一、雏鸡感染柔嫩艾美尔球虫后鸡血清蛋白醋膜电泳分析（论文文献综述）
程振扬[1]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价》文中指出鸡球虫病是一种呈全球性分布的寄生性原虫病,其病原有7种,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）的致病性最强,分别引起鸡的急性盲肠球虫病和小肠球虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治措施主要有在饲料或饮水添加药物和接种活虫苗两种方法。长期添加药物已引起耐药、污染环境和危害肉蛋品质等问题。活虫苗虽可产生较强的免疫保护效果,但存在着扩散病原、毒力返强等缺点,且生产成本较高,对免疫后鸡群的饲养管理要求较高。而基因工程疫苗可以解决这些难题。本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白Etgam22和Etgam59基因进行了克隆与原核表达,获得的重组蛋白rEtGAM22和rEtGAM59能被柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染鸡的康复血清识别,可提高免疫鸡的平均增重、降低卵囊产量。在此基础上,本研究利用杆状病毒表达系统对Etgam22基因进行表达,通过动物试验评价其对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力,并与原核表达的重组蛋白进行比较,最后通过动物试验评价rEtGAM22和rEtGAM59联合免疫的保护效果,为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析将优化后的Etgam22基因插入转座载体pFastbac1构建重组质粒,命名为pFastbac1-Etgam22;然后将pFastbacl-Etgam22转化到DH1OBac感受态细胞,构建重组杆状病毒穿梭载体,命名为Bacmid-Etgam22;将Bacmid-Etgam22转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,命名为reBac-Etgam22。重组杆状病毒在Sf9细胞诱导表达,获得真核表达蛋白rEtGAM22-e,其大小约35 kDa。用IFA检测结果显示重组蛋白能被抗原核表达蛋白rEtGAM22-p多克隆抗体识别;Western blot检测结果显示重组蛋白可被鼠抗His单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示真核表达蛋白rEtGAM22-e具有良好的反应原性和交叉反应原性。2.真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析以黄羽鸡为试验动物,主要以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平等为指标,评价杆状病毒表达蛋白rEtGAM22-e对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果,并与原核表达蛋白rEtGAM22-p和rEtGAM59相比较。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:免疫组成活率均为100%,未免疫攻虫组为90%;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e组平均增重稍次于重组蛋白rEtGAM59组,但高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组病变记分高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组和rEtGAM59组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组卵囊减少率高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组;原核表达蛋白rEtGAM59组ACI最高,为158.83;真核表达蛋白rEtGAM22-e组血清抗体水平显着高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组。（2）对毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但ACI值要低。结论:rEtGAM22和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫能产生一定的免疫保护力;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e免疫保护力稍高于原核表达的重组蛋白rEtGAM22-p;重组蛋白rEtGAM59免疫保护效力高于重组蛋白rEtGAM22。3.重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析按上一章方法,评价rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:各试验组存活率均为100%;除rEtGAM22-e单免组外,其余各免疫组的平均增重均显着大于未免疫攻虫组（P<0.05）,且与未免疫未攻虫组相比差异不显着（P>0.05）;联合免疫低剂量组病变记分最低;联合免疫组卵囊减少率相近,分别为46.21%和44.70%,高于单免组;联合免疫组的抗球虫指数分别为153.43和157.65,高于单免组;联合免疫组的血清抗体水平显着高于单免组（P<0.05）。（2）对攻毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但抗球虫指数分别为158.28和160.34。结论:rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫保护效力高于单一重组蛋白免疫,联合免疫剂量100 μg（50+50）的保护效力要好于200 μg（100+100）剂量。
戴玉[2]（2020）在《鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究》文中进行了进一步梳理柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）是分布最广、致病力最强的几种球虫之一,严重危害养禽业,造成重大的经济损失。目前药物防治是控制球虫病的有效手段,但随着抗球虫株的产生及绿色食品概念的形成,抗球虫新型疫苗的研究成为热点。E.tenella SAG13表面抗原蛋白是基于DF-1细胞感染模型,通过分泌蛋白质组分析筛选到的一种上调表达蛋白。为探究EtSAG13是否具有分泌特性,以及是否可以作为候选疫苗抗原蛋白,本研究对EtSAG13基因进行原核表达,以E.tenella子孢子cDNA为模板进行扩增,按照GenBank的基因序列合成引物,将合成的EtSAG13基因序列连接到pET28a（+）载体上,构建了pET28a-SAG13重组质粒,并将pET28a-SAG13重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,利用IPTG诱导EtSAG13目的基因的表达;用SDS-PAGE及免疫印迹法对表达蛋白进行分析和鉴定。将EtSAG13表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,进行亚细胞定位,EtSAG13定位在E.tenella子孢子的表面,同时部分蛋白可以分泌到裂殖子细胞外,具有分泌特性。本研究将pET28a-EtSAG13亚单位疫苗组作为试验组,通过鸡球虫攻毒试验,对EtSAG13蛋白重组亚单位疫苗免疫效果进行了评价。将90只个体差异不大的雏鸡随机分成1组（EtSAG13免疫感染球虫组）、2组（不免疫不感染球虫组）、3（不免疫感染球虫组）,每组30只鸡,以比较pET28a-EtSAG13亚单位疫苗的免疫效果。7日龄时,用完全弗氏佐剂充分乳化后的蛋白对1组进行颈部皮下多点注射,免疫剂量为100μg/只,另外两组注射等量PBS;待14日龄时,用不完全弗氏佐剂等比例乳化EtSAG13蛋白进行第二次加强免疫,免疫方法同7日龄;21日龄时,对1、3组接种2万个新鲜的具有感染活性的E.tenella孢子化卵囊。免疫结果表明:pET28a-EtSAG13亚单位疫苗免疫后,鸡体的CD3+CD4+和CD3+CD8+比例显着升高,表明该免疫能诱导显着性的细胞免疫反应和体液免疫反应;在盲肠病变计分（LS）方面,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组（1组）的雏鸡盲肠病变计分显着低于不免疫攻虫组（3组）（p<0.05）;试验组鸡与不免疫攻虫的对照组相比增重明显,且卵囊排出量显着下降,肠道损伤明显减轻;在血清抗体检测中,EtSAG13重组蛋白免疫攻虫组（1组）的雏鸡IgG水平显着高于空白对照组和不免疫攻虫组。试验结果表明,EtSAG13蛋白定位在子孢子表面,并能够分泌到细胞外,具有分泌特性;EtSAG13蛋白亚单位疫苗能够对E.tenella感染提供一定的免疫保护力。本研究鉴定了EtSAG13蛋白的分泌特性和免疫原性,为下一步研究EtSAG13蛋白在入侵过程中的具体分子功能和研制新型鸡球虫疫苗提供基础。
赵宁宁[3]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
高洋[4]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫体外入侵宿主细胞分泌蛋白质组学分析及入侵相关蛋白质的筛选鉴定》文中认为鸡球虫病是由多种艾美尔球虫引起的具有严重危害的寄生虫病,其中以柔嫩艾美尔球虫（Eimeria tenella）致病力最强,每年给养鸡业造成巨大经济损失。对球虫进行防控,最有效的方法是阻断其入侵,所以筛选鉴定球虫入侵关键蛋白质是阐明球虫致病机理从而进行有效防控的首要任务。球虫入侵过程复杂,许多蛋白质如棒状体蛋白、微线蛋白和表面抗原蛋白等已被证明与球虫入侵相关。有研究表明分泌蛋白在球虫入侵过程中可能发挥重要作用,对入侵相关分泌蛋白进行研究将有助于筛选鉴定球虫入侵关键蛋白质,加深对球虫入侵机理和球虫-宿主之间互作机制的了解,并为制备更有效的抗球虫药物或疫苗提供更多重要参考数据。本研究通过TMT标记定量蛋白质组学技术对E.tenella体外入侵DF1细胞的相关分泌蛋白进行了系统筛选鉴定,并对2个E.tenella入侵相关蛋白质SAG14和EF1α进行了功能初步分析。本研究主要分为以下四个部分:1.柔嫩艾美尔球虫体外入侵DF1细胞分泌蛋白质组学分析为对球虫入侵机理及球虫-宿主细胞之间互作机制进行深入研究,筛选鉴定入侵相关蛋白质成为研究重点。本研究以未感染细胞的子孢子分泌蛋白为对照,通过TMT标记子孢子入侵DF1细胞0.5 h、1 h和2 h三个时间点的分泌蛋白进行定量蛋白质组学分析。结果显示,共定量到208个有效蛋白,其中153个差异蛋白,包括82个上调蛋白和71个下调蛋白。对差异蛋白进行统计分析,结果显示鉴定到15个共同表达上调蛋白和9个共同表达下调蛋白。对差异蛋白进行GO二级注释和亚细胞结构定位分类分析,结果显示,差异蛋白主要集中在细胞过程和代谢过程等生物进程,主要参与细胞、细胞器和大分子复合物等细胞组成,在入侵过程中主要发挥催化活性、粘附连接、结构分子活性、抗氧化活性和运输活动等分子功能,并且主要定位在细胞外和细胞质等部位。2.qPCR与Western blot验证组学结果本研究通过qPCR与Western blot两种方法相结合的方式验证了组学结果的可靠性。首先挑选12个差异蛋白设计qPCR引物进行验证,结果显示12个差异蛋白中有10个蛋白在mRNA转录水平与蛋白表达水平具有一致性,符合率为83.33%,初步验证了组学结果的可靠性。之后选取组学结果中表面抗原14（SAG14）、延伸因子1α（EF1α）和丝氨酸蛋白酶抑制剂（SERPIN1）作为Western blot验证蛋白,主要进行了基因克隆、蛋白表达与纯化、多克隆抗体制备。以ACTIN抗体作为内参抗体进行Western blot验证,结果显示SAG14、EF1α和SERPIN1为分泌蛋白,符合率为100%,进一步验证了组学结果的可靠性。3.入侵相关蛋白SAG14功能初步探究有研究表明表面抗原蛋白在球虫入侵过程中可能具有重要作用,本研究选取组学结果中的SAG14分泌蛋白进行功能初步探究,包括生物信息学分析、子孢子定位、细胞粘附作用、体外入侵阻断作用和动物免疫保护力评价。生物信息学分析结果显示,SAG14具有信号肽和跨膜区;子孢子定位结果显示SAG14定位在子孢子表面;将SGA14展示在酵母表面对细胞进行粘附,结果显示表面展示有SAG14的酵母菌与对照组（16.22%±2.84%）相比对细胞有更加显着的粘附作用,粘附率为41.89%±2.38%;体外入侵阻断试验结果表明SAG14抗体可显着降低入侵细胞的子孢子数量,最高抑制入侵率为48.40%±3.98%。通过动物试验对SAG14免疫保护力进行评价,结果显示雏鸡在免疫SAG14重组蛋白后,可显着降低因感染E.tenella造成的雏鸡体重减轻情况,减轻雏鸡盲肠病变并减少卵囊排出量,经计算SAG14抗球虫指数为142.20,抗球虫效果为中等有效,ELISA分析结果显示雏鸡感染E.tenella可刺激雏鸡产生高滴度SGA14抗体抵抗球虫入侵,显示SAG14对雏鸡具有部分免疫保护效果。4.入侵相关蛋白EF1α功能初步探究选取组学结果中EF1α分泌蛋白进行功能初步探究,包括生物信息学分析、子孢子定位、细胞粘附作用、体外入侵阻断作用和动物免疫保护力评价。生物信息学分析结果显示,EF1α有临时延伸因子1α功能的PTZ00141保守结构域;子孢子定位表明EF1α可定位在子孢子表面;将EF1α展示在酵母表面对细胞进行粘附,结果显示表面展示有EF1α的酵母菌与对照组（16.22%±2.84%）相比对细胞粘附效果更加显着,粘附率为35.00%±4.32%;体外入侵阻断试验结果显示EF1α抗体可显着降低入侵细胞的子孢子数量,最高抑制入侵率为42.07%±4.46%。通过动物试验对EF1α的免疫保护力进行评价,雏鸡免疫EF1α重组蛋白后,结果表明可显着降低因感染E.tenella造成的雏鸡体重减轻情况,减轻感染雏鸡盲肠病变同时降低卵囊排出量,经计算EF1α抗球虫指数为165.53,抗球虫效果为良好,ELISA分析结果显示雏鸡感染E.tenella可诱导雏鸡产生高滴度EF1α抗体抵抗球虫入侵,显示EF1α对雏鸡具有部分免疫保护效果。本研究通过TMT标记定量蛋白质组学技术对E.tenella体外入侵DF1细胞的分泌蛋白进行了系统性分析,共筛选鉴定到153个差异显着蛋白,包括82个上调蛋白和71个下调蛋白。验证SGA14、EF1α和SERPIN1为分泌蛋白,对分泌蛋白SGA14和EF1α进行功能初步探究发现其均与子孢子粘附与入侵相关,并对雏鸡具有部分免疫保护力。
王晓慧[5]（2020）在《白介素8基因多态性及与京海黄鸡球虫病抗性指标的相关分析》文中认为本研究采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测白介素-8（Interleukin-8,IL-8）基因在京海黄鸡感染（感染Ⅰ组每只鸡灌饲7500个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,感染Ⅱ组每只鸡灌饲1.5万个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊）和未感染（对照组每只鸡灌饲生理盐水）情况下的表达情况,并对感染不同天数和不同剂量下的京海黄鸡血浆中抗性指标进行检测。利用DNA测序技术,检测京海黄鸡IL-8基因上游-2000 bp 至下游 1000 bp 的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）,对5’端调控区的SNPs进行生物信息学分析,并将所有SNPs与球虫抗性指标进行关联分析。结果如下:1、IL-8基因在感染第7 d时,在各个组织中均有表达,且在大部分组织中感染组的表达量均高于对照组。其中感染Ⅱ组的IL-8基因在肝脏中表达量显着高于其他两组（P<0.05）,在脾脏和盲肠中表达量极显着高于其他两组（P<0.01）,在法氏囊和胸腺中表达量显着高于对照组（P<0.05）。2、比较感染不同天数和不同剂量对京海黄鸡血液生化指标和抗氧化指标的影响结果发现:在感染第3d时不同试验组的碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）和葡萄糖（Glucose,GLU）指标之间有显着性差异（P<0.05）,感染第7 d时不同试验组的ALP、总蛋白（Total protein,TP）、球蛋白（Globulin,GLOB）、肌酐（Creatinine,CRE）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、钙（Calcium,Ca）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、一氧化氮（Nitric oxide,NO）、IL-2、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）与 IL-8指标之间有显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）差异。3、测序结果与GenBank上序列进行比较后,共发现了 42个SNPs,新发现的突变位点有4个。其中位于5’端调控区的SNPs有14个,包括1个新发现的SNP;位于第1内含子的SNPs有7个,包括1个新发现的SNP;位于第2、3内含子的SNPs共有12个;位于3’端非编码区（Untranslated region,UTR）的SNPs有9个,包括2个新发现的SNPs。4、将IL-8基因全序列检测到的SNPs与球虫抗性指标关联分析后发现共有15个SNPs与抗性指标有关联,这些位点有5个位于5’端调控区,有6个位于内含子区,有4个位于3’端非编码区,这些突变可能对球虫抗性指标有一定的调控作用。5、对这15个SNPs进行单倍型分析,并与抗性指标关联,结果表明:5’端的 H1H3 单倍型组合的 SOD、CAT、白介素-1β（Interleukin-1-β,IL-1β）、IL-6、IL-8和γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）指标均高于其他三种单倍型组合,CAT和IL-6指标分别极显着（P<0.01）与显着（P<0.05）的高于H3H3单倍型组合,丙二醛（Malondialdehyde,MDA）指标显着低于H3H3单倍型组合（P<0.05）,IL-8指标极显着高于H1H1单倍型组合（P<0.01）,表明了 H1H3单倍型组合为优势单倍型组合。内含子的H6H7单倍型组合的SOD、谷胱甘肽过氧化物（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、CAT、IL-8 和 IFN-γ 指标均高于其他三种单倍型组合,H5H7和H6H7单倍型组合的GSH-Px与IL-8指标均显着高于H5H5单倍型组合（P<0.05）;H6H7单倍型组合的CAT指标显着高于H5H5单倍型组合（P<0.05）,表明了 H6H7单倍型组合为优势单倍型组合。3’端的H9H11单倍型组合的SOD、GSH-Px、NO、IL-2、IL-6和IL-8指标均高于其他三种单倍型组合,H9H11单倍型组合的SOD与IL-2指标显着高于H9H9单倍型组合（P<0.05）,NO指标显着高于H9H10单倍型组合（P<0.05）,表明H9H11单倍型组合为优势单倍型组合。
华恩玉[6]（2020）在《堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是一种严重危害养鸡业的寄生原虫病,据不完全统计每年球虫病给家禽养殖业造成的经济损失超过30亿美元。长期以来,鸡球虫病的防控主要依赖药物。但随着球虫耐药性的不断增强以及药物残留危害食品安全,鸡球虫病的防控措施由药物防治转向疫苗免疫预防。目前,用于临床的鸡球虫病疫苗主要是活虫苗,亚单位疫苗仅见有一种,即由分离于巨型艾美耳球虫（Eimeriamaxima）配子体的3种蛋白研制而成。堆型艾美耳球虫（E.acervulina）是养鸡场流行最广泛的鸡球虫之一,可引起鸡的亚临床球虫病,影响鸡的生长发育,降低饲料利用率。迄今,国内外对堆型艾美耳球虫配子体蛋白及其基因少有报道,其重组蛋白的免疫保护力也尚无见有报道。为此,本文对堆型艾美耳球虫配子体蛋白56基因（Eagam56）与82基因（Eagam82）进行了克隆和序列分析,分别构建了 2个基因的原核表达质粒,诱导表达后鉴定了重组蛋白的免疫原性,并经动物免疫保护试验评价了重组蛋白对堆型艾美耳球虫的免疫保护力,研究结果将为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.堆型艾美耳球虫Eagam56基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam56基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后进行诱导表达,表达产物分别进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam56基因全长为1323 bp,具有一个大小为1323 bp的完整开放阅读框,编码440个氨基酸;与Genbank上的Eagam56基因序列对比,其同源性为99.9%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam56基因含有10个抗原决定簇,其中3个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约49 kDa,以可溶蛋白形式居多,可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM56具有良好的免疫原性和交叉抗原性。2.堆型艾美耳球虫Eagam82基因的克隆表达与免疫原性分析提取堆型艾美耳球虫（扬州株）卵囊的基因组DNA,PCR扩增Eagam82基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体;经测序、密码子优化后连接至pET-28a（+）质粒,构建pET-28a（+）-Eagam82表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后,对表达产物进行SDS-PAGE分析、Western-blot鉴定以及免疫原性分析。结果显示,克隆的Eagam82基因全长为1704bp,具有一个大小为1704bp的完整开放阅读框,编码568个氨基酸;与Genbank上的Eagam8基因序列对比,其同源性为99.4%;用在线软件对该基因编码区抗原性进行预测,发现Eagam82基因含有15个抗原决定簇,其中2个位于酪氨酸、脯氨酸富集区;重组蛋白大小约82 kDa,以可溶蛋白形式为多;可被HIS单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示重组蛋白EaGAM82具有良好免疫原性和交叉抗原性。3.重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力以黄羽肉鸡为试验动物,以鸡的增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分、抗球虫指数（ACI）以及血清抗体水平等为评价指标,评价重组蛋白rEaGAM56、rEaGAM82以及2种重组蛋白联合应用的免疫保护效果。结果显示,rEaGAM56与rEaGAM82高（200 μg/鸡）、中（100 μg/鸡）剂量免疫组以及联合免疫组,鸡临床症状减轻。随着免疫剂量的增加,鸡的相对增重率与卵囊减少率增加,平均肠道病变记分减少。联合免疫高剂量组（各100 μg/鸡重组蛋白）的相对增重率与卵囊减少率达73.74%和74.27%。rEaGAM56、rEaGAM82、联合免疫高剂量组的 ACI 分别为 148.24、143.92 和 148.74。rEaGAM56的免疫保护力较rEaGAM82的强,rEaGAM56和rEaGAM82免疫鸡后均能产生血清抗体。结论:两种重组蛋白免疫均能产生一定的免疫保护力。
余水兰[7]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中认为鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
陈欢[8]（2020）在《鸡球虫重组双价疫苗的制备及其效果评价》文中研究指明田间鸡球虫感染多为混合感染,为了更好防控鸡巨型和柔嫩艾美球虫的混合感染,本试验制备了巨型和柔嫩艾美鸡球虫共同抗原IMP1C与免疫佐剂EDA结合的双价亚单位疫苗,并对其产生的免疫效果进行评价。方法:将巨型艾美尔球虫和柔嫩艾美尔球虫的共同抗原IMP1C分别与EDA分子佐剂结合,构建p ET28a-EDA-Et IMP1C、p ET28a-EDA-Em IMP1C、p ET28a-Em IMP1C-EDA-Et IMP1C及p ET28a-EDA四种重组质粒并进行原核表达。将表达后的蛋白按150μg/只的剂量对试验鸡（12只/组）进行三次肌肉注射,并分次采取免疫后一周的血清进行IL-12、IL-2、IFN-γ、Ig G等细胞因子的检测,采取三免的全血进行CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群检测。在三次免疫后,对试验鸡分组饲喂2×104个柔嫩艾美尔球虫及巨型艾美尓球虫孢子化卵囊,攻毒后第5天剖解观察病变并制作病理切片,收集攻毒后5～10天的粪便采用麦克马斯特计数法对球虫卵囊计数,观察并记录死亡数量,称量攻毒前后体重。结果:（1）成功构建原核表达载体并表达出相应蛋白,蛋白经Ni2+柱层析法及尿素透析法纯化,p ET28a-EDA-Et IMP1C及p ET28a-EDA-Em IMP1C蛋白大小为38k Da,p ET28a-Em IMP1C-EDA-Et IMP1C蛋白大小为63.8k Da,p ET28a-EDA蛋白大小为10.8k Da。（2）在细胞免疫方面,Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组血清中IL-2、IFN-γ的含量均高于EDA-Et IMP1C组和EDA-Em IMP1C组,全血中CD4+T淋巴细胞数量最高的为Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组,蛋白免疫组CD8+T淋巴细胞差异不明显（P>0.05）,但均明显高于EDA佐剂组及PBS空白组（P<0.05）;血清中IL-12浓度最高的为Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组,其次为EDA-Et IMP1C组和EDA-Em IMP1C组,但均明显高于EDA佐剂组及PBS空白组（P<0.05）。（3）在体液免疫方面,Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组Ig G抗体经1:1600的比例稀释,浓度仍高于EDA-Et IMP1C组和EDA-Em IMP1C组。（4）Em IMP1C-EDA-Et IMP1C组试验鸡体增重明显,抗柔嫩艾美尔球虫组增重率为82.11%,抗巨型艾美尔球虫组增重率为85.86%;空盲肠道病变程度轻,抗柔嫩艾美尔球虫组肠道病变计分为1.19,抗巨型艾美尔球虫组肠道病变计分为0.89;卵囊排出量少,抗柔嫩艾美尔球虫组球虫卵囊排出减少率为84.01%,抗巨型艾美尔球虫组球虫卵囊排出减少率为79.12%;抗柔嫩艾美尔球虫指数为176,抗巨型艾美尔球虫指数为183。结果表明:抗巨型及柔嫩艾美尔球虫双价疫苗组能够成功激活体液及细胞免疫,并产生交叉免疫保护,抵抗巨型及柔嫩艾美尔球虫感染的效果较单价疫苗组更佳。
于林增[9]（2019）在《抗柔嫩艾美耳球虫天然化合物及中药复方制剂的筛选》文中认为鸡球虫病由寄生在鸡肠上皮细胞内的艾美耳属多种球虫引发,该病发生率高,分布范围广,危害严重,给养鸡业造成严重的经济损失。长期以来,化学药物作为控制鸡球虫病的主流策略,使用化学药物防治鸡球虫病极易导致球虫产生耐药性,及鸡体抗球虫药物残留,从而影响人类健康。在饲料中添加各种抗球虫药虽然可以预防并控制球虫病,但往往诱发球虫的抗药性和药物残留等问题,是化学药物使用面临的挑战之一。中草药制剂的使用是防控鸡球虫病的有效策略之一,具有不易产生耐药性,毒副作用小等优点,具有较好的应用前景。本文通过体外传代细胞筛选法,确定有效天然化合物单体,并选择对应的有效中药组成方剂进行动物实验验证。首先,我们从华南部分地区主要为广东的部分地区不同规模的养鸡场采集粪便（垫料）样品,收集不同地理来源的球虫虫株,进行抗球虫药的耐药性调查,由于采样的特殊性,采样的鸡场均为发病鸡场。有针对性的采样,导致阳性率偏高。除广东揭阳和广东云浮两地,分离株中检测鸡球虫其他地区阳性率均为100%。全部都为混合感染,其中艾美耳球虫感染率67%,堆型艾美耳球虫感染率65%,这两类在感染中占绝对优势,属于优势虫种。根据卵囊强度统计,感染强度在“++++”的样品的所占比例42%,强度在“+++”的样品所占比例21%,感染强度在“++”的样品占21%,感染强度在“+”的样品占17%,卵囊强度偏高。根据所测11种目前应用较多抗球虫药物耐药性分析,耐药程度严重,同一株虫株,对多种药物同时耐药。球虫虫株对药物耐药性严重,通过结果可知拉沙洛西钠药物耐药性情况较轻,鸡球虫对其相对敏感。同时利用柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养体系筛选单体化合物,获得在细胞上抗球虫生长效果较好的青蒿素、肉桂醛和常山酮。其中检测样品中,青蒿素和常山酮IC50值分别为7±0.6μM和2±0.3μM,敏感性较好。将其对应的中药成分,购买相应的中药,并根据鸡球虫病的特点和药典配伍禁忌,依据中药的有效成分和精简高效的原则组成三个中药方剂,通过观察治疗球虫病的临床效果,进行抗球虫方剂的筛选试验。通过中药复方抗球虫效果试验的动物实验,可筛选出方剂1（肉桂20、大黄10、青蒿20、仙鹤草18、伏龙肝20、陈皮18）和方剂3（白头翁1、仙鹤草1、青蒿1）效果优秀,方剂2（仙鹤草100、何首乌100,白头翁60、青蒿60、肉桂52）效果相对较差,并且在每只鸡每天1 g用量的时候效果最好,且在攻虫的当天给药效果相对更好,对抗柔嫩艾美耳球虫有一个较好的效果。方剂1和方剂3的ACI值分别为165.13和173.90,与药物对照组磺胺氯吡嗪钠的ACI值169.01相比,效果相当。以ELISA检测试剂盒测定各阶段鸡血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12水平变化来看,攻虫对照组在中整个实验过程中并无明显变化,中药方剂以及药物对照组血清中的细胞因子也基本保持稳定,说明试验中药物对鸡血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-12水平没有影响。从临床病理组织切片来看,在攻虫的当天给药,抗球虫效果较好;攻虫前两天给药的鸡肠道会有轻微的炎性反应,分析原因可能是方剂的泻下作用会对鸡体肠道造成轻微损伤。结合体内外试验结果,对中药配方及使用剂量进行优化,进一步分析其抗球虫效果,为今后鸡球虫病的有效防控提供理论依据。
郭宸旭[10]（2019）在《植物提取物抗球虫效果及对鸡免疫指标的影响》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是一种由鸡球虫引起的寄生性原虫病,是鸡群的主要易感疾病之一,在鸡球虫病的药物防控方面临床上仍以抗生素和化学合成药为主,但面临着球虫严重耐药性和抗寄生虫药物残留的问题。研究表明,植物提取物同样具有和化学药物类似的抗病害和提高生长性能的作用。由于植物提取物绿色天然,不易产生耐药性和药物残留,这些特性可能使其成为未来无抗养殖的重要角色。本研究分别对北京爱绿生物科技有限公司生产的两种复合植物提取物爱绿爽1和爱绿爽5在鸡人工感染毒害艾美耳球虫下,和爱绿爽5在鸡人工感染柔嫩艾美耳球虫下进行抗球虫效果测试及多项免疫指标分析。毒害艾美耳球虫人工感染的实验鸡在笼养条件下进行,在抗球虫方面,结果显示爱绿爽5组的平均卵囊减少率为3.72%,抗球虫指数为147.340,为低效抗球虫药;爱绿爽1组的抗球虫指数为136.825,为低效抗球虫药。在免疫学和肠粘膜组织学指标方面,与阳性组对比,爱绿爽5和爱绿爽1在鸡感染毒害艾美耳球时,鸡的血清IgG浓度、血清IL-2浓度、血清IFN-γ浓度、肠粘膜sIgA浓度、十二指肠粘膜SGLT1mRNA相对表达量、空肠粘膜SGLT1mRNA相对表达量均显着降低;T淋巴细胞转化率、B淋巴细胞转化率、CD4+和CD8+T细胞阳性率显着增高;在毒害艾美耳球虫的攻击下,爱绿爽5和爱绿爽1对各项指标降低或增高作用虽略微不及甲基盐霉素,但与阳性组相比,差异显着,各指标均明显趋向于阴性组,且其中爱绿爽5效果优于爱绿爽1。柔嫩艾美耳球虫人工感染的实验鸡在地面平养条件下进行,在抗球虫方面,柔嫩艾美耳球虫攻击下,爱绿爽5组平均卵囊减少率为6.56%,抗球虫指数为141.204,为低效抗球虫药。爱绿爽5在鸡感染柔嫩艾美耳球时,在免疫学和肠粘膜组织学指标方面,与阳性组对比,爱绿爽5对鸡的血清IgG浓度、血清IL-2浓度、血清IFN-γ浓度、肠粘膜sIgA浓度、十二指肠粘膜SGLT1mRNA相对表达量、空肠粘膜SGLT1mRNA相对表达量具有显着降低作用;对T淋巴细胞转化率、B淋巴细胞转化率、CD4+和CD8+T细胞阳性率具有显着增高作用。在柔嫩艾美耳球的攻击下,爱绿爽5作用虽略微不及化学药物组,但爱绿爽5组上述各指标均与阳性组具有显着差异。
二、雏鸡感染柔嫩艾美尔球虫后鸡血清蛋白醋膜电泳分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、雏鸡感染柔嫩艾美尔球虫后鸡血清蛋白醋膜电泳分析（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫免疫机理 |
| 2 鸡球虫病疫苗类型 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.2 鸡球虫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫分子生物学研究进展 |
| 1.2.2 鸡球虫分泌蛋白研究概况 |
| 1.2.2.1 微线蛋白 |
| 1.2.2.2 蛋白激酶 |
| 1.2.2.3 棒状体蛋白 |
| 1.3 鸡球虫病防治概况 |
| 1.3.1 药物防治 |
| 1.3.2 疫苗研究进展 |
| 1.3.2.1 鸡球虫免疫机制 |
| 1.3.2.2 传统疫苗和商品化疫苗 |
| 1.3.2.3 新型疫苗研究进展 |
| 1.3.3 鸡球虫免疫应答的研究进展 |
| 1.4 EtSAGs家族蛋白 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验菌株和载体 |
| 2.1.2 试验动物与虫株 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 鸡球虫复壮与传代 |
| 2.2.3 鸡球虫的收集与孢子化卵囊的收集 |
| 2.2.4 EtSAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 2.2.4.1 EtSAG13 基因克隆与转化 |
| 2.2.4.2 EtSAG13 基因片段PCR产物的回收 |
| 2.2.4.3 EtSAG13 目的基因片段和载体双酶切和胶回收 |
| 2.2.4.4 目的基因酶切产物与pET-28a(+)载体的连接 |
| 2.2.4.5 重组质粒转化入Top10 感受态细胞 |
| 2.2.4.6 重组质粒的菌液PCR鉴定 |
| 2.2.4.7 重组质粒DNA的提取与鉴定 |
| 2.2.4.8 阳性克隆质粒测序鉴定 |
| 2.2.5 EtSAG13 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.5.1 EtSAG13 重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.5.2 EtSAG13 重组蛋白SDS-PAGE和 Western blot检测 |
| 2.2.5.3 重组EtSAG13 蛋白纯化 |
| 2.2.6 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定 |
| 2.2.6.1 EtSAG13 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.6.2 EtSAG13 的亚细胞定位分泌蛋白鉴定 |
| 2.2.7 SAG13 蛋白免疫保护效果评价 |
| 2.2.7.1 动物试验设计与免疫程序 |
| 2.2.7.2 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果评价 |
| 2.2.7.2.1 存活率 |
| 2.2.7.2.2 增重效果 |
| 2.2.7.2.3 卵囊排出量 |
| 2.2.7.2.4 盲肠病变计分 |
| 2.2.7.2.5 抗球虫指数(ACI)评价 |
| 2.2.7.2.6 血清和粘膜抗体检测 |
| 2.2.7.2.7 细胞免疫水平的检测 |
| 2.2.7.2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SAG13 基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 3.2 EtSAG13 重组克隆载体的测序结果 |
| 3.3 EtSAG13 多克隆抗体的制备及鉴定结果 |
| 3.3.1 SDS-PAGE与 Western Blot验证EtSAG13 蛋白的原核表达 |
| 3.3.2 EtSAG13 原核重组蛋白的大量诱导及纯化 |
| 3.3.3 鼠源多克隆抗体的制备及分泌蛋白鉴定结果 |
| 3.3.4 E.tenella虫体EtSAG13 蛋白间接免疫荧光定位结果 |
| 3.4 EtSAG13 亚单位疫苗免疫保护效果的评价 |
| 3.4.1 体重增长情况 |
| 3.4.2 盲肠病变计分 |
| 3.4.3 卵囊排出量 |
| 3.4.4 抗球虫指数(ACI)结果 |
| 3.4.5 血清抗体水平检测结果 |
| 3.4.6 粘膜抗体水平检测结果 |
| 3.4.7 CD4~+、CD8~+T 淋巴细胞亚群检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EtSAG13 重组蛋白分泌蛋白鉴定 |
| 4.2 原核表达EtSAG13 蛋白的意义及其免疫保护效果 |
| 4.3 血液抗体和粘膜抗体以及T淋巴细胞在抗球虫感染免疫保护中的作用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（3）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（4）鸡柔嫩艾美尔球虫体外入侵宿主细胞分泌蛋白质组学分析及入侵相关蛋白质的筛选鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 鸡球虫病病原 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病防控现状 |
| 1.1.4 鸡球虫入侵机理研究进展 |
| 1.2 蛋白质组学技术及其在球虫研究中的应用 |
| 1.2.1 蛋白质组学技术 |
| 1.2.2 iTRAQ/TMT蛋白质组学技术 |
| 1.2.3 蛋白质组学技术在球虫研究中的应用 |
| 1.3 分泌蛋白及其在寄生虫中的研究进展 |
| 1.3.1 分泌蛋白概述 |
| 1.3.2 寄生虫分泌蛋白与入侵、寄生及致病的关系 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 虫株、细胞、试验质粒及菌株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制方法 |
| 2.2.2 试验设计 |
| 2.2.3 柔嫩艾美尔球虫子孢子的获得与纯化 |
| 2.2.4 柔嫩艾美尔球虫子孢子分泌蛋白的收集 |
| 2.2.5 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2.2.6 生物信息学分析方法 |
| 2.2.7 柔嫩艾美尔球虫子孢子全蛋白的提取及浓度测定 |
| 2.2.8 柔嫩艾美尔球虫子孢子总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 2.2.9 引物设计 |
| 2.2.10 荧光定量PCR验证 |
| 2.2.11 基因克隆 |
| 2.2.12 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.13 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.14 Western blot验证分泌蛋白 |
| 2.2.15 子孢子定位试验 |
| 2.2.16 细胞粘附试验 |
| 2.2.17 体外抗体阻断试验 |
| 2.2.18 动物免疫保护性试验 |
| 2.2.19 数据统计分析方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 柔嫩艾美尔球虫体外入侵DF1 细胞分泌蛋白质组学分析 |
| 3.1.1 分泌蛋白样品的收集及质量鉴定 |
| 3.1.2 分泌蛋白质组学鉴定结果 |
| 3.1.3 GO二级注释分析 |
| 3.1.4 亚细胞结构定位分类 |
| 3.2 分泌蛋白质组学结果验证分析 |
| 3.2.1 qPCR验证蛋白质组学结果 |
| 3.2.2 Western blot验证蛋白质组学结果 |
| 3.3 SAG14 蛋白功能初步分析 |
| 3.3.1 生物信息学分析 |
| 3.3.2 子孢子定位 |
| 3.3.3 细胞粘附作用分析 |
| 3.3.4 体外抗体阻断入侵作用分析 |
| 3.3.5 动物免疫保护效果评价 |
| 3.4 EF1Α蛋白功能的初步分析 |
| 3.4.1 生物信息学分析 |
| 3.4.2 子孢子定位 |
| 3.4.3 细胞粘附作用分析 |
| 3.4.4 体外抗体阻断入侵作用分析 |
| 3.4.5 动物免疫保护效果评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柔嫩艾美尔球虫分泌蛋白质组学研究的意义 |
| 4.2 柔嫩艾美尔球虫分泌蛋白在球虫入侵过程中的作用 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫SAG14 为球虫抗原候选蛋白 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫EF1Α为球虫抗原候选蛋白 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）白介素8基因多态性及与京海黄鸡球虫病抗性指标的相关分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病的致病机理 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治措施及局限性 |
| 1.1.2.1 管理控制 |
| 1.1.2.2 药物防治 |
| 1.1.2.3 疫苗预防 |
| 1.1.3 鸡球虫病抗病育种的必要性和可行性 |
| 1.2 白介素8研究进展 |
| 1.2.1 IL-8的生物学功能研究 |
| 1.2.2 IL-8与鸡球虫病抗性的研究 |
| 1.2.3 IL-2和15生物学功能研究 |
| 1.3 球虫病抗性相关的评价指标 |
| 1.3.1 抗氧化指标 |
| 1.3.1.1 抗氧化系统酶 |
| 1.3.1.2 白细胞介素 |
| 1.3.1.3 NO与IFN-γ指标 |
| 1.3.2 生化指标 |
| 1.3.2.1 血清酶指标 |
| 1.3.2.2 蛋白质指标 |
| 1.3.2.3 血糖及血清离子等其他指标 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第2章 柔嫩艾美耳球虫感染对京海黄鸡不同组织中IL-8,IL-2和IL-15基因表达量的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 组织样本采集 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 总RNA的提取和检测(Trizol法) |
| 2.1.5.1 总RNA的提取 |
| 2.1.5.2 总RNA的检测 |
| 2.1.6 cDNA的合成 |
| 2.1.7 荧光定量引物设计 |
| 2.1.8 荧光定量PCR |
| 2.1.9 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 RNA提取结果 |
| 2.2.2 目的基因溶解曲线 |
| 2.2.3 基因在各个组织中的表达 |
| 2.2.3.1 IL-8基因在各个组织中的表达情况 |
| 2.2.3.2 IL-2基因在各个组织中的表达情况 |
| 2.2.3.3 IL-15基因在各个组织中的表达情况 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 不同柔嫩艾美耳球虫感染剂量对京海黄鸡抗性指标的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 样本采集 |
| 3.1.3 抗性指标的测定 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 E.tenella不同感染剂量对京海黄鸡抗性指标的影响 |
| 3.2.1.1 E.tenella不同感染剂量对京海黄鸡生化指标的影响 |
| 3.2.1.2 E.tenella不同感染剂量对京海黄鸡抗氧化指标的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 E.tenella感染对京海黄鸡生化指标的影响 |
| 3.3.1.1 对酶的影响 |
| 3.3.1.2 对蛋白质的影响 |
| 3.3.1.3 对CRE、UA、GLU与TG含量的影响 |
| 3.3.1.4 对离子的影响 |
| 3.3.2 E.tenella感染对京海黄鸡生化指标的影响 |
| 3.3.2.1 对抗氧化系统酶的影响 |
| 3.3.2.2 对白细胞介素的影响 |
| 3.3.2.3 对NO、IFN-γ的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 IL-8基因单核苷酸突变及启动子区多态性的生物信息学分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物及病原 |
| 4.1.2 血样采集 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.1.4 DNA提取主要试剂及步骤 |
| 4.1.5 引物设计 |
| 4.1.6 PCR扩增 |
| 4.1.7 基因测序 |
| 4.1.8 序列比对 |
| 4.1.9 群体遗传多样性分析 |
| 4.1.10 转录因子预测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 基因组DNA的提取效果检测 |
| 4.2.2 IL-8基因测序结果 |
| 4.2.3 IL-8基因SNPs多态性数据分析 |
| 4.2.4 IL-8基因5'端调控区SNPs突变引起的转录因子改变预测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 IL-8基因的多态性与群体遗传多样性分析 |
| 4.3.2 IL-8基因5端调控区多态性 |
| 4.3.3 IL-8基因外显子与内含子多态性 |
| 4.3.4 IL-8基因3'端非编码区多态性 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 京海黄鸡IL-8基因多态性与球虫抗性指标的关联分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物及病原 |
| 5.1.2 主要仪器设备与型号 |
| 5.1.3 鸡球虫抗性指标的测定 |
| 5.1.4 连锁不平衡和单倍型分析 |
| 5.2 数据统计与分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 IL-8基因全序列单核苷酸突变与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.1 突变位点6各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.2 突变位点7各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.3 突变位点9各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.4 突变位点11各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.5 突变位点13各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.6 突变位点15各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.7 突变位点17各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.8 突变位点18各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.9 突变位点26各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.10 突变位点28各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.11 突变位点29各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.12 突变位点36各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.13 突变位点38各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.14 突变位点39各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.1.15 突变位点40各基因型与球虫抗性指标关联分析 |
| 5.3.2 IL-8基因各突变位点的连锁不平衡分析 |
| 5.3.2.1 5'端各突变位点连锁不平衡分析 |
| 5.3.2.2 内含子区各突变位点连锁不平衡分析 |
| 5.3.2.3 3'端非编码区各突变位点连锁不平衡分析 |
| 5.3.3 单倍型分析 |
| 5.3.3.1 5'端调控区各突变位点的单倍型分析 |
| 5.3.3.2 5'端单倍型组合与抗性指标的关联分析 |
| 5.3.3.3 内含子区各突变位点的单倍型分析 |
| 5.3.3.4 内含子区单倍型组合与抗性指标的关联分析 |
| 5.3.3.5 3'端非编码区各突变位点的单倍型分析 |
| 5.3.3.6 3'端非编码区单倍型组合与抗性指标的关联分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 IL-8基因全序列的SNPs与鸡球虫抗性指标的关系 |
| 5.4.2 连锁不平衡与单倍型分析 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 鸡球虫病防治研究进展 |
| 1 鸡球虫的生物学特征 |
| 2 鸡球虫病的诊断与防治 |
| 3 鸡球虫病的免疫预防 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第一章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam56基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 堆型艾美耳球虫配子体蛋白gam82基因的克隆与表达及其免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组蛋白rEaGAM56和rEaGAM82及其联合免疫对堆型艾美耳球虫的免疫保护力 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）鸡球虫重组双价疫苗的制备及其效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.鸡球虫的概述及入侵机制 |
| 2 鸡抗球虫的免疫机制及相关细胞因子的作用 |
| 2.1 免疫机制 |
| 2.2 细胞因子的作用 |
| 3 新型鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 3.1 DNA疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗 |
| 3.3 活载体疫苗 |
| 4 鸡球虫免疫相关蛋白1(IMP1)的研究进展及应用 |
| 5 纤维外链接蛋白EDA佐剂的研究进展及应用 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第一章 重组质粒的构建 |
| 目的 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与试剂盒 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 Em IMP1C、EDA、Et IMP1C片段的扩增 |
| 2.2 构建pEASY-Em IMP1C、pEASY-Et IMP1C、pEASY-EDA质粒 |
| 2.3 构建pET28a-Em IMP1C、pET28a-Et IMP1C、pET28a-EDA 重组质粒 |
| 2.4 构建pET28a-EDA-Em IMP1C、pET28a-EDA-Et IMP1C质粒 |
| 2.5 构建pET28a-Em IMP1C-EDA-Et IMP1C表达质粒 |
| 3 结果 |
| 3.1 EDA、Em IMP1C及 Et IMP1C扩增 |
| 3.2 重组质粒pET28a-Et IMP1C和 pET28a-Em IMP1C的酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒pET28a-EDA-Et IMP1C、pET28a-EDA-Em IMP1C及 pET28a-EDA的酶切鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 重组蛋白的表达 |
| 目的 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂及试剂盒 |
| 1.2 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 BL21蛋白表达菌的转化 |
| 2.2 重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.3 Western-blot鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 诱导时间 |
| 3.2 可溶性表达 |
| 3.3 蛋白纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 动物模型免疫学研究 |
| 目的 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂及试剂盒 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 实验动物及球虫株 |
| 2 方法 |
| 2.1 球虫卵囊的活化 |
| 2.2 血清IgG抗体检测 |
| 2.3 ELISA效价检测 |
| 2.4 IL-12、IL-10、IFN-γ细胞因子浓度检测 |
| 2.5 CD4~+/CD8~+T淋巴细胞检测 |
| 2.6 病理切片制作 |
| 2.7 体重变化 |
| 2.8 肠道病变计分方法 |
| 2.9 排出卵囊数 |
| 2.10 计算ACI(抗球虫指数) |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IL-2细胞因子检测 |
| 3.2 IL-12细胞因子检测 |
| 3.3 IFN-γ细胞因子检测 |
| 3.4 抗体IgG浓度及效价检测 |
| 3.5 淋巴细胞亚群检测 |
| 3.6 平均增重、卵囊排出数量、肠道病变计分 |
| 3.7 病理变化 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 仪器 |
| 附录 B 检测步骤 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（9）抗柔嫩艾美耳球虫天然化合物及中药复方制剂的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫 |
| 1.1.1 鸡球虫分类 |
| 1.1.2 鸡球虫的生活史 |
| 1.2 鸡球虫病流行概况 |
| 1.3 鸡球虫病的控制策略及其局限性 |
| 1.4 抗球虫药物使用现状 |
| 1.5 中药提取物对鸡球虫抗药性的研究现状 |
| 1.6 中药提取物复合使用抗球虫研究进展 |
| 1.7 中药提取物作为抗球虫药的限制和问题 |
| 1.8 研究思路 |
| 1.9 技术方法 |
| 1.10 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物与日粮 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.1.5 虫株与细胞 |
| 2.1.6 化合物单体 |
| 2.1.7 药物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 鸡球虫病流行情况与耐药性调查 |
| 2.2.2 柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养体系筛选单体化合物 |
| 2.2.3 中药复方抗球虫效果试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸡球虫病流行情况与耐药性调查 |
| 3.1.1 华南部分地区鸡球虫流行情况 |
| 3.1.2 华南部分地区鸡球虫耐药性情况 |
| 3.2 柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养模型筛选单体化合物 |
| 3.2.1 卵囊的纯化和子孢子制备 |
| 3.2.2 荧光定量测定化合物对子孢子入侵的抑制率 |
| 3.3 中药复方抗球虫效果试验 |
| 3.3.1 方剂的初筛 |
| 3.3.2 方剂有效剂量的筛选 |
| 3.3.3 方剂作用峰期的研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸡球虫病流行情况与耐药性调查 |
| 4.1.1 感染情况 |
| 4.1.2 优势虫种 |
| 4.1.3 耐药情况 |
| 4.1.4 耐药分析 |
| 4.1.5 耐药性的延缓或解决措施 |
| 4.2 柔嫩艾美耳球虫MDBK细胞培养模型筛选单体化合物 |
| 4.2.1 技术优势 |
| 4.2.2 筛选结果 |
| 4.3 中药复方抗球虫效果试验 |
| 4.3.1 筛选结果 |
| 4.3.2 实验方剂优势 |
| 5 全文讨论与总结 |
| 5.1 全文讨论 |
| 5.2 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（10）植物提取物抗球虫效果及对鸡免疫指标的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 球虫虫株 |
| 2.2 试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 爱绿爽抗毒害艾美耳球虫作用及对免疫指标影响试验 |
| 2.3.2 爱绿爽抗毒柔嫩美耳球虫作用及对免疫指标影响试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 爱绿爽抗毒害艾美耳球虫作用及免疫指标影响实验结果与分析 |
| 3.1.1 相对增重率和料肉比 |
| 3.1.2 相对卵囊减少率 |
| 3.1.3 抗球虫指数 |
| 3.1.4 免疫指标指标测定结果与分析 |
| 3.1.5 肠粘膜组织学指标测定结果与分析 |
| 3.2 爱绿爽抗柔嫩艾美耳球虫作用及免疫指标影响实验结果与分析 |
| 3.2.1 相对增重率、料肉比 |
| 3.2.2 卵囊排出情况 |
| 3.2.3 抗球虫指数 |
| 3.2.4 免疫指标指标测定结果与分析 |
| 3.2.5 肠粘膜组织学指标测定结果与分析 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 植物提取物抗球虫效果 |
| 4.1.2 植物提取物对免疫相关指标的影响 |
| 4.1.3 植物提取物肠粘膜保护效果 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、雏鸡感染柔嫩艾美尔球虫后鸡血清蛋白醋膜电泳分析（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价[D]. 程振扬. 扬州大学, 2021
- [2]鸡柔嫩艾美耳球虫蛋白SAG13分子功能初步研究[D]. 戴玉. 山东农业大学, 2020(11)
- [3]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [4]鸡柔嫩艾美尔球虫体外入侵宿主细胞分泌蛋白质组学分析及入侵相关蛋白质的筛选鉴定[D]. 高洋. 山东农业大学, 2020(12)
- [5]白介素8基因多态性及与京海黄鸡球虫病抗性指标的相关分析[D]. 王晓慧. 扬州大学, 2020
- [6]堆型艾美耳球虫配子体蛋白EaGAM56与EaGAM82的原核表达及其免疫保护作用研究[D]. 华恩玉. 扬州大学, 2020
- [7]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [8]鸡球虫重组双价疫苗的制备及其效果评价[D]. 陈欢. 福建农林大学, 2020
- [9]抗柔嫩艾美耳球虫天然化合物及中药复方制剂的筛选[D]. 于林增. 华南农业大学, 2019
- [10]植物提取物抗球虫效果及对鸡免疫指标的影响[D]. 郭宸旭. 华南农业大学, 2019(02)