一、肝细胞癌SCT表现和相关基因表达的初步研究（论文文献综述）
孙新锋[1]（2021）在《芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究》文中研究说明背景:原发性肝癌是一个全球性的健康问题,其中90%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是第二位致死性肿瘤,5年生存率仅为18%,HCC早期可选择肝移植、手术切除或射频消融等根治性治疗,中晚期化疗栓塞/放射栓塞和全身系统治疗是仅存的治疗方法。和大多数肿瘤一样,HCC中存在干性癌细胞,即癌干细胞（cancer stem cell,CSC）,是具有无限增殖和分化潜能的一类特殊细胞群,特别是在HCC的复发转移过程中起着关键作用。癌干细胞标志物是一种特异性的信号分子或蛋白质受体,是利用其鉴定癌干细胞最简单的方法。很多研究表明癌干细胞表面标记物是影响HCC固有耐药性和侵袭转移能力以及调节其干性的关键因素。随着对癌干细胞的深入研究,越来越多的癌干细胞标记物被发现,在体内成瘤实验中确证过,常见的有EpCAM、CD133、CD44及SOX4等癌干细胞表面蛋白,这些标记物在上皮癌变过程中具有一定的促进作用,它的活化和显着表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。最近研究表明,HCC癌干细胞的存在是影响临床疗效导致HCC患者死亡的主要原因之一。中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶,具有毒副反应少、多组分、治疗靶点多、减毒增效等特点,能够优化HCC治疗早已形成共识,导师在传承的基础上,创新和发展传统中医宏观气血辨证论治思想,对芪术抗癌方治疗HCC宏观和微观物质基础进行了一系列研究,本方以由黄芪、莪术、炒白术、柴胡、白芍、鸡内金及炙甘草等药物组成。前期临床研观察发现,该方可显着提高HCC患者临床疗效,明显改善生存质量、减少肿瘤的复发和转移并提高患者的生存率。进一步研究发现该方能阻止癌细胞转移、诱导HepG2细胞凋亡、p53蛋白表达及p21细胞周期调控等;并通过调节JNKs信号通路促进HepG2细胞凋亡、阻止裸鼠HCC转移,及逆转TGF-β诱导的肝癌细胞EMT和干性特征减少癌细胞迁移等。故系统深入研究HCC癌干细胞的侵袭转移机制以及寻求新的治疗方法,是提高疗效、改善预后及延长生存率的关键环节。通过对癌干细胞的起源、生物学特征及作用和机制初步的阐述,进一步研究HCC转移和复发机制,探讨中药阻止HCC进展的疗效机制具有重要意义。目的:芪术抗癌方可能会影响癌细胞干性标志物表达从而影响HCC复发和转移;据此,本研究拟在导师前期工作基础上,（1）通过对HCC患者外周血淋巴细胞（PBMC）进行癌干性标志物高通量测序以验证主要干性相关标志物基因及SOX4的表达;（2）建立芪术抗癌方处理HepG2细胞损伤模型,验证芪术抗癌方对肝癌细胞株干性标志物表达的影响。（3）建立肝癌原位小鼠动物模型,验证芪术抗癌方对干性标志EpCAM、CD133、CD44表达和对SOX4基因表达的影响。本研究结果,有望在肿瘤干性标志物方面初步阐释芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效作用机制,为中药抗癌制剂的研发和广泛的临床应用提供理论和实验依据。方法:第一部分:收集正常对照人群、HCC患者血液标本,通过PBMC高通量测序及蛋白芯片表达,研究不同分期分级HCC患者之间干性标志及SOX4表达差异,并与正常对照人群进行对比分析。1.经医院伦理委员会批准依据我国《原发性肝癌诊疗规范》（2017年版）选择确诊为肝细胞癌患者,共80例,其中年龄在30岁至70岁之间,平均年龄51.2岁。根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期,80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;为了进一步区分HCC组癌干性基因表达,我们选取了正常对照组,随机入组50例正常人群作为对照组,同时对入组进行统计学分析。2.对入组者进行外周血单个核细胞（PBMC）提取A.使用量约5ml的EDTA抗凝真空采血管进行血液采集,上下颠倒与抗凝剂混合均匀后放入4℃冰箱保存,并在2小时内完成PBMC提取。B.对入组标本进行RNA提取与检测,包括Trizol法提RNA,Thermo试剂盒法进行细胞裂解、RNA萃取、RNA清洗、Elute RNA、RNA检测,对文库构建与质控,库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina 测序。C.数据对比分析:采用Subread软件中的FeatureCounts工具对基因进行表达水平的定量,FeatureCounts主要使用-Q 10-B-C参数,分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上的reads,比对到基因组多个区域的reads。3.随机抽取36例肝癌患者和对照组血浆标本进行蛋白数据进行分析,包括原始数据归一化,差异蛋白筛选,差异蛋白聚类等基础分析。第二部分:芪术抗癌方体外、体内实验研究1.芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达影响的体外肝癌细胞研究通过体外实验,观察芪术抗癌方是否影响TGF-β1诱导的肝癌细胞干性标志物表达。利用TGF-β1诱导Huh7细胞干性表达,加入芪术抗癌方浸提液共培养,Western blot检测癌细胞干性相关蛋白表达水平,验证芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达的影响。2.芪术抗癌方对癌细胞干性标志及SOX4基因表达影响的体内肝癌动物模型研究2.1肝癌原位模型造模小鼠肝包膜下种植SMMC7721-luc制备肝癌模型,4周后进行活体成像仪查看荧光情况来确认小鼠是否造模成功。2.2分组用耳标法将30只肝癌模型小鼠和5只空白小鼠进行编号,然后将肝癌模型小鼠随机等量分为5组（肝癌模型组、索拉非尼组、芪术抗癌低剂量、中剂量、高剂量组）。空白小鼠则做为对照组。2.3取材给药30天后用安乐处死小鼠,剪开小鼠腹部皮肤2cm,分离肌肉,取出小鼠肝脏、拍照。然后肝脏和肿瘤备用。2.4 HE染色及免疫组织化学染色2.5 PCR定量检测根据实验说明书从肝脏肿瘤组织中提取的总RNA,以RNA为模板,按照说明书配制逆转录反应体系,总体积为20μl,37℃,60min;98℃,10min,合成cDNA第一链,并收集备用;加入特定引物,在PCR反应条件下:94℃ 2min,94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 20s,40循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线分析证实。基因表达相对定量与ΔΔCt方法实现（Ct值）。2.6肝癌组织标本进行Western Blot和免疫组化检测。结果:第一部分:收集健康对照组、肝细胞癌患者血液标本,通过PBMC基因测序及蛋白芯片表达,对比健康对照组与HCC、HCC不同分期组之间干性标志物基因、蛋白及SOX4基因表达。本研究中对纳入的80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;同时纳入50例健康人群作为对照组。通过采用RNA-Seq对HCC患者和正常健康对照组外周血淋巴细胞（PBMC）进行高通量测序,及生物信息学方法分析,发现在HCC患者和健康对照者验证队列中,使用qRT-PCR对9个干性基因表达进行验证对比发现,在两者组人群中都存在 CD13、CD24、CD44、CD47、EPCAM、CD133、SOX2、SOX4、CD90等基因表达,并且以CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4表达更显着。对HCC巴塞罗那分期0-B期和C-D期,进一步进行RNA-Seq测序结果分层分析比较,发现在9个癌干性基因表达中,CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4、EpCAM在两组中亦均明显表达,同时发现C-D级较0-B期HCC患者CD133基因表达更为显着,而EpCAM表达0-B期较C-D期患者基因表达有较为明显的表达,同时我们还发现在两组患者中具有同等水平的SOX4的表达。HCC患者和对照组的干性基因表达聚类图进一步分析发现,SOX4基因在HCC组呈现明显的高表达,同样HCC患者PBMC中CD24、CD47、CD13基因表达和健康对照组比较存在显着差异。通过HCC患者血浆蛋白芯片检测,发现HCC患者存在CD44、EpCAM基因高表达。本研究部分,通过RNA-seq技术及血浆芯片蛋白检测技术,确证人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关。第二部分:通过体外、体内实验观察芪术抗癌方对癌干细胞中CD133、CD44、EpCAM及SOX4表达的影响,初步探讨在癌干细胞方面中医药治疗肝癌的作用。1.芪术抗癌方对Huh7肝癌细胞干性标志表达的影响我们体外研究发现,通过对TGF-β1诱导的癌细胞干性标志基因蛋白表达发现,芪术抗癌方干预Huh7肝癌细胞后,能抑制EpCAM和CD133表达,表明该中药复方可以在体外通过抑制癌细胞中EpCAM和CD133干性表达而阻止HCC进展。2.芪术抗癌方对肝癌动物模型癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响EpCAM、CD133、CD44、SOX4等细胞表面蛋白的活化和高表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。我们已对HCC患者PBMC进行了高通量测序研究,发现EpCAM、CD133、CD44、SOX4等干性相关基因,在HCC患者PBMC中表达,及体外实验亦证实了芪术抗癌方可以抑制部分干性标志及SOX4基因表达。由此,我们进行了进一步体内实验研究,验证芪术抗癌方对HCC癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响,初步探索芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效机制。我们对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色研究分析,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉菲尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方可以通过影响癌细胞干性标志物表达从而阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关。结论:在本研究中,首先通过对临床HCC患者PBMC进行RNA-seq及血浆芯片蛋白检测研究,发现了人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关,而中医药可能通过调节SOX4基因影响干性标志表达。其次,通过体外实验研究发现芪术抗癌方可影响Huh7肝癌细胞中CD133、CD44、EpCAM干性标志表达。最后,我们通过对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色分析研究,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉非尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方在体内外实验中能通过影响癌细胞干性标志物表达阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关,为芪术抗癌方进一步深入的疗效机制研究提供了较好的临床及试验证据,为中医药在HCC治疗的临床广泛应用提供了研究依据。
申慧敏[2]（2021）在《铁代谢相关基因RRM2在肝癌细胞中的生物学功能和机制研究》文中研究指明研究背景:原发性肝癌（primary liver cancer）是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,病因复杂,起病隐匿,恶性程度高。其中肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是最主要的病理类型,约占原发性肝癌的75-85%。肝癌对全身化疗和放疗均不敏感,虽然近年来手术和药物治疗手段有了很大的发展,但首次确诊的患者往往已经进入中晚期,因而错过了最佳治疗时间,导致治疗手段极其有限,患者的预后仍极差。因此对肝癌患者的预后预测以及肝癌发生发展机制的研究具有非常重要的意义。铁是生物体必需的元素,参与了各种重要的生理过程。过去数十年的研究发现铁元素具有双重特性,其既能促进细胞生长,也能促进细胞死亡。在癌细胞中已经观察到,为满足快速增殖的需要,癌细胞对铁的依赖性增加,并且更容易受到铁耗竭的影响。因为癌细胞对铁的需求大量增加,导致铁代谢紊乱在不同类型的癌症是普遍现象,包括肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤,其参与到肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的过程中。而肝脏作为人体内铁的最主要贮存库,也是铁的代谢器官,在维持铁稳态的生理过程中发挥重要作用,同时对铁毒性亦高度敏感。有研究证实,铁代谢紊乱是肝细胞癌的重要危险因素,与肝细胞癌的发生发展密切相关,然而目前相关机制尚未完全阐明。因此,我们有必要鉴定出与肝细胞癌发生发展密切相关的铁代谢相关基因,探讨其与肝细胞癌患者预后的相关性,以及对肝癌细胞的生物学功能影响和分子调控机制。本研究利用生物信息学方法筛选出肝细胞癌的关键预后基因,建立预后风险模型,系统分析了铁代谢相关基因与肝细胞癌患者的预后关系。根据我们筛选出的预后基因结果,发现铁代谢相关基因RRM2表达水平在肝细胞癌患者中显着升高,且其对肝细胞癌发病机制的影响尚不明确。因此我们将RRM2列为研究目标,考察RRM2对肝癌细胞生物学功能的影响以及初步探讨相关分子调控机制。我们的研究为肝癌的发生发展提供了一种新的可能机制,也为抗肿瘤药物提供了新的潜在治疗靶点,具有一定的临床意义。第一部分:铁代谢相关基因对肝细胞癌患者预后的影响研究目的:基于生物信息学分析,鉴定与肝细胞癌患者预后密切相关的铁代谢相关基因,作为肝细胞癌患者的预后预测指标。研究方法:1.肝细胞癌组织和癌旁组织的RNA测序数据、临床信息数据来自肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,通过R软件筛选出差异表达基因（differentiallyexpressedgenes,DEGs）。铁代谢相关的基因集来自分子标签数据库（Molecular Signatures Database,MSigDB）,与 DEGs 相结合后获得差异表达的铁代谢基因。2.利用TCGA数据库中的肝细胞癌甲基化数据,分析DEGs的基因表达与CpG位点甲基化之间的相关性。3.对筛选出的铁代谢和甲基化相关基因进行LASSO Cox回归分析、单因素Cox回归分析、多因素Cox回归分析,获得与肝细胞癌预后密切相关的基因。4.根据获得的预后基因特征,建立预后模型来预测肝细胞癌患者的总生存率。以公式计算风险评分（Riskscore）,根据风险评分中位数值将肝细胞癌患者分为高风险组和低风险组,进行Kaplan-Meier（K-M）生存分析和绘制时间依赖的受试者工作曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC）评估基因模型的预后意义和效能。将风险评分和肝细胞癌患者的临床指标进行多因素Cox回归分析,以确定预后模型的风险评分是否可以作为肝细胞癌患者的独立预后因素。5.用国际癌症基因组联合体（International Cancer Genome Consortium,ICGC）数据库中的一个独立肝细胞癌序列对建立的肝细胞癌预后风险模型进行验证。6.通过加权基因共表达网络（Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA）构建预后基因的共表达网络,通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）研究受影响的相关代谢及信号通路,从而进一步确定铁代谢相关基因在肝细胞癌中的潜在调控机制。7.收集2020年9月至2020年10月12例在山东省立医院接受外科手术的肝细胞癌患者的配对癌和癌旁组织标本,利用免疫组织化学染色法鉴定目标蛋白在组织标本中的表达情况。研究结果:1.在TCGA数据库中,肝细胞癌组织中共有71个差异表达的铁代谢相关基因,其中29个呈上调,42个呈下调。对这71个基因的表达水平和CpG位点甲基化进行相关性分析,再进行LASSO Cox回归分析和单因素、多因素Cox回归分析,鉴定出4个铁代谢相关基因与肝细胞癌患者的预后相关,包括RRM2、FTCD、CYP2C9、ATP6V1C1。2.根据4个基因表达水平和相关系数建立预后模型,计算出的风险评分公式为:Risk score=RRM2×0.24+FTCD×（-0.087）+CYP2C9×（-0.097）+ATP6V1C1×0.27。通过K-M生存分析显示,肝细胞癌高风险组患者的生存率明显低于低风险组患者的生存率（p=3.356e-06）。绘制ROC曲线对肝细胞癌患者1年、3年和5年的总生存率进行预测,曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.74,0.67和0.65。多因素Cox回归分析进一步表明,风险评分是与肝细胞癌患者预后相关的独立预测因子（p=2.8e-06,HR=1.7,95%置信区间:1.4-2.1）。3.在ICGC数据库中,进一步验证了预后模型的可靠性。与TCGA队列结果一致,K-M生存分析显示肝细胞癌高风险组患者的生存率明显低于低风险组的生存率（p=4.534e-07）,AUC 在 1 年和 3 年均为 0.77。4.在WGCNA网络中,共有213个目的基因与鉴定出的4个预后基因共表达。此外,GSEA分析显示这些铁代谢相关基因与细胞内噬途径、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路有关。5.免疫组织化学染色法结果证实了生物信息分析的结果,RRM2和ATP6V1C1在肝细胞癌组织中表达水平上调,而FTCD和CYP2C9的表达水平下调。结论:1.本研究鉴定出RRM2、FTCD、CYP2C9、ATP6V1C1这4个与铁代谢相关的关键基因与肝细胞癌患者的预后密切相关。2.通过4个基因的表达水平构建了新的预后模型并计算风险评分,计算出的风险评分是肝细胞癌患者预后的独立预测因子。第二部分:RRM2在肝癌细胞中的生物学功能研究研究目的:进一步明确铁代谢相关基因RRM2在肝细胞癌组织中的表达情况,在体外和体内水平研究RRM2对肝癌细胞生物学功能的影响,初步探讨其在肝细胞癌发生发展中的作用。研究方法:1.利用TCGA数据库,分析RRM2的表达水平与肝癌的分化程度、分期、转移、预后等的关系。2.应用实时定量PCR和Western blot方法,分析肝细胞癌组织和癌旁组织中的RRM2表达情况。3.利用siRNA构建RRM2敲降的MHCC97H和Huh7细胞系,利用质粒构建RRM2过表达的BEL-7402细胞系,采用实时定量PCR和Western blot方法分别验证3种细胞株的转染效率。4.通过细胞增殖实验（MTT）、细胞克隆形成实验、EdU实验,分析RRM2敲降和过表达后对肝癌细胞增殖的影响。5.通过细胞周期检测,分析RRM2敲降和过表达后对细胞周期的影响。6.通过凋亡实验（Annexin V-FITC/PI染色）,分析RRM2敲降和过表达后对肝癌细胞凋亡的影响。采用Western blot方法检测3种转染后的肝癌细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和PARP的表达情况。7.通过Transwell实验、划痕实验分析RRM2敲降和过表达后对肝癌细胞迁移能力的影响。Western blot检测3种转染后的肝癌细胞中迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 的表达情况。8.采用体内实验明确RRM2表达受抑制时对肝癌的增殖、细胞凋亡的影响。在MHCC97H细胞株中,利用慢病毒sh-RRM2转染从而稳定敲降RRM2表达,构建裸鼠皮下移植瘤增殖模型。根据实验结果绘制皮下瘤生长曲线,免疫组化检测Ki-67蛋白的表达情况以及Tunel实验检测细胞凋亡。研究结果:1.基于生物信息学分析结果显示,RRM2表达水平在肝细胞癌组织中显着上调,且RRM2高表达的肝细胞癌患者总生存期及无病生存期显着缩短。RRM2的表达水平随着肝癌的分级、分期、转移程度的增高而升高。2.实时定量PCR和Western blot检测结果显示,与癌旁组织相比,RRM2的表达水平在肝细胞癌组织中显着上调（p<0.05）。3.实时定量PCR结果显示,转染si-RRM2后MHCC97H和Huh7细胞株的RRM2表达水平显着降低（p<0.001）,而转染pcDNA3.1-RRM2的BEL-7402细胞株的RRM2表达水平显着升高（p<0.001）。与实时定量PCR的结果相一致,Western blot显示MHCC97H和Huh7细胞株的RRM2蛋白表达水平显着降低（p<0.001）,而BEL-7402细胞株的RRM2蛋白表达水平显着升高（p<0.05）。4.MTT实验、细胞克隆形成实验及EdU实验的结果均显示,RRM2的表达上调对肝癌细胞的增殖有明显促进作用,而RRM2的表达下调则可以抑制肿瘤细胞增殖,差异具有统计学意义。5.在RRM2表达受抑制后,MHCCH97H和Huh7肝癌细胞在G0/G1期细胞比例上升（p<0.05）,而S期比例显着下降（p<0.05）,提示G1期细胞周期阻滞。过表达RRM2后,BEL-7402肝癌细胞在G0/G1期和G2/M期细胞比例下降（p<0.05）,而S期细胞比例显着升高（p<0.05）。6.凋亡实验结果显示,RRM2在MHCC97H和Huh7细胞中的表达下调后细胞凋亡率显着升高（p<0.001）。与之相反,在BEL-7402细胞中RRM2的表达上调后细胞凋亡率显着下降（p<0.01）。7.Western blot结果示,在MHCC97H和Huh7细胞系中,RRM2表达下调导致Bax和PARP的表达水平显着升高（p<0.001）,而Bcl-2的表达水平显着下降（p<0.001）。在BEL-7402细胞中RRM2的表达上调引起Bax和PARP蛋白的表达水平显着下降（p<0.001）,而Bcl-2的表达水平显着升高（p<0.001）。8.Transwell迁移实验结果显示,RRM2在MHCC97H和Huh7肝癌细胞中表达降低导致转移至小室下层的细胞数量显着减少,差异具有统计学意义（p<0.001）。与之相反,过表达RRM2的BEL-7402肝癌细胞转移至小室下层的数量显着增加,差异具有统计学意义（p<0.01）。划痕实验结果显示,MHCC97H和Huh7肝癌细胞的迁移率显着低于对照组,而BEL-7402肝癌细胞迁移率明显高于对照组（p<0.001）。9.Western blot结果示,在MHCC97H和Huh7细胞系中,RRM2表达下调后引起E-cadherin蛋白的表达水平升高（p<0.001）,N-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平下降,差异具有统计学意义。与之相反,在BEL-7402细胞系中RRM2的表达增加导致E-cadherin蛋白的表达水平下降（p<0.001）,N-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平升高（p<0.001）。10.裸鼠皮下移植瘤增殖实验结果显示,敲降RRM2表达的sh-RRM2组裸鼠皮下移植瘤的体积、重量均显着低于对照组裸鼠（p<0.05）;免疫组化结果显示sh-RRM2组的Ki-67细胞阳性染色率显着低于对照组（p<0.05）;Tunel实验结果显示sh-RRM2组的细胞凋亡率显着高于对照组（p<0.05）。结论:1.RRM2表达水平在肝细胞癌组织中显着上调,与肝细胞癌患者预后不良密切相关。2.敲降RRM2的表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。RRM2的表达水平上调则可以促进肝癌细胞增殖、迁移,对细胞凋亡产生显着抑制作用。3.动物实验证实,RRM2的表达水平下调可以在体内抑制肝癌的增殖,诱导细胞凋亡。4.对铁代谢相关基因RRM2在肝癌细胞中的生物学功能进行了较为全面的研究,有助于进一步明确RRM2促进肝癌发生发展的潜在机制,并为临床提供新的治疗靶点。第三部分:RRM2促进肝癌细胞增殖和迁移的机制研究研究目的:初步探讨铁代谢相关基因RRM2促进肝癌细胞增殖和迁移的分子调控机制。研究方法:1.通过GSEA分析RRM2可能影响的信号通路,找到需要研究的目标信号通路。2.采用Western blot方法对敲降RRM2表达的MHCC97H和Huh7肝癌细胞株进行检测,明确目标信号通路相关蛋白的表达水平变化。3.通过挽救实验来验证,通过上调信号通路的关键调控蛋白,是否可以逆转RRM2表达水平下降对肝癌细胞凋亡和迁移能力产生的影响。研究结果:1.利用GSEA的hallmark基因集进行富集分析,发现RRM2与mTOR信号通路的激活有关。2.Western blot结果显示,在敲降RRM2的MHCC97H和Huh7肝癌细胞株中p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K的表达水平均显着下调,差异具有统计学意义（p<0.05）。3.在敲降RRM2的MHCC97H和Huh7肝癌细胞株中,利用质粒构建Akt过表达。细胞凋亡实验证实,上调Akt的表达导致细胞凋亡率显着下降,差异具有统计学意义（p<0.05）,达到了预期的挽救作用。Transwell实验的结果示,上调Akt的表达可以诱导肝癌细胞迁移能力显着增强,差异具有统计学意义（p<0.05）,同样达到了预期的挽救作用。结论:RRM2可以通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路来促进肝癌的发生发展。
王健鹏[3]（2021）在《基于介入的安罗替尼联合PD-1单抗对门脉癌栓肝癌的协同作用与机制》文中研究表明背景和目的:门静脉癌栓（portal vein tumor throumbs,PVTT）是晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）预后不良的重要因素,序贯经皮肝动脉化疗栓塞（transarterial chemoembolization,TACE）和射频消融（radiofrequency ablation,RFA）是重要的局部治疗方法,酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKI）为全身治疗的一线方案,这些治疗方式的联合在真实世界中尚需进行临床验证。程序性死亡受体-1（programmed death-1,PD-1）抑制剂在晚期HCC中显示出优势,其与TKI药物的协同效应与机制需要进一步探究。当前生物标志物检测尚不能达到对肝癌免疫治疗应答情况的全面及动态评估,亟需探寻更多的临床适用的评估模式。PVTT与免疫检查点相关的独有基因靶点亦未见报道,需要进行探寻与分析。方法:本课题首先开展了两项对PVTT-HCC病人的回顾性临床研究（A:安罗替尼+TACE+RFA对照TACE+RFA;B:安罗替尼+PD-1抑制剂+TACE+RFA对照PD-1抑制剂+TACE+RFA）,探索在介入治疗基础上TKI安罗替尼与PD-1抑制剂应用于PVTT-HCC的临床协同作用。用流式细胞方法,对接受联合治疗模式的病人进行外周免疫细胞和PD-1标记的效应T细胞检测,以临床治疗方式和结果等为基础进行分层分析,阐释可能的协同机制与应答评估方面的意义。从外周免疫的角度对PD-1抑制剂的治疗时机和可能的终点进行解读,为临床决策提供借鉴证据。通过生信分析,在分子水平探寻合并PVTT的HCC病人独有的与免疫检查点相关的有治疗或预后潜在可能的靶点基因。结果:安罗替尼+TACE+RFA组的中位肿瘤无进展时间（Time to tumor progression,TTP）为6个月,中位生存期（Overall survival time,OS）12个月,优于对照组（TACE+RFA）的4个月与10个月。安罗替尼+PD-1抑制剂+TACE+RFA对照PD-1抑制剂+TACE+RFA中位TTP为8个月,中位OS为15个月,优于对照组6个月和15个月。外周血淋巴细胞在不同治疗方式和肿瘤负荷的分层中变化显着:NK细胞增多、Treg细胞减少及CD3+T、CD4+T、CD8+T等细胞增多。PD-1抑制剂用药1-2周期后外周循环中PD-1标记的CD3+/CD4+/CD8+T细胞占比明显下降后维持在较低水平并与后续3个周期的PD-1抑制剂治疗无明显相关;在PVTT的HCC的特有靶点中,与免疫检查点相关的基因有17个。结论:基于介入的安罗替尼联合PD-1抑制剂治疗合并PVTT的HCC具有协同效应,可能成为临床优选治疗模式之一。安罗替尼和/或免疫治疗后病人外周免疫细胞水平发生明显改变,NK细胞明显增多可能是安罗替尼联合PD-1抑制剂协同作用的重要体现;PD-1抑制剂用药1-2周期后外周循环中PD-1结合效应T细胞的比例明显下降并维持在较低水平,这些显着变化趋势可能为免疫治疗的应答评估及时机提供支持并为综合治疗的评估提供参考。合并PVTT的HCC具有独特的与免疫检查点相关的靶点,这些靶点可能是免疫治疗PVTT的潜在靶点或预后因子。
赵鑫[4]（2021）在《基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究》文中提出肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝脏恶性肿瘤之一,其中乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）的感染是HCC的主要病因。目前HCC占我国所有新发癌症病例的第五位,所有癌症致死性疾病的第二位,严重危害着人类健康。HCC的早期诊断、综合及个体化治疗、治疗后监测复发及远处转移,是提高肝癌诊断率及治愈率的重要手段。MiRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用,与细胞生长、代谢、凋亡、肿瘤发生、肿瘤细胞侵袭性以及肿瘤治疗等方面存在密切关系。迄今为止,许多研究证实了miRNA在多种恶性肿瘤中的异常表达,如乳腺癌、脑癌、大肠癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺癌等。在肝癌中,miRNA可作为诊断标记物miRNA辅助临床肝癌诊治,同时也通过多种细胞信号通路影响肝癌发生发展。自噬（Autophagy）作为细胞的一种自我保护机制,与肿瘤发生息息相关。由于自噬与细胞代谢、蛋白质和细胞器周转、细胞生存等密切相关,所以自噬在肿瘤中的作用呈现动态及多样性变化,具有高度的复杂性。MiRNA如何调节自噬过程至今尚未明确,持续发现的调节自噬新的miRNA提示我们,miRNA作为重要分子可通过靶向调控自噬相关基因的表达,影响自噬的过程,调节疾病进展,因此值得进一步探索异常表达的miRNA调控自噬与疾病进展的关系。本研究通过公共数据库筛选与肝癌自噬相关的miRNA,并分析它们的临床意义;在肝癌细胞系,通过缺氧诱导自噬,收集各组细胞进行miRNA和mRNA测序,根据转录组测序数据分析不同肝癌细胞中自噬相关miRNA及其可能作用机制;并初步确定参与肝癌自噬的关键miRNA及其靶基因;稳定过表达/抑制miRNA后检测自噬活性,观察自噬现象,检测miRNA下游信号通路基因变化,为miRNA在HCC诊断、治疗及随访提供理论及实验基础。第一部分:基于TCGA数据库机器学习法研究miRNA作为肝癌诊断生物标志物的价值目的:筛选潜在的HCC诊断生物标志物,初步确定具有诊断潜力的miRNA。方法:根据癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas database,T CGA）数据库,通过随机森林算法初步确定最具诊断价值的差异表达的miRNA。建立分类模型以区分患有肝细胞癌的患者和正常个体,然后在差异表达的miRNA和mRNA之间构建调控网络。使用GSE63046数据集来验证鉴定出的差异表达miRNA的表达,同时进行差异表达miRNA的诊断和预后分析。结果:1.总共发现14个差异表达的miRNA（均上调）和2,982个差异表达的mRNA（1,989个上调和993下调）,其中hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p和hsa-miR-182-5p被认为可能是肝细胞癌诊断生物标志物;2.这五个miRNA靶向的mRNA包括SFRP1,EDNRB,NR4A3,FHL2,NKX3-1,IL6ST,FOXO1。“胆汁酸的生物合成和胆固醇代谢”通路是这些靶标mRNA最富集的信号通路;3.初步确定的五个miRNA的验证与GSE63046数据集验证结果一致;4.Hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-10b-3p可能对肝细胞癌患者预后具有重要的价值。小结:1.5个差异表达的miRNA可以被视为肝细胞癌患者的诊断生物标志物。2.5个miRNA靶向的mRNA（包括SFRP1,EDNRB,NR4A3,FHL2,NKX3-1,IL6ST和FOXO1）差异表达水平可能与肝细胞癌的发生有关。第二部分:MiRNA作为肝癌诊断生物学标志物的体外验证研究目的:肝癌差异表达miRNA的临床体外验证。方法:留取7例肝细胞癌肝癌组织及癌旁2cm癌旁组织,应用RT-q PCR方法定量分析肝癌差异表达miRNA（hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p、hsa-miR-182-5p）组织水平。结果:7名HCC患者中5个差异表达的miRNA的表达水平全部上调,并且hsa-miR-224-5p上调最为显着,与第一部分的生物信息学分析结果一致。小结:1.5个差异表达的miRNA可以被视为肝细胞癌患者的诊断生物标志物2.肝组织样本miRNA水平与公共数据集研究结果一致。第三部分:基于转录组测序进行肝癌自噬相关的机制研究目的:探索肝癌自噬相关新分子,进一步阐明其在调控自噬影响肝癌中进展的作用机制。方法:本部分首先建立缺氧诱导的细胞自噬模型,通过电子显微镜观察自噬泡的数量。Western Blot和Transwell实验分析自噬相关蛋白表达水平和细胞侵袭力。转录组测序分析对照组和低氧组肝癌细胞差异表达的mRNA和miRNA。建立miRNA-mRNA相互作用网络和miRNA靶向的基因的功能富集分析探索缺氧诱导肝癌自噬的潜在机制。结果:1.我们发现缺氧可能通过诱导自噬促进肝癌细胞的侵袭;2.与正常对照组相比,诱导HCCLM3自噬组和SMMC-7721自噬组中共鉴定出407个共享mRNA和57个共享miRNA。此外,278个mRNA属于癌症自噬特异性mRNA,24个miRNA被鉴定为癌自噬特异性miRNA。小结:1.基于miRNA-mRNA相互作用网络获得了19种高度表达的miRNA。2.Hsa-miR-483-5p,hsa-miR-4739,has-miR-214-3p和has-miR-296-5p可能是与肝癌自噬相关的潜在分子标记物。结论:1.Hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-183-5p和hsa-miR-182-5p可能是肝细胞癌诊断标志物。2.临床组织样本证实上述miRNA可能是临床肝癌诊断标记物。3.细胞水平探索发现,hsa-miR-483-5p,hsa-miR-4739,has-miR-214-3p和has-miR-296-5p可能是与肝癌自噬相关的重要分子。4.筛选肝癌及肝癌自噬相关miRNA有助于了解肝癌自噬的潜在分子机制,同时为临床诊断、监测预后提供新的治疗靶点。
郑佳彬[5]（2020）在《复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究》文中提出立题依据:研究背景:恶性淋巴瘤（ML）是一组起源于淋巴系统的恶性肿瘤,多发生于淋巴结和（或）结外部位淋巴组织,通过肿瘤细胞表面的白细胞分化抗原不同可将其分为T细胞来源淋巴瘤及B细胞来源淋巴瘤两大类。T细胞淋巴瘤临床较B细胞淋巴瘤较为少见,仅约占所有淋巴瘤的10%-15%。但这类淋巴瘤由于其亚洲人群高发病率、明显的个体异质性、广泛的症状特异性、较差的治疗预后和转归及大多数在治疗2-3年内复发的特点,也一直受到国内外学者的广泛重视。复方苦参注射液由于其抗肿瘤、镇痛、增强免疫等功效,常用于晚期患者的维持治疗及放化疗辅助治疗。中国中医科学院首席研究员、中国中医科学院广安门医院肿瘤科前主任林洪生教授在多年的淋巴瘤患者诊治过程中发现复方苦参注射液在治疗缓慢进展的T细胞淋巴瘤,尤以伴以多种形式皮肤损伤的患者效果显着,填补了缓慢进展或除皮肤受累症状外并无其他淋巴结或结外器官受累症状的患者等待观察期无药可用的空白,缓解了患者症状,显着改善生活质量。研究目的:本研究分别通过体内及体外实验设计,探索复方苦参注射液对不同人源淋巴瘤细胞系的干预作用,并在小鼠体内模型中进一步验证和探索其免疫调控作用机制。为复方苦参注射液临床有效性是否源于其对淋巴瘤抑制调节作用提供进一步科学依据。研究方法:1.复方苦参注射液对淋巴瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响1.1复方苦参注射液对不同淋巴瘤细胞系增殖的影响及筛选分别培养Hut78（人源皮肤T细胞淋巴瘤细胞株）、Loucy（人源T淋巴细胞白血病细胞株）、Jurkat（人源T淋巴细胞白血病细胞株）、Raji（人源B细胞淋巴瘤细胞株）、EL4（鼠源T淋巴细胞白血病细胞株）5种不同淋巴瘤细胞株。通过比较CCK8及prestoblue敏感度及复方苦参注射液颜色带来的影响,选择prestoblue法作为细胞活力检测试剂。使用prestoblue法及细胞计数法重复验证不同浓度（0.039-5mg/ml）复方苦参注射液对不同细胞株干预后24h、48h、72 h、96h后对其增殖的影响。从而筛选增殖抑制有效及敏感的细胞株。1.2复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞周期的调节作用对上一步筛选敏感细胞株Hut78、Loucy细胞采用PI染色,通过流式细胞仪检测细胞周期,分析不同剂量复方苦参注射液对细胞周期的调节作用。1.3复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞凋亡的影响对敏感细胞株Hut78、Loucy细胞采用7AAD/AnnexinV双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分析不同剂量复方苦参注射液对细胞凋亡的诱导作用。并通过Western Blot法检测凋亡相关内切酶casepase3、casepase7表达进一步证实凋亡的发生。2.复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞信号调控通路蛋白表达的影响应用反向蛋白阵列术（RPPA）检测敏感细胞株Hut78经不同剂量复方苦参注射液干预24h后蛋白表达差异,聚类分析潜在作用通路,蛋白质印迹法（WB）验证相关有效通路蛋白在复方苦参注射液干预的Hut78、Loucy细胞蛋白表达中的影响,明确复方苦参注射液抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等生物学行为的调控机制。3.复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞能量代谢的影响使用高压液相和质谱联用的方法定量检测敏感细胞株Hut78、Loucy经不同剂量复方苦参注射液干预24h后代谢产物表达差异,明确复方苦参注射液影响肿瘤细胞能量代谢生物学行为的调控机制。4.复方苦参注射液对EL4淋巴瘤动物模型的体内实验研究4.1复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型生存期的影响使用C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,将荷瘤小鼠随机分为低、中、高剂量（2ml/kg、4ml/kg、8ml/kg）复方苦参注射液组,甲氨喋呤（MTX）组,生理盐水组以腹腔注射方式干预荷瘤小鼠14天,观察记录其对瘤体大小、小鼠体重及生存期的影响,探索CKI治疗的最佳剂量。4.2复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型免疫调节及肿瘤能量代谢的影响使用C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,将荷瘤小鼠随机分为最佳剂量复方苦参注射液组（2ml/kg,4ml/kg）及生理盐水组以腹腔注射方式干预荷瘤小鼠7天,观察比较瘤体大小,绘制瘤体生长曲线;通过免疫细胞亚群测定检测小鼠肿瘤及脾脏免疫细胞分型表达;通过高压液相和质谱联用的方法进行肿瘤组织代谢产物检测。以进一步验证探索复方苦参注射液体内作用机制;小鼠肿瘤组织石蜡切片的制作及Cleave Casepase3 IHC染色用以检测肿瘤组织凋亡情况。以进一步验证探索复方苦参注射液体内作用机制。研究结果:1.通过细胞活力鉴定的方法学摸索,CCK8及Prestoblue均具有良好的敏感性,但复方苦参注射液颜色对Prestoblue读数的影响程度更小。因此选择prestoblue法及细胞计数法重复验证CKI在淋巴瘤细胞增殖中发挥的作用。Prestoblue法结果显示复方苦参注射液对5种淋巴瘤细胞均显示出生长抑制作用。其中T细胞淋巴瘤细胞系Hut-78、EL4、Loucy、Jurkat要显着强于B细胞淋巴瘤细胞Raji,在人源T细胞淋巴瘤细胞系中,复方苦参注射液对Hut-78（人源皮肤T细胞淋巴瘤细胞）抑制效果最强,Loucy（人源T淋巴细胞白血病细胞株）的抑制效果次之,均呈现显着的剂量及时间依赖性。细胞计数法结果与Prestoblue检测结果趋势一致,也进一步验证Prestoblue细胞增殖-活力检测方法检测结果的真实性及准确性。细胞周期检测结果显示CKI处理后Hut-78、Loucy细胞的细胞周期G0-G1,S,G2/M期并未见明显的周期停滞作用。但是subG 1期的比例呈明显剂量依赖性增加,提示细胞凋亡在CKI的作用机制中或许扮演着重要作用。细胞凋亡检测结果显示CKI可以诱导Hut-78、Loucy细胞的凋亡,凋亡相关内切酶casepase3、casepase7蛋白表达的Western Blot检测也进一步证实了这一点。不同的是,CKI在48h更多的引起Hut-78细胞的早期凋亡,其凋亡率增高明显;但在Loucy细胞中,晚期凋亡和坏死细胞比率更多,这说明CKI诱导Loucy细胞死亡的方式或机制与Hut-78可能纯在差异。2.通过分析反向蛋白阵列术（RPPA）结果发现CKI的潜在作用通路可以聚焦在 PI3K/Akt/mTOR、NF-KB、MEK/ERK 等通路,其中 PI3K/Akt/mTOR 通路的多数蛋白表达调节符合CKI调节分子机制的构想。Western Blot验证结果证实CKI可通过下调Hut-78细胞中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达,进一步调控其下游AMPK/TSC1/mTor/S6通路,从而影响细胞增殖或诱导凋亡。这种现象在Loucy细胞中同样可见。可见,调控PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/TSC1/mTor/S6通路也许是CKI作用T细胞淋巴瘤的主要分子机制。3.高压液相和质谱联用的方法检测提示CKI具有潜在调控谷氨酸及乳酸代谢的作用。CKI可以通过直接减少谷氨酸或乳酸代谢的途径抑制糖解途径酵,减少肿瘤能量代谢。Western Blot蛋白表达验证结果证实CKI具有潜在下调GLS1、LDHA蛋白表达的作用,从而干预肿瘤能量代谢途径,减少肿瘤能量供应。4.通过对C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,我们发现CKI、MTX干预相比生理盐水组可显着提高生存率,延长生存期,相较于化疗药物MTX,CKI表现出非劣势的作用。比较两个实验的小鼠瘤体生长曲线,发现CKI干预后瘤组织的瘤体积增长速度呈降低趋势,与生存期研究结果相一致,相较于化疗药物MTX,CKI依然表现出非劣势的肿瘤抑制作用。免疫细胞亚群结果提示CKI可以选择性上调T细胞亚群（CD3+）,而其中发挥作用的主要免疫细胞群体可能是上调辅助T细胞（CD3+CD4+）、调节性T细胞（CD4+FoxP3）,或下调Th17细胞（CD3+CD4+IL17）比例达成的。这一发现提示CKI的抗肿瘤作用可能与免疫调控有关。通过对肿瘤组织代谢产物的高压液相和质谱联用的方法发现CKI在谷氨酸途径代谢中,可以显着降低谷氨酰胺、谷氨酸及乳酸含量。这与Hut-78及Loucy的实验结果相一致,也进一步提示CKI可以通过抑制谷氨酸及糖酵解途径影响肿瘤能量代谢,降低肿瘤供能,从而发挥抑制肿瘤生长的作用。小鼠肿瘤组织石蜡切片的制作及Cleave Casepase3 IHC染色的结果显示CKI的抑瘤作用可能是通过诱导细胞凋亡产生的,这也进一步印证了体外实验的结论。研究结论:1.复方苦参注射液对淋巴瘤细胞均显示出生长抑制作用。其中对T细胞淋巴瘤要显着强于B细胞淋巴瘤。其发挥细胞增殖抑制的作用可能是通过诱导细胞凋亡完成;2.调控PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/TSC1/mTor/S6通路也许是CKI作用T细胞淋巴瘤的主要分子机制;3.CKI具有降低谷氨酸及乳酸代谢的作用,从而抑制糖解酵途径,减少肿瘤能量代谢,这一点在体内外实验中均得到了验证;4.CKI干预EL4淋巴瘤动物模型可以提高生存率,延长生存期,降低肿瘤生长速度,相较于化疗药物MTX,CKI表现出非劣势的作用;5.CKI发挥肿瘤免疫调节的机制可能是下调Th17（CD3+CD4+IL17）/Treg（CD4+FoxP3）比例,提示CKI的抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤相关性炎症发挥的。
王维伟[6]（2020）在《LncRNA BZRAP1-AS1介导THBS1甲基化在肝细胞癌血管生成中的机制研究》文中研究指明背景:肝细胞癌是最常见的原发性肝癌,死亡率很高。长链非编码RNA（LncRNA）最近已出现作为癌症发展和进程中的调节剂,并可作为新的治疗靶标。在本研究中,我们旨在探讨LncRNA BZRAP1-AS1与肝细胞癌血管生成的关系。方法:采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测临床肝细胞癌组织样本及肝细胞癌细胞系中LncRNA BZRAP1-AS1的表达情况;荧光原位杂交（FISH）、核质分离法检测BZRAP1-AS1在肝细胞癌细胞内的定位;小管形成实验显示体外血管生成情况;鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成试验显示体内血管生成情况。qRT-PCR检测基因表达表达,甲基化特异性PCR（MSP）、亚硫酸盐修饰测序法（BSP）、RNA Pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫共沉淀（ChIP）检测BZRAP1-AS1、DNMT3b、THBS1的相互作用关系。采用BALB/C裸鼠构建肝癌细胞移植瘤模型;苏木素伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理学改变;免疫组织化学染色、免疫荧光染色技术检测体内血管生成情况。结果:LncRNA BZRAP1-AS1在肝细胞癌组织及肝细胞癌细胞系中高表达,FISH、核质分离结果显示BZRAP1-AS1主要定位于细胞核。小管形成实验、CAM实验显示过表达BZRAP1-AS1提高血管生成能力;进一步探讨其机制发现,qRT-PCR结果显示过表达BZRAP1-AS1下调THBS1 mRNA,甲基化转移酶抑制剂5-Aza可减弱这种作用;MSP、BSP结果显示过表达BZRAP1-AS1增加THBS1甲基化程度;RIP、RNA Pull-down的结果显示BZRAP1-AS1与DNMT3b相互结合;双荧光素酶报告基因实验和ChIP结果显示BZRAP1-AS1、DNMT3b可富集在THBS1启动子区。在肝癌荷瘤体内模型中,HE染色结果显示过表达BZRAP1-AS1移植瘤组织血管增多;免疫组织化学染色、免疫荧光染色结果显示过表达BZRAP1-AS1移植瘤瘤体微血管密度增加、CD31表达水平增加。结论:长链非编码RNA BZRAP1-AS1与DNMT3b相互作用并将DNMT3b募集到THBS1启动子,导致CPG位点高甲基化和基因沉默,正向调控肝细胞癌的血管生成。
周子龙[7]（2019）在《PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究》文中提出抑制素2（Prohibitin 2,PHB2）是一种进化上高度保守的蛋白,其在真核细胞中广泛表达,通常与PHB1结合形成复合体,负责维持线粒体结构与功能,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学行为。目前,已有研究显示PHB2与肿瘤的发生、发展有关,但PHB2在肿瘤中的作用及分子机制还未完全阐明。横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma,RMS）是最常见的小儿软组织肿瘤之一,起源于原始间叶细胞,发病率约占小儿软组织肉瘤的50%。横纹肌肉瘤表达肌源性促分化转录因子,但却不能完成终末分化。我们的前期研究表明PHB2负调控肌肉促分化转录因子（如MyoD和MEF2）的活性,从而对成肌细胞的分化进程具有明显的抑制作用,那么PHB2是否在横纹肌肉瘤发生、发展中发挥一定的作用?鉴于此,本文对PHB2在横纹肌肉瘤细胞中的功能及作用机制进行了系统研究。此外,我们的初步研究结果表明PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中可能存在着亚细胞定位和生物学作用上的差异,为了进一步探讨这种差异,我们利用肝癌和正常肝细胞系对PHB2在正常细胞和癌变细胞中的生物学作用进行了初步的对比研究。为了研究PHB2在横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程中的作用,我们采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制内源性PHB2的表达,以分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞增殖及分化的调控作用,并探讨其中的作用机制。首先,我们采用MTT法检测干扰PHB2表达对横纹肌肉瘤细胞系的细胞活力的影响,结果发现PHB2表达下调明显降低了横纹肌肉瘤细胞的细胞活力。为了进一步明确横纹肌肉瘤细胞细胞活力的下降是否与细胞增殖受到抑制有关,我们分别采用BrdU掺入法检测了细胞的DNA合成能力,免疫荧光染色法检测了细胞增殖标志物Ki67的阳性率以及分析了细胞的平板克隆形成能力。结果表明PHB2表达下调明显降低横纹肌肉瘤细胞DNA合成能力,并导致Ki67阳性细胞数显着减少及克隆形成能力下降。以上结果提示PHB2表达下调可明显抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力。为了进一步研究PHB2表达下调是否影响横纹肌肉瘤细胞的细胞周期及诱导细胞发生凋亡,我们采用流式细胞术和免疫印迹法分别分析了肿瘤细胞的细胞周期和凋亡以及周期蛋白的表达水平,结果发现PHB2表达下调导致横纹肌肉瘤细胞系RD细胞出现G1期阻滞,同时抑制了周期蛋白E（Cyclin E）的表达,并引起少量细胞凋亡。为了进一步分析PHB2对横纹肌肉瘤细胞分化的影响,我们采用免疫印迹及免疫荧光染色的方法检测了骨骼肌细胞分化标志分子成肌因子（myogenin）的表达,结果表明PHB2表达下调提高了横纹肌肉瘤细胞myogenin的表达水平及myogenin阳性细胞数,说明PHB2表达下调促进了横纹肌肉瘤细胞的分化。以上结果说明PHB2参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化状态。为了进一步探究PHB2参与调节横纹肌肉瘤细胞增殖和分化过程的分子机制,我们首先对之前发现的部分PHB2疑似细胞核核仁定位进行了确认。通过对横纹肌肉瘤细胞中的PHB2和核磷蛋白（nucleophosmin,NPM）进行免疫荧光共定位检测,我们发现,不同组织类型来源的多种横纹肌肉瘤细胞系中均有部分PHB2与NPM共定位于核仁,但在大鼠正常成肌细胞L6细胞中却未观察到PHB2的核仁定位。为了进一步研究PHB2核仁定位的普遍性和特异性,我们对人肝细胞癌细胞系HepG2、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人卵巢癌细胞系A2780及人正常肝细胞系L02细胞进行了PHB2免疫荧光染色分析,结果发现MDA-MB-231细胞和A2780细胞中均未出现PHB2的核仁定位,而值得关注的是,PHB2在HepG2细胞中出现了核仁定位,在L02细胞中则无核仁定位。以上结果说明PHB2至少在包括横纹肌肉瘤及肝癌等在内的部分肿瘤细胞中存在着特异的细胞核核仁定位。鉴于部分PHB2明显定位于横纹肌肉瘤细胞的核仁中,而核仁的结构与功能与肿瘤的发生、发展密切相关,其介导的rRNA合成功能的增强是肿瘤细胞增殖的重要标志,因此接下来我们探究了PHB2表达下调对横纹肌肉瘤细胞核仁结构和功能的影响。透射电子显微镜观察横纹肌肉瘤细胞超微结构的结果显示,与对照组相比,PHB2表达下调后,横纹肌肉瘤细胞表现出核仁小且致密、边界不清,海绵状核仁消失等特征。同时采用实时定量PCR检测45S核糖体RNA（45S rRNA）和18S核糖体RNA（18S rRNA）的转录水平以分析核仁的功能,结果表明PHB2表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞45S rRNA和18S rRNA的合成,说明PHB2参与调控核糖体DNA（rDNA）转录。有研究表明,转录因子Myc和肌肉特异性促分化转录因子成肌分化蛋白（Myoblast determination protein 1,MyoD）分别正或负调控rDNA的转录从而促进细胞增殖（Myc）或促进细胞分化（MyoD）。为了进一步揭示PHB2对rDNA转录的调节作用是否与这两种转录因子的活性有关,我们采用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）检测PHB2表达下调是否影响转录因子Myc和MyoD与rDNA的结合,结果表明,PHB2表达下调明显抑制Myc与rDNA的结合,同时促进MyoD与rDNA的结合,这一结果与PHB2表达下调抑制rRNA合成的结果相一致,提示PHB2通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞的rRNA合成。由于PHB2在部分肿瘤细胞及其对应的正常细胞中存在着核仁定位的差异,为了明确这种定位上的差异是否导致PHB2在肿瘤细胞和正常细胞中发挥不同的生物学作用,我们选用人肝细胞癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L02开展了对比研究。首先对比分析PHB2对正常肝细胞和肝细胞癌细胞活力的影响,MTT实验结果显示PHB2表达下调明显抑制了HepG2细胞的细胞活力,但对正常肝细胞L02则无明显影响。BrdU掺入实验亦显示PHB2表达下调降低了HepG2细胞的DNA合成能力,而对正常细胞L02无明显影响。细胞周期蛋白表达水平的免疫印迹分析显示PHB2表达下调可以抑制HepG2细胞而非L02细胞中细胞周期蛋白Cyclin E的表达,同时初步发现PHB2表达下调可以促进HepG2细胞中p27和p53的表达。这些结果说明PHB2在正常细胞和肿瘤细胞的增殖过程中可能发挥着不同的作用。进一步透射电镜分析超微结构显示PHB2表达下调导致HepG2细胞的核仁体积明显变小,而L02细胞的核仁结构则无明显改变。实时定量PCR分析rRNA水平亦显示PHB2表达下调可明显抑制HepG2细胞的rRNA合成,但对L02细胞的rRNA合成则无抑制作用,说明PHB2特异地对肝细胞癌细胞的rRNA合成至关重要。PHB2的线粒体定位普遍存在于几乎所有细胞,因此我们又对比分析了PHB2下调对正常肝细胞和肝细胞癌细胞ATP合成能力的影响,结果我们发现PHB2表达下调对HepG2细胞ATP合成的抑制作用高于L02细胞,但这仅是我们初步的研究结果,还需要进一步的研究进行确认。总之,在本研究中,我们首次确定部分PHB2特异地定位于部分肿瘤细胞的核仁,并参与维持核仁的结构,调控核仁的功能。在横纹肌肉瘤细胞中,PHB2具有促进细胞增殖,抑制细胞分化的作用,并参与维持横纹肌肉瘤细胞的核仁结构,及通过调节转录因子Myc和肌肉特异性转录因子MyoD对rDNA转录调控作用来促进横纹肌肉瘤细胞中rRNA合成,提示PHB2对核仁结构与功能的调节作用是其参与维持横纹肌肉瘤细胞存活、增殖及低分化的分子机制之一。在肝细胞癌细胞与正常肝细胞的对比研究中,我们亦发现PHB2特异地定位于肝细胞癌细胞而非正常肝细胞的核仁中,且具有促进肿瘤细胞而非正常细胞增殖以及能量代谢的作用,参与调控肿瘤细胞而非正常细胞的核仁功能。本研究提供了PHB2参与肿瘤发生发展过程的新证据并提出其发挥作用的新机制。
廖锡文[8]（2019）在《乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT，AST变化相关的单核苷酸多态性特征筛查及验证》文中认为研究内容:本研究分为五部分进行研究:1.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查。2.乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的候选单核苷酸多态性位点高尔基体SNAP受体复合物成员 2（golgi SNAP receptor complex member 2,GOSR2）-rs 197922 的二期队列验证。3.基于全基因组数据集对GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的临床应用价值及分子机制研究.4.乙肝相关性原发性肝细胞癌GOSR2表达水平和rs197922的临床病理特征及预后分析。5.GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的生物学功能鉴定及其在正常肝细胞系中与ALT,AST的调控关系研究。目的:本研究尝试通过GWAS方法对广西乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的全外显子单核苷酸多态性特征进行筛查,并分析其临床病理特征和预后。材料方法:收集49例在广西医科大学第一附属医院行肝切除术的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者,且术后行TACE术。根据患者TACE术前和术后ALT和AST的变化进行分组,对这些患者癌组织进行全外显子芯片扫描并进行全外显子关联分析。结果:根据患者TACE术前和术后ALT和AST的变化进行全外显子关联分析,我们筛选了 1247个P<0.05的候选SNPs位点。通过ICSNPathway分析我们共鉴定出17个具有影响通路改变的SNPs位点（包括rs75387493,rs2271683,rs1 1768465,rs8207,rs28365927,rs1344642,rs1863704,rs10160013,rs4036,rs2235324,rs17183814,rs7973658,rs34550074,rs3740168,rs197922,rs3 790525,rs41309181）,发现了 4条 SNP-Gene-Pathway的调控机制。通过生物信息学分析,利用GeneMANIA在线分析工具发现这些17个候选SNPs位点所在的基因与ALT和AST的编码基因具有共表达互作关系。通过GTEx数据库发现这17个SNPs中的高尔基体SNAP受体复合物成员 2（golgi SNAP receptor complex member 2,GOSR2）-rs197922在肝脏等多个正常组织中具有表达数量性状基因座关系。结论:本研究筛选出17个潜在具有SNP-Gene-Pathway调控潜力的SNPs,其中GOSR2-rs 197922位点可能参与调控血清ALT和AST。目的:本研究通过收集独立于一期GWAS队列的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者进行全外显子关联分析结果的二期队列验证。材料方法:本研究收集于2014年至2017年在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除手术且术后行TACE术的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者的癌组织,通过Sanger法对这些患者进行高尔基体SNAP受体复合物成员 2（golgi SNAP receptor complex member 2,GOSR2）-rs197922位点进行基因分型,分析候选位点与TACE术前术后血清ALT和AST变化的关系。结果:二期验证队列共纳入88例乙肝相关性原发性肝细胞癌接受肝切除术后行TACE治疗的患者,其中rs197922位点的基因型分布如下:AA基因型23例,AG基因型43例和GG基因型22例。通过卡方检验和Ligistic回归分析,我们未能观察到rs197922基因型分布与乙肝相关性原发性肝细胞癌患者肝切除术后接受TACE治疗后血清ALT和AST的变化相关。结论:由于纳入二期验证队列的乙肝相关性原发性肝细胞癌患者TACE化疗药物方案的改变,我们未能观察到rs197922位点的基因型与TACE术后ALT和AST水平变化显着相关。目的:本研究的目的是基于GEO和TCGA数据库中原发性肝细胞癌的全基因组数据集对高尔基体SNAP受体复合物成员2（golgi SNAP receptor complex member 2,GOSR2）基因的临床意义进行探索,及利用生物信息学方法对该基因在HCC中的分子机制进行分析。材料与方法:本研究分别纳入GSE14520和TCGA的212个和370个原发性肝细胞癌患者。通过诊断ROC和生存分析探索GOSR2基因的临床应用价值。随后基于全基因组数据对GOSR2进行差异表达基因、共表达基因和基因集富集分析等生物信息学方法探索其潜在的分子机制。结果:通过GSE14520和TCGA队列的验证,我们发现GOSR2基因在原发性肝细胞癌癌组织中表达量上调,高表达GOSR2基因的原发性肝细胞癌患者具有较短的无复发生存时间和总生存时间。通过比较高、低表达GOSR2基因的原发性肝细胞癌患者之间的全基因组表达谱数据,筛选两组之间的差异表达基因和进行基因集富集分析,以及GOSR2的共表达基因,以及通过生物信息学方法进行富集发现GSOR2可能通过调控细胞增殖、周期、NF-kB和Wnt等信号通路参与原发性肝细胞癌生物学行为的调控。结论:GOSR2可能具有作为原发性肝细胞癌诊断和预后生物标志物的潜力。其生物学功能可能涉及细胞增殖和周期等信号通路的调控。目的:本研究通过评估高尔基体SNAP受体复合物成员2（golgi SNAP receptor complex member 2,GOSR2）免疫组化表达量和rs197922的基因型分布探索他们作为乙肝相关性原发性肝细胞癌生物标志物的潜在临床应用价值,同时分析rs197922在乙肝相关性原发性肝细胞癌中的表达数量性状基因座（expression Quantitative Trait Loci,eQTL）特性。材料方法:本研究通过免疫组化方法对乙肝相关性原发性肝细胞癌患者的癌组织进行GOSR2基因的免疫组化染色,以及对rs197922位点进行基因分型,比较不同GOSR2基因表达量和不同rs197922基因型患者之间的临床病理特征和预后差异。结果:本研究纳入342例广西乙肝相关性原发性肝细胞癌患者,通过多因素生存分析比较,我们发现GOSR2基因免疫组化阴性和阳性染色患者的无瘤生存和总体生存时间的差异未达到统计学显着性。但是,我们发现rs197922位点的基因型在非根治性切除等亚组的原发性肝细胞癌患者中与预后显着相关。结论:本研究中我们观察到GOSR2基因免疫组化表达水平与乙肝相关性原发性肝细胞癌患者预后无关,但是我们发现到rs197922基因型分布在特定的乙肝相关性原发性肝细胞癌亚组中具有作为预后分子标志物的潜力。目的:本研究通过在肝癌细胞株中沉默高尔基体SNAP受体复合物成员2（golgi SNAP receptor complex member 2,GOSR2）基因探索其在原发性肝细胞癌中的生物学功能,并探索其在正常肝细胞中在TACE化疗药干预的条件下与ALT和AST的调控关系。材料方法:利用小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）技术在肝癌细胞株（MHCC-97H,Hep-G2和HCC-M）和正常肝细胞株（HL-7702）中沉默GOSR2基因,通过Western Bllot,RT-PCR,细胞划痕、增殖、侵袭等实验验证GOSR2生物学功能。通过化疗药物（5-氟尿嘧啶,吡柔比星,顺铂和洛铂）干预探索GOSR2在正常肝细胞株中与ALT和AST的调控关系。结果:通过WB,RT-PCR验证siRNA在细胞株中的沉默GOSR2的效果,并通过细胞划痕、增殖、侵袭等实验证实在肝癌细胞株中抑制GOSR2基因的表达可以显着抑制肝癌细胞的迁移、增殖和侵袭能力。在正常肝细胞株中沉默GOSR2基因表达,我们未观察到经化疗药物干预后正常肝细胞株分泌ALT和AST有明显变化。结论:本研究证实GOSR2基因在肝细胞癌中可能起着一个癌基因的角色,但本研究并未观察到其表达量的变化与ALT和AST在正常肝细胞株中经化疗药干预后存在显着的直接调控关系。
刘刚,李天然,杨立[9]（2017）在《肝癌的影像学研究进展》文中研究指明随着科学技术的发展,肝癌的影像学研究取得了明显的进步,本文对MSCT、MR、PET/CT成像对肝癌的诊断价值,进行了综合性的回顾和探讨,并对刚刚起步的肝癌生物学特性的成像,进行了初步介绍。开展对肝癌转移潜能的分子影像学研究,是肝癌分子影像学向纵深拓展的需要。而最新的分子影像学技术,主要是指MR和PET/CT技术及分子探针标记技术的进步为开展研究奠定了基础。利用转移相关分子探针,通过多模式影像技术,开展对肝癌高低不同转移潜能的在体成像研究具有可行性和创新性。
姚红霞[10]（2007）在《肝细胞癌螺旋CT增强征象与MVD、VEGF表达间关系的研究》文中研究指明背景和目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝脏最常见的恶性肿瘤。螺旋CT（spiral computed tomography，SCT）的应用为HCC的诊断、治疗及预后判断提供了有效手段。血管生成是恶性肿瘤生长和转移的基础，现在多使用微血管密度（microvessel density，MVD）来评价肿瘤组织的血管生成，MVD与肿瘤的侵袭及预后密切相关。肿瘤组织的血管生成受多种因子的调控，其中血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）与肿瘤血管生成关系密切，在多种肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中起重要作用，对判断肿瘤预后有重要意义。肿瘤影像学表现特征都依其组织病理学为基础，并由肿瘤生物学特性所决定，将SCT征象通过病理与肿瘤的生物学特性对照分析，探讨影像学与分子生物学之间的内在联系是近年来研究的热点之一。本研究的目的是探讨肝细胞癌的螺旋CT征象与瘤内MVD及VEGF表达之间的关系。探讨CT估计肝细胞癌新生微血管状态的能力，加深对肝细胞癌CT影像病理基础的再认识，为肝细胞癌的诊断、临床治疗及预后提供更多的信息。材料与方法：运用免疫组化SP法，检测45例经手术切除并病理证实的肝细胞癌瘤内MVD及VEGF的表达，所有病例术前均行CT平扫及增强扫描，且未接受放疗、化疗等非手术治疗。SCT检查使用Siemens Somatom Esprit螺旋CT机，先平扫，然后使用高压注射器以3.0～3.5ml／s的速度静脉注射碘海醇100ml，分别于注射开始后30～35s行动脉期扫描及60～70s行门脉期扫描双期扫描，必要时延迟扫描，扫描参数均为130KV，250-300mA，螺距为1.0，准直器5-10mm。采用在400倍视野下分别计数MVD及VEGF的表达，判断病理分级、MVD及VEGF间的关系；分析术前CT征象，包括肿瘤的大小、边缘、密度、侵袭转移性及增强类型等，并统计各CT征象与MVD、VEGF阳性表达率的关系。统计分析应用SPSS10.0软件包进行数据处理，统计分析方法为计量资料间用t检验和q检验，计数资料间用Fisher确切概率法，P＜0.05为有显着性差异。结果：1．在45例肝细胞癌中，VEGF阳性表达32例，阳性表达率为71.1％（32／45）。MVD的变化范围为12.1～87.5，平均值（（?））为44.1，标准差（s）为16.2。肝细胞癌VEGF阳性表达组的MVD高于肝细胞癌VEGF阴性表达组，在VEGF阳性和阴性组，MVD值（（?）±s）分别为57.3±25.6和38.7±14.9，组间有显着性差异（P＜0.01）。2．病理分级、MVD及VEGF间的关系：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级的MVD分别为22.9±12.6、36.7±16.2、51.1±17.3和67.8±21.4，VEGF阳性表达率分别为28.6％（2／7）、53.3％（8／15）、90.9％（10／11）和100.0％（12／12），Ⅰ与Ⅲ／Ⅳ级和Ⅱ级与Ⅳ级之间的MVD、VEGF阳性表达率差异显着（P＜0.05），Ⅰ与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级和Ⅲ与Ⅳ级之间的MVD、VEGF阳性表达率无显着性差异（P＞0.05）。3．CT征象与MVD、VEGF表达之间的关系：①瘤体边缘模糊组和清晰组的肝细胞癌MVD分别为50.3±16.2和38.7±13.4，VEGF阳性表达率分别为90.0％（19／21）和54.1％（13／24），组间MVD及VEGF阳性表达率均有显着性差异（P＜0.01）。②瘤内有坏死不强化组和无坏死组的肝细胞癌MVD分别为65.3±17.6和38.2±13.0，VEGF阳性表达率分别为77.8％（7／9）和69.4％（25／36），组间MVD及VEGF阳性表达率均有显着性差异（P＜0.01）。③有扩散转移组和无扩散转移组的肝细胞癌MVD分别为73.9±20.4和40.6±17.1，VEGF阳性表达率分别为100.0％（18／18）和51.8％（14／27），组间MVD及VEGF阳性表达率均有显着性差异（P＜0.01）。④瘤体直径＞5cm和直径≤5cm的肝细胞癌MVD分别为54.6±18.4和46.1±16.5，VEGF阳性表达率分别为75.0％（15／20）和68.0％（17／25），组间MVD及VEGF阳性表达率均无显着性差异（P＞0.05）。⑤动脉供血型、双重供血型及少血供型肝细胞癌的MVD分别为70.6±22.9、65.7±21.6和25.1±13.5，VEGF阳性表达率分别为85.1％（23／27）、63.6％（7／11）和28.6％（2／7）。动脉供血型和双重供血型、双重供血型和少供血型之间VEGF阳性表达率差异均无显着性（P＞0.05），动脉供血型或动脉供血型和双重供血型合并组与少供血型之间VEGF阳性表达率差异有显着性（P＜0.05）；动脉供血型和双重供血型的肝细胞癌，其MVD计数均高于少血供型，组间有显着性差异（P＜0.01），动脉供血型与双重供血型MVD计数无显着性差异（P＞0.1）。结论：1．MVD与VEGF表达之间存在相关性，说明VEGF作为一个调节因子与肝细胞癌微血管的生成密切相关。2．MVD及VEGF表达与HCC的病理分级密切相关，随着病理分级的增加，MVD和VEGF阳性表达率增高，说明其可在一定程度上反映HCC的分化程度。3．MVD及VEGF表达与HCC的边缘是否清晰、瘤内有无液化坏死、有无浸润转移及增强类型等CT征象密切相关，反映了新生血管是其生长、发展的形态学基础，在HCC的浸润转移中起了很大作用，并可在一定程度上反映HCC的血供分型。4．分析肝细胞癌螺旋CT增强征象和肿瘤新生血管的关系，可以进一步认识CT征象的意义，在一定程度上从分子水平判断HCC的侵袭和转移，从而为HCC的诊断、治疗的选择及预后估计提供更多的信息。
二、肝细胞癌SCT表现和相关基因表达的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞癌SCT表现和相关基因表达的初步研究（论文提纲范文）
（1）芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌研究概况 |
| 一、肝癌流行病学现况 |
| 二、肝癌病因研究 |
| 三、肝癌发病机制 |
| 四、肝癌的治疗现状 |
| 五、肝癌发生发展与肝癌干细胞的关系 |
| 六、肝癌干细胞与上皮间质转化(EMT) |
| 第二节 肝癌中医药基础理论的形成和发展及芪术抗癌方研究概况 |
| 一、肝癌的渊源及病因病机 |
| 二、肝癌辨证治疗 |
| 三、芪术抗癌方中医气血辨证治疗肝癌的理论依据 |
| 四、芪术抗癌方临床疗效、机制及微观物质基础研究 |
| 第二章 芪术抗癌方对肝癌干细胞的影响 |
| 第一节 临床研究 |
| 一、资料与方法 |
| 二. 数据分析结果 |
| 三、结论 |
| 第二节 体外、体内实验研究 |
| 一、芪术抗癌方对癌细胞的干性表达体外研究 |
| 二、芪术抗癌方对癌细胞干性表达体内研究 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（2）铁代谢相关基因RRM2在肝癌细胞中的生物学功能和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分：铁代谢相关基因对肝细胞癌患者预后的影响 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| (四) 结论 |
| (五) 图表 |
| (六) 附图 |
| 第二部分: RRM2在肝癌细胞中的生物学功能研究 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| (四) 结论 |
| (五) 附图 |
| 第三部分: RRM2促进肝癌细胞增殖和迁移的机制研究 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 讨论 |
| (四) 结论 |
| (五) 附图 |
| 全文总结 |
| (一）结论 |
| (二）创新性 |
| (三）局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 铁与肝癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（3）基于介入的安罗替尼联合PD-1单抗对门脉癌栓肝癌的协同作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 安罗替尼联合序贯介入方式治疗合并门脉癌栓的肝细胞癌临床应用研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章结论 |
| 第二章 安罗替尼与PD-1抑制剂联合序贯介入方式治疗门脉癌栓肝细胞癌的临床研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章结论 |
| 第三章 外周血免疫水平监测对TKI联合PD-1抑制剂治疗门脉癌栓肝癌协同机制的探究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第四章 合并PVTT的HCC与免疫检查点相关基因靶点探究及预后意义解读 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 附表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 基于TCGA数据库机器学习法研究miRNA作为肝癌诊断生物标志物的价值 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiRNA作为肝癌诊断生物学标志物的体外验证研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于转录组测序进行肝癌自噬相关的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 MicroRNA与肝细胞癌的相关研究及进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一: T细胞淋巴瘤的治疗现状及进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二: 复方苦参注射液抗肿瘤作用及其机制实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究 |
| 实验一 复方苦参注射液对不同淋巴瘤细胞系增殖的影响及筛选 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞周期的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验三 复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第三部分 复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞信号调控通路蛋白表达的影响 |
| 方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第四部分 复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第五部分 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤动物模型体内实验研究 |
| 实验一 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型生存期的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型免疫调节及肿瘤能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 中医药科技查新报告书 |
（6）LncRNA BZRAP1-AS1介导THBS1甲基化在肝细胞癌血管生成中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分LncRNA BZRAP1-AS1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 LncRNA BZRAP1-AS1在肝癌组织中表达的临床意义 |
| 2.2 LncRNA BZRAP1-AS1在肝细胞癌细胞内的定位 |
| 2.3 LncRNA BZRAP1-AS1基因在肝细胞癌组织中高表达 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 LncRNA BZRAP1-AS1、DNMT3b、THBS1的相互作用关系 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 LncRNA BZRAP1-AS1与肝细胞癌的血管生成的关系 |
| 2.2 LncRNA BZRAP1-AS1与DNMT3b、THBS1之间的作用关系 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 LncRNA BZRAP1-AS1在体内对肝细胞癌进展的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 LncRNA BZRAP1-AS1、DNMT、THBS1在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 2.2 LncRNA BZRAP1-AS1在体内促进肝细胞癌血管生成 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: BZRAP1-AS1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 横纹肌肉瘤 |
| 1.1.1 横纹肌肉瘤概述 |
| 1.1.2 横纹肌肉瘤组织学分型及遗传学分析 |
| 1.1.3 横纹肌肉瘤与骨骼肌分化 |
| 1.2 肝细胞癌 |
| 1.2.1 肝细胞癌概述 |
| 1.2.2 肝细胞癌发病机制研究进展 |
| 1.3 核仁在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.3.1 核仁的结构 |
| 1.3.2 核仁核糖体生成与肿瘤 |
| 1.3.3 核仁非核糖体生成功能与肿瘤 |
| 1.4 PHB2 蛋白与肿瘤 |
| 1.4.1 PHB2 蛋白简介 |
| 1.4.2 PHB2 蛋白的定位与功能 |
| 1.4.3 PHB2 蛋白在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PHB2 蛋白对横纹肌肉瘤细胞生物学行为的影响及定位于核仁的确认 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 PHB2 表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞活力 |
| 2.2.2 PHB2 表达下调抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖能力 |
| 2.2.3 PHB2 表达下调诱导RD细胞凋亡 |
| 2.2.4 PHB2 表达下调促进RD细胞分化 |
| 2.2.5 部分PHB2 蛋白定位于肿瘤细胞的核仁 |
| 2.2.6 PHB2 表达下调改变横纹肌肉瘤细胞的超微结构 |
| 2.2.7 PHB2 表达下调抑制RD细胞r RNA的合成 |
| 2.2.8 PHB2 调控r RNA合成的分子机制 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 PHB2 蛋白在正常肝细胞和肝细胞癌细胞中生物学作用的对比研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的细胞活力 |
| 3.2.2 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的增殖 |
| 3.2.3 PHB2 表达下调对Hep G2和L02 细胞超微结构的影响 |
| 3.2.4 PHB2 表达下调抑制HepG2 而非L02 细胞的r DNA转录 |
| 3.2.5 PHB2 表达下调抑制HepG2 细胞的ATP合成能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
（8）乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT，AST变化相关的单核苷酸多态性特征筛查及验证（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的临床病理特征和预后分析及全外显子单核苷酸多态性特征筛查 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT,AST变化的候选单核苷酸多态性位点GOSR2-rs197922的二期队列验证 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于全基因组数据集对GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的临床应用价值及分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 乙肝相关性原发性肝细胞癌GOSR2表达水平和rs197922的临床病理特征及预后分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 GOSR2基因在原发性肝细胞癌中的生物学功能鉴定及其在正常肝细胞系中与ALT,AST的调控关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 附表 |
| 综述 基于TCGA多组学全基因组数据集筛选原发性肝细胞癌相关分子标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（9）肝癌的影像学研究进展（论文提纲范文）
| 1 肝癌 (Hepatocellular Carcinoma, HCC) 基础研究进展 |
| 1.1 肝癌的流行病学 |
| 1.2 肝癌的病因 |
| 1.3 肝癌的转移复发机制与预测分子生物学指标 |
| 2 CT和MRI在肝癌诊断中的应用 |
| 2.1 CT在肝癌诊断中的应用 |
| 2.1.1 CT尤其是多排螺旋CT (Multi-slices computed tomography, MSCT) 对小肝癌的诊断具有很重要的价值, MSCT薄层和快速的特点可以更多地检出病灶并避免呼吸伪影的干扰。 |
| 2.1.2 肝脏CT生物学行为显像 |
| 2.2 MRI在肝癌诊断中的应用 |
| 2.2.1 MRI诊断肝癌的敏感性和特异性 |
| 2.2.2 MRI对肝癌的病理和生物学特性关系的显示 |
| 2.2.3 MRI特异性造影剂在肝癌诊断中的应用 |
| 3 肝癌PET/CT成像研究进展 |
| 3.2 PET对转移性肝脏肿瘤的诊断 |
| 3.3 肝脏肿瘤治疗后的监测 |
| 3.4 新型示踪剂18F-Acetate |
| 4 骨髓间充质干细胞与肝癌的关系 |
| 4.1 骨髓间充质干细胞对肝癌的影响 |
| 4.2 细胞粘附因子—整合素与肝癌转移相关分子探针RGD |
| 5 结语 |
（10）肝细胞癌螺旋CT增强征象与MVD、VEGF表达间关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文部分 肝细胞癌螺旋CT增征象与MVD及VEGF表达间关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述部分 影像技术评价肿瘤血管生成的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 附:攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、肝细胞癌SCT表现和相关基因表达的初步研究（论文参考文献）
- [1]芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究[D]. 孙新锋. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]铁代谢相关基因RRM2在肝癌细胞中的生物学功能和机制研究[D]. 申慧敏. 山东大学, 2021(11)
- [3]基于介入的安罗替尼联合PD-1单抗对门脉癌栓肝癌的协同作用与机制[D]. 王健鹏. 南方医科大学, 2021(02)
- [4]基于癌症基因组图谱数据库和高通量测序对肝癌自噬相关的miRNA的研究[D]. 赵鑫. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究[D]. 郑佳彬. 中国中医科学院, 2020(01)
- [6]LncRNA BZRAP1-AS1介导THBS1甲基化在肝细胞癌血管生成中的机制研究[D]. 王维伟. 郑州大学, 2020(02)
- [7]PHB2在肿瘤细胞中特异性核仁定位及促肿瘤细胞增殖作用研究[D]. 周子龙. 东北师范大学, 2019(04)
- [8]乙肝相关性原发性肝细胞癌切除术后行TACE致ALT，AST变化相关的单核苷酸多态性特征筛查及验证[D]. 廖锡文. 广西医科大学, 2019(08)
- [9]肝癌的影像学研究进展[J]. 刘刚,李天然,杨立. 前沿科学, 2017(01)
- [10]肝细胞癌螺旋CT增强征象与MVD、VEGF表达间关系的研究[D]. 姚红霞. 郑州大学, 2007(04)