一、筛选能激活HBV特异性T细胞反应的细胞因子佐剂的研究（论文文献综述）
路文婷[1]（2021）在《基于B细胞表面TLR9水平及移行与B细胞活化的关系研究CpG ODN发挥疫苗佐剂作用的机制》文中指出CpG ODN（CpG oligodeoxynucleotide）是一类由人工合成的、含CpG二核苷酸基序的非甲基化脱氧寡核苷酸,是细胞内模式识别受体TLR9（Toll-like receptor 9）的激动剂。CpG ODN与TLR9结合后,激活下游信号级联反应,促进B细胞、浆细胞样树突状细胞（p DC）、T细胞等细胞的活化,因此具有疫苗佐剂的潜力。TLR9组成性地表达在人和小鼠的B细胞及p DC中,也表达在小鼠的树突状细胞（DC）、单核/巨噬细胞中。一般认为,当细胞处于静止状态时,TLR9主要定位在细胞内的内质网膜上,受到刺激后移行至内体,并在内体中与进入细胞内的CpG ODN结合。值得注意的是,最近的研究发现TLR9也可以表达在B细胞、中性粒细胞等细胞的细胞膜上,成为表面TLR9（surface TLR9,sTLR9）。然而,sTLR9是否受CpG ODN的调节、调节模式如何及其与CpG ODN的佐剂效应是否有关等尚不清楚。本文拟以B细胞sTLR9为切入点,用自行设计的CpG ODN作为TLR9激动剂,探究B细胞sTLR9表达、移行与B细胞活化的关系,以此对CpG ODN作为疫苗佐剂增效抗体应答提供一种新的解释。我们首先通过生物信息学方法,在所有自行设计的CpG ODN中预测出CpG5805和CpG 5801的免疫刺激性最强。随后采用VSV保护试验和Ed U掺入细胞增殖实验检测CpG ODN的生物学活性,并依此将自行设计的CpG ODN进行分型,最终确定了一个C型CpG ODN（CpG 5805）和三个B型CpG ODN,没有获得A型CpG ODN。为了探究CpG ODN是否可以调节B细胞sTLR9的表达水平,我们将所有CpG ODN分别与小鼠脾细胞共培养,使用流式细胞术分别通过表面染色及胞内染色检测其中B细胞sTLR9及总TLR9（total TLR9,t TLR9）的表达水平。结果显示,B型和C型CpG ODN对B细胞sTLR9表达水平有下调作用,而CpG ODN对B细胞t TLR9水平与sTLR9水平的调节作用是相反的。以往用作疫苗佐剂的CpG ODN通常是B型CpG ODN,考虑到C型CpG ODN不仅具有B型CpG ODN的特性,还具有诱导IFN-I的特性,后者也具有辅助体液免疫的作用。为此,我们选择CpG 5805作为研究对象,观察其对抗体应答相关免疫细胞如B细胞、树突状细胞（DC）、T细胞的增殖和活化作用。结果显示,CpG 5805可以显着促进B细胞的增殖和活化,对DC、CD4+T和CD8+T细胞的增殖没有影响,但是能够显着促进这些细胞的活化。由此可见,CpG 5805具有更强的免疫刺激活性,展现出极大的作为疫苗佐剂的潜力。为了检测CpG 5805的疫苗佐剂效应,我们分别将其与重组蛋白ΔCP疫苗、灭活流感病毒H9N2乳化疫苗、重组乙肝疫苗联合免疫小鼠,并在免疫后不同时间用ELISA检测小鼠血清中特异性抗体水平。结果显示:CpG 5805能够显着提高重组蛋白ΔCP疫苗及商品化乙肝疫苗免疫小鼠血清中的抗体水平,但对灭活流感病毒H9N2疫苗免疫小鼠的抗体应答没有明显增效作用。随后我们将CpG5805与免疫效果最好的商品化乙肝疫苗相联合,体外刺激小鼠脾细胞,检测其中B细胞表面CD80、CD86、CD40、MHC II的表达情况,进而观察CpG 5805作为佐剂对B细胞活化水平的影响。结果发现CpG 5805作为佐剂能够显着上调B细胞表面MHC II、CD80、CD86、CD40的表达,促进B细胞活化。为了检测以CpG 5805为佐剂的乙肝疫苗对免疫小鼠体内B细胞活化及其sTLR9表达水平的影响,我们从免疫后小鼠的免疫器官分离出引流区淋巴结细胞和脾细胞,检测其中B细胞上sTLR9及CD80、CD86、CD40和MHC II的表达水平。结果发现CpG 5805作为疫苗佐剂在小鼠体内能明显增强B细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC II的表达水平,提高免疫器官中TLR9及其下游信号通路分子的m RNA表达水平。与此同时,CpG 5805作为疫苗佐剂能在小鼠体内明显下调B细胞sTLR9水平。以上结果提示,CpG 5805作为疫苗佐剂可以在小鼠体内下调B细胞sTLR9水平的同时,通过激活TLR9信号通路促进B细胞的活化。尽管CpG5805能够下调B细胞上sTLR9的表达水平,但却能够上调B细胞内总TLR9蛋白及m RNA水平,提示sTLR9的减少不能用总TLR9表达水平的变化来解释。由于TLR9具有移行（trafficking）的特性,可以从内质网移行至内体或细胞膜表面,那么,CpG 5805使sTLR9水平下降的唯一解释应该是迫使其向细胞内移行,移行最可能的目标位置应该是内体膜。为了验证这种推测,我们做了如下的研究:我们首先采用抗体喂养实验（antibody feeding assay）标记sTLR9,然后体外给予单独乙肝疫苗或联合CpG 5805刺激,最后使用共聚焦显微镜检测CD19+B细胞的sTLR9的位置。结果发现CpG 5805可以使CD19+B细胞上的sTLR9向细胞内移行并且移行至内体。与此同时,我们发现CpG 5805引起sTLR9内移的B细胞体积明显变大,由此推测发生sTLR9内移的B细胞发生了母细胞化。于是,接下来我们采用流式细胞术检测发现,CpG 5805和乙肝疫苗共同刺激后,体积变大的B细胞比例明显增多,这群B细胞上sTLR9水平明显下降,但CD40表达水平明显增高。这证明了我们的推测,即CpG 5805引起B细胞体积变大的确是B细胞活化的征象,并且B细胞活化的同时sTLR9水平降低。为了证明CpG5805的疫苗佐剂效应依赖其诱导B细胞sTLR9内移及TLR9信号活化,根据我们实验室的前期工作及相关文献报道,我们选择能特异性地抑制TLR9从内质网移出的CCT ODN（一种抑制性ODN）、抑制TLR9信号下传的MS19（也是一种抑制性ODN）、破坏内体酸化的氯喹及干扰AP2表达的si RNA作为研究工具,分别干扰TLR9移行的不同环节,观察CpG 5805对B细胞sTLR9水平及活化的调节是否受影响。结果显示:1)当用CCT ODN干扰TLR9从内质网移出时,无论CpG 5805存在与否,B细胞sTLR9水平都明显下降,同时,CpG 5805对B细胞CD40水平的上调作用也消失了,说明TLR9移行被阻断后CpG ODN刺激B细胞活化的作用不能发挥。2)当用AP2 si RNA干扰sTLR9内移时,CpG 5805诱导B细胞sTLR9水平下降的作用消失,同时其对B细胞表面CD40水平的上调作用也丧失,说明CpG ODN诱导B细胞活化与其诱导sTLR9水平下降是一致的。3)当用氯喹干扰内体酸化环境时,CpG 5805不能下调B细胞sTLR9水平,也不能上调B细胞CD40水平,说明CpG 5805诱导的B细胞活化需要以内体TLR9在酸性环境下工作为前提,并且sTLR9是否能进入内体也依赖内体的工作环境。4)当用MS19干扰TLR9信号通路时,CpG 5805仍能下调B细胞sTLR9的表达水平,但不能上调B细胞CD40水平,说明sTLR9内移后需加盟到内体TLR9介导的信号通路中才能发挥其免疫学活性。由此可见,CpG 5805引起的B细胞sTLR9水平下降及B细胞活化是通过sTLR9移行进入内体引起TLR9信号传导实现的。综上所述,我们从自行设计的CpG ODN中筛选获得一种C型CpG ODN,CpG 5805,并证明了其具有促进抗体应答的微生物疫苗佐剂效应。根据CpG 5805对B细胞sTLR9水平的调节作用,围绕TLR9移行的各个环节,证明了CpG 5805诱导B细胞sTLR9水平下降是其发挥免疫增强作用的一种机制,即被诱导下降的sTLR9移行进入内体,并加盟到内体TLR9介导的信号通路中,因此使B细胞活化成熟,抗体产生增多。这可能是阐述CpG ODN作为疫苗佐剂发挥免疫增强作用的另一机制。
赵华俊[2]（2019）在《poly Ⅰ：C作为佐剂与rHBVvac联用治疗慢性HBV感染的作用与机制研究》文中研究指明研究目的:乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个重大的公共卫生问题。慢性乙型肝炎病毒（CHB）感染是肝损伤和炎症的主要诱因,如未及时得到有效治疗,大约25%的CHB患者可以发展为纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌（HCC）。CHB患者难以治愈的主要是,在CHB患者肝脏中形成的免疫抑制的微环境中,调节性T细胞（Tregs）和髓系来源抑制性细胞（MDSCs）的比例升高,干扰并抑制T细胞介导的抗HBV功能,最终导致体内抗原特异性的CD8+T细胞处于无能的状态。目前临床治疗CHB的药物有核苷（酸）类似物（Nucleotide/Nucleoside analogues,NAs）和干扰素α两大类,但两类药物对于治疗CHB都具有一定的局限性,不能实现长期的病毒学控制。为了克服目前临床CHB治疗的局限性,目前国内外科研工作者们正研发新的治疗药物以实现乙肝治疗终极目标,而HBV治疗性疫苗是本世纪CHB治疗研究领域研究的热点。治疗性乙肝疫苗是针对CHB患者或HBV携带者,通过不同途径呈递乙肝抗原,旨在打破机体的免疫耐受,提高机体特异性CD4+T细胞、CD8+T细胞和体液免疫应答,最终达到清除乙肝病毒的目的。免疫佐剂是能够增强机体对抗原（Ag）特异性免疫应答的物质。但是到目前为止,美国食品药品监督管理局批准上市的佐剂只有铝佐剂,MF-59、AS03以及AS04等几种,限制了治疗性乙肝疫苗的研究。因此,需要寻找新的治疗性乙肝疫苗佐剂,以用于临床CHB的治疗。宿主细胞表面或细胞质中表达的模式识别受体（PRR）,如Toll样受体（TLR）、RIG-I样受体、NOD样受体等,可以识别微生物中的病原体相关分子模式（PAMP）。已有文献报道,PAMP作为疫苗的免疫佐剂可以促进抗原呈递细胞（APC）的活化。作为一种合成的dsRNA（TLR3配体）,聚肌苷-聚胞苷酸钠盐（poly I:C）可以激活TRIF依赖的信号通路,诱导I型干扰素的表达和抗HBV免疫反应。而且,由于TLR3分子在具有交叉呈递功能的树突状细胞（DC）上高度表达,poly I:C的刺激可以增强DC对外源性抗原的交叉递呈,从而诱导机体产生抗原特异性的CD8+T细胞应答。这些发现提示,poly I:C可以作为一种潜在的疫苗佐剂用于抗病毒,尤其是慢性HBV的治疗。尽管已有文献报道,polyI:C可以诱导机体产生抗HBV的免疫应答,但是HBV特异性CD8+T细胞的特性以及CD8+T细胞不同亚群的作用仍不清楚。此外,目前还没有关于polyI:C是否可以诱导免疫记忆或实现长期病毒学控制的报道。在本研究中,我们基于慢性HBV感染诱导机体免疫耐受的特点,利用TLR3激动剂polyI:C作为HBV治疗性疫苗的佐剂（简称“pHBV疫苗”）,通过“初免-加强”（prime-boost）的免疫策略皮下接种,证明pHBV疫苗在抗HBV中的潜在应用价值,并阐述了短寿命效应细胞（SLECs）在慢性HBV治疗过程中发挥的关键作用和相应的机制,为临床治疗慢性HBV提供了新的理论和实验依据思路。研究方法:1.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV 1.2至C57 BL/6J小鼠或者CD11c-DTR小鼠体内,建立HBV-carrier小鼠模型或者HBV-carrier-CD 11 c-DTR小鼠模型。2.通过“初免-加强”的免疫策略,以一周为时间间隔,皮下接种3次。3.通过CLIA、ELISA分别检测小鼠血清中HBsAg、、anti-HBs的水平。通过荧光定量PCR检测血清中HBV DNA copies的含量。通过荧光定量PCR检测肝组织中HBV cccDNA、HBV DNA、HBV total RNA、HBV-3.5kb-RNA的含量。4.通过Southern blot检测肝组织中HBV cccDNA的水平。5.通过ELISA检测小鼠血清中IL-12的水平。6.通过赖氏微板法检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）的水平。7.通过免疫组化检测肝组织原位HBcAg的表达;通过HE染色检测肝组织损伤。8.利用IL-4和GM-CSF体外诱导骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）。9.利用白喉毒素清除HBV-carrier-CD11c-DTR小鼠体内的DCs。10.通过肝脏原位灌流分离小鼠原代肝实质细胞,并通过免疫荧光和流式细胞术检测EGFP的表达。11.通过流式细胞术分离小鼠的淋巴细胞并过继转输至受体鼠体内。12.通过流式细胞术检测小鼠来源的单个核细胞膜分子、胞内分子及核转录因子的表达水平。13.通过MTT法和CFSE法检测脾淋巴细胞的增殖能力。14.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV 1.2至免疫后的C57 BL/6J小鼠体内,观察其对再次感染HBV的抵抗能力。研究结果:一、HBV 慢性感染小鼠模型中存在多种HBV DNA中间体1.高压注射后质粒进入肝脏并持续表达通过尾静脉高压注射的pAAV/HBV 1.2质粒可以进入肝脏并能长期持续存在。2.HBV 慢性感染小鼠模型中存在多种HBV DNA中间体尾静脉高压注射pAAV/HBV 1.2质粒的方式所建立的HBV慢性感染小鼠模型中有多种HBV DNA中间体的存在,包括HBV cccDNA、HBV rcDNA、ss HBV DNA、dsl AAV-HBV中间体。二、poly I:C作为佐剂与rHBV疫苗联合使用能够安全有效的清除HBV1.单独使用 poly I:C或者rHBV疫苗不能清除HBV与Untr组相比,单独使用poly I:C或者rHBV疫苗治疗后不能有效的降低HBV-carrier小鼠中的HBV cccDNA、HBsAg、HBV DNA、HBV total RNA、HBV-3.5 kb-RNA的水平,也不能诱导机体产生保护性的anti-HBs。同时,经poly I:C或者rHBV疫苗单独治疗的小鼠也不能保护机体防止HBV的再次感染。2.pHBV 疫苗能够有效的清除HBV与Untr组相比,pHBV疫苗治疗组小鼠外周血血清中HBsAg的水平有明显的下降,并且治疗效果可以维持至少4周的时间。同时,血清HBV DNA和肝内HBV DNA、HBV RNA,尤其是HBV cccDNA,在pHBV疫苗治疗后的小鼠中几乎检测不到。免疫组化染色显示,HBcAg+的肝细胞在pHBV疫苗治疗后几乎消失。此外,pHBV疫苗组anti-HBs水平在治疗后的第5周检测到有明显的上调趋势。3.pHBV 疫苗治疗不引起小鼠肝脏炎症损伤与Untr组相比,虽然在pHBV疫苗治疗后肝脏中有单核细胞的浸润,但是肝脏HE切片染色和血清学ALT的水平检测显示,在治疗周期中小鼠的肝脏并无明显肝细胞损伤。三、pHBV疫苗增强机体DC的成熟和抗原递呈功能1.pHBV疫苗增强体内DC的成熟和分化与Untr组相比,单独使用poly I:C和pHBV疫苗治疗均可增加小鼠外周血和引流淋巴结中DC的比例以及DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86和CD80的表达,而rHBV疫苗单独免疫组对CD11c+DC无明显的影响。与未加poly I:C处理组相比,当用不同浓度的poly I:C体外刺激BMDC时,能明显增加DC对FITC标记的OVA抗原（FITC-OVA）的吞噬作用,同时,DC表面MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD80、CD86的百分比以及MFI的水平在poly I:C刺激后均有明显上调,且呈浓度依赖性的增加。2.pHBV疫苗诱导产生的抗HBV作用依赖于DC的功能HBV-carrier-CD11c-DTR小鼠腹腔注射白喉毒素后外周血中CD11c+ DC的比例以及DC上MHC-Ⅱ的表达明显降低,经疫苗治疗后,清除HBV的能力显着降低。四、pHBV疫苗能改善机体的免疫抑制环境与Untr组相比,pHBV疫苗治疗能明显降低小鼠肝细胞上免疫抑制分子PD-L1的表达。同时,治疗后小鼠肝脏以及脾脏中Tregs、MDSCs的比例也有一定程度的降低。五、pHBV疫苗诱导机体产生的抗原特异性CD11ahi CD8α1o细胞介导机体对病毒的清除1.CD11ahi CD8a1o细胞为抗HBV特异性的CD8+T细胞pHBV疫苗治疗后的小鼠肝脏、脾脏中总的CD3+T细胞以及CD4++T细胞、CD8+T细胞的比例以及CD8+T细胞的绝对数均增加,并且我们检测了治疗后更长时间（3周）时脾脏中T细胞亚群的变化,得到了一致的现象。治疗后小鼠肝脏部位的CD8+T细胞活化分子CD69的表达以及分泌抗病毒细胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增加。CFSE标记的全脾细胞、CD8α+T细胞、CD11ahi CD88αlo T细胞转输至新的HBV-carrier小鼠体内后表现出显着的抗原特异性增殖,而CD11alo CD8αhi T细胞没有明显的增殖,并且全脾细胞和CD8α+T细胞中增殖的细胞为CD11ahi CD8αlo表型。分离不同治疗组小鼠的全脾细胞,用HBsAg体外刺激72 h,也证明增殖的细胞为CD11ahi CD8αlo表型。2.pHBV疫苗诱导机体产生抗原特异性CD11ahi CD8αlo细胞抗原特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例在pHBV治疗后小鼠的脾脏、肝脏以及外周血有明显的增加。与Untr组相比,pHBV疫苗治疗后1周以及3周的小鼠脾淋巴细胞在体外经过HBsAg刺激时均发生明显的抗原特异性的增殖。抗原特异性的CDllahi CD8αlo细胞高表达增殖核抗原Ki-67。rHBVvac或poly I:C单独处理组小鼠CD11ahi CD8αlo细胞的比例没有明显的变化。单独转输CD11alo CD8ααhi细胞不能清除HBV,而转输全脾细胞、CD8+T细胞和CDl1ahi CD8αlo细胞组均能显着降低HBV-carrier小鼠模型中HBsAg的水平,而且单独转输CD11ahi CD8aαlo与CD8+T细胞就能达到与转输全脾细胞相近的治疗效果。与转输CD11alo CD8αhi细胞组相比,转输CD11ahi CD8αlo细胞组能够降低血清中HBV DNA的水平,而且肝脏免疫组化染色显示HBcAg+的肝细胞几乎消失。3.pHBV疫苗诱导机体产生抗原特异性CD11ahi CD49dhi CD4+T细胞辅助CD8+T细胞应答pHBV疫苗接种后,小鼠脾脏部位的CD4+T细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增加,且HBV特异性CD11ahi CD49dhi CD4+T细胞比例明显升高。六、pHBV疫苗逆转了HBV特异性CD8+T细胞的耗竭状态并诱导产生KLRG1+CD8+T细胞1.pHBV疫苗逆转了HBV特异性CD8+T细胞的耗竭pHBV疫苗治疗可以明显地降低肝脏和脾脏组织中抗原特异性的CD11ahi CD8αloT细胞上LAG-3、CTLA-4、TIGIT、PD-1、Tim-3和Eomes 的表达水平;表达两种细胞因子（IFN-γ+ IL-2+、IFN-γ+ TNF-α+以及IL-2+ TNF-α+）的多功能CD8+T细胞增加,表达一种细胞毒性相关分子（CD107a+、granzym B+、perforin+）的CD8+T细胞的比例在pHBV疫苗治疗也显着增加。2.pHBV疫苗诱导KLRG1+ CD8+T细胞的产生与Untr组相比,pHBV疫苗治疗组小鼠外周血KLRG1+ CD8+T细胞百分比以及KLRG1的MFI值在治疗周期中有明显的上调,且维持在较高的水平。与Untr组相比,治疗后小鼠的肝脏、脾脏中KLRG1+CD8+T细胞的比例也具有明显的提高。更为有意义的是,我们发现KLRG1只表达在HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上,而在非特异性的CD11alo CD8αhi细胞上几乎没有表达。七、pHBV疫苗促进CD8+ T细胞的终末分化1.pHBV疫苗促进了SLECs的形成pHBV疫苗治疗可以促进CD8+ T细胞的终末分化,肝脏、脾脏和外周血中SLECs的比例和绝对数明显增加。SLECs 比MPECs表达更高的增殖核抗原Ki-67分子,而rHBV疫苗或poly I:C单独治疗并不能促进SLECs的形成。2.SLECs在清除HBV过程中占有主导地位与MPECs相比,SLECs高表达IFN-γ、CD107a、granzymB 和perforin,低表达免疫抑制分子Tim-3。供者来源的CD11ahi CD8αlo细胞发挥清除HBV作用的同时,其SLECs的比例在血液、脾脏和肝脏中明显增加,而供者来源的CD11a1o CD8αhi细胞没有检测到SLECs 比例的明显变化。3.pHBV疫苗通过降低MPEC上Eomes表达而促进CD8+T细胞的终末分化在慢性HBV-carrier小鼠模型中,与MPECs相比,肝脏、脾脏的SLECs低表达Eomes,且pHBV疫苗治疗可以降低肝脏、脾脏的MPECs上Eomes的表达。八、pHBV疫苗诱导产生的HBV特异性SLECs能保护机体防止HBV的再次感染1.pHBV疫苗免疫能保护机体防止HBV的再次感染在再次进行HBV的感染后,与Untr小鼠相比,经pHBV疫苗免疫的小鼠几乎检测不到血清HBsAg,而且有50%以上的小鼠体内产生了高水平的保护性anti-HBs。pHBV疫苗免疫的小鼠几乎检测不到肝内的HBV cccDNA、HBV DNA、HBV RNA、HBcAg+肝细胞以及血清中的HBV DNA。CXCR5+PD-1+滤泡辅助性T细胞的比例随着HBV再次感染而增加。2.SLECs在HBV免疫记忆中起关键作用在再次进行HBV的感染后,与Untr小鼠相比,经pHBV疫苗免疫的小鼠的肝脏和脾脏中SLECs的比例和绝对数显着增加,而MPECs没有显示任何显着变化;肝脏中SLECs的比例与HBV再次感染后第5天血清HBsAg的水平呈明显的负相关关系（p<0.01）。同时,CD8+T细胞上KLRG1的表达也与血清HBsAg水平呈负相关（p<0.05）。与Untr小鼠相比,用pHBV疫苗免疫的小鼠中MPECs表达高水平的CD62L,同时血清中IL-12水平增加。结论及意义:1.本研究证明,利用TLR3激动剂poly I:C作为HBV治疗性疫苗的佐剂制备pHBV疫苗能安全有效地清除HBV。2.发现pHBV疫苗能够打破慢性HBV感染诱导的免疫耐受状态,诱导DC的成熟与活化,恢复耗竭的HBV特异性CD11ahi CD8αlo T细胞亚群的功能。3.发现pHBV疫苗治疗可以诱导长期免疫记忆,保护机体防止HBV的再感染,其中pHBV疫苗诱导的短寿命效应细胞（SLECs）可能在预防HBV再感染中发挥重要作用。4.研究提示,pHBV疫苗可能是临床治疗慢性乙型肝炎的潜在候选疫苗,在临床治疗后可较好地预防HBV感染的复发。
李彤亚[3]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中研究指明由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。
贾晓娟[4]（2014）在《猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析》文中进行了进一步梳理Gp96是热休克蛋白HSP90家族一员,具有多种免疫学效应,包括提高抗原呈递、刺激抗原呈递细胞（APCs）产生细胞因子、激发机体特异性免疫应答及细胞毒性T细胞（CTL）反应,以及免疫佐剂效应。本论文主要研究猪Gp96N对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的B、T细胞表位合成肽疫苗、B细胞表位串联亚单位疫苗以及猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）灭活疫苗的免疫佐剂效应。首先建立了表达猪Gp96N的大肠杆菌和毕赤酵母p.pastoris-X33表达系统,利用纯化的猪Gp96N作为免疫佐剂,在小鼠和猪上,从细胞免疫、体液免疫和天然免疫角度,分析了猪Gp96N对上述三种疫苗的免疫增强效应。研究结果为猪Gp96N作为免疫佐剂在疫苗中的应用提供了科学依据。从猪肾脏中提取RNA,采用RT-PCR扩增得到猪Gp96N基因cDNA片段,分别插入载体pET-32a和pPICZαA中,构建出原核表达载体pET-32a/Gp96N和真核表达载体pPICZaA/Gp96N,分别转入大肠杆菌BL21和毕赤酵母p.pastoris-X33中,经抗性筛选获得重组大肠杆菌BL21/pET-32a/Gp96N和重组毕赤酵母p.pastoris-X33/pPICZaA/Gp96N。对表达产物进行纯化,获得猪Gp96N蛋白。根据文献报道,筛选出PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白的高度保守B细胞和T细胞抗原表位,经化学合成表位多肽,与猪Gp96N联合免疫小鼠和猪。结果发现,猪Gp96N能够增强表位肽诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答；猪Gp96N能显着上调IL-12和TNF-a,下调IL-4和IL-10的表达水平；用PRRSV高致病性毒株JXwn06对免疫猪的攻毒试验结果表明,表位多肽+猪Gp96N （BT-Gp组）免疫猪在攻毒后第7天全部死亡,表位多肽免疫（BT组）猪在第5天全部死亡,而对照组（PBS组和猪Gp96N组）的猪在攻毒后第3天全部死亡。虽然BT-Gp组和BT组的免疫猪均不能抵抗JXwn06的攻击,但比较攻毒后猪体温、临床症状、血清中病毒滴度等发现,在PRRSV攻毒后7天内,猪Gp96N与表位多肽联合使用能在一定程度上缓解猪的临床症状,降低猪血清中的病毒载量。将一些PRRSV的结构蛋白和非结构蛋白Nsp2的高度保守B细胞抗原表位通过柔性linker连接,利用重叠PCR技术获得融合基因,并将其重组到原核表达质粒中,经过大量表达和纯化后得到串连多B细胞表位亚单位疫苗（Cpl、Cp2）。以猪Gp96N为免疫佐剂,与Cpl、CP2联合免疫小鼠和猪。经过三次免疫后,采用ELISA检测小鼠和猪血清中的抗体。结果表明,免疫小鼠和猪血清中均可检测到PRRSV特异性抗体,且猪Gp96N能提高抗体滴度3-4倍；从免疫小鼠血清中可检测到中和抗体,但在猪血清中未检测到中和抗体；ELISPOT及淋巴细胞增殖试验结果表明,猪Gp96N能显着提高疫苗诱导的细胞免疫。此外,定量ELISA检测发现,猪Gp96N能显着上调猪血清中IFN-γ, IL-12等Th1型细胞因子以及TNF-α的表达水平,同时能够下调IL-4和IL-10的表达水平。用不同剂量的猪Gp96N与PCV2灭活疫苗联合免疫猪,采用ELISA检测免疫前后各组血清中PCV2特异性抗体IgG以及IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子含量。结果发现,与单独免疫PCV2灭活苗及商业化的亚单位疫苗相比,猪Gp96N能够提高特异性抗体IgG水平,且随着Gp96N剂量增加,IgG水平呈递增趋势,表明猪Gp96N能够增强PCV2灭活疫苗的体液免疫。此外,与单独免疫疫苗相比,猪Gp96N+PCV2灭活疫苗联合免疫,能提高免疫猪的IFN-γ、TNF-α水平,但对1L-1β、IL-6没有影响。综上研究结果表明,猪Gp96N在一定程度上能够增强PRRSV亚单位疫苗的体液和细胞免疫应答,提升PCV2灭活疫苗的体液免疫效果,具有潜在的免疫佐剂效应。
汪颖[5]（2013）在《含有TLR7/8受体激活物的乙肝病毒治疗性疫苗的作用及机制研究》文中提出慢性持续性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是我国肝癌发生的主要病因,清除HBV感染性肝细胞有可能阻断肝癌的发生进程。抗病毒疗法是现阶段临床治疗HBV感染的主要手段,并已在部分患者中证明能有效控制病毒复制,但却不能完全清除病毒。含有HBV抗原的治疗性疫苗可打破慢性感染者体内对病原体的免疫耐受,增强或重建机体针对HBV抗原的免疫应答反应,有望成为治愈慢性HBV感染的有效手段。Toll样受体（TLRs）配体能通过与相应TLRs结合而激活免疫细胞,调节适应性免疫反应的强度或改变反应的类型,现已用于抵御人类疾病疫苗的佐剂研发中。我们已有的工作表明：HBV表面抗原（HBsAg）与TLR7/8受体激动剂CL097的偶联可促进外周血单核细胞（Mo）在组织中成熟分化为树突状细胞（DC）,相对于铝盐佐剂,在小鼠体内可诱导出更强的抗HBsAg应答。乙肝核心抗原（HBcAg）是乙肝治疗性疫苗研发过程中的一个重要抗原,其特异性T细胞的存在和慢性HBV感染的清除有关。TLR7/8激动剂与目的抗原的偶联能更好的进行抗原交叉提呈,诱导抗原特异性的Th1型免疫应答及CD8+T细胞的产生。本研究中,采用氢氧化铝盐吸附制备了含有5μgTLR7/8激动剂CL097和5μ.gHBsAg及5μg HBcAg的含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗（HBV-Ag+Alum+CL097）,采用UPLC-Q-TOF-MS高分辨串联质谱分析证实：TLR7/8激动剂CL097通过表面电荷效应能有效被铝盐吸附,与共同吸附的HBsAg及HBcAg抗原抗原形成物理性连接的颗粒性抗原。将抗原进行FITC荧光标记后,通过铝盐吸附,注射到C57BL/6J小鼠皮内,48小时后收集局部引流淋巴结发现：加入CL097后,引流淋巴结中含有更多的标记抗原,表明在疫苗中加入CL097可以促进更多携带外周抗原信息的DC回巢到淋巴结中。进而,我们分离分析了摄取标记抗原的细胞群体,结果显示：摄取疫苗性抗原的细胞主要是CDllb阳性细胞（≥90%）,而非CD11c阳性细胞（<10%）；CL097加入后,摄取抗原的CD11c阳性细胞比例有所增加,但主要仍是CDllb阳性细胞。在CDllb阳性细胞群体中,其中一大部分细胞高表达Ly6c,一部分低表达或不表达Ly6c分子。免疫分选上述两群细胞后转输到小鼠皮内,结果发现这两群细胞在体内均可分化成为能够回巢到局部引流淋巴结的CDllc+细胞。随后,我们分离小鼠脾脏Ly6c+细胞,用该疫苗进行刺激,发现与单纯采用铝佐剂的疫苗抗原相比,其能显着促进Mo向DC分化成熟,上调CCR7表达,促进细胞产生和分泌IL-6和TNF-α。上述刺激分化后的Mo在与初始T （naive T）细胞共培养后,能促进这种T细胞表达更高水平的BCL-6和T-beta转录因子,表现为滤泡辅助性T细胞的表型特征,细胞表面高表达CXCR5,分泌产生IL-21、IFN-γ及TNF-α。为此,我们采用2株不同来源的HBV转基因小鼠模拟人体的慢性HBV感染状态,进行疫苗的皮下免疫注射,观察含有CL097的HBV疫苗的治疗作用,每2周免疫1次,共4次。结果发现：含有CL097通过铝盐吸附的HBV抗原在4次免疫后,54.5%（6/11）的小鼠中可检测到HBsAg特异性抗体（抗HBs）,抗体含量为85.88mIU/ml;抗体在第4次免疫20周后仍可检测到,并且在加强免疫一周后迅速升高。ELISPOT检测结果显示免疫小鼠体内产生了HBsAg特异性B细胞。流式分析发现小鼠脾脏淋巴细胞中有CD4+IFN-γ+T、CD8+IFN-γ+T及IL-21+T细胞生成。以上结果提示：该疫苗免疫在HBV转基因小鼠体内可有效诱导针对HBsAg的体液及细胞免疫应答。随后,我们分选到经上述疫苗免疫后的HBV转基因小鼠体内的CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）和Treg清除后脾细胞,转输到未处理的正常C57BL/6J小鼠体内,采用5μg HBsAg免疫3天后即可检测到特异性的抗HBs产生,表明该疫苗在HBV转基因小鼠中有效诱导出抗原特异性的记忆性B淋巴细胞；在转输CD4+CD25+的Treg细胞后,采用5μg HBsAg免疫12天后可检测有特异性抗体产生。而在未免疫的正常C57BL/6J小鼠体内转输未免疫的HBV转基因小鼠的CD4+CD25-细胞和CD4+CD25+调节性T细胞后,采用5μgHBsAg免疫后均未检测到有抗HBs产生。由此表明,含有TLR7/8激动剂的HBV抗原疫苗能打破机体特异性免疫耐受状态,促进抗原特异性免疫应答的产生。同时,我们也考察了该疫苗联合使用外源性Ⅰ型干扰素IFN-α-2b在HBV转基因小鼠中的治疗效果,结果发现两者联合使用后抗HBs的产生提前,这为慢性HBV感染的治疗提供了一种新疗法。此外,我们利用高成瘤性黑色素瘤细胞系B16建立了表达HBV相关抗原的种植性肝脏肿瘤小鼠模型,采用上述疫苗免疫3次后,肝脏原位接种上述肿瘤细胞。结果发现该疫苗免疫后能在正常C57BL/6J小鼠中有效诱导出较强的体液及T细胞免疫应答。接种肿瘤细胞后,荷瘤小鼠中位生存时间相对于常规预防性乙肝疫苗免疫组延长了5天,同时1/7小鼠实现了治愈,并可在体内检测到大量抗原特异性的IFN-γ分泌型T细胞。通过上述研究,我们获得如下结果：1、TLR7/8激动剂CL097通过表面电荷效应能有效被铝盐吸附,与共同吸附的HBsAg及HBcAg抗原形成物理性连接的颗粒性抗原；该疫苗抗原在皮下注射后,主要被CD11b阳性的单核吞噬细胞所摄取,并能促进其分化成熟,携带相应的抗原信息回巢到局部引流淋巴结。2、经含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗作用后的单核细胞源性的树突状细胞能促进初始T细胞分化为表达CXCR5, IL-21产生型的滤泡性辅助T细胞。3、含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗能在HBV转基因小鼠（模拟人类慢性乙型肝炎感染状态）中能打破机体特异性免疫耐受状态,促进抗原特异性免疫应答的产生。联合使用外源性Ⅰ型干扰素IFN-α-2b使用后抗HBs的产生提前,为慢性HBV感染的治疗提供了一种新疗法。4、含有TLR7/8受体激动剂CL097的HBV抗原疫苗在正常C57BL/6J小鼠中有效诱导出较强的体液及T细胞免疫应答,并能减缓表达HBV抗原的肿瘤细胞在肝脏上的生长。
杨明[6]（2012）在《CpG ODN-MF59辅佐肿瘤抗原诱导抗小鼠黑色素瘤及肺癌的实验研究》文中认为MF59是一种水包油的乳化剂，已在欧洲被批准用于人流感疫苗。由于诱导偏向于Th2型的免疫反应，其几乎没有被用于肿瘤疫苗的研究。为了观察MF59是否能成为一种有效的肿瘤抗原疫苗佐剂，我们加入了病原相关分子模式（PAMP）的模拟物来改变MF59的免疫特点，使其向利于肿瘤免疫的Th1方向发展。本研究中，以HSP65-MUC1（分枝杆菌HSP65与人MUC1表位肽的融合蛋白）为抗原，观察了MF59分别与CpG ODN、ploy I:C及胸腺肽α1配伍后是否能辅助抗原诱导Th1型免疫反应。结果发现C型CpG ODN（YW002）与MF59配伍（MF59-YW002）后能诱导最显着的Th1免疫反应。随后，我们在MUC1+B16小鼠黑色素瘤预防性和治疗性模型中对MF59-YW002的肿瘤疫苗佐剂效应进行了研究。结果发现，预防性给予MF59-YW002/HSP65-MUC1能抑制小鼠体内MUC1+B16黑色素瘤的生长并延长荷瘤小鼠的生存期，且诱生了大量的肿瘤特异性CTLs；而MF59单独与HSP65-MUC1配伍却促进了MUC1+B16黑色素瘤的生长。但荷瘤后给予MF59-YW002/HSP65-MUC1却未能显着的诱导抗MUC1+B16黑色素瘤的免疫反应。基于以上结果，我们又观察了MF59-YW002对Lewis肺癌细胞裂解物（TCL）在小鼠Lewis肺癌胸腔和皮下移植瘤模型中的佐剂作用，结果显示MF59-YW002没有显示出对TCL抗肿瘤能力的增效作用。因此，MF59与CpG ODN配伍作为肿瘤疫苗佐剂时显示出一定的潜在应用价值，但还需要进一步的实验验证。
李平[7]（2012）在《重组人白细胞介素-12联合重组表面抗原疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床前安全性和有效性评价》文中认为白细胞介素-12 （Interleukin-12, IL-12）是免疫网络中占有十分重要地位的核心细胞因子,是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁,免疫调节作用和生物学效应包括:1) IL-12调节Th1/Th2应答,使其向Th1倾斜,诱导Th1细胞发育和增殖,增强T细胞的杀伤功能;2)活化NK细胞产生细胞毒作用,增强NK/LAK细胞溶解活性,促进NK细胞的增殖。3) IL-12诱生T细胞、NK细胞产生IFN-γ。重组人白细胞介素-12 （Recombinant Human Interleukin-12,rhIL-12）是新型生物药物,是利用基因工程技术将人IL-12质粒转染致CHO细胞,通过细胞培养和蛋白质纯化,最终获得产品。rhIL-12作为功能强大的细胞因子,除了其自身可直接治疗疾病,其作为免疫佐剂与特异性抗原蛋白联合使用也具有广泛的应用前景。国外的临床试验研究表明,rhIL-12在临床上用作免疫佐剂,已显示了初步的效果,具有广泛的应用前景。本研究的内容主要是,以rhIL-12为佐剂与重组表面抗原（rHBsAg）疫苗联合组成治疗性乙型肝炎疫苗,评价rHBsAg联合rhIL-12治疗慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB ）的临床前安全性和有效性。1临床前安全性评价1.1rhIL--12与rHBsAg疫苗联合应用单次给予小鼠的毒性试验试验分为rhIL-12单用（静脉注射）组、rhIL-12单用（皮下注射）组、以及rhIL-12 （皮下注射）与重组乙型肝炎疫苗（肌肉注射）联合应用组,rhIL-12的给药剂量为4000 μg/kg,疫苗的给药剂量为600 μg/kg,另设生理盐水对照组（静脉注射）,给药后连续观察14天。结果表明,试验期间雌性动物食量未见明显异常,药后1-3和4-7天雄性动物各给药组食量与同期同性别对照组比较略有减少,药后8-14天,rhIL-12单用静脉注射组和rhIL-12与乙肝疫苗联合应用组雄性动物食量开始恢复,而rhIL-12单用皮下注射组雄性动物食量仍较少,未见恢复;雌性动物各给药组体重在药后3天、7天和14天与同期同性别对照组比较,未见统计学差异,药后7天和14天,雄性动物各给药组体重增长略见减缓,其中药后14天IL-12单用静脉注射组雄性动物体重与同期同性别对照组比较有统计学差异（P<0.05）;试验期间没有动物死亡;观察期结束后对动物实施安乐死并解剖,肉眼观察各动物主要脏器未见异常。因此在本试验条件下,rhIL-12单次皮下注射和静脉注射给予小鼠的最大耐受量（MTD） ≥4000 μg/kg,rhIL-12 （皮下注射4000 μg/kg）与重组乙型肝炎疫苗（肌肉注射600μg/kg）联合单次给药后也未见毒性反应。1.2 rhIL-12单次给予食蟹猴的毒性试验rhIL-12单次皮下注射给予食蟹猴,给药剂量为112.5和253.2μg/kg,每个剂量给予1只动物。给药后进行临床观察、体重、体温、心电图、血液学、血液生化、尿常规等指标检查。观察14天后,将动物安乐死,进行了大体解剖观察和部分组织器官的病理学检查。结果表明,给药剂量为112.5μg/kg的动物临床观察未见异常表现。该动物的体重给药后略有下降。Hb、RBC、HCT、WBC和PLT在给药后呈下降趋势,药后14天基本恢复。ALT于药后14天明显升高,达到229U/L; AST于药后7天明显升高,药后14天略有降低,但仍然较高。TBIL在给药后升高,TG药后7天有一过性升高,药后14天恢复。药后7天该动物尿中UBG出现升高。病理检查发现部分组织脏器淋巴细胞增生或浸润。其他指标包括体温、食量、心电图和凝血功能指标均未见与给药相关的明显异常改变。253.2μg/kg剂量组的动物临床观察未出现异常表现。该动物的体重给药后略有下降。Hb、RBC、HCT、WBC和PLT在给药后呈下降趋势,药后14天基本恢复。ALT和AST于药后1天即明显升高,药后7天最高,分别为485U/L和511U/L,药后14天略有恢复;APTT药后7天延长,ALP药后7天升高,药后14天均略有恢复;CK于药后1天和3天明显升高,药后7天和14天逐渐恢复。TBIL在给药后升高,TG药后7天有一过性升高,药后14天恢复。病理检查发现了可能与免疫调节相关的病理改变,主要表现为淋巴细胞的增生或组织浸润。其他指标包括体温、食量和心电图指标均未见与给药相关的明显异常改变。本试验条件下,112.5 μg/kg和253.2μg/kg两个剂量单次给药,对动物骨髓造血系统、肝脏、心脏和免疫系统造成了不同程度的影响。重组人白细胞介素12 （rhIL-12）单次皮下注射给予食蟹猴的最大耐受剂量为253.2μg/kg。1.3 rhIL-12给予豚鼠的全身主动过敏反应试验试验共设4组,分别为阴性对照组（PBS缓冲液）、阳性对照组（人血白蛋白）、供试品低剂量组（2μg/kg）和高剂量组（20μg/kg）,每组6只豚鼠。致敏采用皮下注射,隔日1次共3次,末次致敏后14天静脉注射两倍致敏剂量进行激发。阴性对照组和阳性对照组给药方法、时间与供试品组相同。结果表明,阴性对照组豚鼠过敏反应为阴性;阳性对照组豚鼠过敏反应为阳性至极强阳性,其中有1只动物激发给药后死亡;供试品低剂量组有1只动物激发给药后8分钟出现排尿反应,考虑为应激反应所致,供试品组其余动物在激发后均未见过敏反应症状。结果表明,在本试验条件下,rhIL-12给予豚鼠的全身主动过敏反应为阴性。1.4 rhIL-12与rHBsAg疫苗反复给予食蟹猴13周的毒性试验为评价rhIL-12以及与重组乙型肝炎疫苗联合应用反复给药的安全性,本试验选用食蟹猴42只,雌雄各半,随机分为7组,分别为阴性对照组、单用疫苗组、单用rhIL-12低、中、高剂量组和疫苗与低、高剂量rhIL-12联用组。rhIL-12给药剂量分别为0.5、5、40μg/kg,每周给药3次,共给药40次,疫苗的给药剂量为每只动物90μg,每4周给药一次,共给药4次。给药结束对每组4/6的动物实施安乐死,剩余动物进行4周的恢复期观察。试验期间对动物进行一般临床观察,监测了动物体重、体温、摄食量、心电图、血液学、血生化、尿常规等指标和血清抗体产生情况,并进行了眼科检查;对所有动物均进行了系统尸检和主要组织器官的组织病理学检查。单用rhIL-12 40μg/kg组:有2只动物出现腹泻,2只动物出现面部及下颌区肿胀。给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大,有1只动物出现了注射局部红斑。血液学指标出现了 Lymph和EOS的降低,Neut、BASO和LUC的升高,RBC、HGB、HCT、MCV —过性降低,RetL比例先增加后降低。生化指标出现一过性血清CHO、Alb、A/G、Ca、Na+、C1-及P浓度降低,CK、AST和TG升高。CD3、CD8细胞比例增加,CD4细胞比例下降。给药7次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体。疫苗与rhIL-12 40μg/kg联用组:有5只动物出现腹泻,其中1只动物临床症状较重,出现了明显消瘦、精神状态差和全身多处溃疡等症状。给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大,有2只动物皮下注射部位出现红斑。血液学、生化及免疫学指标的变化与单用rhIL-12 40μg/kg组基本一致。rhIL-12给药7次,疫苗给予1次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体和乙肝抗体。单用rhIL-12 5μg/kg组:有3只动物出现腹泻,1只动物出现眼睑和面部肿胀,2只动物出现尾中部溃疡,给药期间有4只动物出现了腹股沟淋巴结肿大,1只动物出现注射局部红斑。血液学指标出现Lymph降低,BASO及LUC增高,RBC、HGB、HCT、MCV—过性降低,给药后期Ret降低。生化指标出现一过性血清 CHO、Alb、A/G、Ca、Na+、Cl-和 P 浓度降低,CK、AST、TG 和 BUN升高。CD3、CD8细胞比例增加,CD4细胞比例下降。给药7次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体。单用rhIL-12 0.5μg/kg组:给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大,1只动物出现注射局部硬结。血液学指标出现了 Lymph、EOS、HCT、MCV的降低,Neut、BASO和LUC增高,恢复较快。生化指标出现血清CHO降低,AST和ALT —过性升高。给药7次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体。疫苗与rhIL12 0.5μg/kg联用组:有1只动物出现腹泻,给药期间该组6只动物均出现了腹股沟淋巴结肿大。血液学和生化指标的变化与单用rhIL-120.5μg/kg组基本一致。rhIL-12给药7次,疫苗给予1次后,所有动物均产生了抗IL-12的中和性抗体和乙肝抗体。单用疫苗组:给药期间有1只动物出现腹股沟淋巴结肿大。疫苗给予1次后,所有动物均产生了乙肝抗体。病理组织学检查未见各给药组与给药相关的大体及镜下观察异常病理改变。皮下连续注射rhIL-12可引起注射局部刺激反应,停药4周后注射局部反应明显消退。毒代动力学结果显示,首次给药后,rhIL-12的0.5、5及40μg/kg给药组的AUC（0-∞）分别为 0.039±0.005、0.543±0.056 和6.029±0.715μg·h/mL; Cmax分别为1.55±0.17,23.34±9.95 和 155.79±4.04μg·h/mL; T1/2 分别为 12.82±2.88,19.01±5.66和27.11±6.96 h;疫苗与0.5及40μg/kg rhIL-12联用组的AUC（0-∞）分别为0.036±0.009 和 7.314±1.155 μg·h/mL; Cmax 分别为 1.29±0.30 和 186.20±26.21μg.h/mL; T1/2分别为16.05±4.76和21.24±2.03h。第10及第39次药后,由于大部分动物的药物浓度低于检测限,毒代动力学参数未计算。综上所述,rhIL-12皮下注射给予食蟹猴,给药剂量为0.5、5、40μg/kg,每周给药3次,共给药40次,同时设重组乙型肝炎疫苗与低剂量和高剂量rhIL-12联用组,疫苗的给药剂量为每只动物90μg,每4周给药一次,共给药4次。rhIL-12给药导致动物出现腹泻、面部及眼睑部肿胀、腹股沟淋巴结肿大、溃疡、及注射局部红斑和硬结等临床症状,并出现贫血和白细胞分类异常,生化指标出现肝脏转氨酶和肌酸激酶升高、低蛋白血症及血清总胆固醇、Ca、Na+、Cl-及P浓度降低。免疫学指标出现外周血总T淋巴细胞比例增加,CD4细胞百分率下降、CD8细胞百分率增加。因此,在本试验条件下,rhIL-12皮下注射给予食蟹猴,毒性靶器官和组织为血液系统、肝脏、心脏、肾脏和淋巴结等免疫调节系统。0.5μg/kg为基本安全剂量。单用疫苗组未见明显异常反应,疫苗联用组与相应的rhIL-12单用组,反应基本一致,临床症状及检测指标未见明显差别。rhIL-12首次给药,疫苗联用组与相应的rhIL-12单用组在食蟹猴体内的动力学参数无差别。因此,在本试验条件下,疫苗与rhIL-12联用未明显增加rhIL-12的毒性。rhIL-12首次给药后的药物浓度呈现剂量依赖性,药物达峰浓度与给药剂量成正比;系统暴露量（AUC）与剂量呈现线性关系。rhIL-12反复给予食蟹猴,动物体内产生抗rhIL-12抗体,抗体具有中和rhIL-12活性的作用。连续给药10次及以上时,血清中的rhIL-12浓度显着降低,大部分动物无法检测到。rhIL-12反复皮下注射给予药食蟹猴,对注射局部有明显刺激性损伤,停药4周后可基本恢复。2临床前有效性评价2.1体外药效学研究取CHB患者外周静脉血5ml,分离PBMCs,加刺激物:RPMI-1640基础培养液空白对照、rHBsAg0.5μg/ml、rhIL-12 （0.01 ng/ml、0.1 ng/ml和 1 ng/ml）和rHBsAg0.5μg/ml+rhIL-12 （0.01ng/ml、0.1ng/ml和1ng/ml）,置37℃、5%CO2培养箱孵育72h后,在无菌条件下收集无细胞上清液,ELISA方法测定IFN-γ含量。结果表明,0.5μg/mlrHBsAg单独对CHB患者PBMCs刺激72h后诱生的IFN-y含量（11.65±9.74）很低,与对照组相比差异无统计学意义;rhIL-12 0.01、0.1、1 ng/ml单独对CHB患者PBMCs刺激72h后诱生的IFN-y含量分别为:214.17±82.07、452.68±145.13和870.78±373.05,与对照组相比有统计学意义上的显着性差异（P<0.01）; rhIL-12 0.01、0.1、1ng/ml联合rHBsAg对CHB患者PBMCs刺激72h后诱生的IFN-γ含量分别为:424.53±145.21、821.17±283.55和 1561.42±602.77,与对照组相比有统计学意义上的显着性差异（P<0.01）; 3个rhIL-12联合rHBsAg组诱生的IFN-γ要高于同剂量的rhIL-12组,且差异有统计学意义（P<0.01）; 3个rhIL-12联合rHBsAg组之间诱生IFN-γ比较有统计学意义上的差异（P<0.01）,且随着rhIL-12剂量的增加,IFN-γ的量也升高。取CHB患者外周静脉血20ml,分离PBMCs,分别加入RPMI-1640基础培养液、rHBsAg 0.5μg/ml、rhIL-12 lng/ml 和 rHBsAg0.5μg/ml+rhIL-12 lng/ml 培养24h,加抗体标记,流式细胞仪检测细胞内的IFN-γ。结果表明,CHB患者PBMCs用不同刺激物培养24h后细胞内IFN-γ的细胞来源主要有:CD4+ T细胞、CD8+T细胞和NK细胞（CD56+细胞）;rHBsAg组对CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞诱生的IFN-γ均较低（分别为:0.40±0.15、0.09±0.02和0.16±0.09）,与对照组比较均无统计学意义上的差异;rhIL-12组和rhIL-12联合rHBsAg组均能诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK产生IFN-γ,与对照组相比各种细胞内的IFN-γ升高,且差异具有统计学意义;rhIL-12联合rHBsAg组在CD4+T细胞、CD8T+T细胞内诱生的IFN-γ量,比rhIL-12组和rHBsAg组均有所升高,且差异具有统计学意义;rhIL-12联合rHBsAg组在NK细胞内诱生的IFN-y量与rhIL-12组相比无统计学意义上的差异。2.2体内药效学研究48只HBV转基因小鼠,随机分为6组,每组8只,分别为:对照组（生理盐水）、rmIL-12 组（0.9μg/只）、rHBsAg 组（6μg/只）、低剂量联合组（rmIL-12 0.lμg/只+rHBsAg μg/只）、中剂量联合组（rmIL-12 0.3μg/只+rHBsAg6μg/只）和高剂量联合组（rmIL-12 0.9μg/只+rHBsAg6μg/只）。rmIL-12为后肢皮下注射给药,每周给药2次;rHBsAg为后肢肌肉注射给药每周1次,12周后改为2周1次,共治疗24周。各组小鼠给药前、rmIL-12第1次给药后24h、rmIL-12第24次给药（12周）后24h和rmIL-12第40次给药（24周）后24h分别自眼球后静脉oaoo a a a a （?）.BsAg0.2μg /ml体外刺激脾细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育,分别于培养18h后,检测IFN-γ含量和细胞来源。IFN-γ检测结果表明,各组给药前、各时间点对照组和rHBsAg组小鼠血清均检测不出IFN-γ; rmIL-12组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-γ含量分别为:1127.13±235.32、687.55±183.07 和 258.64±56.16pg/ml;低剂量联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-γ含量分别为:150.57±43.65、96.17±30.21和66.32±25.78pg/ml;中剂量联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清 IFN-γ含量分别为:471.39±120.09、307.01±66.01 和 165.52±43.10pg/ml;高剂量联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-y含量分别为:1734.25±411.63、898.38±202.62 和 481.92±170.92pg/ml;高剂量联合组小鼠在第0周和第24周血清IFN-γ含量均高于rmIL-12组,且差异均有统计学意义;3个联合组小鼠在第0周、第12周和第24周血清IFN-γ含量差异均具有统计学意义,且随着rmIL-12剂量的增加小鼠血清IFN-γ水平增高;rmIL-12组和各联合组小鼠血清IFN-γ水平在不同时间点的差异具有统计学意义,且随着给药时间的延长小鼠血清IFN-γ水平降低。血清HBV DNA检测结果表明,各组给药前小鼠血清HBV DNA拷贝数为105;给药12周后,rHBsAg组有2只小鼠降为104, rmIL-12组有3只降为104,2只降为103,低剂量联合组有5只降为104,中剂量联合组有3只降为104, 4只降为103, 1只降为102,高剂量联合组有3只降为103, 4只降为102;给药24周后,rHBsAg组有3只小鼠将为104,5只降为103, rmIL-12组有1只降为104, 5只降为103, 1只降为102,低剂量联合组有5只降为104, 3只降为103,中剂量组有3只降为103,5只降为102,高剂量联合组全部小鼠降为102。rHBsAg组和低剂量联合组在给药24周后小鼠血清HBV DNA拷贝数与对照组相比降低,且差异具有统计学意义;rmIL-12组、中剂量联合组和高剂量联合组在给药12周和给药24周后小鼠血清HBVDNA拷贝数与对照组相比降低,且差异具有统计学意义;高剂量联合组在给药12周和给药24周后小鼠血清HBV DNA拷贝数低于同时期的rmIL-12组和rHBsAg组,且差异具有统计学意义;3个联合组在给药12周和给药24周后小鼠血清HBV DNA拷贝数差异有统计学意义,且rmIL-12剂量越高,小鼠血清HBV DNA拷贝数越低。小鼠脾细胞诱生IFN-γ的检测结果表明,低剂量联合组小鼠脾细胞经rHBsAg刺激后诱生的IFN-γ水平与生理盐水对照组相比无统计学意义上的差异;中剂量联合组和高剂联合量组小鼠脾细胞经rHBsAg刺激后诱生的IFN-γ水平高于生理盐水对照组,且差异具有统计学意义;小鼠脾细胞经rHBsAg刺激后诱生的IFN-γ主要来源于CD4+和CD8+ T细胞。2.3作用机制研究取健康人外周静脉血20ml,分离PBMCs,将浓度为2×106/ml的细胞分别加入3种激活物:阴性对照组、阳性对照组（0.2ug/ml Anti-CD3单抗）、和rHBsAg组（0.5μg/ml）,孵育72h,加抗体标记,流式细胞仪检测T细胞表明IL-12R的表达量。结果表明,rHBsAg刺激健康人PBMCs后,CD4+CD212+β1细胞百分率（0.50±0.15%）和CD4+CD212+β2细胞百分率（0.59±0.16%）均比生理盐水对照组升高,且差异具有统计学意义,表明rHBsAg上调了 CD4+T细胞表面的IL-12Rβ1 和 IL-12R β2 的表达;CD8+CD212+β1 细胞百分率（2.55±1.10%）和CD8+CD212+β2细胞百分率（1.33±0.51%）均比生理盐水对照组升高,且差异具有统计学意义,表明rHBsAg上调了 CD8+ T细胞表面的IL-12Rβ1和IL-12Rβ2的表达。
韩秋菊[8]（2011）在《双功能HBx-3p-siRNA逆转HBV免疫耐受及其分子机制研究》文中指出研究目的：RNA干扰（RNAi）是植物和低等动物体内发挥防御内源性核酸的比较保守的机制。内源性的RNAi通路主要通过siRNA和miRNA两个途径发挥作用,而miRNA主要是基因组中非完全匹配的非编码RNA。目前,RNAi已被广泛应用于抗HBV研究中,并在体内外实验中证实能够明显抑制HBV的复制和表达。随着研究的深入,人们发现某些siRNA具有免疫激活作用,能被胞内固有免疫受体所识别。机体天然免疫系统主要通过TLRs、PKR、RIG-I等介导对siRNA的识别,进而活化NF-κB、MAPK、IRF-7等信号通路,诱导干扰素和炎性因子的产生。X基因（HBx）是多功能HBV序列的代表,其编码的X蛋白是所有转录本均具有的保守序列,因此,是进行基因治疗的理想靶标。在HBV所引起的慢性乙型肝炎的发病机制中,既有病毒的始动作用,又有机体固有免疫和获得性免疫的功能不足,肝脏中HBV的持续存在可抑制TLRs、RIG-I等介导的天然免疫应答,此亦成为HBV持续性感染进一步加重肝脏免疫耐受、影响HBV临床治疗效果的原因之一。因此,对慢性乙肝的治疗要求兼顾抑制病毒和增强免疫功能。降低HBV负荷的同时提高肝脏微环境中天然和获得性免疫应答能力可能会纠正或逆转HBV导致的免疫耐受。本研究的目的是通过设计靶向HBx基因的5’-triphosphate-siRNA （3p-HBx-siRNA）和化学合成siRNA（HBx-siRNA）,观察该siRNA能否既发挥特异性的靶基因沉默作用,又能够激活天然免疫相关信号通路,从而改善HBV导致的免疫耐受状态。研究方法：首先,我们以携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞为模型,观察转染3p-siRNA对HBV表达和复制的影响及免疫刺激作用。用RT-qPCR的方法检测了HBx基因和HBs/p基因的表达；用ELISA的方法检测了HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量变化。在免疫刺激作用方面,用RT-qPCR的方法检测了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表达水平；通过Western blotting检测p42/p44 MAPK信号通路的活化,以及NF-κB信号通路中IKB的蛋白降解水平；应用萤光素酶报告基因实验观察3p-HBx-siRNA对IFN-β的启动子序列的调控。另外,我们比较了HepG2和HepG2.2.15细胞表达相关细胞因子的差别,发现感染HBV的HepG2.2.15细胞中,RIG-Ⅰ和干扰素相关基因表达相对较低；HepG2细胞对poly I：C刺激的免疫应答效应更为明显,而HepG2.2.15的反应相对比较迟钝。这表明,相对于无HBV感染的HepG2细胞,HepG2.2.15细胞处于免疫抑制状态。而3p-HBx-siRNA对RIG-Ⅰ信号通路的活化能够有效逆转这种免疫耐受状态。通过RIG-Ⅰ的过表达以及沉默实验,我们进一步证实,3p-HBx-siRNA能够通过活化RIG-Ⅰ信号通路进而增强对HBV复制的抑制作用。其次,我们将化学合成的siRNA转染到HepG2.2.15细胞中,进一步验证了靶向HBx基因的HBx-siRNA对HBV的抑制作用,用RT-qPCR的方法检测HBx基因以及HBV s/p基因的表达；用ELISA的方法检测了HepG2.2.15细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量变化；通过Western Blotting技术观察了HBx-siRNA对HepG2.2.15细胞中PKR信号通路的活化作用,用RT-qPCR的方法检测了IFN-α、IFN-β、ISG15和ISG56的mRNA表达水平；通过PKR的过表达实验和抑制实验,观察了胞内干扰素相关基因的变化,并检测了对HBV复制的影响。最后,我们通过尾静脉高压注射HBV质粒的方式建立小鼠HBV感染模型。一方面,通过灌流法分离小鼠肝实质细胞,然后转染HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA,观察其对HBV的抑制作用和免疫激活作用。另一方面,在HBV感染小鼠体内进行HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA的治疗,观察其在小鼠体内的免疫激活作用和HBV抑制作用。用放射免疫方法比较了血清中HBsAg和HBeAg的含量变化；用免疫组化的方法检测了胞内HBcAg的表达；用ELISA法检测了小鼠血清中IFN-α、IFN-β,以及免疫抑制因子TGF-β和IL-10的含量；用流式细胞术检测了不同淋巴细胞亚群CD69和NKG2D的表达。结果一体外试验证实5’-triphosphate-siRNA能够逆转HBV免疫耐受1.5’-triphosphate-siRNA的体外转录以及鉴定利用T7 RNA聚合酶的体外转录方法,我们成功获得了靶向HBx基因的5’-triphosphate-siRNA （3p-HBx-siRNA）,其序列和化学合成的siRNA相同,见表1和表2。我们还设计了靶向GAPDH以及无关序列的3p-siRNA,即3p-GAPDH-siRNA和3p-scramble-siRNA。2.非特异性3p-siRNA能够序列非依赖性引起免疫激活作用将靶向GAPDH和scramble的3p-siRNA转染HepG2.1.15细胞,检测干扰素相关基因的表达,发现其能激活RIG-Ⅰ通路并诱导干扰素等细胞因子的表达,并在一定程度上抑制HBV的复制。3.化学合成的siRNA的抗HBV和免疫激活效应化学合成的HBx-siRNA能够显着抑制HBV的复制,但其对Ⅰ型干扰素的诱导能力比较弱,诱导倍数在4-6倍左右。4.3p-HBx-siRNA的‘’off-target"免疫刺激效应靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA能够被胞内RIG-Ⅰ所识别,进而活化下游NF-κB和MAPK信号通路,从而诱导Ⅰ型干扰素和促炎症因子的表达,并下调免疫抑制因子IL-]0和TGF-β的表达。5.双功能3p-HBx-siRNA优于单纯具基因沉默作用的HBx-siRNA兼具免疫激活作用和直接HBx沉默作用的3p-HBx-siRNA能够更加有效地抑制HBx、HBV s/p基因的表达,以及上清中HBsAg和HBeAg的分泌,其抑制HBV的效果要明显优于化学合成HBx-siRNA。6.3p-HBx-siRNA逆转HBV免疫耐受携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞本身处于免疫耐受的状态,且对于polyI:C诱导的应答反应亦不如HepG2细胞敏感。靶向HBx基因的3p-HBx-siRNA不仅能够抑制HBV的复制,还能够激活RIG-Ⅰ免疫信号通路,进一步逆转HBV诱导的免疫耐受。7.3p-HBx-siRNA的免疫刺激作用和RIG-Ⅰ介导的Ⅰ型干扰素有关过表达RIG-Ⅰ后,3p-HBx-siRNAs的HBV抑制作用更为显着,并且能够增强免疫激活作用；RIG-Ⅰ的沉默后,3p-HBx-siRNAs对HBV的抑制作用明显削弱。这些结果进一步表明,RIG-Ⅰ信号通路活化与HBV抑制有关。而用IFNR1中和抗体将干扰素信号通路阻断后,3p-HBx-siRNAs对HBx基因的抑制作用明显削减。结果二化学合成的HBx-siRNA能够通过激活PKR信号通路进一步抑制HBV的复制1. HBx-siRNAs抑制HBV的表达化学合成的HBx-siRNAs不仅能够沉默HepG2.2.15细胞HBx基因的表达,还能抑制HBcAg的表达,降低HBsAg和HBeAg的水平,并且这种抑制HBV的效果具有siRNA浓度依赖关系。2. HBx-siRNAs诱导免疫应答反应在HepG2.2.15细胞中,化学合成HBx-siRNA可以诱导干扰素效应,并且其诱导效果随siRNA转染浓度的升高而增强；HBx-siRNA在诱导干扰素效应的同时,还能引起炎症因子的分泌；其对趋化因子CXCL2、CCL4、CXCL10的表达并没有显着影响。3. HBx-siRNAs能够诱导PKR以及下游信号通路的活化在HepG2.2.15细胞中,化学合成HBx-siRNA可以诱导PKR表达；Western Blotting结果显示,胞内PKR的磷酸化程度增强,并且能明显促进PKR底物eIF-2a的磷酸化；这些结果显示,PKR可能介导了HBx-siRNA所诱导的免疫激活作用。4.PKR介导HBx-siRNAs诱导的免疫应答和转染对照质粒组相比,HepG2.2.15细胞转染HBx-siRNAs后,过表达PKR可进一步促进IFN-αα和IFN-p mRNA水平的升高。而用2-AP抑制PKR活性后,干扰素和抗病毒基因的表达受到明显影响。结果提示,PKR的确参与了HBx-siRNAs引起的天然免疫应答。5.进一步确认PKR活化对于HBV的抑制作用我们将PKR过表达质粒以及对照质粒转染HepG2.2.15细胞,进而分析HBV表达的变化,结果发现HBx和HBs/p表达水平降低,表现出更加显着的抗HBV效果。而用2-AP抑制PKR后,HBx-siRNA对HBV的抑制效果明显削减。这些结果说明,PKR的活化能够有效抑制HBV的复制。结果三HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA逆转HBV免疫耐受的体内效应1.HBV持留续存（免疫耐受）小鼠模型的建立通过尾静脉高压注射的方式成功建立了HBV慢性感染模型,HBV感染比例大约为80%左右。2.3p-HBx-siRNA对HBV免疫耐受小鼠肝实质细胞的抗病毒效应胶原酶灌流法提取分离HBV慢性感染小鼠体内肝实质细胞；HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能抑制HBV基因的表达,从而抑制HBV的复制；均能明显上调RIG-Ⅰ的表达和Ⅰ型干扰素的产生。3.双功能3p-HBx-siRNA对HBV免疫耐受小鼠肝实质细胞的HBV抑制效应HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA转染小鼠肝实质细胞可明显抑制HBx和HBsAg的基因表达,降低血清中HBsAg和HBeAg的水平,抑制胞内HBcAg的表达,而以3p-HBx-siRNA的作用更明显。4. HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA在HBV免疫耐受小鼠体内的免疫激活效应HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA均能明显诱导HBV免疫耐受小鼠IFN-α和IFN-β的分泌,降低血清中TGF-β和IL-10的含量。HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治疗对小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞的比例并没有显着影响；3p-HBx-siRNA治疗可明显增强肝脏T细胞、NKT细胞CD69的表达；HBx-siRNA能明显上调肝脏T细胞和脾脏NK细胞CD69的表达；3p-HBx-siRNA治疗可略提高肝脏NKT细胞和NK细胞NKG2D的表达,而HBx-siRNA组并无明显变化。5.肝损伤的检测HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA进行高压注射治疗不会影响小鼠血清中ALT和AST转氨酶的水平；HE染色结果显示肝脏组织结构正常,无坏死灶,说明HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA治疗虽然激活天然免疫应答但并不引起明显肝损伤。结论及意义：1、首次设计出兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的3p-HBx-siRNA,并应用于抗HBV的治疗,发现这种双功能的siRNA较化学合成的siRNA具有更好的HBV抑制和病毒清除效果。2、3p-HBx-siRNA在通过活化RIG-Ⅰ信号通路诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生,还能诱导TNF-αα等抗炎因子的表达,抑制TGF-β、IL-10等免疫抑制性因子的产生从而有效逆转HBV所致的免疫耐受。3、化学合成的HBx-siRNA可通过活化PKR信号通路激活肝细胞天然免疫应答,诱导干扰素和抗炎因子的产生,更加有利于siRNA对HBV的抑制和清除。这种兼具靶基因沉默作用和免疫激活作用的双功能siRNA具有在降低HBV负荷的同时提高肝脏微环境中天然和获得性免疫应答能力,并进而纠正HBV导致的免疫耐受的独特优势,将为HBV慢性感染,尤其是乙肝免疫耐受,提供新的治疗策略和思路。
刘栋[9]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中进行了进一步梳理在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
孙静[10]（2009）在《DNA疫苗载体优化设计和新型佐剂的研究》文中提出DNA疫苗作为一种新型疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势,同时能诱导体液免疫和细胞免疫,而且抗原编码的“裸”DNA具有相对安全、稳定、生产方便和在体内能介导抗原的长期表达等优点。但是由于免疫原性相对较弱,目前DNA疫苗的发展仍然受到很大的限制。提高抗原基因的表达对提高DNA疫苗的免疫原性起到重要的作用,抗原基因的优化策略包括:对质粒载体骨架调控元件的优化和利用宿主基因的偏好对密码子进行优化等。目前常利用人巨细胞病毒（hCMV）第一内含子（IntronA）作为转录后调节元件,与hCMV启动子/增强子（Promoter/Enhancer）一同提高缺失内含子的目的基因的表达。有文献报道,乙肝病毒（HBV）/旱獭肝炎病毒（WHV）转录后调节元件（H/WPRE）、Mason-Pfizer猴病毒（MPMV）组成性转运元件（CTE）、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK）pre-mRNA加工增强元件（PPE）都能通过提高mRNA的稳定性、3’末端的加工、促进mRNA出细胞核和细胞质中mRNA的积累来增强未经剪接的基因表达。但是这类转录后调节元件是否能替代hCMVintronA或与其产生协同作用,从而提高DNA疫苗免疫原性还有待进行研究。本研究首先通过删除pVR1012质粒载体hCMVIE imronA,构建内含子缺失的质粒载体pCMV,然后将HPRE、WPRE、CTE、PPE元件分别克隆入pVR1012和pCMV,获得了pIn-HPRE、pIn-WPRE、pIn-CTE、pIn-PPE和pHPRE、pWPRE、pCTE、pPPE载体。为比较hCMV IE intronA与HPRE、WPRE、CTE、PPE元件对目的基因表达的调控,将luciferase报告基因分别克隆入上述载体,体外瞬时转染293T细胞。实验结果表明,与pVR1012载体相比pIn-HPRE和pIn-WPRE能显着增强体外luciferase基因的表达,而pHPRE、pWPRE与pVR1012无差别。为比较HPRE、WPRE元件在hCMV IE intronA存在和缺失的情况下,对体外抗原基因表达及体内抗原特异的免疫反应增强效果的差异,将野生型或密码子优化型的HIV-1 B’/C重组亚型CN54株Gag基因克隆入携带HPRE、WPRE元件的pVR1012和pCMV的载体,体外瞬时转染293T细胞和免疫Balb/C小鼠进行比较。实验结果表明,PRE元件能够显着地提高野生型Gag基因在293T细胞中的表达,其中当hCMV IE intronA和HPRE元件在载体上同时出现的时候基因的表达水平最高,而且pInHGagw（+intronA/+HPRE）在10μg剂量诱导出的免疫反应水平高于pGagw（-intronA/-HPRE）以及pInGagw（+intronA/-HPRE）在40μg剂量所诱导的水平。虽然载体优化对提高体外和体内密码子优化型抗原基因表达作用不太明显,但研究结果发现,如果载体经hCMVIE intronA和HPRE元件的优化,那么即使携带野生型基因的载体也能达到与等量的密码子优化Gag DNA疫苗体外抗原基因表达和体内免疫原性相同的水平。大量的实验证明佐剂能够增强DNA疫苗的免疫原性。卡介菌的细胞壁骨架由分支菌酸、阿拉伯半乳糖、肽聚糖组成,能激活至少五种Toll样受体（TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR9）,同时BCG中富含有免疫调节作用的CpG基序,因此它被认为是强有效的非特异免疫刺激剂,并在许多疫苗研究中得以使用。卡介苗多糖核酸（BCG-PSN）是经热酚法提取卡介菌多糖核酸制成的免疫调节剂,在临床上已经被成功地运用于免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病的治疗。本研究选择卡介苗多糖核酸（BCG-PSN）作为佐剂,评价了在不同剂量、不同免疫次数下BCG-PSN对pDRVI1.0gp1455M（HIV-1 CN54 gp145基因）DNA疫苗诱导的体液免疫,细胞免疫以及长期免疫记忆的增强作用。实验结果表明,BCG-PSN和DNA疫苗质粒混合后注射,能显着地提高DNA疫苗的免疫原性。并且BCG-PSN的使用能够减少DNA疫苗的免疫次数,降低DNA疫苗的用量。本研究为提高DNA疫苗免疫原性提供了新的途经,为开发中国株HIV-1 DNA疫苗奠定了坚实的基础。
二、筛选能激活HBV特异性T细胞反应的细胞因子佐剂的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、筛选能激活HBV特异性T细胞反应的细胞因子佐剂的研究（论文提纲范文）
（1）基于B细胞表面TLR9水平及移行与B细胞活化的关系研究CpG ODN发挥疫苗佐剂作用的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.CpG ODN及其免疫学活性 |
| 1.1 CpG ODN的发现及种属特异性 |
| 1.2 CpG ODN的分型 |
| 1.3 CpG ODN作为TLR9 激动剂启动TLR9 信号转导 |
| 1.4 CpG ODN作为疫苗佐剂及其机制的研究 |
| 2.TLR9 的结构、移行和定位 |
| 2.1 TLR9 的结构 |
| 2.2 TLR9 的移行和定位及其与活化的关系 |
| 3.sTLR9 的结构、免疫学活性及与CpG ODN的关系 |
| 3.1 sTLR9 的结构 |
| 3.2 sTLR9 的免疫学活性 |
| 3.3 sTLR9与CpG ODN的关系 |
| 4.人用疫苗佐剂的研究现状 |
| 4.1 疫苗佐剂概述 |
| 4.2 几种人用疫苗佐剂的组成及作用机制 |
| 4.3 疫苗佐剂的作用途径 |
| 科学假设 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 自行设计的CpG ODN及其对B细胞sTLR9 的影响 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验动物及细胞 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 CpG ODN |
| 1.2.2 VSV病毒 |
| 1.2.3 其他试剂 |
| 1.3 实验器材 |
| 1.3.1 实验仪器 |
| 1.3.2 实验耗材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 CpG ODN二级结构预测 |
| 1.4.2 CpG ODN的免疫刺激基序分析 |
| 1.4.3 CpG ODN与病原微生物基因序列的同源性及相似性比对 |
| 1.4.4 CpG ODN的综合评分方式 |
| 1.4.5 CpG ODN的合成 |
| 1.4.6 小鼠脾细胞的分离 |
| 1.4.7 细胞培养及细胞培养上清的制备 |
| 1.4.8 细胞的荧光抗体染色及流式细胞术检测 |
| 1.4.9 Ed U掺入法检测细胞增殖 |
| 1.4.10 VSV保护实验 |
| 1.4.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 自行设计CpG ODN的分析评估 |
| 2.1.1 CpG ODN的 CG基序数量分析 |
| 2.1.2 CpG ODN的免疫刺激基序分析 |
| 2.1.3 CpG ODN的二级结构预测 |
| 2.1.4 CpG ODN与病原微生物基因序列的同源性及相似性比对 |
| 2.1.5 CpG ODN的综合评分 |
| 2.2 CpG ODN的合成及鉴定 |
| 2.2.1 CpG ODN的合成及基本信息 |
| 2.2.2 CpG ODN的纯度鉴定 |
| 2.3 .CpG ODN免疫学活性的验证性研究及分型 |
| 2.3.1 CpG ODN的抗病毒活性研究 |
| 2.3.2 CpG ODN对脾细胞增殖的影响 |
| 2.4 .CpG ODN对 B细胞sTLR9及t TLR9 水平的影响 |
| 2.4.1 CpG ODN对 B细胞sTLR9 水平的影响 |
| 2.4.2 CpG5805对B细胞sTLR9 水平的影响 |
| 2.4.3 CpG5805对t TLR9 表达水平的影响 |
| 2.5 CpG5805 对脾细胞中免疫细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.1 CpG5805 对脾细胞中B细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.2 CpG5805 对脾细胞中树突状细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.3 CpG5805 对脾细胞中CD4~+T 细胞增殖及活化的影响 |
| 2.5.4 CpG5805 对脾细胞中CD8~+T 细胞增殖及活化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 CpG 5805 疫苗佐剂效应及与B细胞活化和sTLR9 水平的关系 |
| 1.材料方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.1.1 重组蛋白 |
| 1.1.2 灭活病毒 |
| 1.1.3 商品化乙肝疫苗 |
| 1.1.4 疫苗乳化剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 疫苗的配制 |
| 1.2.2 动物免疫 |
| 1.2.3 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 1.2.4 抗体水平的检测 |
| 1.2.5 B细胞表面协同共刺激分子、MHC II及 sTLR9 的检测 |
| 1.2.6 小鼠淋巴器官TLR9 信号通路分子的mRNA水平检测 |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 CpG5805 作为疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.1.1 CpG5805 作为重组蛋白疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.1.2 CpG5805 作为灭活病毒疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.1.3 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂对抗体产生水平的影响 |
| 2.2 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外对小鼠脾细胞中B细胞活化的影响 |
| 2.2.1 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面CD80 的影响 |
| 2.2.2 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面CD86 的影响 |
| 2.2.3 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面CD40 的影响 |
| 2.2.4 CpG5805 作为乙肝疫苗佐剂在体外不同时间点对小鼠脾细胞中B细胞表面MHC II的影响 |
| 2.3 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官中B细胞活化及sTLR9 表达水平的影响 |
| 2.3.1 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官内活化B细胞及sTLR9 表达细胞比例的影响 |
| 2.3.2 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官内B细胞上活化双信号及sTLR9 表达水平的影响 |
| 2.3.3 CpG5805 为佐剂的疫苗对小鼠淋巴器官TLR9 信号通路表达的影响 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三章 CpG5805 诱导sTLR9 移行与B细胞活化的关系 |
| 1.实验方法 |
| 1.1 流式细胞术 |
| 1.2 免疫荧光 |
| 1.3 抗体喂养实验 |
| 1.4 原代小鼠脾细胞siRNA干扰 |
| 1.5 siRNA沉默AP2 表达效果的鉴定 |
| 2.结果 |
| 2.1 CpG5805对sTLR9 移行及定位的影响 |
| 2.1.1 CpG5805对B细胞sTLR9 移行的影响 |
| 2.1.2 CpG5805 诱导sTLR9 移行位置的探索 |
| 2.2 CpG5805 诱导sTLR9 移行对B细胞活化的影响 |
| 2.2.1 CpG5805 诱导sTLR9 移行对B细胞母细胞化的影响 |
| 2.2.2 CpG5805 诱导的母细胞化B细胞上sTLR9 的表达 |
| 2.2.3 CpG5805 诱导的B 细胞上sTLR9 的表达水平与B 细胞活化水平的关系 |
| 2.3 干扰TLR9 移行对CpG5805 调节B 细胞 sTLR9 表达水平及B 细胞活化水平的影响 |
| 2.3.1 阻断TLR9 移出内质网对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 2.3.2 阻断sTLR9 向内体移行对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 2.3.3 干扰内体对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 2.3.4 干扰TLR9 下游信号通路对B 细胞sTLR9 表达及B 细胞活化的影响 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）poly Ⅰ：C作为佐剂与rHBVvac联用治疗慢性HBV感染的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: HBV的免疫生物学及其感染的免疫调节机制 |
| 1 HBV的分子生物学 |
| 1.1 HBV病毒基本结构 |
| 1.2 HBV生命周期 |
| 2 HBV持续性感染的机制 |
| 2.1 DCs在HBV感染中的作用 |
| 2.2 NK细胞在HBV感染中的作用 |
| 2.3 CD8~+T细胞在HBV感染中的作用 |
| 2.4 CD4~+T细胞在HBV感染中的作用 |
| 2.5 B细胞介导的体液免疫应答在HBV感染中的作用 |
| 3 获得持续病毒学抑制的新策略 |
| 3.1 以病毒为靶点 |
| 3.2 以宿主为靶点 |
| 4 HBV研究的动物模型 |
| 4.1 黑猩猩HBV感染模型(灵长类动物) |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 嗜肝性DNA病毒动物模型 |
| 4.4 小鼠HBV复制和感染模型 |
| 5 结束语 |
| 参考文献 |
| 第二部分: poly I:C作为佐剂与rHBVvac联用治疗慢性HBV感染的作用与机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要材料及试剂 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 主要实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HBV慢性感染小鼠模型中存在多种HBV DNA中间体 |
| 3.2 poly I:C作为佐剂与rHBV疫苗联合(pHBV)使用能够安全有效的清除HBV |
| 3.3 pHBV疫苗增强机体DC的成熟和抗原递呈功能 |
| 3.4 pHBV疫苗能改善机体的免疫抑制环境 |
| 3.5 pHBV疫苗诱导机体产生的抗原特异性CD11a~(hi) CD8α~(lo)T细胞介导机体对病毒的清除 |
| 3.6 pHBV疫苗逆转了HBV特异性CD8~+T细胞的耗竭并诱导产生KLRG1~+ CD8~+T细胞 |
| 3.7 pHBV疫苗促进CD8~+T细胞的终末分化 |
| 3.8 pHBV疫苗诱导产生的HBV特异性SLECs能保护机体防止HBV的再次感染 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议及奖励 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（3）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人类免疫缺陷病毒Nef蛋白调控Fas凋亡通路的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HIV及调控蛋白Nef |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 Nef的特点 |
| 1.1.3 Nef对表面受体的调控 |
| 1.1.4 Nef对信号通路的调控 |
| 1.2 细胞凋亡的信号途径 |
| 1.2.1 死亡受体介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.2 内质网介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 线粒体介导的凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞色素B与细胞凋亡 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.2.1 菌株、细胞与动物 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 酵母双杂交筛选 |
| 3.1.1 测定文库的滴度 |
| 3.1.2 扩增酵母文库 |
| 3.1.3 酵母菌的活化 |
| 3.1.4 小量转化诱饵蛋白质粒 |
| 3.1.5 文库质粒的转化 |
| 3.1.6 诱饵蛋白自身激活检测 |
| 3.1.8 酵母质粒的提取 |
| 3.1.9 DH5α感受态制备及质粒转化 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.1 质粒的小量提取 |
| 3.2.2 限制性酶消化 |
| 3.3.3 用试剂盒回收DNA |
| 3.3.4 DNA片段和载体的连接 |
| 3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.1 细胞传代 |
| 3.3.2 细胞的转染 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 Cyto b免疫抗原的表达纯化 |
| 3.5.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.6 线粒体的纯化 |
| 3.7 HIV-1BA-L假病毒的制备 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 Western Blot实验 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 Nef能直接与Cyto b结合 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 Cyto b与 Nef能产生体内的相互作用 |
| 4.2 胞质中的Cyto b参与了Fas凋亡通路 |
| 4.2.1 Cyto b免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 Fas刺激后引起Cyto b的切割和C端从线粒体的释放 |
| 4.3 Nef抑制了Fas介导的细胞凋亡 |
| 4.4 Fas凋亡信号诱导Nef与 Cyto b的结合 |
| 4.5 Nef抑制了Cyto b介导的Fas凋亡途径 |
| 4.6 Nef是 Cyto b介导的Fas凋亡通路的抑制子 |
| 4.7 Nef也参与抑制了Cyto c介导的Fas凋亡途径 |
| 4.8 HIV感染细胞后,FasL诱生Cyto b的释放有所增强 |
| 5 结果讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒核心抗原HBc抑制干扰素α诱导IFITM1 表达的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HBV及核心蛋白HBc |
| 1.1.1 HBV基因组 |
| 1.1.2 HBV与肝癌 |
| 1.1.3 HBc及其功能 |
| 1.2 IFN及其诱导的信号通路 |
| 1.2.1 干扰素的分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 IFN诱导的信号通路 |
| 1.3 SWI/SNF家族 |
| 1.3.1 SWI/SNF的功能 |
| 1.3.2 BAF200 |
| 1.4 IFITM家族 |
| 1.4.1 IFITM家族的特点 |
| 1.4.2 IFITM1 及其功能 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA干扰试验 |
| 3.2 RT-PCR |
| 3.2.1 RNA提取所用器具的处理 |
| 3.2.2 细胞总m RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA电泳检测 |
| 3.2.4 RNA的反转录 |
| 3.3 细胞活力检测 |
| 3.4 ELISA 实验 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 4 研究结果 |
| 4.1 HBc与 BAF200 的相互作用 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 HBc与 BAF200 存在体内的相互作用 |
| 4.2 BAF200 调控IFNα诱导的IFITM1 的表达 |
| 4.3 HBc通过与BAF200 相互作用抑制IFITM1 的转录 |
| 4.4 HBc与 BAF180 竞争性结合BAF200,破坏PBAF复合体的形成,进而削弱了BAF200对IFITM1 的表达调控 |
| 4.5 IFNα的诱导不影响STAT1 的磷酸化水平 |
| 4.6 HBc削弱BAF200 对细胞活性的影响 |
| 4.6.1 BAF200 通过IFITM1 对细胞活力进行影响 |
| 4.6.2 HBc可以削弱BAF200 对细胞活力的影响 |
| 4.7 IFNα诱导下BAF200和HBc对 HBV复制水平的影响 |
| 5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
（4）猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 免疫佐剂的研究进展 |
| 1.1 免疫佐剂概述 |
| 1.2 免疫佐剂的作用机理 |
| 1.3 常见疫苗免疫佐剂 |
| 1.4 免疫佐剂应用展望 |
| 2 Gp96研究进展 |
| 2.1 Gp96概述 |
| 2.2 Gp96的结构特点及免疫学特性 |
| 2.3 Gp96佐剂效应的分子机制 |
| 2.4 Gp96在抗感染和抗肿瘤中的应用研究 |
| 2.5 Gp96的应用展望 |
| 3 研究目的及意义 |
| 第二章 猪Gp96N的表达与纯化 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞总RNA的提取 |
| 2.2 RT-PCR扩增总cDNA |
| 2.3 PCR扩增猪Gp96N基因 |
| 2.4 重组质粒pET-32a/Gp96N的构建 |
| 2.5 大肠杆菌的转化 |
| 2.6 大肠杆菌表达猪Gp96N及蛋白检测 |
| 2.7 阴离子交换层析纯化猪Gp96N蛋白 |
| 2.8 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.9 猪Gp96N的基因扩增及重组质粒pPICZaA/Gp96N的构建 |
| 2.10 毕赤酵母的电转化 |
| 2.11 阳性转化子的筛选与鉴定 |
| 2.12 重组酵母诱导表达猪Gp96N蛋白及检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大肠杆菌表达猪Gp96N及目的蛋白的纯化及检测 |
| 3.2 酵母菌表达猪Gp96N及目的蛋白的纯化与检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 Gp96N对PRRSV合成肽免疫效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 病毒和细胞 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PRRSV的B细胞表位和T细胞表位多肽的合成 |
| 2.2 蛋白佐剂猪Gp96N的获得 |
| 2.3 病毒粒子纯化 |
| 2.4 实验动物分组及免疫 |
| 2.5 攻毒实验 |
| 2.6 间接免疫荧光染色(IFA) |
| 2.7 ELISA检测抗体水平 |
| 2.8 病毒-血清中和实验 |
| 2.9 小鼠脾细胞的分离 |
| 2.10 病毒滴度(TCID_(50))检测 |
| 2.11 猪PBMC的分离 |
| 2.12 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 2.13 小鼠IFN-γ/EIISPOT实验 |
| 2.14 ELISA检测猪细胞因子 |
| 2.15 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV的B细胞表位和T细胞表位的序列分析 |
| 3.2 PRRSV的B细胞表位合成肽能激活小鼠体液免疫 |
| 3.3 猪Gp96N能够增强B细胞表位肽对小鼠的体液免疫效应 |
| 3.4 PRRSV的B细胞表位肽能激发猪的体液免疫 |
| 3.5 猪Gp96N能够增强B细胞表位肽对猪的体液免疫效应 |
| 3.6 猪Gp96N与PRRSV的T细胞表位肽联合免疫能够激活小鼠的细胞免疫 |
| 3.7 猪Gp96N与PRRSV合成肽联合免疫能够激活猪的细胞免疫 |
| 3.8 猪Gp96N对PRRSV合成肽免疫效应的增强具有Thl型偏好性 |
| 3.9 猪Gp96N对PRRSV合成肽免疫保护力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 猪Gp96N对PRRSV亚单位疫苗免疫效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PRRSV的B细胞表位亚单位疫苗重组质粒的构建 |
| 2.2 重组蛋白Cpl、Cp2的表达与检测 |
| 2.3 猪Gp96N蛋白的获得 |
| 2.4 实验动物分组及免疫 |
| 2.5 IFA检测PRRSV特异性抗体 |
| 2.6 体液免疫水平检测 |
| 2.7 细胞免疫水平检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 筛选出9个抗原性较高的PRRSV的B细胞表位 |
| 3.2 重组蛋白Cpl、Cp2的表达纯化及检测 |
| 3.3 Cpl、Cp2能够激发小鼠产生PRRSV特异性抗体 |
| 3.4 猪Gp96N能够增强Cp对小鼠的体液免疫效应 |
| 3.5 猪Gp96N能够增强Cp对小鼠的细胞免疫效应 |
| 3.6 猪Gp96N能够增强Cp对猪的体液免疫效应 |
| 3.7 猪Gp96N能够增强Cp对猪的细胞免疫效应 |
| 3.8 猪Gp96N增强PRRSV亚单位疫苗Cp的免疫效应具有Th1型偏好性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 猪Gp96N对PCV2灭活疫苗免疫效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 病毒和细胞 |
| 1.4 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫佐剂猪Gp96N蛋白的制备 |
| 2.2 不同剂量猪Gp96N与疫苗联合免疫的制备方法 |
| 2.3 实验动物分组及免疫方案 |
| 2.4 PCV2特异性抗体IgG的检测 |
| 2.5 血清细胞因子检测 |
| 3 结论与分析 |
| 3.1 猪Gp96N能够增强PCV2灭活疫苗对猪的体液免疫 |
| 3.2 细胞因子检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）含有TLR7/8受体激活物的乙肝病毒治疗性疫苗的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 表索引 |
| 图索引 |
| 英文缩写注解 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 基金资助情况 |
| 已发表文章 |
| 申请专利 |
| 参加会议 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）CpG ODN-MF59辅佐肿瘤抗原诱导抗小鼠黑色素瘤及肺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 研究背景 |
| 文献综述 |
| 1.1 疫苗佐剂的研究进展 |
| 1.2 相关肿瘤疫苗研究进展 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 疫苗佐剂的制备及肿瘤抗原和细胞的鉴定 |
| 3.2 与 MF59 配伍的最佳免疫刺激性佐剂的筛选 |
| 3.3 MF59-YW002 辅助 HSP65-MUC1 抗 MUC1~+B16 黑色素瘤的体内作用研究 |
| 3.4 MF59-YW002 增强 HSP65-MUC1 在小鼠体内诱导的细胞免疫反应 |
| 3.5 MF59-YW002 辅助肿瘤细胞裂解物抗 Lewis 肺瘤的体内作用研究 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 MF59 单独应用在抗肿瘤免疫中的不利反应 |
| 4.2 CpG YW002 对 MF59 诱导的免疫特点及抗肿瘤免疫的改变 |
| 4.3 C 型 CpG YW002 较其他 TLRs 激动剂在诱导细胞免疫反应中的优势 |
| 4.4 MF59-YW002/HSP65-MUC1 在 MUC1~+B16 预防和治疗模型中的不同效果 |
| 4.5 MF59-YW002 在 MUC1~+B16 黑色素瘤和 Lewis 肺癌模型中的不同效果 |
| 4.6 总结和展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）重组人白细胞介素-12联合重组表面抗原疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床前安全性和有效性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 CHB的发病机理及免疫治疗 |
| 2 国外的临床研究 |
| 3 主要研究内容 |
| 4 选题意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 治疗性乙型肝炎疫苗的设计 |
| 1 治疗性乙肝疫苗研究概况 |
| 2 以rhIL-12为佐剂设计治疗性乙型肝炎疫苗 |
| 3 剂型 |
| 4 用法用量 |
| 参考文献 |
| 第三章 组人白细胞介素-12与重组表面抗原疫苗联合应用的临床前安全性评价 |
| 第一节 重组人白细胞介素-12与重组乙型肝炎疫苗联合应用单次给予小鼠的毒性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 结论 |
| 第二节 重组人白细胞介素-12单次给予食蟹猴的毒性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三节 重组人白细胞介素-12给予豚鼠的全身主动过敏反应试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四节 重组人白细胞介素-12与重组乙型肝炎疫苗反复给予食蟹猴13周的毒性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 试验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五节 重组人白细胞介素-12与重组乙型肝炎疫苗反复给予食蟹猴的毒代动力学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 重组人白细胞介素-12与重组表面抗原疫苗联合应用的临床前有效性评价 |
| 第一节 体外药效学研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 体内药效学研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 中英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（8）双功能HBx-3p-siRNA逆转HBV免疫耐受及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一.HBV与免疫耐受 |
| 1. HBV的特征 |
| 1.1 HBV感染现状 |
| 1.2 HBV基因组 |
| 1.3 HBV的生活周期和复制 |
| 2. HBV诱导免疫耐受 |
| 2.1 肝脏在抗病毒天然免疫中的地位 |
| 2.2 HBV诱导免疫耐受机制 |
| 3. HBV的治疗 |
| 3.1 IFN-α |
| 3.2 核苷类似物 |
| 3.3 RNAi类分子 |
| 4. 总结与展望 |
| 二、RNAI干扰技术:从基础科学到临床研究 |
| 1. RNAI及基因沉默原理 |
| 1.1 RNAi的发现 |
| 1.2 siRNA的沉默机制 |
| 1.3 siRNA与miRNA |
| 2. RNAI技术的应用 |
| 2.1 高通量研究基因功能 |
| 2.2 研究信号转导通路的新工具 |
| 2.3 siRNA与药物研发 |
| 3. RNAI的非靶效应 |
| 3.1 siRNA非特异性基因沉默作用 |
| 3.2 siRNA的非靶毒副作用 |
| 4. RNAI的免疫激活效应 |
| 4.1 TLR受体 |
| 4.2 非TLR受体 |
| 5. 总结与展望 |
| 三.SIRNA的免疫激活作用与疾病治疗 |
| 1. 控制免疫激活作用 |
| 1.1 选择合适的siRNA序列 |
| 1.2 siRNA化学修饰 |
| 1.3 siRNA脂质载体研究 |
| 1.4 高分子材料和其他siRNA载体 |
| 1.5 病毒载体 |
| 1.6 适配体修饰siRNA |
| 2. 利用SIRNA免疫激活作用 |
| 2.1 RNA类佐剂的研究 |
| 2.2 抗肿瘤研究 |
| 2.3 抗血管生成 |
| 2.4 抗病毒作用 |
| 2.5 对获得性免疫的激活作用 |
| 3. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 3P-HBX-SIRNA激活胞内天然免疫受体RIG-Ⅰ并逆转HBV免疫耐受 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 1. 5'-TRIPHOSPHATE-SIRNA的体外转录以及鉴定 |
| 2. 3P-SIRNA的序列非依赖性免疫激活效应 |
| 2.1 3p-siRNA的序列非依赖性引起免疫激活效应 |
| 2.2 3p-siRNA的序列非依赖性抑制HBV的复制 |
| 3. 化学合成SIRNA的抗HBV和免疫激活效应 |
| 3.1 化学合成siRNA的抗HBV效应 |
| 3.2 化学合成siRNA的免疫激活效应 |
| 4. 3P-HBX-SIRNA的"OFF-TARGET"免疫刺激效应 |
| 4.1 3p-HBx-siRNA对胞内信号通路的活化 |
| 4.2 3p-HBx-siRNA的干扰素效应 |
| 4.3 3p-HBx-siRNA的炎症效应 |
| 5. 双功能3P-HBX-SIRNA优于单纯基因沉默HBX-SIRNA |
| 5.1 双功能3p-HBx-siRNA优于单纯基因沉默HBx-siRNA(mRNA水平) |
| 5.2 双功能3p-HBx-siRNA优于单纯基因沉默HBx-siRNA(蛋白水平) |
| 6. 3P-HBX-SIRNA逆转HBV免疫耐受 |
| 6.1 HBV导致HepG2.2.15处于免疫耐受状态 |
| 6.2 HepG2细胞对3p-siRNA的应答更为敏感 |
| 6.3 双功能3p-HBx-siRNA逆转HBV免疫耐受 |
| 7. 3P-HBX-SIRNA的免疫刺激效应与RIG-Ⅰ介导Ⅰ型干扰素有关 |
| 7.1 过表达RIG-Ⅰ逆转HBV的免疫抑制效应 |
| 7.2 沉默RIG-Ⅰ加重HBV的免疫抑制效应 |
| 7.3 阻断干扰素受体加重HBV的免疫抑制效应 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化学合成的HBX-SIRNA能够通过激活PKR信号通路进一步抑制HBV的复制 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 1. HBX-SIRNAS抑制HBV的表达 |
| 1.1 HBx-siRNAs的沉默效果(mRNA水平) |
| 1.2 HBx-siRNAs抑制HBV的表达(蛋白水平) |
| 1.3 HBx-siRNAs对HBV的抑制效果具有浓度依赖性 |
| 2. HBX-SIRNAS诱导免疫应答反应 |
| 2.1 HBx-siRNAs的干扰素效应 |
| 2.2 HBx-siRNAs的炎症效应 |
| 2.3 HBx-siRNAs对趋化因子影响较弱 |
| 3. HBX-SIRNAS能够诱导PKR以及下游信号通路的活化 |
| 3.1 HBx-siRNAs促进PKR的表达 |
| 3.2 HBx-siRNAs活化PKR信号通路 |
| 4. PKR介导HBX-SIRNAS诱导的免疫应答 |
| 4.1 抑制PKR,HBx-siRNAs诱导的免疫应答减弱 |
| 4.2 过表达PKR,促进HBx-siRNAs诱导的免疫应答 |
| 5. PKR活化对于HBV的影响 |
| 5.1 抑制PKR,HBx-siRNAs诱导的抗病毒效应减弱 |
| 5.2 过表达PKR,HBx-siRNAs诱导的抗病毒效应增强 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 SIRNA体内逆转HBV免疫耐受 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 1. HBV持留续存(免疫耐受)小鼠模型的建立 |
| 1.1 HBV表达质粒的提取以及鉴定 |
| 1.2 HBV持留续存(免疫耐受)小鼠模型的建立及阳性小鼠筛选 |
| 2. 3P-HBX-SIRNA对HBV免疫耐受小鼠肝实质细胞的双功能抗病毒效应 |
| 2.1 HBV免疫耐受鼠肝实质细胞的提取分离 |
| 2.2 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA的抗病毒效应 |
| 2.3 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA的免疫刺激效应 |
| 3. HBX-SIRNA和3P-HBX-SIRNA的体内抗病毒效应 |
| 4. SIRNA在HBV免疫耐受小鼠体内的免疫激活效应 |
| 4.1 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA对血清细胞因子水平的影响 |
| 4.2 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA对肝脾淋巴细胞比例和数量的影响 |
| 4.3 HBx-siRNA和3p-HBx-siRNA对肝脏淋巴细胞活化的影响 |
| 4.4 HBx-siRNA或3p-HBx-siRNA对肝脏淋巴细胞NKG2D表达的影响 |
| 5. 肝损伤的检测 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文章创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 攻读学位期间获奖情况 |
| 攻读学位期间发明专利 |
| 待发表SCI论文1 |
| 待发表SCI论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（10）DNA疫苗载体优化设计和新型佐剂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 DNA疫苗载体优化设计 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一)、实验材料 |
| (二)、实验方法 |
| 二、结果与分析 |
| (一)、目的基因的扩增 |
| (二)、载体的构建及鉴定 |
| (三)、体外Luciferase基因表达分析 |
| (四)、体外抗原基因表达分析 |
| (五)、携带hCMVIE intronA和/或PRE元件的质粒对小鼠免疫应答的影响 |
| 三、讨论 |
| 四、第一部分小结 |
| 第二部分 新型DNA疫苗佐剂的研究 |
| 一、实验材料与方法 |
| (一)、实验材料 |
| (二)、实验方法 |
| 二、结果与分析 |
| (一)、质粒的大量提取及浓度的调节 |
| (二)、动物免疫及检测 |
| 三、讨论 |
| 四、第二部分小结 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究生简历 |
四、筛选能激活HBV特异性T细胞反应的细胞因子佐剂的研究（论文参考文献）
- [1]基于B细胞表面TLR9水平及移行与B细胞活化的关系研究CpG ODN发挥疫苗佐剂作用的机制[D]. 路文婷. 吉林大学, 2021(01)
- [2]poly Ⅰ：C作为佐剂与rHBVvac联用治疗慢性HBV感染的作用与机制研究[D]. 赵华俊. 山东大学, 2019(09)
- [3]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)
- [4]猪Gp96N增强PRRSV合成肽疫苗、亚单位疫苗及PCV2灭活疫苗免疫效应的分析[D]. 贾晓娟. 中国农业大学, 2014(11)
- [5]含有TLR7/8受体激活物的乙肝病毒治疗性疫苗的作用及机制研究[D]. 汪颖. 北京协和医学院, 2013(02)
- [6]CpG ODN-MF59辅佐肿瘤抗原诱导抗小鼠黑色素瘤及肺癌的实验研究[D]. 杨明. 吉林大学, 2012(09)
- [7]重组人白细胞介素-12联合重组表面抗原疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床前安全性和有效性评价[D]. 李平. 南方医科大学, 2012(01)
- [8]双功能HBx-3p-siRNA逆转HBV免疫耐受及其分子机制研究[D]. 韩秋菊. 山东大学, 2011(06)
- [9]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [10]DNA疫苗载体优化设计和新型佐剂的研究[D]. 孙静. 中国协和医科大学, 2009(10)