一、精原干细胞的增殖与分化（论文文献综述）
姜璘[1]（2021）在《氯化锰对小鼠精原干细胞的损伤及机制研究》文中研究表明目的:通过对体外培养的小鼠精原干细胞给予氯化锰干预,探讨氯化锰对体外培养精原干细胞造成损伤的分子机制。方法:1.体外培养DBA系小鼠精原干细胞,按照0、25、40、50μmol/ml的浓度进行氯化锰干预,对照组精原干细胞不做任何处理,观察SSCs的增殖情况。2.MTT法检测不同浓度氯化锰干预后SSCs的增殖情况。3.Brd U法检测氯化锰干预后Brd U阳性细胞变化情况。4.Hochest法检测氯化锰干预后SSCs细胞周期变化情况。5.RT-qPCR技术检测精原干细胞干性维持基因MVH、PLZF、Pou5f1、GFRa1以及细胞周期相关基因Ccnd1、Ccnd2以及Ccne的mRNA表达情况。6.Western blot检测SSCs干性维持、细胞周期及凋亡相关蛋白表达情况。7.RNA-seq技术分析氯化锰干预后SSCs转录组水平变化情况。结果:1.氯化锰处理后导致SSCs增殖减缓。MTT法结果显示在25、40、50μmol/ml浓度的氯化锰干预3d后,SSCs增殖明显减缓（P<0.01）,且细胞数量显着减少（P<0.01）。且细胞增殖减缓的程度随氯化锰剂量增加而逐渐加重。2.根据MTT法实验结果,选取30μmol/ml氯化锰干预SSCs 3d后,Hochest染色后进行细胞流式分析。结果显示,与对照组相比,氯化锰干预后导致G0/G1期细胞显着增加（P<0.01）,在S期SSCs的数量显着减少（P<0.01）。表明氯化锰干预后SSCs的细胞周期被阻滞在G0/G1期。氯化锰干预SSCs后细胞增殖减少可能是由于细胞周期异常调控导致的。3.氯化锰干预后对SSCs干性相关基因MVH、Plzf、Pou5f1、GFRa1以及细胞周期相关基因Ccnd1、Ccnd2以及Ccne mRNA的表达影响。结果显示与对照组相比,30μmol/ml氯化锰干预后的SSCs,干性相关基因MVH、Pou5f1、GFRa1 mRNA表达显着降低（P<0.01）,Plzf mRNA表达降低（P<0.05）。细胞周期相关基因Ccnd1、Ccnd2以及Ccne mRNA表达显着降低（P<0.01）。4.氯化锰处理后对SSCs分化、周期以及凋亡相关蛋白的表达影响:与对照组相比,30μmol/ml氯化锰干预后,分化型SSCs标记蛋白C-Kit表达显着降低（P<0.01）,未分化精原干细胞的标记蛋白GFRa1、Plzf表达显着降低（P<0.01）,细胞周期相关蛋白Ccnd2以及Ccne表达显着降低（P<0.01）。5.RNA-seq结果表明,与对照组相比,30μmol/ml氯化锰干预后,有418个基因的表达显着上调、262个基因的表达显着下调。差异基因主要富集于氧化应激等生物学过程中。KEGG通路分析发现HIF-1通路等信号通路发生改变。结论:1.氯化锰干预后SSCs细胞周期被阻滞在G0/G1期,处于S期的SSCs减少。2.通过降低SSCs干性相关基因Plzf、GFRa1的表达,影响SSCs的干性。细胞周期相关蛋白CCND家族表达下降导致SSCs细胞周期出现紊乱。3.RNA-seq结果显示氯化锰干预后SSCs基因表达出现差异,信号通路出现改变。其中一些SSCs干性相关基因表达降低,以及通路的改变都导致了SSCs增殖的降低。
崔燕飞[2]（2021）在《绒山羊青春前期精原干细胞自我更新相关基因表达模式的初步研究》文中认为精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是位于曲细精管生精上皮的基底部分,与基底膜接触的一类成体干细胞。其作为雄性哺乳动物精子发生的基础,一方面增殖更新维持自身群体数量恒定,为持续不断地精子发生提供保障;另一方面逐渐分化产生精子,将遗传信息传递到子代。SSCs的自我更新受到许多基因及生长因子的调控,但是对于这一机制的研究大多以啮齿类动物为模型,而在家畜中的研究较少,更不清楚这些SSCs自我更新信号分子是如何调控SSCs自我更新。阿尔巴斯绒山羊是内蒙古地区的一种经济型家畜,其具有每胎产子数少,生殖周期长的繁殖特征,因此开展绒山羊SSCs自我更新和分化的研究有助于了解其精子发生机制,对于提高绒山羊繁殖率、品种改良和治疗雄性不育等具有特别重要的实际意义。本课题组前期研究发现86-110日龄的绒山羊睾丸内SSCs自我更新剂量依赖性调控因子GDNF及其受体表达呈现显着性变化,提示这一阶段睾丸中的精子发生过程正在经历巨大的转变。为了进一步探索绒山羊体内大量生殖细胞进行减数分裂的同时,如何维持SSCs的自我更新,本研究分别选取青春前期86、102和110日龄的绒山羊睾丸组织进行转录组测序。结果显示,110日龄与102日龄比较组合中,有上调基因4173个,下调基因4543个;110日龄与86日龄比较组合中,有上调基因4832个,下调基因5108个;102日龄与86日龄比较组合中,有上调基因3989个,下调基因3729个。这些差异表达基因富集到数以千计的GO term中,从中筛选出20个可能与SSCs自我更新相关的GO term。并根据GO富集分析结果,筛选到7个表达量较高和差异变化较大的与SSCs自我更新相关基因fgfr1、fgf2、wnt5a、plzf、dmrt1、taf4b、scf。本研究采用qRT-PCR和Western blot技术对上述7个基因在青春前期56、69、86、102、110、122日龄的绒山羊睾丸组织中的表达模式进行了分析。结果显示,在转录水平上,尽管不同日龄的表达趋势不同,但fgf2、wnt5a、taf4b、scf均呈现出“M”型表达变化;在102日龄睾丸中wnt5a、dmrt1转录达到峰值,而fgfr1、fgf2、taf4b转录显着下降,进入110日龄转录水平才升高;且fgf2、taf4b、scf均在110日龄达到转录的峰值。在翻译水平上,WNT5A、DMRT1、SCF在青春前期基本保持着相对稳定的表达;FGFR1、FGF2、PLZF和TAF4B的表达量均在69日龄达到了最高值;在102日龄睾丸中可观察到FGFR1、DMRT1、TAF4B、SCF表达量的下降,WNT5A、PLZF表达量的上升。这些结果提示102、110日龄是绒山羊精子发生过程的关键时间节点。FGFR1、FGF2、WNT5A、SCF和转录因子PLZF、DMRT1、TAF4B在其中扮演了重要的角色。免疫组织化学染色结果显示,在青春期绒山羊睾丸组织中PLZF、DMRT1、TAF4B表达于精原细胞中;而FGF2、SCF在支持细胞中表达。
李学亮[3]（2021）在《组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究》文中认为精子发生过程包括三个阶段,即精原干细胞的自我更新与分化、精母细胞的减数分裂和单倍体圆形精细胞的变形。这一过程受到基因表达的精密调控。条件性敲除胚胎期生殖细胞内的H3K9me2去甲基化酶基因Jmjd1a和Jmjd1b导致基因表达紊乱和精子发生受损。因此,探究组蛋白甲基化修饰对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制,对于雄性不育的诊治具有一定的指导意义。组蛋白甲基转移酶SETDB1能够催化组蛋白H3K9甲基化,在干细胞多能性维持,神经细胞分化等过程中发挥重要作用。然而,SETDB1调控精原干细胞增殖与分化的确切机制仍不清楚。因此,本研究利用细胞免疫荧光,染色质免疫共沉淀,RNA-seq,ATAC-seq和Ch IP-seq等方法探究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制。主要结果如下:（1）Ed U和细胞流式检测结果显示Setdb1-KD导致小鼠精原干细胞增殖速率降低,细胞周期阻滞在S期。细胞免疫荧光与TUNEL检测结果表明,Setdb1敲低诱导细胞DNA断裂和凋亡水平升高。这表明Setdb1-KD阻碍了精原干细胞增殖,导致细胞凋亡。（2）Setdb1-KD导致精原干细胞NADPH氧化酶4（NOX4）及其配体P22PHOX表达量上升,活性氧水平升高。挽救试验发现,相对于Setdb1敲低组,Setdb1和Nox4同时敲低组的细胞内活性氧含量较低,细胞凋亡增加和增殖速率减慢的表型得到部分挽救。此外,使用活性氧清除剂褪黑色素直接清除细胞内的活性氧,也可以在一定程度上抑制Setdb1-KD诱导的细胞凋亡。这表明NOX4上调介导的活性氧水平升高参与到Setdb1敲低诱导的细胞凋亡和增殖速率减慢。（3）Setdb1-KD导致细胞内p-P38和p-JNK水平升高、FOXO4活化,这表明Setdb1-KD激活了细胞内活性氧下游p38/JNK-FOXO4信号通路。（4）SETDB1-Ch IP-qPCR和H3K9me3-Ch IP-qPCR结果显示,Nox4基因启动子区域几乎没有SETDB1和H3K9me3的富集,说明SETDB1对Nox4的调控不是直接的,有可能是由于Setdb1-KD导致Nox4基因临近处的转座子激活,从而使得NOX4表达量升高。（5）在小鼠精原细胞内,Ythdf2-KO导致SETDB1与H3K9me3修饰水平降低。蛋白质免疫共沉淀结果表明,SETDB1与γH2AX之间相互作用。当发生DNA损伤时,Setdb1-sh RNA介导的Setdb1-KD导致精原细胞的克隆形成能力降低,细胞凋亡增加,γH2AX阳性细胞数增加。同时,当发生DNA损伤时,Ythdf2-KO的精原细胞出现了与Setdb1-KD类似的表型。而且体内试验结果发现,当用DNA损伤药物etoposide诱导发生DNA损伤时,Ythdf2 c KO小鼠(Stra8-Cre,Ythdf2loxp/loxp)睾丸组织平均每个曲细精管内的γH2AX阳性细胞数和c PARP阳性细胞数均高于对照组。这表明在小鼠精原细胞,YTHDF2能够调控Setdb1的表达,且它们均参与DNA损伤应答反应。（6）挽救试验发现,当发生DNA损伤时,在Ythdf2-KO的精原细胞过表达Setdb1,部分挽救了Ythdf2-KO介导的细胞克隆形成能力降低的表型。此外,RNA-seq分析表明,在DNA损伤条件下,SETDB1过表达使得Ythdf2-KO组中部分促凋亡基因转录水平降低。这表明Ythdf2-KO诱导的精原细胞DNA损伤敏感性增加部分是由于SETDB1下调导致的。（7）借助流式细胞术和STA-PUT分选猪精原干细胞和分化精原细胞,结合ATAC-seq,Ch IP-seq和RNA-seq解析猪精原干细胞分化过程中SETDB1,H3K9me3修饰以及染色质可及性变化。RNA-seq分析结果表明,精原干细胞分化过程中有684个基因表达上调,702个基因表达下调。而且,在分化过程中,促分化相关基因c-Kit启动子处的SETDB1和H3K9me3修饰富集水平降低,染色质可及性升高。因此,推测SETDB1可能通过H3K9me3修饰调控促分化相关基因表达,从而调控精原干细胞分化。综上所述,本研究发现SETDB1通过调控NADPH氧化酶NOX4的表达和细胞内的活性氧水平,调控小鼠精原干细胞的存活;Ythdf2-KO导致SETDB1下调,从而诱导DNA损伤敏感性增加;SETDB1通过H3K9me3修饰调控猪精原干细胞分化过程中染色质可及性,引起分化相关基因表达变化,从而调控精原干细胞的分化。本研究为组蛋白甲基化修饰对雄性精子发生的调控机制提供理论参考。
周子惠[4]（2021）在《Bta-miRNA-495影响牛精原干细胞增殖与凋亡的机制研究》文中认为雄性动物的繁殖性能与睾丸发育和精子发生密切相关。作为睾丸的重要组成细胞,精原干细胞是雄性动物体内唯一可以将遗传物质传递给子代的成体干细胞,具有极强的自我更新和分化的双重能力。其通过分化为精原细胞,而后进行有丝分裂和减数分裂源源不断地产生精子。MicroRNA（miRNA）作为一种小片段非编码RNA,其经典作用方式是通过与mRNA 3’UTR区靶向结合以调控相关生物学功能。有关研究表明,miRNA广泛参与生精过程,其在雄性繁殖性状发育上的重要性不容忽视,但目前关于miRNA在牛精原干细胞中的功能研究较少。因此,本研究根据前期安格斯牛睾丸组织转录组测序数据,筛选到在不同发育阶段的牛睾丸组织中差异表达的bta-miR-495作为研究对象。对bta-miR-495的表达特征分析后,利用过表达和干扰手段,以及RT-qPCR、流式细胞术、EdU、CCK-8、双荧光素酶报告分析、Western Blot试验等技术系统地探究了bta-miR-495对牛精原干细胞增殖和凋亡的影响及其机制。本研究为了解牛精子发生的分子调控机制及雄性繁殖性状的分子选育提供了理论依据。主要研究结果如下:1、bta-miR-495的筛选及对牛精原干细胞增殖与凋亡的影响通过已有的牛睾丸组织转录组测序数据,筛选得到初生期和性成熟后差异表达的bta-miR-495。表达特征分析结果表明bta-miR-495在初生期牛睾丸中表达量显着高于成年牛,这与测序数据一致。以牛精原干细胞永生化细胞系为模型,通过过表达和抑制bta-miR-495,使用RT-qPCR、流式细胞术、EdU、CCK-8和Western Blot试验,表明bta-miR-495抑制牛精原干细胞增殖且促进其凋亡。2、bta-miR-495的靶基因的预测与验证使用生物信息学软件Targetscan预测bta-miR-495的潜在靶基因,结合查阅文献筛选到三个可能影响牛精原干细胞增殖与凋亡的潜在靶基因（NABP1、CMTM8、RCN2）,并通过RT-qPCR、双荧光素酶报告分析验证RCN2是bta-miR-495的直接靶基因。3、RCN2-ERK调控牛精原干细胞的增殖和凋亡为了揭示bta-miR-495的靶基因RCN2在调控牛精原干细胞的增殖和凋亡中的重要作用,将RCN2的小干扰RNA转染进牛精原干细胞永生化细胞系。并利用RT-qPCR、流式细胞术、EdU、CCK-8和Western Blot实验技术证明特异性敲低RCN2后,导致MAPK通路中增殖和凋亡关键蛋白ERK的磷酸化水平显着下降,且牛精原干细胞的增殖受到抑制,其凋亡受到促进作用。以上试验结果表明,bta-miR-495和RCN2在牛精原干细胞增殖及凋亡过程中扮演重要角色,并且进一步验证了bta-miR-495对RCN2的靶向沉默作用,为进一步了解精子发生过程中复杂的分子调控机制提供了帮助。
李富远[5]（2021）在《SSEA4作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定》文中研究说明哺乳动物体内,精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是唯一一种可以将父系遗传信息传递给后代的成体干细胞。因此,SSCs在动物遗传育种与繁殖等方面有着重要的应用前景。将基因编辑技术与SSCs移植技术相结合,可以制作转基因动物,提高动物的生产性能。同时,SSCs也是阐明干细胞自我更新与分化机制的良好模型。由于睾丸内SSCs的数目稀少,需要分离和富集SSCs才能开展相关研究。在啮齿类动物和灵长类动物,已经鉴定到若干有效的SSCs分子标记物。虽然已鉴定了几个猪未分化精原细胞的分子标记物,但是,仍然缺乏富集猪SSCs的表面分子标记物。据报道,阶段特异性胚胎抗原4（stage-specific embryonic antigen 4,SSEA4）在人和非人灵长类动物的精原干细胞外膜表面表达。因此,本研究旨在探究SSEA4在猪睾丸组织中的表达与分布,鉴定SSEA4对猪精原干细胞分离与富集的有效性。主要结果如下:（1）采集7日龄、90日龄和150日龄的猪睾丸组织,制作组织切片。苏木精-伊红染色及组织免疫荧光染色结果表明所采集的猪睾丸发育正常,SSEA4阳性细胞为生精小管基底膜处的精原细胞;统计分析显示,随着日龄的增加,平均每个生精小管内VASA阳性和UCHL-1阳性细胞数目表现为递增趋势,而SSEA4阳性细胞表现为递减趋势。这表明SSEA4可能是猪精原干细胞的表面分子标记物。（2）借助组织免疫荧光双染色鉴定表达SSEA4的细胞类型。结果表明SSEA4阳性细胞与已知的未分化精原细胞分子标记物DBA、PLZF共定位;且随着日龄增加,SSEA4阳性细胞占DBA、PLZF阳性细胞的比例逐渐下降,而不与SSEA4阳性细胞共定位的DBA、PLZF阳性细胞逐渐增加。因此,SSEA4阳性细胞是未分化精原细胞的一个小亚群。（3）采用流式细胞分选法分离SSEA4阳性精原细胞并借助免疫荧光染色、Western blot对其进行鉴定。结果表明以SSEA4为膜表面标记物,利用流式细胞分选法可高效富集SSEA4阳性精原细胞,富集效率在90%以上。细胞免疫荧光染色发现,SSEA4阳性精原细胞高度富集了未分化精原细胞。（4）借助转录组测序与分析,发现SSEA4阳性细胞高表达精原干细胞的标记基因ID4、PAX7、PIWIL4、EGR4、MSL3、TCF3等,而精原细胞（SPG）主要表达GFRA1、LIN28A、UCHL-1等生精细胞祖细胞基因以及STRA8、c-KIT和SYCE3等分化精原细胞的标记基因。GO分析表明,SSEA4阳性细胞上调的基因参与细胞黏附、干细胞群体维持和胚胎器官发生等干细胞相关功能;下调的基因则主要参与生殖细胞发育、细胞代谢过程和细胞内物质转运等生物学过程。（5）借助细胞异种移植鉴定SSEA4阳性细胞的生物学功能。异种移植结果显示,SSEA4阳性细胞生成的细胞克隆数目是未分化精原细胞（SPG）的2.5倍,是SSEA4阴性细胞的21倍,表明SSEA4阳性细胞是精原干细胞。综上所述,本研究表明SSEA4是猪精原干细胞的表面分子标记物。基于SSEA4利用流式分选法能够高效分离与富集猪精原干细胞。猪既是重要的肉用家畜,也是理想的医学模式动物。本研究结果为猪精原干细胞的体外培养及研究利用提供了条件和基础,并为其它家畜精原干细胞的分离与富集提供参考。
张仙玉[6]（2020）在《内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究》文中指出猪肉是我国居民肉类消费的主要来源。在现代养猪生产中,顶级种公猪通过人工授精技术可繁殖大量后代,对于提高养殖效益和经济效益发挥着重大作用。如何能大量复制顶级种公猪或其遗传物质?体细胞克隆是当前的主要技术手段,但由于克隆动物的效率低,限制了这一技术的规模化应用。将外源精原干细胞（SSCs）移植到自身无SSCs生精能力的受体睾丸中产生精子,这是一个类似于动物克隆技术,实现外源遗传物质完全复制的新途径。本文的目的是,研究制备自身SSCs消融但能利用外源SSCs生产精子的受体模型动物,为下一步建立替代克隆技术复制供体动物遗传物质的新体系打下坚实基础。全文主要研究内容包括:采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的ETV5基因,制备小鼠模型,将体外培养的正常SSCs移植到小鼠模型睾丸中,观察精子的发生,评估该技术的可行性,进一步制备ETV5基因敲除猪动物模型。全文主要结果如下:1、ETV5基因敲除小鼠的制备:（1）通过CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠ETV5基因后,纯合敲除的公鼠(ETV5-/-),从3周龄开始,其睾丸明显比野生型（WT）要小,睾丸重也显着低于WT（P<0.01）。（2）ETV5-/-小鼠睾丸生殖细胞渐行性丢失,到12周龄生殖细胞丢失殆尽,出现唯支持细胞综合症。（3）性成熟后ETV5-/-小鼠睾酮含量显着低于WT（P<0.01）,附睾中精子在12周龄丢失殆尽,且丧失了繁殖后代的能力。（4）ETV5基因杂合敲除的小鼠,其睾丸形态和发育均与WT小鼠无差别,生育能力正常。2、小鼠SSCs体外培养体系的建立:（1）通过两步酶消化法能得到活力99%以上的睾丸单细胞悬液,通过差速贴壁法获得纯度79%以上的SSCs。（2）丝裂霉素C处理之后的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,Stem Pro-34（含SFM）作为基础培养基,添加GDNF、LIF、b FGF、IGF1生长因子的复合培养体系,能支持SSCs的体外增殖与长期培养。（3）小鼠SSCs能正常冻存与复苏,在体外培养与富集后用AKP免疫染色和PLZF免疫荧光均可观察到大量阳性克隆集落。用RT-PCR和Q-PCR检测SSCs中标志基因的表达水平,均显示SSCs可在体外稳定培养增殖并维持干性。3、小鼠SSCs移植:（1）幼鼠(3周龄的ETV5-/-小鼠)作为移植受体比成鼠(7周龄的ETV5-/-小鼠)易于重启外源精子的发生。移植后2个月,幼鼠睾丸中全部恢复了精子的发生,精子统计数约为9.58±5.05×104,而成鼠受体睾丸中无精子发生的恢复。（2）荧光显微镜下,幼鼠受体附睾中产生的精子头部发出绿光,说明精子来源于外源供体的SSCs（移植前用慢病毒感染使其带有EGFP报告基因）。精液中外源基因EGFP和ETV5的表达,进一步说明恢复的精子来源于外源供体的SSCs,而非内源产生。4、ETV5基因敲除猪动物模型探讨:（1）用构建成功的p X330-g RNA质粒转染莱芜猪胎儿成纤维细胞,敲除效率约为41.92%。（2）通过体细胞核移植得到8头新生克隆猪,基因型检测显示ETV5基因在靶位点被敲除,Western blot结果证实了ETV5蛋白的丢失。（3）睾丸组织切片的H.E.染色和UCHL-1蛋白的表达显示,1月龄的ETV5-/-公猪曲细精管的形态和生殖细胞与WT公猪几乎无差异。但2.5月龄的ETV5-/-公猪曲细精管管腔中央的生殖细胞有消融的趋势。另外,UCHL-1蛋白标记的阳性SSCs细胞比WT睾丸中要少。这些结果说明ETV5基因的敲除影响猪生殖细胞的发育。综上所述,本研究制备了ETV5基因纯合敲除后生殖细胞消融且无生育能力的受体小鼠;随后进行外源正常的精原干细胞移植,受体小鼠的生精能力得以恢复;最后将小鼠上构建的方法体系借鉴应用于猪受体模型的制备。目的为家畜优质个体遗传物质大量复制,物种的保种和精原干细胞研究等提供科学依据。
宋连杰[7]（2020）在《蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定》文中研究指明马业由古老的产业向现代马术和赛马产业发展,已经成为当今重要的经济支柱,我国是养马大国,以蒙古马居多。蒙古马具有抗寒、抗病、耐粗饲的特点,在马的遗传资源中是一个及其珍贵的基因库。但是蒙古马的育种繁殖方面研究相对薄弱,从而影响了马匹改良进程。精原干细胞是雄性动物体内唯一能够进行有丝分裂,并且能把遗传信息传递给下一代的干细胞,然而在众多睾丸细胞中精原干细胞数量较少,为其后续分离纯化带来难度。迄今为止,模型动物精原干细胞的纯化培养体系日渐成熟,然而对于马属动物的精原干细胞的体外分离培养却仍然处于初级阶段。因此,本研究通过建立蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养体系,有利于对精原干细胞的长期培养和生长条件的进一步探索,不仅可以揭示蒙古马睾丸精原干细胞的体外增殖特点,还可以进一步探究蒙古马睾丸发育和精子产生机制,对蒙古马的改良以及育种有着重要意义。本实验以2岁蒙古马为研究对象,取其睾丸通过机械分离法和酶逐步消化法获得睾丸单细胞悬液,经过差速贴壁法进行分离纯化精原干细胞,然后接种于事先复苏好的支持细胞饲养层上,并采用碱性磷酸酶（AKP）染色、免疫荧光染色、qRT-PCR进行特异性标志基因鉴定。研究结果如下:1.支持细胞饲养层的制备,采用机械分离法和胶原酶、胰酶逐步消化法联合使用提取睾丸单细胞悬液,使用明胶包被的培养皿进行差速贴壁以期纯化支持细胞,其生长活性旺盛。2.对纯化的支持细胞进行HE染色,发现其形状不规则或者呈辐射状,细胞核染色为蓝紫色,胞质染色为红色,细胞之间紧密相连,符合支持细胞生长特征。3.连续8天检测支持细胞生长活率,发现其生长曲线呈“S”型,根据生长曲线选择前三代生存活力旺盛的细胞进行丝裂霉素C灭活留作饲养层有较高的使用价值。4.采用qRT-PCR方法检测培养5 d的蒙古马睾丸支持细胞特异性表达基因并选用蒙古马成纤维细胞（EFF）为对照,根据计算结果,P值小于0.01,表明支持细胞特异性基因GATA4和GDNF在支持细胞与成纤维细胞中的差异极显着。证明本次关于蒙古马睾丸支持细胞的体外分离与培养实验成功。5.蒙古马睾丸精原干细胞的制备,将睾丸样品进行分离消化,采用明胶、大鼠尾胶原、层粘连蛋白不同基质包被的培养皿差速贴壁法进行纯化,分离纯度为82%。6.使用经过丝裂霉素C灭活的支持细胞作为饲养层相对使用层粘连蛋白作为饲养层,精原干细胞增殖较快,一周以内出现细胞克隆团,细胞活力稳定。7.将精原干细胞进行（AKP）染色,细胞被染成棕褐色,即AKP 阳性,细胞具有干性,属于蒙古马精原干细胞。qRT-PCR检测精原干细胞特异性标志基因TSPYL2、Gfra1、Pgp9.5、CD9、MHC-I,以蒙古马成纤维细胞作为对照,结果为差异极显着（P<0.01）,即所培养的为蒙古马精原干细胞,经过免疫荧光染色,检测到干细胞标记物Pgp9.5表达,再次确定所培养的细胞为蒙古马睾丸精原干细胞。
刘营东[8]（2020）在《精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化动态修饰图谱》文中研究说明精子发生是一个高度复杂且动态变化的生精过程。精原干细胞（Spermatogonia stem cells,SSCs）位于睾丸曲细精管的基底膜处,经过一系列分化、减数分裂以及精细胞变形等运动,最终形成具有受精能力的精子,贮存在附睾中。通过深入了解各时期生精细胞的发育发生机制,可以为我们进一步揭示雄性生殖生理调控以及为解决雄性不育等实际生产问题提供理论研究基础。鉴于此,本文利用分选得到的小鼠未分化精原细胞、分化的精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精细胞以及成熟精子作为研究对象,结合低细胞量Ch IP-seq（Ultra-low-input micrococcal nuclease-based native Ch IP-seq）和全基因组DNA甲基化WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequencing）测序技术,首次建立了精子发生过程中全基因组H3K9me3和DNA甲基化动态修饰图谱。主要研究结果如下:1.DNA甲基化和H3K9me3修饰在基因启动子和重复序列区域具有不同的序列偏好性和动态分布特征。首先,全基因组水平上H3K9me3修饰的覆盖度随着精子发生的进行而逐渐下降,启动子区域H3K9me3修饰的覆盖度在圆形精细胞时期达到最高,重复序列LTR和LINE区域H3K9me3修饰的覆盖度是逐渐下降的,在成熟精子时期略微升高。整个精子发生过程中,重复序列LTR、LINE区域H3K9me3修饰高富集,而启动子区域只有圆形精细胞时期高富集。2.通过K-均值聚类方法对精子发生过程中H3K9me3修饰进行聚类分析,发现未分化和分化的精原细胞时期特异的H3K9me3修饰域主要富集在重复序列区域,且该区域DNA甲基化程度较低;减数分裂和精细胞时期特异H3K9me3修饰域主要富集在基因启动子区域;成熟精子时期特异的H3K9me3修饰域未展示出明显的偏好性。3.未分化和分化精原细胞时期特异H3K9me3修饰域对应的DNA甲基化修饰水平在减数分裂之前处于上升趋势,H3K9me3修饰在该过程中呈现下降趋势,两种抑制性表观修饰作用的重复序列LTR在粗线期精母细胞时期存在表达激活的现象。4.圆形精细胞时期存在特异表达的基因,如Hypm、Cypt1基因等,其基因启动子区域H3K9me3修饰在该时期被擦除。5.父本印记调控区域的DNA甲基化修饰在未分化向分化精原细胞转变过程中迅速建立起来,而母本印记调控区域的DNA甲基化修饰在未分化向分化精原细胞转变过程中迅速擦除。父本印记调控区域的H3K9me3修饰随着精子发生过程逐渐擦除。总的来说,该项研究首次建立了精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化修饰的动态图谱,这为后续更深入了解精子发生发育机制、解决雄性不育等实际问题提供理论基础。
封同英[9]（2020）在《猪精原干细胞永生化细胞系的建立》文中研究指明精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）具有自我更新和向成熟功能精子分化的能力,是雄性生物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。猪精原干细胞在转基因猪的生产和再生医学猪模型的建立中具有重要的应用价值。然而,由于猪睾丸中精原干细胞数量少,且缺乏理想的长期稳定的培养体系,长期培养猪精原干细胞的研究和应用受到很大的阻碍。在本研究中,通过将表达猿猴病毒40（SV40）大T抗原的质粒包装慢病毒后转导到猪原代精原干细胞中,首次培养出两种具有猪精原干细胞属性的永生细胞系。进一步通过试验发现:（1）永生化的猪精原干细胞在培养过程中经历了逐渐的形态转化,经过培养从圆形/椭圆形转变为扁平形。通过对微丝、微管的染色发现,细胞的形态也是正常的,无多倍体的细胞出现。（2）在使用了RA（维甲酸）对永生化细胞系进行处理后,发现永生化的猪精原干细胞系对RA的处理有应答,但分化有限,其特点是PLZF出现微弱的下调,STRA8上调,C-KIT表达稳定,细胞形态无明显变化。（3）猪精原干细胞的标志物UCHL1,PLZF和THY1在整个培养过程中均有表达,生殖细胞标志物VASA和DAZL也都有表达,归巢相关因子CXCR4也有表达,增殖标记物PCNA在各代中均有表达,永生化SV40大T抗原也有表达。（4）通过对永生化的猪精原干细胞进行异体移植,并对受体小鼠做了荧光观察、曲细精管染色、冰冻切片染色等检测,观察到永生化猪精原干细胞可以在曲细精管的基底膜上定植,也证实了其干细胞特性。（5）通过检测了细胞核型和DNA含量,结果显示染色体数目有减少,部分染色体发生了畸变。与原代精原细胞相比,永生化细胞的DNA含量也发生了改变。本试验所构建的猪精原干细胞永生化细胞系现已培养7个月以上,传代35次以上,未见形态异常。因此,建立的永生化猪精原干细胞系可以为猪精原干细胞自我更新和分化的机制研究提供丰富的细胞来源,从而促进猪原代精原干细胞长期培养体系的建立及其在畜牧业和医学上的应用。
徐辰泽[10]（2020）在《小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究》文中研究表明胚胎睾丸支持细胞（embryonic Sertoli cells,eSCs）是雄性胚胎发育过程中形成的第一种雄性特异性细胞,对性别决定具有至关重要的作用,并且分泌多种营养物质,能够对其它种类细胞,如精原干细胞（spermatogonia stem cells,SSCs）起到支持扩增或分化等功能。因此,对胚胎睾丸支持细胞发育形成机理进行研究有助于揭示胚胎性腺发育和性别决定机制,为将来的临床应用提供指导作用。然而,采用常规的组织分离方法从小鼠雄性胚胎中难以大量提取胚胎睾丸支持细胞,阻碍了对胚胎睾丸支持细胞的基础理论研究和实验应用。因此,建立新的胚胎睾丸支持细胞的体外诱导获取方法具有重要意义。近年来,有研究添加维甲酸（retinoic acid,RA）和激活素A（ActivinA）等物质,诱导小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）分化形成中间中胚层（intermediate mesoderm,IM）来源细胞,再通过卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）等蛋白因子化合物诱导胚胎睾丸支持样细胞（embryonic Sertoli-like cells,eSLCs）的形成。然而,这种诱导分化方法的分化途径和分子机制仍未阐明。另有研究将成纤维细胞进行基因重编程,通过转分化方式诱导出胚胎睾丸支持样细胞,表明5种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sox9和Dmrt1的表达可能对胚胎睾丸支持细胞的形成具有重要功能。因此,本论文根据以上小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导方法,结合已知的胚胎睾丸支持细胞在体内的发育途径和分子机理,首先在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化形成中间中胚层来源细胞,接着通过对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子分别进行时序性调控表达,成功诱导形成小鼠胚胎睾丸支持样细胞,建立了一种新的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。主要结果如下:一、比较并建立了小鼠胚胎干细胞培养和分化诱导方法。为提供分化潜能状态良好的大量小鼠胚胎干细胞,研究比较了不同滋养层和培养条件,结果表明采用TM4细胞来源的条件培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）滋养层进行培养,提高了小鼠胚胎干细胞复苏后的聚集和增殖能力。为建立合适的小鼠胚胎干细胞诱导方法,本研究首先根据已知方法通过添加维甲酸和激活素A诱导小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞进行分化。接着,针对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子,比较了直接在细胞中进行转录表达调控和添加外源重组蛋白两种方法的诱导效果。结果表明通过慢病毒介导的转录表达调控方法更能有效诱导潜在的小鼠胚胎睾丸支持细胞祖细胞,即体腔上皮样细胞（coelomic epithelial-like cells）（CK18+）和性腺发育相关细胞（AMH+）的分化形成。二、建立了小鼠胚胎干细胞向小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。为了在体外模拟出体内小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的发育途径,研究根据小鼠胚胎中雄性性腺细胞的发育规律,在小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞诱导分化后,采用四环素启动子和光控启动子控制Wt、G1ata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子进行时序性表达,并在诱导14天后鉴定出有潜在的胚胎睾丸支持样细胞（FSHR+/AMH+）形成。通过细胞形态学、特异性标志物的蛋白表达和标志性基因的转录表达,鉴定和分析了小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化的过程。结果表明:小鼠胚胎干细胞在0-8.5天分化形成中间中胚层来源细胞;在9.5-11.5天从中间中胚层来源细胞中分化形成体腔上皮体细胞样细胞（coelomic epithelial somatic-like cells）;在11.5-12.5天体腔上皮体细胞样细胞分化为SF1阳性前体样细胞（SF1-positive precursor-like cells,SPLCs）,并发育为 SF1 阳性性腺前体样细胞（SF1-positive gonadal precursor-like cells,SGPLCs）;在12.5天之后SF1阳性性腺前体样细胞发育形成胚胎睾丸支持样细胞;在12.5-14.5天,胚胎睾丸支持样细胞形成环状结构;在14.5天之后,细胞组成的环状结构继续发育为管束状结构,与小鼠睾丸生精小管骨架结构相似。这些结果显示,建立的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化过程与已知的小鼠胚胎内性腺发育和细胞分化途径相似。三、初步鉴别6种发育相关因子对小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化途径的诱导作用。研究通过对6种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1的表达调控进行组合,利用不同细胞的特异性标志物进行鉴定,初步鉴别出这些因子对小鼠胚胎干细胞诱导分化途径的影响。结果表明Wt1和Gata4拘调控表达与分化形成体腔上皮体细胞样细胞有关;Sf1基因的表达与SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的形成相关;Sry和Sox9基因在诱导作用上表现相似,与SF1阳性性腺前体细胞向雄性分化决定的过程相关;Dmrt1基因的表达影响到胚胎睾丸支持样细胞形成的细胞数量。四、基于小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,研究不同发育分化阶段的分子机理。为了探索小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化机理,研究将分化过程分为三个阶段:（1）体腔上皮体细胞样细胞、SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的分化形成阶段;（2）SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞的分化阶段;（3）胚胎睾丸支持样细胞发育维持阶段。分子机制主要采用慢病毒转染方法调控目标因子进行过表达,或采用CRISPR/Cas9敲除（knock out,KO）方法抑制目标因子的表达来进行研究。结果显示:（1）Wt1基因的过表达有利于激活体腔上皮组织发育相关基因,并上调Gata4和Sf1的转录表达。Gata4能激活功能因子Lhx9进行表达。Wt1和Gata4可能对体腔上皮体细胞样细胞和SF1阳性前体样细胞分化形成具有重要作用;（2）Sf1能激活Amh、Amhr2、Insl3、Dax1等因子的表达,并促进体腔上皮体细胞样细胞向SF1阳性前体细胞的分化发育。另外,Sf1基因的表达可能对细胞的上皮样向间质样形态转变（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）、迁移和聚集能力具有影响。Sf1无法单独激活雄性分化决定关键因子Sry和Sox9的表达。然而,Sf1的表达缺失将阻碍雄性分化决定过程;（3）Sry和Sox9是雄性分化决定的关键基因。Sry的过表达能激活Sox9进行表达,然而Sox9的过表达无法单独激活Sry进行表达。Sry或Sox9的过表达能激活一些相似的雄性分化决定相关下游基因,促进SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞进行诱导分化。在Sry和Sox9不表达的情况下,SF1阳性性腺前体样细胞可能发生雌性分化决定过程,向卵巢支持样细胞（ovarian supporting-like cell）（AMH+/WNT4+）进行分化发育;（4）Dmrt1的过表达能激活Amh、Ptgds、Fgt9、Gdnf等雄性发育相关的功能因子,抑制Wnt4、Foxl2等雌性分化决定因子,从而帮助维持雄性发育过程、保持胚胎睾丸支持样细胞的生理特性、促进其形成生精小管的组织结构、并避免发生睾丸支持样细胞向卵巢支持样细胞的转化。五、诱导胚胎睾丸支持样细胞的功能成熟,并检验其生理特性和生精滋养功能。为验证这些诱导胚胎睾丸支持样细胞是否具有与天然胚胎睾丸支持细胞相似的潜在生理功能和特性,实验先采用包含睾酮等物质的条件培养基促进诱导形成的小鼠胚胎睾丸支持样细胞的发育和功能成熟,再通过流式细胞分选后用于小鼠睾丸组织的细胞移植试验和精原干细胞共培养试验。结果显示,在小鼠睾丸生精小管移植实验中,注入的睾丸支持样细胞能够与小鼠自身睾丸细胞相融合、分散生长、并无明显成瘤性,与阳性对照组中异源小鼠睾丸提取的成熟睾丸支持细胞的移植结果相似,表明这些诱导睾丸支持样细胞的生理特性接近于天然形成的成熟睾丸支持细胞;在精原干细胞共培养试验中,诱导睾丸支持样细胞能够滋养精原干细胞发育为雄性配子样细胞,表明诱导出的睾丸支持样细胞具备一定的生殖细胞滋养功能。综上,本论文建立了一种小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,并基于模型研究了相关的分子机理,为胚胎发育学、性别决定机理和临床应用提供了研究基础和技术平台。
二、精原干细胞的增殖与分化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、精原干细胞的增殖与分化（论文提纲范文）
（1）氯化锰对小鼠精原干细胞的损伤及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化锰造成雄性生殖损伤的分子机制研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）绒山羊青春前期精原干细胞自我更新相关基因表达模式的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 调控精原干细胞自我更新相关基因的研究进展 |
| 1 SSCs的生物学特性 |
| 1.1 SSCs的起源 |
| 1.2 SSCs的自我更新与分化 |
| 1.3 SSCs微环境 |
| 1.4 SSCs的表面标志物 |
| 2 调控SSCs自我更新的重要分子 |
| 2.1 胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF) |
| 2.2 成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor2,FGF2) |
| 2.3 转录因子Ets变异基因5(Ets variant gene5,ETV5) |
| 2.4 集落刺激因子1(Colony stimulating factor1,CSF1) |
| 2.5 Wnt家族成员5A(Wnt family member5A,WNT5A) |
| 2.6 干细胞因子(Stem cell factor,SCF) |
| 2.7 早幼粒细胞白血病锌指蛋白(Promyelocytic leukaemia zinc finger,PLZF) |
| 2.8 B细胞CLL/淋巴瘤6 成员B(B-cell CLL/lymphoma6 member B,BCL6B) |
| 2.9 TATA盒结合蛋白相关因子4b(TATAbox-binding protein-associated factor4b,TAF4B) |
| 2.10 LIM同源盒蛋白1(Lim homeobox protein1,LHX1) |
| 2.11 POU类 3 同源盒1(POU class 3 homeobox1,POU3F1) |
| 2.12 双性和mab-3 相关转录因子1(Doublesex and mab-3 related transcription factor1,DMRT1) |
| 2.13 成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor1,FGFR1) |
| 3 调控SSCs自我更新的信号通路 |
| 3.1 SFK信号通路 |
| 3.2 Ras/ERK1/2 信号通路 |
| 3.3 PI3K-AKT信号通路 |
| 3.4 Wnt信号通路 |
| 第二章 绒山羊青春前期精原干细胞自我更新相关基因表达模式的初步研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验组织及来源 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验所用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 青春前期86、102和110 日龄的绒山羊睾丸组织转录组测序 |
| 2.2.2 qRT-PCR检测青春前期不同日龄睾丸中7个SSCs自我更新相关基因相对表达水平 |
| 2.2.3 Western blot检测青春前期不同日龄睾丸中7个SSCs自我更新相关蛋白相对表达水平 |
| 2.2.4 青春期绒山羊睾丸组织中5 个SSCs自我更新相关蛋白的免疫组织化学染色 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 青春前期86、102和110 日龄的绒山羊睾丸组织转录组测序分析 |
| 3.1.1 总RNA质量检测 |
| 3.1.2 原始测序数据质控结果 |
| 3.1.3 参考基因组比对分析 |
| 3.1.4 基因定量分析 |
| 3.1.5 差异表达基因分析 |
| 3.1.6 差异表达基因功能富集分析 |
| 3.2 青春前期不同日龄绒山羊睾丸组织中7 个SSCs自我更新相关基因的转录模式分析 |
| 3.2.1 不同日龄睾丸组织总RNA质量检测 |
| 3.2.2 不同日龄睾丸组织c DNA模板质量鉴定 |
| 3.2.3 不同日龄睾丸组织中SSCs自我更新相关基因的转录水平定量分析 |
| 3.3 青春前期不同日龄绒山羊睾丸组织中7 个SSCs自我更新相关基因的翻译模式分析 |
| 3.3.1 不同日龄睾丸组织总蛋白的提取和检测 |
| 3.3.2 SDS-PAGE检测不同日龄睾丸组织总蛋白的表达 |
| 3.3.3 不同日龄睾丸组织中SSCs自我更新相关蛋白表达量灰度分析 |
| 3.4 青春期绒山羊睾丸组织中5 个SSCs自我更新相关蛋白的免疫组织化学染色 |
| 4 讨论 |
| 5 小结和创新点 |
| 5.1 小结 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文 |
（3）组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.3 精原干细胞增殖调控 |
| 1.3.1 GDNF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.2 ETV5 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.3 BCL6B对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.4 ID4 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.5 PLZF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.6 POU5F1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.7 FOXO1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.8 活性氧对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.4 精原干细胞分化调控 |
| 1.4.1 SOX3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.2 STAT3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.3 NGN3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.4 SOHLH1和SOHLH2 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.5 DMRT1 对精原干细胞分化的调控 |
| 第二章 表观修饰与SETDB1 的研究进展 |
| 2.1 组蛋白甲基化 |
| 2.2 H3K9me3 修饰 |
| 2.2.1 H3K9me3 与异染色质形成 |
| 2.2.2 H3K9me3 与细胞命运决定 |
| 2.3 组蛋白甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.1 H3K4 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.2 H3K9 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.3 H3K27 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.4 H3K36 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.5 H3K9 甲基化和DNA甲基化对转座子的调控 |
| 2.4 组蛋白甲基化对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.5 m~6A修饰对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.6 SETDB1 的结构 |
| 2.7 SETDB1 的亚细胞定位 |
| 2.8 SETDB1 对转座子的调控 |
| 2.9 SETDB1 在雄性生殖细胞中的功能 |
| 2.10 研究目的与意义 |
| 试验部分 |
| 第三章 SETDB1 对小鼠精原干细胞存活的调控作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Setdb1 si RNA干扰效率检测 |
| 3.2.2 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞内活性氧水平的影响 |
| 3.2.3 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞存活的影响 |
| 3.2.4 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞增殖速率的影响 |
| 3.2.5 Setdb1-KD诱导活性氧上调的分子机制 |
| 3.2.6 Setdb1-KD通过调节细胞内活性氧水平调控精原干细胞存活 |
| 3.2.7 Setdb1-KD激活活性氧下游信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SETDB1在Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加过程中的功能 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Ythdf2-KO导致小鼠精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.2 Ythdf2-KO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.3 体内试验说明Ythdf2 cKO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.4 Ythdf2-KO对 H3K9me3 修饰的影响 |
| 4.2.5 Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加的分子机制 |
| 4.2.6 SETDB1与γH2AX具有相互作用 |
| 4.2.7 Setdb1-KD导致精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.8 Setdb1-KD影响DNA损伤修复 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 SETDB1 对猪精原干细胞分化的调控 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 猪精原干细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.2 猪分化精原细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.3 猪精原干细胞分化过程中的基因表达分析 |
| 5.2.4 猪精原干细胞分化过程中染色质可及性变化 |
| 5.2.5 SETDB1 介导的H3K9me3 修饰与染色质可及性之间的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）Bta-miRNA-495影响牛精原干细胞增殖与凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.1.1 精原干细胞的生成 |
| 1.1.2 精原干细胞与精子发生 |
| 1.1.3 精原干细胞的生物标记 |
| 1.1.4 牛精原干细胞的研究进展 |
| 1.2 miRNA的研究进展 |
| 1.2.1 miRNA的生物合成及作用 |
| 1.2.2 miRNA与精子生成 |
| 1.2.3 miRNA与精原干细胞 |
| 1.3 RCN2 的研究进展 |
| 1.3.1 RCN2 的结构特征 |
| 1.3.2 RCN2 的生物学功能 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 bta-miR-495 的筛选及其对牛精原干细胞增殖与凋亡的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验样品准备 |
| 2.1.2 牛精原干细胞的培养 |
| 2.1.3 细胞转染 |
| 2.1.4 总RNA提取、cDNA合成与RT-qPCR实验 |
| 2.1.5 细胞总蛋白提取与Western Blot实验 |
| 2.1.6 流式细胞仪检测细胞周期实验 |
| 2.1.7 EdU细胞增殖试剂盒检测细胞增殖实验 |
| 2.1.8 CCK-8 试剂检测细胞增殖实验 |
| 2.1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡实验 |
| 2.1.10 数据统计 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 bta-miR-495 在牛各个组织中的表达 |
| 2.2.2 bta-miR-495 抑制牛精原干细胞的增殖 |
| 2.2.3 bta-miR-495 促进牛精原干细胞的凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 bta-miR-495 靶基因的预测与验证 |
| 3.1 试验方法和材料 |
| 3.1.1 细胞准备 |
| 3.1.2 细胞培养 |
| 3.1.3 细胞转染 |
| 3.1.4 构建载体 |
| 3.1.5 双荧光素酶活性检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 miR-495 保守性分析及靶基因预测 |
| 3.2.2 bta-miR-495 直接靶向RCN2 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RCN2-ERK调控牛精原干细胞的增殖和凋亡 |
| 4.1 试验方法和材料 |
| 4.1.1 材料准备 |
| 4.1.2 总RNA提取、cDNA合成与RT-qPCR实验 |
| 4.1.3 细胞总蛋白提取与Western Blot实验 |
| 4.1.4 流式细胞仪检测细胞周期实验 |
| 4.1.5 EdU细胞增殖试剂盒检测细胞增殖实验 |
| 4.1.6 CCK-8 试剂检测细胞增殖实验 |
| 4.1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡实验 |
| 4.1.8 数据统计 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RCN2 促进牛精原干细胞的增殖 |
| 4.2.2 RCN2 抑制牛精原干细胞的凋亡 |
| 4.2.3 RCN2对ERK的调控机制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论和创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）SSEA4作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源 |
| 1.1.2 精原干细胞巢 |
| 1.2.3 精原干细胞的增殖 |
| 1.2.4 精原干细胞的分化 |
| 1.2.5 精原干细胞的鉴定方法 |
| 1.2.6 精原干细胞的分离与富集 |
| 1.2.7 精原干细胞的表面分子标记物 |
| 1.3 SSEA4 研究进展 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 试验部分 |
| 第二章 SSEA4 作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及组织准备 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪睾丸组织石蜡包埋 |
| 2.2.2 猪睾丸组织的冷冻组织包埋 |
| 2.2.3 组织切片苏木精-伊红染色 |
| 2.2.4 组织切片免疫荧光染色 |
| 2.2.5 睾丸细胞的分离 |
| 2.2.6 流式细胞分选(FACS) |
| 2.2.7 细胞总RNA的提取 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.2.10 转录组数据分析 |
| 2.2.11 猪精原干细胞的异种移植 |
| 2.2.12 异种移植后细胞克隆数的计数 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 猪睾丸的组织学分析 |
| 2.3.2 SSEA4 阳性细胞的定位分析 |
| 2.3.3 免疫荧光染色鉴定猪睾丸组织中表达SSEA4 的细胞类型 |
| 2.3.4 FACS分离的SSEA4 阳性细胞富集猪未分化精原细胞 |
| 2.3.5 SSEA4 阳性精原细胞的转录组分析 |
| 2.3.6 SSEA4 阳性细胞的生物学功能分析 |
| 2.4 讨论 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源与精子发生 |
| 1.2.2 精原干细胞的应用 |
| 1.2.3 精原干细胞的移植 |
| 1.2.4 受体的制备 |
| 1.2.5 CRSPR/Cas9 技术的应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 内源性精子发生消融的小鼠模型制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂与配置 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 F_0代小鼠获得及基因型鉴定 |
| 2.2.2 F_1代新生小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 Western blot鉴定ETV5 蛋白的缺失 |
| 2.2.4 不同基因型小鼠体重的检测 |
| 2.2.5 不同基因型小鼠睾丸重的检测 |
| 2.2.6 睾丸组织形态学比较 |
| 2.2.7 附睾中精子的检测 |
| 2.2.8 精子发生相关基因的表达 |
| 2.2.9 睾酮水平检测 |
| 2.2.10 繁殖能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠精原干细胞的分离培养与检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备与耗材 |
| 3.1.3 主要试剂与配置 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 用小鼠胎儿成纤维细胞制备饲养层细胞 |
| 3.2.2 两种饲养层培养SSCs细胞体外增殖的比较 |
| 3.2.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 3.2.4 添加不同生长因子对精原干细胞体外增殖的影响 |
| 3.2.5 精原干细胞体外增殖的碱性磷酸酶染色 |
| 3.2.6 精原干细胞体外增殖的免疫荧光染色 |
| 3.2.7 精原干细胞的标志基因表达检测 |
| 3.2.8 精原干细胞标志基因表达水平的实时定量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 精原干细胞移植与精子来源的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与配制 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SSCs的移植 |
| 4.2.2 移植后睾丸重量的检测 |
| 4.2.3 睾丸的组织形态观察(H.E.染色) |
| 4.2.4 睾丸切片的免疫组织化学分析 |
| 4.2.5 附睾精子的检测 |
| 4.2.6 精子来源的检测 |
| 4.2.7 精子发生相关基因的表达 |
| 4.2.8 繁殖能力评估 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因敲除猪受体模型的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验设备与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与配制 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pX330-gRNA质粒的构建 |
| 5.2.2 质粒电转猪胎儿成纤维细胞 |
| 5.2.3 电转后单克隆细胞团的收取 |
| 5.2.4 单克隆细胞团敲除方式的鉴定 |
| 5.2.5 ETV5 基因纯合敲除细胞系的获得 |
| 5.2.6 SCNT制备ETV5 基因敲除克隆猪 |
| 5.2.7 新生克隆猪的基因型鉴定 |
| 5.2.8 新生克隆猪ETV5 蛋白Western blot鉴定 |
| 5.2.9 睾丸发育的组织形态检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 全文总结与主要结论 |
| 6.2 主要创新点与后续工作 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要英文对照缩略表 |
| 附录2 全文 RT-PCR(Q-PCR)引物序列 |
| 附录3 细胞系测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蒙古马简介及其特点 |
| 1.2 睾丸发育和精子发生过程 |
| 1.2.1 睾丸组织学构造及功能 |
| 1.2.2 精子发生过程 |
| 1.2.3 精子发生的微环境 |
| 1.3 精原干细胞(spermatogonial stem cells SSCs) |
| 1.3.1 精原干细胞简介 |
| 1.3.2 精原干细胞来源 |
| 1.3.3 精原干细胞生物学特点 |
| 1.3.4 精原干细胞的特殊生长环境 |
| 1.3.5 精原干细胞表面分子标记物 |
| 1.3.6 精原干细胞自我更新分化方式 |
| 1.3.7 精原干细胞的培养 |
| 1.3.8 精原干细胞体外培养研究进展 |
| 1.3.9 温度对精原干细胞的影响 |
| 1.4 精原干细胞应用前景 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 实验一 蒙古马睾丸支持细胞(饲养层)的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 支持细胞原代分离培养及纯化 |
| 2.2.2 支持细胞的低渗处理 |
| 2.2.3 支持细胞生长曲线绘制 |
| 2.2.4 支持细胞饲养层制备 |
| 2.2.5 支持细胞鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 支持细胞生长曲线观察 |
| 2.3.2 HE染色结果 |
| 2.3.3 qRT-PCR结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 实验二 蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.2 实验前工作准备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 蒙古马睾丸单细胞悬液制备 |
| 3.3.2 利用差异贴壁法将蒙古马睾丸精原干细胞的纯化 |
| 3.4 将精原干细胞转移到支持细胞饲养层上培养 |
| 3.4.1 支持细胞饲养层复苏 |
| 3.4.2 精原干细胞的培养 |
| 3.4.3 精原干细胞的纯化效率 |
| 3.5 精原干细胞的鉴定 |
| 3.5.1 精原干细胞生长情况检测和形态学观察 |
| 3.5.2 精原干细胞(SSCs)碱性磷酸酶(AKP)染色鉴定 |
| 3.5.3 精原干细胞SSCs免疫荧光化学染色鉴定 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 支持细胞饲养层形态 |
| 3.6.2 精原干细胞分离纯化效率检测 |
| 3.6.3 在不同饲养层上的形态 |
| 3.6.4 碱性磷酸酶(AKP)染色法鉴定SSCs |
| 3.6.5 精原干细胞免疫荧光染色结果 |
| 3.6.6 qRT-PCR结果 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 4 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（8）精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化动态修饰图谱（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞相关研究 |
| 1.1.1 精原干细胞简介 |
| 1.1.2 精原干细胞分子标记 |
| 1.1.3 精原干细胞增殖与分化 |
| 1.1.4 精原干细胞应用 |
| 1.2 减数分裂及精细胞变形过程 |
| 1.3 各时期生精细胞分选方法 |
| 1.3.1 重力沉降法(STA-PUT) |
| 1.3.2 免疫磁珠分选 |
| 1.3.3 流式细胞分选 |
| 1.4 精子发生过程表观遗传重塑 |
| 1.4.1 精子发生过程中DNA甲基化修饰变化 |
| 1.4.2 精子发生过程中组蛋白修饰变化 |
| 1.4.3 精子发生过程中非编码RNA修饰变化 |
| 1.5 测序技术研究进展 |
| 1.5.1 染色质免疫沉淀法(ChIP) |
| 1.5.2 DNA甲基化测序技术 |
| 第二章 生精细胞分选及鉴定 |
| 2.1 实验材料与设备 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.1.3 未分化和分化精原细胞分选 |
| 2.1.4 粗线期精母细胞和圆形精细胞分选 |
| 2.1.5 生精细胞总RNA提取 |
| 2.1.6 生精细胞RNA反转录 |
| 2.1.7 生精细胞qRT-PCR |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 生精细胞的分选 |
| 2.2.2 生精细胞的纯度鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化修饰研究 |
| 3.1 实验材料与设备 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 精子发生过程组蛋白修饰检测(ULI-NChIP) |
| 3.1.3 生精细胞DNA提取 |
| 3.1.4 精子发生过程DNA甲基化修饰检测(WGBS-seq) |
| 3.1.5 蛋白免疫印迹实验(Western-Blot) |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化数据质量检测 |
| 3.2.2 精子发生过程中H3K9me3修饰的分布特征 |
| 3.2.3 精子发生过程中H3K9me3修饰动态研究 |
| 3.2.4 重复序列独特的H3K9me3和DNA甲基化修饰模式 |
| 3.2.5 X染色体H3K9me3和DNA甲基化修饰调控 |
| 3.2.6 印记调控区域(gICRs)和印记基因区域DNA甲基化和H3K9me3 修饰 |
| 3.2.7 精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化相关性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论与创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）猪精原干细胞永生化细胞系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 精原干细胞与细胞永生化概述 |
| 1.1 精子发生简介 |
| 1.2 精原干细胞研究进展 |
| 1.2.1 精原干细胞简介 |
| 1.2.2 精原干细胞的微环境 |
| 1.2.3 精原干细胞的分子标记 |
| 1.2.4 精原干细胞的分离、纯化与富集 |
| 1.2.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.2.6 精原干细胞移植 |
| 1.2.7 精原干细胞的应用及存在问题 |
| 1.3 细胞永生化 |
| 1.3.1 永生化细胞 |
| 1.3.2 细胞永生化的方法 |
| 1.3.3 永生化的分子机制 |
| 1.3.4 永生化的功能和应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 猪精原干细胞的分离纯化和永生化 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 试验步骤 |
| 2.2.1 猪精原干细胞的获得 |
| 2.2.2 永生化慢病毒包装及病毒转导 |
| 2.2.3 流式分选获得高纯度的精原干细胞 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 猪精原细胞的分离富集纯化 |
| 2.3.2 永生化慢病毒转导猪精原细胞 |
| 2.3.3 流式分选后细胞纯度鉴定 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 永生化猪精原干细胞的培养 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 试验步骤 |
| 3.2.1 细胞倍增时间检测 |
| 3.2.2 细胞骨架形态检测 |
| 3.2.3 RA诱导Ttag和 Puro细胞系分化检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 永生化猪精原干细胞在培养过程中的形态变化 |
| 3.3.2 永生化猪精原干细胞的倍增时间 |
| 3.3.3 永生化猪精原干细胞的形态结构 |
| 3.3.4 维甲酸诱导对永生化猪精原干细胞的影响 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 永生化猪精原干细胞的鉴定 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 试验步骤 |
| 4.2.1 细胞marker鉴定 |
| 4.2.2 永生化猪精原干细胞异体移植鉴定 |
| 4.2.3 永生化猪精原干细胞核型鉴定 |
| 4.2.4 永生化猪精原干细胞DNA content检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RT-PCR检测不同代数永生化细胞标志物表达 |
| 4.3.2 Western Blotting检测不同代数永生化细胞标志物表达 |
| 4.3.3 细胞免疫荧光检测永生化细胞标志物表达 |
| 4.3.4 永生化猪精原干细胞在受体小鼠睾丸定植检测 |
| 4.3.5 永生化猪精原干细胞核型鉴定 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 胚胎干细胞的研究现状 |
| 1.1.1 胚胎干细胞的来源与种类 |
| 1.1.2 胚胎干细胞的体外培养 |
| 1.1.3 胚胎干细胞的分化诱导 |
| 1.1.4 胚胎干细胞的临床应用 |
| 1.2 睾丸支持细胞的研究现状 |
| 1.2.1 睾丸支持细胞的特性 |
| 1.2.2 睾丸支持细胞的滋养功能 |
| 1.2.3 睾丸支持细胞的免疫豁免功能 |
| 1.2.4 睾丸支持细胞骨架结构有助于形成血睾屏障 |
| 1.2.5 胚胎睾丸支持细胞诱导雄性分化决定 |
| 1.3 胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的分化途径研究 |
| 1.3.1 胚胎睾丸支持细胞的分化来源 |
| 1.3.2 小鼠胚胎睾丸支持细胞的发育形成过程 |
| 1.3.3 小鼠胚胎睾丸支持细胞形成的分子机理 |
| 1.3.3.1 体腔上皮和中性性腺的形成相关因子 |
| 1.3.3.2 雄性分化决定相关因子 |
| 1.3.3.3 胚胎睾丸支持细胞的生长发育相关因子 |
| 1.3.4 现有的胚胎睾丸支持细胞体外诱导方法 |
| 1.3.4.1 控制胚胎干细胞的细胞群落细胞量方法 |
| 1.3.4.2 通过加入重组蛋白,诱导中胚层来源细胞向睾丸支持样细胞分化 |
| 1.3.4.3 通过重编程成纤维细胞诱导转分化出睾丸支持样细胞 |
| 1.4 本文主要研究内容、目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 工具耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.2.1 常用试剂 |
| 2.2.2.2 配制试剂和培养基 |
| 2.2.2.3 细胞材料 |
| 2.2.2.4 核酸分子实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞提取方法 |
| 2.3.1.1 小鼠胚胎干细胞的提取 |
| 2.3.1.2 小鼠胚胎成纤维细胞的提取 |
| 2.3.1.3 精原干细胞和成熟睾丸支持细胞的提取 |
| 2.3.2 核酸扩增技术 |
| 2.3.2.1 聚合酶链反应技术(PCR) |
| 2.3.2.2 感受态细胞转化 |
| 2.3.2.3 核酸琼脂凝胶电泳 |
| 2.3.3 基因转导方法 |
| 2.3.3.1 慢病毒转染 |
| 2.3.3.2 脂质体转染 |
| 2.3.3.3 聚醚酰亚胺阳离子聚合物转染 |
| 2.3.4 细胞鉴定方法 |
| 2.3.4.1 定量聚合酶链反应技术(qPCR) |
| 2.3.4.2 蛋白质印迹分析(WB) |
| 2.3.4.3 免疫荧光电镜检测方法(IF) |
| 2.3.4.4 免疫细胞化学检测法(ICC) |
| 2.3.4.5 流式细胞分析技术(FCM) |
| 2.3.4.6 PKH26活细胞荧光染色 |
| 2.3.4.7 组织石蜡切片制箭 |
| 第3章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 小鼠胚胎干细胞的诱导分化方法 |
| 3.2.1.1 目的基因扩增方法 |
| 3.2.1.2 pcDNA3.1(+)载体常表达质粒的构建 |
| 3.2.1.3 FUW-TetO载体四环素控制表达质粒的构建 |
| 3.2.1.4 FUW-lightO载体光控制质粒的构建 |
| 3.2.2 小鼠胚胎干细胞的体外培养方法 |
| 3.2.2.1 TM4细胞和小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 |
| 3.2.2.2 TM4细胞条件培养基的制备 |
| 3.2.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞定向分化实验设计方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化方法分析 |
| 3.3.1.1 慢病毒转染、脂质体转染和阳离子聚合物对目的基因的转染效率比较 |
| 3.3.1.2 目的基因重组蛋白在不同细胞系中的表达 |
| 3.3.1.3 基因转导调控诱导和蛋白因子诱导胚胎干细胞定向分化效果比较 |
| 3.3.2 TM4细胞对小鼠胚胎干细胞体外培养结果 |
| 3.3.2.1 TM4细胞作为滋养层对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响 |
| 3.3.2.2 TM4细胞条件培养基对小鼠胚胎干细胞聚集、增殖和多能性影响 |
| 3.3.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞体外诱导分化过程鉴定 |
| 3.3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程的形态学分析 |
| 3.3.3.2 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程特异性生物标志物分析 |
| 3.3.3.3 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程中细胞标志性基因的转录表达鉴定 |
| 3.3.3.4 上皮细胞和间质细胞标志性基因表达鉴定分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化模型的分子机理 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 关键因子的诱导功能鉴定方法 |
| 4.2.2 关键因子的分子调控机理研究方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 关键因子在胚胎干细胞诱导分化过程中的功能分析 |
| 4.3.1.1 关键因子对胚胎干细胞诱导分化过程的影响 |
| 4.3.1.2 Sry和Sox9功能比较分析 |
| 4.3.1.3 剔除Sry表达调控后的关键因子诱导功能分析 |
| 4.3.2 诱导分化阶段及其关键因子的功能分析 |
| 4.3.2.1 体腔上皮发育和SF1阳性前体样细胞形成阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.2 SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.3 胚胎睾丸支持样细胞生长发育相关因子功能鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 诱导形成的小鼠睾丸支持样细胞的功能鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 诱导睾丸支持样细胞与精原干细胞共培养实验 |
| 5.2.1.1 睾丸支持样细胞滋养层的制备方法 |
| 5.2.1.2 睾丸支持样细胞与精原干细胞的共培养方法 |
| 5.2.2 诱导睾丸支持样细胞的小鼠睾丸移植实验 |
| 5.2.2.1 诱导睾丸支持样细胞和天然睾丸支持细胞的活细胞染色方法 |
| 5.2.2.2 诱导睾丸支持样细胞注射小鼠睾丸组织的移植方法 |
| 5.2.2.3 移植细胞的鉴定方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 诱导睾丸支持样细胞对精原干细胞体外发育为雄性配子样细胞的结果分析 |
| 5.3.2 诱导睾丸支持样细胞移植在小鼠睾丸组织中的生长情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 讨论、结论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 小鼠胚胎干细胞体外向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型 |
| 6.1.2 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型的分子机理探讨 |
| 6.2 结论 |
| 6.3 创新点 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 附录 3 |
| 附件 |
四、精原干细胞的增殖与分化（论文参考文献）
- [1]氯化锰对小鼠精原干细胞的损伤及机制研究[D]. 姜璘. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]绒山羊青春前期精原干细胞自我更新相关基因表达模式的初步研究[D]. 崔燕飞. 内蒙古大学, 2021(12)
- [3]组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究[D]. 李学亮. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [4]Bta-miRNA-495影响牛精原干细胞增殖与凋亡的机制研究[D]. 周子惠. 西北农林科技大学, 2021
- [5]SSEA4作为猪精原干细胞膜分子标记物鉴定[D]. 李富远. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究[D]. 张仙玉. 湖南农业大学, 2020
- [7]蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养与鉴定[D]. 宋连杰. 内蒙古农业大学, 2020(05)
- [8]精子发生过程中H3K9me3和DNA甲基化动态修饰图谱[D]. 刘营东. 西北农林科技大学, 2020
- [9]猪精原干细胞永生化细胞系的建立[D]. 封同英. 西北农林科技大学, 2020
- [10]小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究[D]. 徐辰泽. 华东理工大学, 2020(01)