 2.2.4 甘蓝抗根肿病种质资源鉴定及筛选 |
| 2.2.5 苗期和成株期发病率比较 |
| 2.2.6 苗期和成株期病情指数比较 |
| 2.2.7 抗病材料抗性评价 |
| 2.3 讨论与结论 |
| 第三章 甘蓝响应芸薹根肿菌胁迫相关基因的鉴定与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 孢子悬浮液准备 |
| 3.1.3 甘蓝播种和接种 |
| 3.1.4 根部显微观察 |
| 3.1.5 RNA提取、cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.6 组装和注释 |
| 3.1.7 表达差异基因分析 |
| 3.1.8 荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 根部组织显微观察 |
| 3.2.2 测序和组装 |
| 3.2.3 表达差异基因功能注释 |
| 3.2.4 抗性相关表达差异基因 |
| 3.2.5 qRT-PCR验证转录组基因表达 |
| 3.3 讨论与结论 |
| 第四章 甘蓝nsLTP基因家族的鉴定及BonsLTPI.14和BonsLTPI.5抗根肿病功能验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料和引物 |
| 4.1.2 BonsLTP基因家族完整序列分析 |
| 4.1.3 BonsLTPs蛋白特征分析和系统进化树构建 |
| 4.1.4 BonsLTPs基因结构和染色体定位和表达谱分析 |
| 4.1.5 BonsLTPs启动子序列的顺式调控元件分析 |
| 4.1.6 BonsLTPs蛋白的亚细胞定位在线预测 |
| 4.1.7 基因全长cDNA序列获得 |
| 4.1.8 重组过表达载体构建 |
| 4.1.9 质粒提取转入根癌农杆菌及鉴定 |
| 4.1.10 转化和检测 |
| 4.1.11 转化植株抗病性鉴定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BonsLTP基因家族的鉴定 |
| 4.2.2 BonsLTPs的ECM结构特征统计及分类 |
| 4.2.3 甘蓝BonsLTPs和拟南芥AtnsLTPs的系统进化分析 |
| 4.2.4 BonsLTPs基因的物理定位 |
| 4.2.5 BonsLTPs基因在不同组织部位的表达 |
| 4.2.6 抗根肿病相关BonsLTPs基因的筛选 |
| 4.2.7 抗根肿病相关BonsLTPs基因启动子序列分析 |
| 4.2.8 抗根肿病相关BonsLTPs蛋白在烟草中的亚细胞定位分析 |
| 4.2.9 BonsLTPI.5和BonsLTPI.14抗根肿病验证 |
| 4.3 讨论和结论 |
| 4.3.1 nsLTPs基因的系统分类和表达特征聚类 |
| 4.3.2 nsLTPs基因在抗病中的作用 |
| 第五章 甘蓝几丁质酶基因家族的鉴定及BoChiAIV.6和BoChiAIV.14抗根肿病功能验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料和引物 |
| 5.1.2 BoChiAs基因家族完整序列分析 |
| 5.1.3 BoChiAs蛋白特征分析和系统进化树构建 |
| 5.1.4 BoChiAs基因结构和染色体定位和表达谱分析 |
| 5.1.5 BoChiAs基因启动子顺式调控元件分析 |
| 5.1.6 BoChiAs蛋白的亚细胞定位在线预测 |
| 5.1.7 基因全长cDNA序列获得 |
| 5.1.8 重组过表达载体构建 |
| 5.1.9 质粒提取转化根癌农杆菌及鉴定 |
| 5.1.10 转化和检测 |
| 5.1.11 转化植株抗病性鉴定 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BoChiAs基因家族的鉴定 |
| 5.2.2 BoChiAs基因及编码蛋白结构特征分析和分类 |
| 5.2.3 甘蓝BoChiAs和其他十字花科作物几丁质酶的系统进化分析 |
| 5.2.4 BoChiAs基因的物理定位 |
| 5.2.5 BoChiAs基因在不同组织部位的表达 |
| 5.2.6 抗根肿病相关BoChiAs基因的筛选 |
| 5.2.7 响应芸薹根肿菌相关BoChiAs基因启动子序列分析 |
| 5.2.8 响应芸薹根肿菌相关BoChiAs蛋白亚细胞定位预测分析 |
| 5.2.9 BoChiAIV.6和BoChiAIV.14抗根肿病验证 |
| 5.3 讨论和结论 |
| 5.3.1 ChiAs基因的结构特征和进化 |
| 5.3.2 ChiAs基因在抗病中的作用 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）产几丁质酶菌株GXUN-20的筛选、鉴定及其产酶条件优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 培养基 |
| 1.2.2 产几丁质酶菌株的筛选及发酵酶活测定 |
| 1.2.3 菌株GXUN-20 16S r DNA扩增及分析 |
| 1.2.4 菌株GXUN-20的鉴定以及抑菌实验 |
| 1.2.5 单因素实验 |
| 1.2.5. 1 生长曲线及最适发酵产酶时间 |
| 1.2.5.2碳源浓度的确定 |
| 1.2.5. 3 氮源及其添加量的确定 |
| 1.2.5. 4 发酵培养温度的确定 |
| 1.2.5. 5 发酵液初始p H |
| 1.2.5. 6 接种量的确定 |
| 1.2.6 正交试验 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 产几丁质酶菌株的筛选及发酵酶活测定结果 |
| 2.2 菌株GXUN-20 16S r DNA扩增及分析 |
| 2.3 菌株GXUN-20的鉴定以及抑菌实验结果 |
| 2.3.1 菌株GXUN-20形态学鉴定 |
| 2.3.2 菌株GXUN-20生理生化特征 |
| 2.3.3 菌株GXUN-20抑菌实验结果 |
| 2.4 单因素实验结果 |
| 2.4.1 生长曲线及其最适发酵产酶时间的确定 |
| 2.4.2 碳源浓度的确定 |
| 2.4.3 最适氮源的筛选 |
| 2.4.4 最适氮源添加量的确定 |
| 2.4.5 最适温度的确定 |
| 2.4.6 发酵液初始最适p H的确定 |
| 2.4.7 发酵液最适接种量确定 |
| 2.5 正交试验结果 |
| 3 结论与讨论 |
（7）香蕉几丁质酶基因家族的鉴定及在枯萎病侵染时的表达分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 Ma CHi基因的鉴定及理化特性分析 |
| 1.2 Ma CHi家族系统进化关系及多序列比对 |
| 1.3 Ma CHi基因响应Foc TR4处理下表达模式分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Ma CHi的鉴定和分类 |
| 2.2 Ma CHi系统发育分析 |
| 2.3 Ma CHi保守结构域分析 |
| 2.4 Foc TR4处理后Ma CHi的表达热图 |
| 2.5 荧光定量PCR验证Ma CHi的表达 |
| 3 讨论 |
（8）吉富罗非鱼胃肠道几丁质酶的克隆、组织分布和纯化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 罗非鱼tChit1a、tChi3和tChit基因cDNA的克隆 |
| 1.2.2 罗非鱼t Chit1a、t Chi3和tChit基因序列的生物信息学分析 |
| 1.2.3 罗非鱼tChit1a、tChi3和t Chit基因的m RNA组织分布 |
| 1.2.4 罗非鱼胃几丁质酶的纯化 |
| 1.2.5 SDS-PAGE及Western blot验证 |
| 1.2.6 酶活测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 罗非鱼3种几丁质酶的cDNA及其编码的氨基酸序列 |
| 2.2 罗非鱼3种几丁质酶的进行树分析 |
| 2.3 3种几丁质酶在罗非鱼不同组织中的表达 |
| 2.4 罗非鱼胃几丁质酶的纯化和酶活测定 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（9）产几丁质酶海洋细菌Dyadobacter sp.CZW019的筛选、鉴定及酶学性质研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 实验部分 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 样品来源 |
| 1.1.2培养基组分 |
| 1.1.3 试剂与设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 产转糖苷活性几丁质酶菌株的筛选 |
| 1.2.2 菌株CZW019的鉴定 |
| 1.2.3 胶体几丁质的制备 |
| 1.2.4 几丁质酶酶活的测定 |
| 1.2.5 酶学性质研究 |
| 1.2.6 菌株CZW019几丁质酶对几丁质的降解产物薄层层析（TLC）研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 产转糖苷活性几丁质酶菌株的筛选 |
| 2.2 菌株CZW019的鉴定 |
| 2.2.1 菌株CZW019的形态学分析 |
| 2.2.2 生理生化特征分析 |
| 2.2.3 菌株CZW019 16SrDNA扩增与分析 |
| 2.3 DNS法几丁质酶葡萄糖标准曲线的制备 |
| 2.4 酶学性质研究 |
| 2.4.1 温度对菌株CZW019几丁质酶酶活性和稳定性的影响 |
| 2.4.2 pH对菌株CZW019几丁质酶酶活性及稳定性的影响 |
| 2.4.3 金属离子对菌株CZW019几丁质酶酶活的影响 |
| 2.4.4 底物对菌株CZW019几丁质酶酶活力的影响 |
| 2.4.5 菌株CZW019几丁质酶对几丁质降解产物分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（10）基于PTA技术的抗虫转基因玉米的培育及玉米黏虫的RNAi机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 几丁质简述 |
| 1.2 几丁质酶简述 |
| 1.2.1 昆虫几丁质酶分类及其功能 |
| 1.3 几丁质酶抑制剂及其功能 |
| 1.3.1 几丁质酶抑制剂的分类 |
| 1.4 玉米黏虫及其防治方法 |
| 1.5 RNAi的发现 |
| 1.6 昆虫不同RNAi途径与机制 |
| 1.6.1 siRNA途径 |
| 1.6.2 miRNA途径 |
| 1.7 人工miRNA的概述 |
| 1.8 RNAi途径中的关键蛋白 |
| 1.9 RNA干扰信号在昆虫体内的传递 |
| 1.9.1 显微注射法 |
| 1.9.2 口服饲喂递送法 |
| 1.9.3 植物介导的递送法 |
| 1.9.3.1 转基因植物递送 |
| 1.9.3.2 非转基因递送 |
| 1.10 影响昆虫RNAi效率的潜在因素 |
| 1.10.1 昆虫核酸酶 |
| 1.10.2 昆虫肠道pH |
| 1.10.3 dsRNA的长度和浓度 |
| 1.11 研究目的与意义 |
| 1.12 技术路线 |
| 第二章 hpMsChi1/2-Ox转基因水稻抑制黏虫的生长发育 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试玉米黏虫 |
| 2.1.2 试剂、菌株和载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Southern杂交实验 |
| 2.2.2 Northern blot检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 转基因水稻基因组DNA的酶切 |
| 2.3.2 靶标基因探针制备 |
| 2.3.3 鉴定转基因水稻的拷贝数 |
| 2.3.4 转基因水稻的玉米黏虫饲喂实验 |
| 2.3.5 不同转基因水稻株系沉默效率的比较 |
| 2.3.6 小RNA文库的建立与高通量测序 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 几丁质酶全长ORF克隆、重组表达及水解活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试玉米黏虫 |
| 3.1.2 试剂、菌株和载体 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 玉米黏虫MsChi2基因表达谱分析 |
| 3.2.2 MsChi2基因克隆载体的构建 |
| 3.2.3 MsChi2基因原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 MsChi2重组蛋白体外活性鉴定 |
| 3.2.5 Western blot检测 |
| 3.2.6 几丁质酶活性检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 MsChi2基因时空和织特异性的表达谱分析 |
| 3.3.2 MsChi2蛋白生物信息学分析 |
| 3.3.3 MsChi2重组蛋白诱导表达与纯化 |
| 3.3.4 Western blot分析 |
| 3.3.5 MsChi2蛋白几丁质酶酶活性检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 几丁质酶抑制剂杀虫活性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试玉米黏虫 |
| 4.1.2 试剂、菌株和载体 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体外转录合成dsRNA |
| 4.2.2 几丁质酶抑制剂饲喂实验 |
| 4.2.3 几丁质酶粗酶液提取方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 体外合成玉米黏虫MsChi2基因dsRNA |
| 4.3.2 几丁质酶抑制剂对玉米黏虫的杀虫实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 PTA表达盒系统提高玉米黏虫靶基因沉默效率 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试剂、植物材料和载体 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 构建报告基因的PTA表达盒 |
| 5.2.2 农杆菌转化及侵染实验 |
| 5.2.3 报告基因PTA表达盒的沉默效应的检测 |
| 5.2.4 构建玉米黏虫靶标基因的PTA表达盒 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 PTA表达系统的建立 |
| 5.3.2 报告基因的单独的amiRNA或tRNA片段的扩增 |
| 5.3.3 Golden Gate无缝组装以及表达载体的构建 |
| 5.3.4 报告基因PTA表达盒的RNAi效率验证 |
| 5.3.5 玉米黏虫多靶基因特异性PTA表达盒的构建 |
| 5.3.6 玉米黏虫MsREase基因的结构域预测以及进化树分析 |
| 5.3.7 玉米黏虫的靶基因单个amiR和tRNA片段的扩增 |
| 5.3.8 玉米黏虫靶基因PTA表达盒的组装以及表达载体的构建 |
| 5.3.9 获得稳定表达PTA表达盒的转基因玉米 |
| 5.3.10 PTA-Ox玉米饲喂玉米黏虫 |
| 5.3.11 不同转基因玉米株系沉默效率的比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 玉米黏虫RNAi途径核心蛋白的功能验证 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 试剂、菌株和载体 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 MsAGO2、MsSID1和MsDcr2基因的原核表达载体的构建 |
| 6.2.2 原核表达MsAGO2、MsSID1和MsDcr2蛋白 |
| 6.2.3 Western blot检测 |
| 6.2.4 凝胶迁移实验 |
| 6.2.5 体外检测Dicer酶切割活性实验 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 玉米黏虫RNAi通路核心蛋白结构域及进化树分析 |
| 6.3.2 玉米黏虫RNAi通路核心蛋白诱导表达与纯化 |
| 6.3.3 Western blot分析 |
| 6.3.4 玉米黏虫MsAGO2蛋白酶活性检测 |
| 6.3.5 体外检测玉米黏虫MsDcr2蛋白切割活性 |
| 6.3.6 MsSID1蛋白酶活性检测 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 全文讨论与结论 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 创新点 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 已发表的论文及参加科研项目情况 |
| 致谢 |
四、CHITINASE（论文参考文献）
- [1]大蒜几丁质酶基因AsCHI1的鉴定及其对盐胁迫的响应[J]. 张宇阳,周雪,刘灵艺,许吴俊,任旭琴,王广龙,熊爱生. 中国农学通报, 2022
- [2]苏云金芽胞杆菌几丁质酶BtCHI1的原核表达与性质分析[J]. 吴锋,周叶波,姜路辛,孙小宝,尹尚军,钱国英,王佳堃,王正东,张慧恩,王谦. 农业生物技术学报, 2022
- [3]昆虫几丁质酶功能研究、酶学性质及应用研究进展[J]. 李妍,李家磊,师献雪,张俊丽,胡淼. 科技视界, 2021(32)
- [4]海洋溶珊瑚弧菌VcChit56几丁质酶的蛋白质工程改造[J]. 孔德颖,蔡燕飞. 浙江海洋大学学报(自然科学版), 2021(05)
- [5]甘蓝抗根肿病种质资源鉴定及抗性相关基因挖掘[D]. 王神云. 扬州大学, 2021(02)
- [6]产几丁质酶菌株GXUN-20的筛选、鉴定及其产酶条件优化[J]. 张奇,王一兵,申乃坤,姜明国. 食品工业科技, 2021
- [7]香蕉几丁质酶基因家族的鉴定及在枯萎病侵染时的表达分析[J]. 林秋妹,王霞,赵东方,贾彩红,王静毅,刘菊华,徐碧玉,张玄兵,王卓. 植物遗传资源学报, 2022
- [8]吉富罗非鱼胃肠道几丁质酶的克隆、组织分布和纯化[J]. 黄金凤,李波,白莹,冯礼燊,李文笙,孙彩云. 广东农业科学, 2021
- [9]产几丁质酶海洋细菌Dyadobacter sp.CZW019的筛选、鉴定及酶学性质研究[J]. 丁志雯,刘耀东,黄志发,程钰,杨光,侯晓月,刘姝,房耀维. 江苏海洋大学学报(自然科学版), 2021(02)
- [10]基于PTA技术的抗虫转基因玉米的培育及玉米黏虫的RNAi机理研究[D]. 包文化. 内蒙古大学, 2021