一、鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析（论文文献综述）
周琦[1]（2020）在《河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立》文中研究表明鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起鸡的一种高度接触性、急性呼吸道传染病。该病传播速度快、发病率高,对养禽业的效益产生严重影响。IBV的基因组易发生变异和重组,导致其基因型和血清型众多,且交叉保护力弱,对养鸡业造成严重打击。不同地区或者同一地区的基因型都可能出现较大差别,及时了解本地流行毒株情况,对于该病的防控有重要意义。本研究通过对临床样本的检测,围绕IBV的同源性及变异分析,展开了相关研究,具体内容如下:1.河北部分地区IBV分离鉴定及序列分析:收集河北部分地区的疑似IB样本进行检测,对阳性样本进行测序分析,通过对14份阳性样本的S1基因与N基因的序列分析,发现有6株毒株与LX4株更为接近,约占到阳性样本的43%,同时分离到的14个毒株之间的S1基因相似性在69.799.8%。而同源性分析结果表明14个分离毒株的N基因之间的相似性为91.599.8%。2.IBV N蛋白的原核表达及纯化:通过设计特异性引物扩增了HB-ZD1909株S1基因和N基因,并成功构建了其重组质粒pGEX-6P-1-S1和pGEX-6P-1-N,通过IPTG诱导,获得了原核表达的S1蛋白和N蛋白。因S1蛋白纯化效果不理想,故选用可溶性表达且纯化效果好的的N蛋白作为后续实验的基础。3.间接ELISA检测方法的建立:通过原核表达并纯化的N蛋白,成功建立了IBV N蛋白的间接ELISA方法,经过一系列摸索和条件优化,该方法的最佳抗原包被条件为0.5μg/mL,最适合的包被条件为4℃包被过夜,阴阳性临界值确定为0.0996,最佳封闭液条件为5%脱脂乳封闭2 h,血清稀释倍数为1:100,最佳血清作用时间30 min,最佳二抗作用时间为60 min,底物作用时间为10min。重复性及特异性试验结果表明本试验获得的N蛋白可以替代IBV病毒来检测抗体,具有较好的应用价值,可作为快速诊断和免疫监测IBV的重要手段。
李佳楠[2]（2020）在《传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选》文中认为传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是家禽产业中具有高度传染性的一种病原体,易感染呼吸道,也可引起禽类肾脏和生殖道等疾病,给养禽业造成了严重的经济损失。IBV变异率高且存在多种血清型,各血清型之间几乎没有交叉保护作用,给IBV的诊断和治疗带来了巨大的挑战。S1蛋白作为主要的结构蛋白,负责病毒与宿主细胞膜的结合,能够引起机体产生中和性抗体。因此,抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）的制备和模拟表位的筛选,为IBV的检测打下基础,并为分析S1蛋白抗原表位提供参考。本研究将IBV M41毒株接种鸡胚进行扩繁,从而获得含有病毒的尿囊液。经提取病毒总RNA,RT-PCR方法扩增选定的S1基因,构建重组载体p ET-28a-S1并导入E.coli BL21（DE3）细胞中。诱导表达产物通过SDS-PAGE分析,重组S1蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 k Da。复性后的重组S1蛋白经Western-blot验证可以与鸡阳性血清发生反应,表明重组S1蛋白具有反应原性。将重组S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,获得能稳定分泌抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体的细胞株3D9。间接ELISA方法测定腹水抗体效价可达1:2.56×105,亲和常数为1.7×109L/mol。免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）结果显示单克隆抗体3D9可以与IBV M41毒株进行反应。以单克隆抗体3D9为靶标,利用噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选。通过3轮淘选,对与单克隆抗体3D9特异结合的噬菌体进行测序、鉴定,最终获到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。本研究成功制备抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体,且可以与IBV M41毒株进行结合,并通过噬菌体展示技术最终筛选到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。
王露[3]（2020）在《2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析及4株代表性IBV变异株的免疫原性研究》文中认为鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。IBV基因组极易发生变异,导致基因型、血清型、致病性和免疫原性多样化,不同基因型或血清型的毒株之间交叉保护效果不理想,生产上免疫失败时有发生,给养禽业带来较大经济损失。因此,及时了解掌握本地区IBV流行毒株的变异情况并筛选出具有良好免疫原性的毒株作为地方疫苗候选株,对IB防控具有很重要的现实意义。之前课题组完成了至2017年的广西IBV分离株的分子流行病学调查,以及对4株广西代表性IBV变异株致病性进行了研究,本研究在此基础上,继续对2018-2019年的广西IBV分离株进行跟踪研究,同时对此4株广西代表性IBV变异株的免疫原性进行研究,具体如下。一、2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析应用鸡胚接种和RT-PCR技术对2018-2019年间广西疑似病鸡进行IBV的分离鉴定,并对分离株的S1基因进行扩增、测序以及相似性、进化树、重组、高变区、糖基化位点和S蛋白裂解位点分析。结果表明共分离鉴定到19个IBV分离株,此19株IBV的S1基因ORF为1611-1629 bp,编码537-543个氨基酸;分离株之间S1基因核苷酸相似性为66.2%-99.9%,分离株与疫苗株4/91、H120、QXL87、LDT3-A、LX4的S1基因核苷酸相似性分别为65.9%-78.9%、65.6%-83.2%、67.7%-96.0%、66.2%-99.1%、78.0%-99.1%。进化树分析表明,19株IBV分属于5个基因型:LX4型为优势基因型,占42.10%（8/19）,LDT3-A型占26.31%（5/19）,TaiwanⅡ型占15.78%（3/19）,TaiwanⅠ型占10.52%（2/19）,4/91型占5.26%（1/19）。重组分析表明,19株IBV中有5株出现基因重组,其中GX-NN190716、GX-NN190923、GX-NN191006和GX-GG190815四株重组株的主亲本均为GX-YL161022（QXⅡ型）株,次亲本均为CK/CH/LSC/99I株;GX-NN191213的主亲本为GX-GL（Taiwan型）株,次亲本为CK/CH/LSC/99I株。高变区分析结果表明,19株IBV三个高变区均发生了大量氨基酸的替换、插入和缺失。糖基化位点分析表明,19株IBV分别有9-18个N-糖基化位点;GX-YL191121株有2个O-糖基化位点,其余18株均无O-糖基化位点;S蛋白裂解位点分析表明,12株为RRFRR,6株为HRRRR,1株为HRRKR。二、4株代表性IBV变异株的免疫原性研究在本课题组前期研究基础上,对已进行了致病性试验的4株代表性广西IBV变异株GX-NN160421、GX-QZ170728、GX-QZ171023和GX-NN130048进行免疫原性和交叉免疫保护试验。将330只5日龄三黄鸡随机分为6组,分别为GX-NN160421组、GX-QZ170728组、GX-QZ171023组、GX-NN130048组、H120组和PBS组。GX-QZ171023组80只,其余各组50只。5日龄首免,19日龄（首免后两周）加强免疫。33日龄（加强免疫后两周）进行交叉攻毒。攻毒后5天宰杀部分试验组鸡,观察组饲养至47日龄（攻毒后14天）。以免疫后血清中的特异性抗体及中和抗体水平、外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞含量、攻毒鸡临床发病率和死亡率以及气管、肾脏、肺脏的病毒载量、咽拭子和肛拭子排毒情况作为判断交叉免疫保护力的指标。IBV特异性抗体及中和抗体检测结果表明,GX-NN130048株灭活油乳剂疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答;CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分含量检测结果表明,GX-NN130048株免疫后能引起鸡只出现高水平的细胞免疫应答;病毒载量检测结果表明,各组平均病毒载量为:GX-NN160421组（27）GX-QZ170728组（27）GX-NN130048组（27）H120组（27）PBS组;发病率、死亡率统计结果表明GX-NN130048株的免疫保护效果最好;观察组咽拭子、肛拭子排毒量检测结果表明,各免疫观察组排毒至5dpi,非免疫观察组排毒至7dpi,且各免疫观察组鸡的咽拭子、肛拭子排毒量均远低于非免疫观察组,与非免疫观察组差异极显着（P（27）0.01）。综合各检测指标,分离株GX-NN130048能诱导较高水平的细胞免疫和体液免疫,且攻毒保护效果较好,可作为研制本地区IBV疫苗的候选毒株。综上所述,本研究结果表明2018-2019年广西地区IBV流行的基因型有LX4型、LDT3-A型、Taiwan型和4/91型,其中优势基因型是LX4型;分离株GX-NN130048免疫原性较好,可作为研制本地区IBV疫苗的候选毒株。
陈基明[4]（2020）在《aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用》文中研究说明禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus,a MPV）主要引起鸡和火鸡的上呼吸道感染,造成蛋鸡产蛋率和蛋品质下降。近年发现a MPV对番鸭等其它禽类也存在致病性。a MPV单一感染致死率不高,但会导致免疫力下降,继发其它疾病,增加死亡率。目前除大洋洲外均出现a MPV感染的报道,该病严重威胁了世界范围内的养禽业。血清学调查表明目前包括广西在内的多个地区养鸡场的鸡群普遍存在a MPV感染,且不同品种、性别和用途的鸡群均感染严重,部分种鸡群阳性感染率甚至达到100%。a MPV分离较为困难,其感染鸡的临床症状、解剖病变又与传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）相似,传统的病理解剖观察很难区分。此外,近年来a MPV、IBV和NDV混合感染呈多发态势。因此,建立同时检测a MPV、IBV和NDV的诊断方法和了解该病在鸡群的流行情况非常重要。本课题组前期已建立了a MPV的RT-PCR检测方法,因此,本研究在此基础上建立a MPV、IBV及NDV三重RT-PCR检测方法并应用于临床样品检测,同时原核表达了a MPV N蛋白中亲水性和抗原性较好的保守区,纯化后作为包被抗原建立能够检测a MPV特异性抗体的通用型间接ELISA方法,具体如下。一、a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法的建立和应用根据Genbank收录的NDV的F基因序列设计一对特异性引物,结合本课题组已设计的a MPV及IBV通用引物,建立了能够同时检测a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR方法。对扩增条件进行优化,特异性试验、敏感性试验和重复性试验等结果表明了方法的可行性。结果显示三重RT-PCR方法能够特异地扩增a MPV、IBV及NDV,而IBDV、ILTV、REV、ALV、MDV、MDPV、DHAV、FADV、DTMUV、E.coli、Salmonella等扩增结果均为阴性;所建立的三重RT-PCR方法最低检出限为1 ng/μL的c DNA;重复性试验结果表明该方法重复性良好。应用建立的方法对220份临床样品检测,结果a MPV检测阳性率为10.45%（23/220）;IBV阳性率为56.4%（124/220）;NDV阳性率2.7%（6/220）。本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法,为养禽生产中三种常见多发的呼吸道疾病的同步快速诊断和疫情的监控提供了有力的技术支撑。二、禽偏肺病毒N蛋白的原核表达根据生物信息学软件对a MPV N蛋白氨基酸序列保守性、二级结构及B细胞抗原位点进行预测,选取较为保守、亲水性、抗原性好的N基因部分片段连入表达载体p ET32a-1中,转化大肠杆菌DE3细胞进行IPTG诱导表达,优化条件后大量表达,利用Ni-NTA树脂进行纯化,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示成功表达了N蛋白。a MPV N蛋白在原核表达系统中的成功表达为a MPV快速诊断技术的开发及基因工程疫苗的研制奠定了基础。三、禽偏肺病毒N蛋白间接ELISA方法的建立及应用应用以上纯化好的重组N蛋白作为包被抗原,经过一系列的条件优化,初步建立了基于N蛋白的间接ELISA方法,所建立ELISA方法与NDV、IBDV、AIV、ALV、MDV、IBV等阳性血清均无交叉反应,批内重复性试验最大变异系数为6.20%,批间重复性试验最大变异系数为8.25%,均小于10%。应用建立的N蛋白间接ELISA方法与商品化试剂盒对326份血清样品进行平行检测,结果表明所建立的N蛋白间接ELISA方法与商品试剂盒符合率为95.4%。对广西地区规模化养殖公司鸡群共960份血清样品进行a MPV抗体检测,结果表明a MPV抗体阳性率为94.06%。本研究为a MPV ELISA检测试剂盒研制打下了基础,同时为a MPV的早期诊断与流行病学调查建立了技术平台。综上所述,本研究建立了高效快速、灵敏特异的针对a MPV、IBV及NDV的三重RT-PCR检测方法;设计并原核表达保守性、抗原性、亲水性良好的通用型N蛋白;并且基于此蛋白建立了间接ELISA方法。本研究为常见多发的a MPV、IBV及NDV混合感染的快速诊断、疫情监测提供了良好的技术平台,为a MPV的早期诊断和流行病学调查奠定了扎实的技术基础。
董志华[5]（2019）在《四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究》文中研究说明鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病,广西养禽业由该病造成的经济损失非常大。鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）基因组十分容易发生变异,不同国家或地区IBV流行株的基因组存在很大的差异。为了进一步阐明广西IBV分子致病变异机制和致病机理,有效控制该病,促进广西养禽业健康发展,非常有必要对广西IBV流行株进行全基因组测序分析和致病性研究。因此,本研究对四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列进行测定,并对获取的全基因组序列进行生物信息学分析,最后对该四株IBV变异株进行SPF鸡和樱桃谷肉鸭的动物回归试验,对其进行致病性研究,旨在为本地区IB防控提供依据。第一,采用高通量测序技术对IBV变异株GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株进行全基因组序列测定,分别对四株样品进行RNA提取、反转录、文库构建、测序和数据分析。研究结果显示:（1）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株全基因组核苷酸序列长度分别为27477 bp、27751 bp、27674 bp和27663 bp;（2）四株IBV基因组结构均符合经典的结构:5’-UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。第二,对获得的四株IBV全基因组序列进行生物信息学分析,包括全基因组序列碱基插入和缺失分析、相似性分析、系统发育分析、重组分析、S1蛋白裂解位点分析、糖基化位点分析和RNA茎环结构预测。结果显示:（1）四株代表性IBV变异株主要在基因组核苷酸2928～3428位、20490～20930位、21330～21550位、24180～24740位和27370～27440位存在明显的碱基插入和缺失现象;GX-N160421株在高度保守的N基因505～507bp处连续缺失3个碱基（aa:S）,为本地区首次发现的N基因连续缺失毒株。（2）GX-NN130048株与GX-YL9、YX1010和DY07株相似度较高,均在95.0%以上;GX-NN160421株与CKCHHB2016和GX-NN09032株相似度较高,均在96.4%以上;GX-QZ170728、GX-QZ171023株和YX10株相似度较高,分别为95.2%和95.3%。（3）GX-NN130048、GX-QZ170728和GX-QZ171023株主要与YX10和DY07株位于较近的发育分支树上;GX-NN160421株主要与GX-NN09032和CK株位于较近的发育分支树上。GX-NN130048和GX-QZ170728株S1基因均属于4/91-type,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1基因分别属于New-type和CK/CH/LSC/991-type。（4）GX-NN130048和GX-QZ170728株是来源于疫苗株4/91和LX4型野毒株的重组株,GX-NN130048株重组片段断点为1～20444和26981～27477,GX-QZ170728株重组片段断点为1～19046和26821～27674。（5）S1基因型为4/91-type的GX-NN130048和GX-QZ170728株的S1蛋白裂解位点为RRSRR,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1蛋白裂解位点分别为HRRKR和RRFRR。（6）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和 GX-QZ171023株S1基因N-糖基化位点分别为18、10、17和16个,N基因均为1个。（7）以基因组5’端前导序列为模板预测出3个RNA茎环结构,主要与4/91、M41、CQ04-1、SAIBK和SC021202株存在突变位点;以基因组ORF1b融合区为模板预测出2个茎环结构,主要与BJ和California株存在突变位点;其中茎环结构I是主要的核苷酸突变位点。本部分研究结果表明本地区IBV变异株主要由点突变和基因重组引起,基因组5’端前导序列和ORF1b融合区茎环结构可能对于基因重组具有重要作用,IB的防控面临更严峻的挑战。第三,为进一步了解四株代表性IBV变异株的致病性,本课题进行了G X-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株对SPF鸡以及鸭源GX-QZ170728株对樱桃谷肉鸭的致病性试验。将SPF鸡随机分为4组攻毒组和对照组,樱桃谷肉鸭随机分为攻毒组和对照组。7日龄所有攻毒组的动物分别点眼滴鼻1×106 EID50的病毒液,对照组采用等量PBS替代。攻毒后每日观察各组临床症状,及时剖检死亡鸡,记录发病率和死亡率。采集0、1、7、11、14和21 dpi血清进行IBV特异抗体的检测;采集1、3、5、7、11、14和21 dpi气管、肺脏和肾脏制作组织切片及观察病理学变化,并使用荧光定量PCR检测气管、肾脏和肛拭子的病毒载量。结果表明:（1）攻毒24 h以后,攻毒鸡出现精神沉郁、羽毛松乱、体重下降、喘气、气管啰音和饮水量增加等临床症状;剖检鸡出现气管粘液和出血、肾肿大苍白和花斑肾等病变。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭无异常变化。（2）四株IBV攻毒鸡发病率为53.33%～100%,死亡率为2.22%～28.89%,GX-QZ171023组发病率和死亡率最高。鸭源GX-QZ170728株攻毒的樱桃谷肉鸭死亡率为0%。（3）0～21 dpi时攻毒组鸡的抗体水平逐渐升高,21 dpi时抗体滴度均大于试剂盒阳性判定值;整个试验期间对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭抗体水平一直较低且无变化。（4）组织病理学观察显示:四株病毒均导致气管黏膜结构混乱、上皮细胞变性坏死和大量炎细胞浸润,肺脏上皮细胞变性坏死、大量炎细胞浸润、局部肺淤血和肺房受压萎缩。GX-QZ171023组肾小管大量坏死、个别肾小球细胞坏死、萎缩,GX-NN130048组肾脏有少量淋巴细胞浸润,其余两组攻毒鸡肾脏无异常变化;对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭病理切片无异常变化。（5）荧光定量PCR检测结果显示:1～21 dpi时4组攻毒组鸡气管、肾脏和肛拭子均可检测到IBV;GX-NN130048组和GX-NN160421组气管病毒载量明显高于肾脏病毒载量;GX-QZ170728组和GX-QZ171023组肾脏病毒载量明显高于气管病毒载量。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭均未检测到IBV。本部分研究结果表明,四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本研究结果表明,广西IBV仍然不断变异,IBV变异株主要由点突变和基因重组引起;四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728分离株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本课题丰富了 IBV以及冠状病毒的全基因组生物信息库,为致病性研究提供依据,对广西乃至全国IB的防控具有重要的参考价值。
洪艳芬[6]（2018）在《传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选》文中认为鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）引起的一类急性、高度接触性呼吸道疾病,由于鸡传染性支气管炎病毒容易发生变异,导致新的血清型和基因型毒株不断出现,目前使用的商品化活疫苗如H120、H52、Ma5等Mass型疫苗株对我国主要流行毒株的保护效果并不是很理想,因此通过调查当地IBV流行株的进化情况,培育筛选弱毒活疫苗,对预防和控制IB的发生和流行具有重要意义。本研究自20162017年期间从广东省各地区采集的疑似病料中分离到16株IBV分离株,生物学特性研究表明经传代培养后,16株病毒株均可以引起鸡胚发生矮小化,出现“侏儒胚”等现象;对所分离毒株的S1基因进行序列测定,结果表明16株分离株的S1基因发生了较多的基因突变及氨基酸的替代和插入现象,经与国内外毒株对比分析表明,16株分离株中有1株分离株与国内流行株2992/02和J2等分离株处于同一基因群,有5株分离株与目前国内主要流行的LX4型处于同一基因群,有10株分离株形成一个独立的基因群,该基因群是国内新报道的IBV基因型。从10株新基因型的分离毒株中挑选1株具有代表性的毒株GDTS13进行全基因组测序,并对S1、M和N基因等IBV的主要结构基因进行遗传进化分析,结果表明GDTS13与国内外流行的主要参考毒株全基因组同源性为84.5%99.6%,其中与LX4型参考毒株同源性为87.6%,GDTS13 S1、M和N基因序列与LX4型参考毒株的同源性分别为68.0%、87.0%和86.5%。采用固定病毒浓度、稀释血清的方法进行鸡胚中和试验,结果显示5株疫苗株4/91、H120、M41、Holte和Conn46的血清抗体均不能中和GDTS13,说明GDTS13与5个疫苗株很可能不属于同一血清型。将GDTS13在SPF鸡胚上传代致弱,并进行不同代次毒株对SPF鸡的致病性试验,结果表明F40代毒株能引起50%的SPF鸡发病并引起相应症状和病变,F60代毒株能引起20%的SPF鸡发病并引起相应症状和病变,F80和F100代次的毒株不引起SPF雏鸡发病,无相应症状和病变;对GDTS13 F1、F20、F40、F60、F80和F100这6个代次毒株的S1基因进行核苷酸测序并分析,结果表明核苷酸序列有4个位点突变,对应氨基酸的序列则有3个残基突变;F80和F100代次病毒的核苷酸和氨基酸序列的同源性为100%,表明病毒经鸡胚多次传代后具有了较好的遗传稳定性。将GDTS13 F100代的病毒接种2日龄的SPF雏鸡并且连续传5代,通过观察临床症状、病变及测定EID50研究病毒毒力是否返强,结果表明GDTS13 F100代次的病毒在SPF鸡传5个代次,每个代次的试验鸡只均没有出现相关的IBV临床症状和病变,EID50在10-5.63-10-5.73之间变化不大,说明GDTS13 F100代次病毒遗传稳定,没有毒力返强的现象。将致弱的GDTS13 F100代次病毒采用滴鼻、点眼的方式接种2日龄的SPF雏鸡,剂量为103.5 EID50/只,14天后分别用同源强毒和异源强毒进行攻毒,攻毒的剂量为105 EID50,试验结果显示GDTS13 F100弱毒对强毒有超过90%的保护率,表明GDTS13F100代次弱毒可以作为新基因型IB的活疫苗候选毒株。本研究通过调查广东地区IBV的流行情况,了解当前IBV主要流行毒株的基因型及变化趋势,通过鸡胚传代致弱方法成功培育出新基因型IB的弱毒活疫苗候选毒株。
李智超[7]（2018）在《鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中的协同致病作用》文中研究表明鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）和鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）均在我国鸡群中普遍流行,且近年来关于IBV与NDV混合感染的报道越来越多,但目前关于这两种病原的共感染的致病性还未见相关报道。鉴于NDV对鸡具有高致病性,故本研究选择在新城疫免疫鸡群中建立鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒混合感染模型,并通过临床观察、组织病理学分析、血清学试验、Real-time PCR等方法对各组鸡的临床症状、死亡情况、组织病理变化、抗体水平、病毒复制滴度和攻毒后天然免疫相关因子表达水平的变化进行了系统研究。研究内容如下:首先本研究分离到一株QX型IBV强毒将其命名为CK/CH/HD/171018,随后对其进行全基因组序列测定（登录号为MH020185）,结果表明其1a基因发生重组。然后本研究将152羽SPF鸡随机分成8组,其中A～F组于50日龄免疫La Sota灭活苗,G、H组作为未免疫对照,随后于64日龄以滴鼻点眼的途径对A～F组分别接种PBS、ZJ1、QX、QX+ZJ1（+24h）、ZJ1+QX（+24h）、QX+ZJ1,G、H组接种ZJ1和QX。连续观察20天,记录死亡情况。期间,于攻毒后2d、3d、5d、7d,分别采集每组SPF鸡的气管、肺脏、脾脏、肾脏、盲肠及法氏囊,进行组织病理学观察和用于脏器含毒量以及细胞因子的表达水平检测。结果表明G组（ZJ1阳性对照）于攻毒后第5天全部死亡,H组（QX阳性对照）及免疫后单独接种PBS、ZJ1和QX组（A～C组）未死亡,而混合感染QX+ZJ1（+24h）、ZJ1+QX（+24h）和QX+ZJ1组死亡率分别为30%、20%和30%,明显高于单独感染QX或ZJ1组。与单独感染QX或ZJ1组相比,混合感染组的临床症状及病理损伤情况均更加严重。此结果证实,新城疫免疫鸡群中IBV强毒与NDV强毒之间存在明显的协同致病增强作用。本研究随后比较了NDV和IBV的抗体水平,结果表明,攻毒后第二天各组NDV抗体水平均有明显升高,但是IBV的抗体直到攻毒后第7天才有显着上升。本研究分别建立了NDV和IBV的绝对定量Real-time PCR的方法,并检测了各组鸡泄殖腔排毒情况,对其气管、肺脏、脾脏、肾脏、盲肠和法氏囊进行了病毒滴度测定,并同时用相对定量Real-time PCR法检测了脏器中的IFNα、IFNβ、1L-1β、1L-6、MX和PKR表达水平。结果表明,混合感染能够导致泄殖腔两种病毒的排毒率和排毒量均显着上升,排毒周期明显延长,且两种病毒在各脏器中的含毒量均显着上升。天然免疫相关因子的检测结果显示,在单独感染QX或ZJ1早期,各种细胞因子均有较高水平的表达;而在混合感染早期,各组织中的抗病毒因子表达水平较低,在后期则会出现强烈的细胞因子免疫应答。基于以上结果,本研究认为这一现象可能与QX和ZJ1的协同致病相关。综上所述,本研究成功建立了IBV和NDV的混合感染模型,系统地检测了混合感染后两种病毒的动态变化以及宿主的抗病毒反应,为证实IBV和NDV混合感染后致病力增强提供了有力论据,同时也为我国IBV和NDV的综合防治提供了参考信息。
周海生[8]（2017）在《2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究》文中提出传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要引起鸡群呼吸道与肾脏疾病,是影响养禽业重要的病毒性病原之一。虽然IBV疫苗广泛使用,但IB仍然频繁爆发,特别是以引起肾脏损伤的肾型IBV分离报道较多,给我国养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV血清型众多,且各血清型间交叉保护作用较低,同时IBV很容易发生基因突变和同源重组,导致新基因型甚至新血清型不断出现,这给养禽业IB的防控带来巨大的困难。提示我们在防控IB中对病毒进行流行病学监测,并对新型病毒或变异株的流行病学特点进行分析,从而为制定IB有效的免疫防控策略提供重要的理论依据。目前IBV临床分型包括呼吸型、肾型、生殖道型和腺胃型等,其中肾型IBV是近年来我国主要的IB病变型。肾型IBV主要引起鸡肾脏肿大,尿酸盐沉积,进而引起鸡群死亡率增加。病毒S蛋白在IBV的血清学分型、基因分型、病毒组织嗜性及致病性中发挥了决定性的作用,而S蛋白中中和抗原位点、受体结合区域都是位于S1亚基上。因此,研究IBVS1蛋白与宿主之间相互作用,可以为病毒组织嗜性与致病性方面的机理提供一定参考。本研究主要内容包括以下4个部分。1、2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学分析2010～2016年间,本研究共从华东地区疑似IB发病鸡群分离到IBV 36株,其中从肉鸡分离毒株35株,从蛋鸡分离毒株1株。在所有分离株中,我们发现1例IB与H9亚型AIV混合感染。对36株IBV S1基因序列进行测定,发现S1基因长度存在4种:1620/540（28 株）、1617/539（4 株）、1611/537（3 株）及 1638/546（1 株）。S 蛋白裂解位点存在 5种:HRRRR（25 株）、RRFRR（6 株）、RRSRR（3 株）、RRLRR（1 株）及 HRRKR（1株）。序列比对显示本研究分离的36株IBV之间的S1基因核苷酸序列同源性在65.2%～99.9%,分离株与参考株之间S1基因核苷酸序列同源性在65.0%～99.9%。S1基因分型结果表明,36株IBV可划分为七个基因型:QX型（26株）、Mass型（3株）、4/91型（3 株）、tl/CH/LDT3/03 型（1 株）、TW-Ⅰ型（1 株）、TC07-2 型（1 株）和新发现的 New-Ⅰ型（1株）。结合GenBank中2001～2016年中国分离的396株IBV毒株S1基因序列,S1基因分型结果显示,2001～2016年间我国流行的432株IBV可以分为13个基因型,包括QX（321 株）、tl/CH/LDT3/03（25 株）、TW-I（20 株）、4/91（18 株）、Mass（18 株）、CK/CH/LSC/99I（7 株）、TC07-2（4 株）、TW-II（2 株）、Ck/CH/LDL/97I（1 株）、Arkansas（1株）、Vis S（1株）、及新鉴定的基因分支New-Ⅰ（8株）与New-Ⅱ（3株）。值得注意的是,属于美国相关基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我国出现。重组分析显示,新出现的New-Ⅰ基因型IBV S1基因来源于4/91与tl/CH/LDT3/03型毒株之间的重组,基因分支New-Ⅱ病毒S1基因来源于tl/CH/LDT3/03型与QX型毒株重组。研究结果表明我国华东地区2001～2016年间流行的IBV基因型众多,基因重组导致IBV新的基因型或变异株出现。本研究为今后IBV疫苗的研发和IB的防控提供一些参考。2、2001～2016年间我国IBV基因组序列重组分析为了解我国IBV分离株基因组重组特点,特别是疫苗株基因参与IBV基因重组情况,本研究对分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 全基因组序列进行测定,同时收集2001～2016年间分离于我国的55株全基因组序列,并与参考株进行了序列重组分析。序列分析显示分离株CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/QL1403基因组中共鉴定出4个重组事件,分别位于CK/CH/2010/JT-1基因组24709-365、17160-19811、21136-21770片段及CK/CH/2014/QL1403基因组20395-24840片段。进一步对基因组序列重组来源分析显示 CK/CH/2010/JT-1 来源于 QX、CK/CH/LSC/99I、tl/CH/LDT3/03 及 4/91基因型IBV重组,CK/CH/2014/QL1403来源于QX与TC07-2型毒株重组,而CK/CH/2014/FJ14是一株典型的QX型IBV。应用RDP4对我国2001～2016年间分离的55株IBV基因组序列进行重组分析,结果显示我国2001～2016年间流行的55株IBV中有52株IBV基因组存在重组事件,其中25个IBV分离株基因组中发现有疫苗型（Mass,tl/CH/LDT3/03及4/91型等）病毒基因组片段的重组,这一结果在SimPlot分析中进一步得到确认。根据生物信息学分析结果,证明流行于我国的IBV基因组序列存在许多基因重组事件,而且疫苗毒株基因频繁参与了 IBV基因重组,导致IBV新的基因型或变异株出现,提示在防控IB时注意合理使用IBV疫苗。3、我国IBV分离株致病性分析及交叉保护研究为了探究分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 致病特点及不同毒株间抗原关系,本研究对分离株进行动物攻毒、交叉中和及交叉保护实验。动物攻毒实验结果显示CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/FJ14可引起雏鸡严重的呼吸道症状、肾脏病变及高死亡率（43.75%与50%）,而CK/CH/2014/QL1403不引起雏鸡产生明显的临床症状与病理变化。中和实验结果表明现有抗H120与4/91疫苗株鸡多抗血清不能有效中和 IBV 分离株 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14,而抗 QX 型毒株 CK/CH/2014/FJ14鸡多抗血清能够有效中和TC07-2型IBV CK/CH/2014/QL1403。交叉保护实验结果表明CK/CH/2014/QL1403免疫雏鸡后能为鸡群提供有效保护来抵抗QX型毒株CK/CH/2014/FJ14 攻击。本研究结果显示 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14 属于 IBV强毒株,且目前常用H120与4/91疫苗株不能有效防控该毒株,而CK/CH/2014/QL1403是一株天然弱毒株,而且可以作为疫苗候选株来防控QX型IBV。4、IBV S1蛋白的天然免疫应答研究为了探究IBV S1蛋白引起鸡胚肾细胞（Chickenembryokidneycell,CEKC）天然免疫应答反应,特别是肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答差异,本研究成功构建了肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14与呼吸型IBVM41株S1基因真核表达载体,通过转染CEKC研究其在细胞中的天然免疫应答。结果表明IBV S1基因在CEKC中成功获得了瞬时表达,而且S1蛋白主要表达于细胞浆中。在mRNA水平上,转染后12 h,IBV 肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1 蛋白引起 TLR3、MDA5 的表达明显高于呼吸型M41;转染后24h,肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1蛋白引起TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达显着高于呼吸型M41。在蛋白水平上,S1蛋白在 CEKC 中瞬时表达后 24h,肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 引起 TLR3、IFN-β及IL-6的表达显着高于经典株M41。重组质粒转染CEKC 24 h时,使用配体poly（I:C）和LPS刺激后,IBV不同致病性毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫没有产生进一步放大作用。本研究结果表明肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达存在差异,暗示IBV对肾脏致病性差异可能与毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6表达差异相关。
马犇[9]（2016）在《检测TMU、IB和ND病毒多重PCR方法的建立及应用》文中提出鸭坦布苏病毒（TMUV）是一种在2010年新发现的病毒,引发鸭产蛋下降、生长阻滞、甚至死亡。近年来,也发现这种病毒感染鸡,对养鸡业造成一定损失,且出现的症状与其它呼吸道病原的感染有许多相似之处。引起鸡呼吸道疾病的病原还有新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）等。目前在很多地区出现了与TMUV的混合感染病例,依靠临床症状已经不能鉴别诊断这几种病原的多重感染。此外,鸡群中也经常存在同一个体在同一时间受到不同的病毒感染的情况。所以,如果能同时检测同一份病料中不同的种类的病毒,将对流行病学调查以及疫病的鉴别诊断起到非常重要的作用。本研究建立了NDV、IBV、TMUV3种禽类病毒的多重PCR检测方法。通过生物信息学的分析,设计了针对这3种病毒的特异性引物,对PCR的反应条件进行了退火温度与引物浓度的梯度优化,结果显示引物浓度在0.110 pmol/μL,退火温度53℃或56℃时,能够清晰扩增出3个病毒基因的条带,分别为386 bp（IBV）,588 bp（NDV）和821bp（TMUV）。建立的多重PCR方法能够准确的扩增出三种病原（NDV、IBV和TMUV）的核酸片段,且没有扩增出其他病原的特异性片段。表明此方法对上述三种病原的检测有很好的特异性。同时,该多重PCR检测方法能同时检测到的NDV、IBV、TMUV三种病毒目的基因的最小浓度分别为1.79 ng/μL、125pg/μL、23.4 pg/μL,表明该多重PCR检测方法具有较高的敏感性。随后,将本试验建立的多重PCR检测方法对收集的一些临床样本进行检测,可检测出TMUV、IBV、NDV的单独感染及TMUV、IBV与NDV的混合感染,与经典的鸡胚分离培养结果基本吻合。最后,通过对临床样本的PCR产物进行测序从分子生物学角度验证了本实验结果的准确性。本研究成功建立了多重PCR检测三种禽类病毒的方法,为有效预防、控制和扑灭这些禽类动物的疫病提供技术支撑。
张东超[10]（2016）在《IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建与鉴定》文中指出鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性、传染性呼吸道疾病,是世界禽类的主要呼吸道传染性疾病之一。IBV的S1蛋白是主要的免疫原性蛋白,目前,已有多篇利用S1蛋白免疫保护鸡并获得较好效果的研究报道。鸡慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease,CRD）是由鸡毒支原体（Mycoplasma Gallisepticum,MG）感染引起的接触性、慢性呼吸道传染病。CRD主要引起产蛋鸡产蛋量下降,蛋的品质降低,饲料转化率降低,常给养鸡业带来巨大的经济损失。MG的TM-1蛋白为黏附宿主细胞的相关蛋白,已有研究证实该蛋白能够诱导机体对MG侵染产生免疫保护作用。目前,尚未发现利用S1基因和TM-1基因重组腺病毒二联基因工程疫苗的相关报道。本研究通过RT-PCR和PCR分别从IBV H52株和MG S6株中扩增出目的基因;将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上,分别获得pMD-S1和pMD-TM-1;经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC315-EGFP连接,分别获得腺病毒重组穿梭质粒pDC315-S1-EGFP、pDC315-TM-1-EGFP、pDC315-S1-TM-1-EGFP;利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒与腺病毒大骨架pBH共转染HEK293细胞,经Western blot检测,获得表达S1基因和TM-1基因的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP、pBH-S1-EGFP、pBH-TM-1-EGFP、pBH-EGFP;重组腺病毒纯化后,经TCID50方法测定重组腺病毒的滴度,结果分别为1010.875TCID50/m L、1011.750TCID50/m L、1010.625TCID50/m L和1012.250TCID50/m L,符合后续动物试验所需的病毒滴度;通过测定重组腺病毒在不同时间的滴度,绘制其一步生长曲线,曲线显示重组腺病毒与腺病毒的生长特性基本一致;对第P4代、P8代、P10代、P15代重组腺病毒进行PCR检测,均含有插入的S1基因和TM-1基因,表明重组腺病毒的遗传稳定性良好,为下一步重组腺病毒二联疫苗动物试验奠定了研究基础。本研究目的是构建表达IBV S1基因和MG TM-1基因的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP,阐明其生长特性和遗传稳定性,籍此为研制鸡传染性支气管炎和鸡毒支原体的二联基因工程载体疫苗奠定基础。
二、鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析（论文提纲范文）
（1）河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 IBV概述 |
| 1.1.1 IBV病原学简介 |
| 1.1.2 IBV结构蛋白及其生物学特性 |
| 1.1.3 IBV分型 |
| 1.2 IBV流行病学 |
| 1.2.1 IBV的流行与传播 |
| 1.2.2 IBV主要临床分型 |
| 1.2.3 IBV的防控 |
| 1.3 IBV疫苗研究进展 |
| 1.3.1 IBV灭活疫苗 |
| 1.3.2 IBV弱毒疫苗 |
| 1.3.3 IBV基因工程苗 |
| 1.3.4 活病毒载体疫苗 |
| 1.4 IBV检测方法研究进展 |
| 1.4.1 RT-PCR检测 |
| 1.4.2 ELISA检测 |
| 1.4.3 胶体金试纸条 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 河北部分地区IBV分离鉴定与基因序列分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂、材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其它生物材料和试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料来源 |
| 2.2.2 引物设计 |
| 2.2.3 病毒总RNA提取及逆转录 |
| 2.2.4 基因扩增 |
| 2.2.5 鸡胚接毒 |
| 2.2.6 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 纯化回收产物的连接 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 重组质粒的转化、鉴定及序列测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床样本PCR鉴定 |
| 2.3.2 鸡胚病变 |
| 2.3.3 扩增结果 |
| 2.3.4 T载体构建 |
| 2.3.5 构建进化树 |
| 2.3.6 同源性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白和N蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、载体及基因工程菌 |
| 3.1.2 主要生化试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 原核蛋白的克隆与鉴定 |
| 3.2.3 原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 重组质粒的表达及纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因片段的克隆与鉴定 |
| 3.3.2 原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 重组质粒的表达及鉴定 |
| 3.3.4 原核蛋白的纯化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 IBV N蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂、材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4.2.2 阴阳临界值的确定 |
| 4.2.3 确定抗原最佳包被条件 |
| 4.2.4 最佳封闭液的选择 |
| 4.2.5 确定最佳封闭时间 |
| 4.2.6 确定血清孵育时间 |
| 4.2.7 确定二抗孵育时间 |
| 4.2.8 确定底物作用时间 |
| 4.2.9 特异性试验 |
| 4.2.10 重复性试验 |
| 4.2.11 敏感性试验 |
| 4.2.12 临床样本检验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4.3.2 阴阳临界值的确定 |
| 4.3.3 确定抗原最佳包被条件 |
| 4.3.4 最佳封闭液的选择 |
| 4.3.5 确定最佳封闭时间 |
| 4.3.6 确定血清孵育时间 |
| 4.3.7 确定二抗孵育时间 |
| 4.3.8 确定底物作用时间 |
| 4.3.9 特异性试验 |
| 4.3.10 重复性试验 |
| 4.3.11 敏感性试验 |
| 4.3.12 临床样本检验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 N蛋白的选择 |
| 4.4.2 间接ELISA检测方法各项条件的优化 |
| 4.4.3 间接ELISA检测方法的特性 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（2）传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 IBV感染临床症状及流行概况 |
| 1.1.1 临床症状 |
| 1.1.2 流行概况 |
| 1.2 IBV病原学概述 |
| 1.2.1 IBV的结构特征 |
| 1.2.2 IBV的理化特性 |
| 1.2.3 IBV的体外培养 |
| 1.2.4 IBV基因组结构 |
| 1.3 IBV结构蛋白及生物学功能 |
| 1.3.1 S(纤突)蛋白 |
| 1.3.2 M蛋白 |
| 1.3.3 N蛋白 |
| 1.3.4 E蛋白 |
| 1.4 IBV的诊断 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 IBVS1蛋白单克隆抗体制备及表位研究进展 |
| 1.5.1 单克隆抗体技术研究进展 |
| 1.5.2 IBVS1蛋白的表位研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 IBVM41S1蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒株和鸡胚 |
| 2.1.2 实验主要仪器及设备 |
| 2.1.3 实验主要试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 IBVM41毒株的扩繁 |
| 2.2.2 IBV M41总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.2.4 引物设计 |
| 2.2.5 PCR扩增S1基因 |
| 2.2.6 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 pMD19-T-S1的构建 |
| 2.2.8 重组载体pET-28a-S1的构建 |
| 2.2.9 重组S1蛋白的表达 |
| 2.2.10 重组S1蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.11 SDS-PAGE |
| 2.2.12 纯化重组S1蛋白 |
| 2.2.13 Western-blot |
| 2.2.14 重组S1蛋白的浓度测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 S1基因的扩增 |
| 2.3.2 pMD19-T-S1载体的构建 |
| 2.3.3 表达载体pET-28a-S1的构建 |
| 2.3.4 S1重组蛋白的表达与可溶性分析 |
| 2.3.5 重组S1 蛋白的复性及Western-blot验证 |
| 2.3.6 重组S1蛋白的浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 S1蛋白抗原区的选择 |
| 2.4.2 表达载体的选择 |
| 2.4.3 蛋白的变性和复性 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 抗IBVM41S1蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物和细胞 |
| 3.1.2 实验主要仪器及设备 |
| 3.1.3 实验主要试剂及耗材 |
| 3.1.4 试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 小鼠血清效价的测定 |
| 3.2.3 SP2/0细胞的培养 |
| 3.2.4 饲养细胞的制备 |
| 3.2.5 脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.10 单抗腹水制备与纯化 |
| 3.2.11 单抗浓度及纯度的测定 |
| 3.2.12 单抗效价及亲和力的测定 |
| 3.2.13 单抗与IBVM41毒株的反应 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清效价的测定 |
| 3.3.2 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 单抗浓度与纯度的鉴定 |
| 3.3.4 单抗效价的测定 |
| 3.3.5 单抗亲和力的测定 |
| 3.3.6 单抗与IBVM41毒株的反应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 IBVM41S1蛋白模拟表位的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验主要仪器及设备 |
| 4.1.2 实验主要试剂及耗材 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 第一轮亲和淘选 |
| 4.2.2 噬菌体的扩增与纯化 |
| 4.2.3 测定洗脱产物和扩增产物的滴度 |
| 4.2.4 第二、三轮噬菌体的淘选 |
| 4.2.5 噬菌斑的扩增与纯化 |
| 4.2.6 阳性噬菌体的鉴定 |
| 4.2.7 阳性噬菌体测序及序列分析 |
| 4.2.8 间接竞争ELISA |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 亲和淘选噬菌体的富集 |
| 4.3.2 阳性噬菌体的鉴定 |
| 4.3.3 噬菌体模拟表位分析 |
| 4.3.4 间接竞争ELISA |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 去污剂浓度、单抗纯度和包被浓度 |
| 4.4.2 模拟表位分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析及4株代表性IBV变异株的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学研究概况 |
| 1.1.1 IBV的生物学分类 |
| 1.1.2 IBV的生物学特性 |
| 1.1.3 IBV基因组结构 |
| 1.1.4 IBV的结构蛋白及其功能 |
| 1.2 IBV的流行情况 |
| 1.2.1 IBV在中国的流行情况 |
| 1.2.2 IBV在世界各国的流行情况 |
| 1.2.3 IBV广泛流行的原因 |
| 1.3 IBV的基因分型研究概况 |
| 1.3.1 IBV的基因分型的方法 |
| 1.3.2 IBV基因分型研究进展 |
| 1.4 IBV的基因分型和血清分型相关性研究概况 |
| 1.4.1 国内研究概况 |
| 1.4.2 国外研究概况 |
| 1.5 IBV的免疫原性研究概况 |
| 1.5.1 国内研究概况 |
| 1.5.2 国外研究概况 |
| 1.6 本课题研究的目的与意义 |
| 第二章 2018-2019年广西地区IBV的分离鉴定和S1基因序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂和试验仪器 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试验鸡胚 |
| 2.1.4 病料来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒增殖 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增 |
| 2.2.4 RT-PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.5 纯化产物的连接 |
| 2.2.6 重组质粒的转化、鉴定及序列测定 |
| 2.2.7 序列的分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 病毒的分离鉴定结果 |
| 2.3.2 各分离株序列测定结果 |
| 2.3.3 相似性分析结果 |
| 2.3.4 进化树分析结果 |
| 2.3.5 重组分析结果 |
| 2.3.6 高变区分析结果 |
| 2.3.7 糖基化位点分析结果 |
| 2.3.8 S蛋白质裂解位点分析结果 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 4株广西代表性IBV变异株的免疫原性试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂及试验仪器 |
| 3.1.2 毒株来源 |
| 3.1.3 试验鸡和鸡胚 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株增殖 |
| 3.2.2 各毒株TOC-ID50的测定 |
| 3.2.3 灭活油乳剂疫苗(OEV)的制备 |
| 3.2.4 动物免疫和攻毒试验 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 各毒株TOC-ID50的测定结果 |
| 3.3.2 免疫后鸡血清中IgG抗体水平 |
| 3.3.3 免疫后鸡血清中和抗体水平 |
| 3.3.4 免疫后鸡外周血中特异性T淋巴细胞百分含量 |
| 3.3.5 攻毒后5天各组鸡气管、肾脏、肺脏的病毒载量 |
| 3.3.6 各组鸡发病率和死亡率 |
| 3.3.7 各观察组鸡只攻毒后的排毒情况 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（4）aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽偏肺病毒的病原学 |
| 1.1.1 禽偏肺病毒的病原分类 |
| 1.1.2 禽偏肺病毒病毒形态学和理化特性 |
| 1.1.3 禽偏肺病毒基因组成和结构蛋白 |
| 1.1.4 禽偏肺病毒的复制与侵染机制 |
| 1.2 禽偏肺病毒的流行病学 |
| 1.2.1 禽偏肺病毒的宿主与易感动物 |
| 1.2.2 禽偏肺病毒的传播与分布 |
| 1.3 禽偏肺病毒的临床症状与病理变化 |
| 1.3.1 禽偏肺病毒的临床症状 |
| 1.3.2 禽偏肺病毒的病理变化 |
| 1.4 禽偏肺病毒的诊断方法 |
| 1.4.1 禽偏肺病毒的分离与培养 |
| 1.4.2 禽偏肺病毒的鉴定与鉴别诊断 |
| 1.4.2.1 禽偏肺病毒的电镜鉴定 |
| 1.4.2.2 禽偏肺病毒的分子生物学鉴定 |
| 1.4.2.3 禽偏肺病毒的血清学鉴定 |
| 1.4.2.4 禽偏肺病毒的鉴别诊断 |
| 1.5 禽偏肺病毒的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 禽偏肺病毒、传染性支气管炎病毒及新城疫病毒的三重RT-PCR方法的建立和应用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 毒株的增殖及RNA抽提 |
| 2.2.1.1 病毒的增殖 |
| 2.2.1.2 病毒核酸的提取及反转录 |
| 2.2.2 RT-PCR引物设计与合成 |
| 2.2.3 NDV通用引物的RT-PCR方法的扩增条件的优化 |
| 2.2.3.1 引物浓度范围的优化 |
| 2.2.3.2 退火温度范围的优化 |
| 2.2.3.3 特异性试验 |
| 2.2.3.4 敏感性试验 |
| 2.2.3.5 重复性试验 |
| 2.2.3.6 临床初步应用 |
| 2.2.4 三重RT-PCR鉴别方法的扩增条件优化 |
| 2.2.4.1 引物浓度范围的优化 |
| 2.2.4.2 退火温度范围的优化 |
| 2.2.5 三重RT-PCR特异性试验 |
| 2.2.6 三重RT-PCR敏感性试验 |
| 2.2.7 三重RT-PCR重复性试验 |
| 2.2.8 三重RT-PCR的初步应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NDV通用引物的RT-PCR方法的扩增条件的优化结果 |
| 2.3.1.1 NDV通用引物的RT-PCR方法的引物添加量优化结果 |
| 2.3.1.2 NDV通用引物的RT-PCR方法的退火温度优化结果 |
| 2.3.1.3 NDV通用引物的RT-PCR方法特异性试验结果 |
| 2.3.1.4 NDV通用引物的RT-PCR方法敏感性试验结果 |
| 2.3.1.5 NDV通用引物的RT-PCR方法重复性试验结果 |
| 2.3.1.6 NDV通用引物的RT-PCR方法的临床初步应用 |
| 2.3.2 三重RT-PCR引物添加量优化结果 |
| 2.3.3 三重RT-PCR退火温度优化结果 |
| 2.3.4 三重RT-PCR特异性试验结果 |
| 2.3.5 三重RT-PCR敏感性试验结果 |
| 2.3.6 三重RT-PCR重复性试验结果 |
| 2.3.7 三重RT-PCR的初步应用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽偏肺病毒N蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 毒株的增殖及RNA抽提 |
| 3.2.1.1 病毒的增殖 |
| 3.2.1.2 病毒的提取及反转录 |
| 3.2.2 N蛋白重组表达质粒的构建 |
| 3.2.2.1 N基因的扩增 |
| 3.2.2.2 目的片段与表达载体的连接 |
| 3.2.2.3 连接产物的转化 |
| 3.2.2.4 重组表达质粒的抽提 |
| 3.2.2.5 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 N基因的原核表达 |
| 3.2.3.1 重组表达质粒转化表达菌株 |
| 3.2.3.2 重组N蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.2.3.3 重组N蛋白的Western Blot鉴定 |
| 3.2.3.4 重组N蛋白的诱导表达条件的优化 |
| 3.2.3.5 重组N蛋白的大量诱导表达 |
| 3.2.3.6 重组N蛋白的纯化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PCR扩增重组N基因的结果 |
| 3.3.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.3.2.1 重组表达质粒的PCR及酶切鉴定结果 |
| 3.3.2.2 重组表达质粒的测序结果 |
| 3.3.3 SDS-PAGE鉴定结果 |
| 3.3.3.1 不同诱导时间蛋白表达结果 |
| 3.3.3.2 不同浓度诱导剂蛋白表达结果 |
| 3.3.3.3 重组N蛋白Western Blot结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 禽偏肺病毒N蛋白的间接ELISA方法的建立及应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 主要试剂的配制 |
| 4.1.3 样品来源 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 N蛋白的间接ELISA最佳条件的摸索 |
| 4.2.1.1 抗原包被浓度和血清检测浓度的摸索 |
| 4.2.1.2 抗原包被条件的摸索 |
| 4.2.1.3 封闭时间的摸索 |
| 4.2.1.4 一抗作用时间的摸索 |
| 4.2.1.5 酶标二抗浓度的摸索 |
| 4.2.1.6 酶标二抗作用时间的摸索 |
| 4.2.1.7 显色TMB底物反应时间的摸索 |
| 4.2.1.8 阴阳性临界值的确定 |
| 4.2.1.9 ELISA特异性试验 |
| 4.2.1.10 ELISA敏感性试验 |
| 4.2.1.11 ELISA重复性试验 |
| 4.2.2 间接ELISA与商品化试剂盒的比较 |
| 4.2.3 间接ELISA的临床应用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 间接ELISA摸索结果 |
| 4.3.1.1 抗原包被浓度和血清检测浓度的摸索结果 |
| 4.3.1.2 抗原包被条件的摸索结果 |
| 4.3.1.3 封闭时间的摸索 |
| 4.3.1.4 一抗作用时间的摸索 |
| 4.3.1.5 酶标二抗浓度的摸索 |
| 4.3.1.6 酶标二抗作用时间的摸索 |
| 4.3.1.7 显色TMB底物反应时间的摸索 |
| 4.3.1.8 阴阳性临界值的确定 |
| 4.3.1.9 根据摸索出的最佳条件确定间接ELISA的步骤 |
| 4.3.1.10 ELISA特异性试验 |
| 4.3.1.11 ELISA敏感性试验 |
| 4.3.1.12 ELISA重复性试验 |
| 4.3.2 间接ELISA与商品化试剂盒的比较 |
| 4.3.3 间接ELISA的临床应用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（5）四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写、符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学的研究概论 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎病毒的分类和形态 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒的理化和生物特性 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎发病机理和流行病学 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理变化 |
| 1.2.2 鸡传染性支气管炎的国外流行情况 |
| 1.2.3 鸡传染性支气管炎的国内流行情况 |
| 1.2.4 IBV变异株的研究进展 |
| 1.3 鸡传染性支气管炎病毒的致病性研究 |
| 1.3.1 鸡传染性支气管炎病毒对呼吸器官的致病性 |
| 1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒对生殖器官的致病性 |
| 1.3.3 鸡传染性支气管炎病毒对泌尿器官的致病性 |
| 1.3.4 鸡传染性支气管炎病毒对其他组织器官的致病性 |
| 1.4 鸡传染性支气管炎病毒基因组 |
| 1.4.1 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构 |
| 1.4.2 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.3 鸡传染性支气管炎病毒非结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.4 鸡传染性支气管炎病毒非编码区与生物学功能 |
| 1.5 鸡传染性支气管炎病毒全基因组生物信息学研究现状 |
| 1.5.1 鸡传染性支气管炎病毒全基因组测定分析的研究进展 |
| 1.5.2 生物信息学分析的理论基础 |
| 1.5.3 糖基化位点与蛋白裂解位点的理论基础 |
| 1.5.4 基因重组研究与RNA茎环结构研究 |
| 1.5.5 蛋白质立体结构研究与分子遗传变异研究 |
| 1.6 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV分离株背景 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的选择及合成 |
| 2.2.2 病毒的增殖及纯化 |
| 2.2.3 病毒RNA的抽提及cDNA的合成 |
| 2.2.4 S1、E、M和N结构基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.5 高通量测序IBV全基因组序列 |
| 2.2.6 一代测序与高通量测序的对比分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的纯化 |
| 2.3.2 IBV S1、E、M和N结构基因序列 |
| 2.3.3 IBV全基因组序列 |
| 2.3.4 一代测序与高通量测序的对比 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 四株广西代表性IBV变异株的生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物信息学分析数据 |
| 3.1.2 生物信息学分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析 |
| 3.2.2 全基因组序列相似性分析 |
| 3.2.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.2.4 全基因组序列的重组分析 |
| 3.2.5 S1蛋白裂解位点分析 |
| 3.2.6 糖基化位点分析 |
| 3.2.7 RNA茎环结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析结果 |
| 3.3.2 全基因组序列相似性分析结果 |
| 3.3.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析结果 |
| 3.3.4 全基因组序列的重组分析结果 |
| 3.3.5 S1蛋白裂解分析结果 |
| 3.3.6 糖基化位点分析结果 |
| 3.3.7 RNA茎环结构预测结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 四株代表性IBV变异株的致病性试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验用SPF鸡胚、SPF鸡及樱桃谷肉鸭 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 4.2.2 SPF鸡及樱桃谷肉鸭分组与攻毒 |
| 4.2.3 病料的采集与处理 |
| 4.2.4 试验动物外周血血清抗体水平的检测 |
| 4.2.5 试验动物组织切片的制作与观察 |
| 4.2.6 试验动物组织器官病毒载量检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定结果 |
| 4.3.2 临床症状与剖检症状 |
| 4.3.3 试验动物外周血血清抗体水平检测结果 |
| 4.3.4 试验动物组织病理变化结果 |
| 4.3.5 试验动物组织器官病毒载量检测结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目 |
（6）传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 传染性支气管炎概述 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒 |
| 1.2.1 IBV的形态学特点 |
| 1.2.2 IBV的结构蛋白 |
| 1.2.3 IBV的分子变异机理 |
| 1.2.4 IBV的生物学特性 |
| 1.3 传染性支气管炎的分型 |
| 1.3.1 临床分型 |
| 1.3.2 血清分型 |
| 1.3.3 基因分型 |
| 1.4 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 活疫苗 |
| 1.4.3 基因工程疫苗 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 SPF鸡与鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的分离 |
| 2.2.3 病料的RT-PCR鉴定 |
| 2.2.4 分离株RT-PCR反应产物的连接与转化 |
| 2.2.5 分离株重组质粒的提取及S1基因序列测定 |
| 2.2.6 分离株S1基因序列分析 |
| 2.2.7 分离株生物学特性研究 |
| 2.2.8 GDTS13纯净性检验 |
| 2.2.9 分离株与疫苗株鸡胚半数感染量(EID50)的测定 |
| 2.2.10 GDTS13的血清中和试验 |
| 2.2.11 血清型与基因型分析 |
| 2.2.12 GDTS13全基因组序列测定与分析 |
| 2.2.13 GDTS13的传代致弱 |
| 2.2.14 SDTS13不同代次的EID50及S1基因序列测定 |
| 2.2.15 GDTS13不同代次的致病性检测 |
| 2.2.16 GDTS13F100的纯净性检测 |
| 2.2.17 GDTS13F100的毒力稳定性试验 |
| 2.2.18 GDTS13F100的免疫效力的初步评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株RT-PCR检测结果 |
| 3.1.1 分离株M基因的鉴定 |
| 3.1.2 分离株S1基因的鉴定 |
| 3.2 分离株S1基因序列分析结果 |
| 3.3 分离株生物学特性鉴定结果 |
| 3.3.1 红细胞凝集试验 |
| 3.3.2 致鸡胚病变特征 |
| 3.4 GDTS13的纯净性检测 |
| 3.5 分离株GDTS13和疫苗株EID50测定结果 |
| 3.6 血清中和试验 |
| 3.6.1 GDTS13和疫苗株的血清抗体检测结果 |
| 3.6.2 疫苗株对GDTS13分离株的血清中和试验结果 |
| 3.7 GDTS13的基因序列分析结果 |
| 3.7.1 GDTS13的全基因序列分析 |
| 3.7.2 GDTS13S1基因分析结果 |
| 3.7.3 GDTS13M基因分析结果 |
| 3.7.4 GDTS13N基因分析结果 |
| 3.8 GDTS13不同代次致病力鉴定结果 |
| 3.9 GDTS13 不同代次的 EID50及 S1 基因序列分析结果 |
| 3.9.1 GDTS136个不同代次的EID50测定结果 |
| 3.9.2 GDTS13不同代次S1基因序列分析 |
| 3.10 GDTS13F100的纯净性检测结果 |
| 3.11 GDTS13F100毒力稳定性评价结果 |
| 3.12 GDTS13F100免疫效力初步评价结果 |
| 3.12.1 攻毒试验 |
| 3.12.2 GDTSF100免疫保护效力评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 分离株的生物学特性 |
| 4.2 分离毒株的分子特点 |
| 4.3 GDTS13的分子特性 |
| 4.3.1 血清中和试验 |
| 4.3.2 GDTS13的全基因序列分析 |
| 4.3.3 GDTS13的S1基因序列分析 |
| 4.3.4 GDTS13的M基因序列分析 |
| 4.3.5 GDTS13的N基因序列分析 |
| 4.4 GDTS13不同代次的EID50结果和S1基因序列分析及致病力分析 |
| 4.5 GDTS13F100的毒力返强试验结果评价 |
| 4.6 GDTS13F100的弱毒疫苗免疫效力的初步评价 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（7）鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中的协同致病作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.2 NDV的分子生物学 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎的研究进展 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎病毒概述 |
| 1.2.2 IBV的分子生物学 |
| 1.2.3 IBV的血清型分类 |
| 1.2.4 IBV的流行情况 |
| 1.2.5 IBV的致病性 |
| 第2章 基于中国知网数据库的鸡传染性支气管炎病毒混合感染分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 检索方法 |
| 2.1.2 鸡传染性支气管炎病毒混合感染地区分布 |
| 2.1.3 鸡传染性支气管炎病毒混合感染疾病类型分析 |
| 2.1.4 鸡传染性支气管炎病毒与NDV和 AIV混合感染情况分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 鸡传染性支气管病毒混合感染地区分布 |
| 2.2.2 鸡传染性支气管病毒混合感染病原类型 |
| 2.2.3 IBV和 NDV、AIV三种病毒混合感染情况 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 鸡传染性支气管炎病毒分离株CK/CH/HD/171018 的生物学特性测定及全基因组序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株、SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 3.1.2 菌种、载体及主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 引物设计及合成 |
| 3.1.5 病毒增殖与鉴定及EID50的测定 |
| 3.1.6 SPF鸡致病性实验 |
| 3.1.7 病毒基因组的扩增 |
| 3.1.8 目的基因克隆 |
| 3.1.9 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CK/CH/HD/171018 病毒对SPF鸡胚致病性 |
| 3.2.2 CK/CH/HD/171018 病毒对SPF鸡致病性 |
| 3.2.3 CK/CH/HD/171018 全基因组序列测定结果 |
| 3.2.4 CK/CH/HD/171018 序列测定和拼接 |
| 3.2.5 CK/CH/HD/171018 遗传进化分析 |
| 3.2.6 CK/CH/HD/171018 的重组分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中混合感染模型的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 毒株、SPF鸡和SPF鸡胚 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 ZJ1的扩增及EID50的测定 |
| 4.2.2 QX的扩增及EID50的测定 |
| 4.2.3 QX和 ZJ1的SPF鸡混合感染试验分组 |
| 4.2.4 病理组织学检查 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 临床症状 |
| 4.3.2 死亡率的统计 |
| 4.3.3 组织病理学观察 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中协同致病作用的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 QX N基因与ZJ1 M基因Real-time PCR检测方法的建立 |
| 5.2.2 QX和 ZJ1的SPF鸡混合感染试验 |
| 5.2.3 鸡抗体水平的测定 |
| 5.2.4 泄殖腔排毒水平的测定 |
| 5.2.5 鸡体内病毒组织分布情况旳测定 |
| 5.2.6 细胞因子表达水平的测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 NDV抗体水平的测定 |
| 5.3.2 IBV抗体水平的测定 |
| 5.3.3 N基因与M基因Real-time PCR检测方法的建立 |
| 5.3.4 泄殖腔QX的排毒率及排毒量统计 |
| 5.3.5 泄殖腔ZJ1的排毒率及排毒量统计 |
| 5.3.6 鸡体内QX的组织分布情况 |
| 5.3.7 鸡体内ZJ1的组织分布情况 |
| 5.3.8 气管中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.9 肺脏中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.10 肾脏中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.11 脾脏中细胞因子的表达情况 |
| 5.3.12 法氏囊中细胞因子的表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 中英对照缩略词 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现、命名与分类 |
| 1.2 生物学特性 |
| 1.3 基因组结构与主要功能蛋白 |
| 1.4 生活周期 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 毒株分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 自然宿主 |
| 2.2 实验室宿主 |
| 2.3 传播方式 |
| 3 临床症状及病理变化 |
| 3.1 呼吸道 |
| 3.2 肾脏 |
| 3.3 生殖道 |
| 3.4 消化道 |
| 3.5 其它 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病原的分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断技术 |
| 4.3 分子生物学检测技术 |
| 5 防治 |
| 5.1 免疫预防 |
| 5.2 治疗 |
| 综述二 传染性支管炎病毒在世界范围内流行现状 |
| 1 亚洲国家IBV流行现状 |
| 2 欧洲国家IBV流行现状 |
| 3 非洲国家IBV流行现状 |
| 4 北美洲国家IBV流行现状 |
| 5 南美洲国家IBV流行现状 |
| 6 大洋洲国家IBV流行现状 |
| 综述三 禽冠状病毒纤突蛋白研究进展 |
| 1 禽冠状病毒S蛋白概述 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 其它禽类冠状病毒S蛋白 |
| 2 禽冠状病毒S蛋白功能 |
| 2.1 组织吸附中的作用 |
| 2.2 细胞亲和性中的作用 |
| 2.3 体内组织嗜性与致病性中的作用 |
| 3 病毒吸附中宿主影响因素 |
| 3.1 唾液酸 |
| 3.2 蛋白受体 |
| 3.3 凝集素 |
| 3.4 硫酸肝素 |
| 3.5 宿主蛋白酶 |
| 4 禽冠状病毒S蛋白引起宿主天然免疫反应 |
| 参考文献 第二部分 研究内容 |
| 第一章 2001～2016年间华东地区传染性支气管炎病毒分子流行病学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒总RNA提取 |
| 2.4 S1基因扩增与序列测定 |
| 2.5 S1基因序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 分离株S1蛋白长度与裂解位点的多样性 |
| 3.3 分离株S1基因分型的多样性 |
| 3.4 新分支New-Ⅰ与New-Ⅱ基因型IBV S1基因的来源 |
| 4 讨论 |
| 第二章 2001～2016年间我国传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分离株全序列扩增引物设计 |
| 2.2 分离株全基因组序列RT-PCR |
| 2.3 病毒基因组5'与3'端序列扩增 |
| 2.4 分离株基因组序列测定与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株基因组结构 |
| 3.2 分离株CK/CH/2010/JT-1基因组的重组来源 |
| 3.3 分离株CK/CH/2014/QL1403基因组的重组来源 |
| 3.4 我国2001～2016年间IBV基因组重组现象普遍 |
| 4 讨论 |
| 第三章 我国鸡传染性支气管炎病毒分离株致病性分析及交叉保护研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 SPF鸡致病性实验 |
| 2.3 病毒中和实验 |
| 2.4 交叉保护实验 |
| 2.5 鸡IBV血清抗体ELISA |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV分离株致病性 |
| 3.2 交叉中和实验结果 |
| 3.3 天然弱毒CK/CH/2014/QL1403对QX型IBV交叉保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒S1蛋白的天然免疫应答研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.3 CEKC的制备 |
| 2.4 CEKC的质粒转染 |
| 2.5 共聚焦显微镜荧光分析 |
| 2.6 Western-blot |
| 2.7 荧光定量PCR方法检测相关因子 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒转染CEKC后S1蛋白的表达 |
| 3.4 IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 3.5 配体刺激后IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 全文总结 致谢 攻读博士期间所获成果 |
（9）检测TMU、IB和ND病毒多重PCR方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 坦布苏病毒 |
| 1.1.1 坦布苏病毒的概述 |
| 1.1.2 坦布苏病毒的分子特征 |
| 1.1.3 坦布苏病毒的鉴别及检测方法 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒 |
| 1.2.1 传染性支气管炎病毒的概述 |
| 1.2.2 传染性支气管炎病毒的分子特征 |
| 1.2.3 传染性支气管炎病毒的鉴别诊断方法 |
| 1.3 新城疫病毒 |
| 1.3.1 新城疫病毒的概述 |
| 1.3.2 新城疫病毒的分子特征 |
| 1.3.3 新城疫病毒的鉴别诊断方法 |
| 1.4 多重PCR技术简介 |
| 1.4.1 PCR技术的原理 |
| 1.4.2 PCR技术的应用 |
| 1.4.3 多重PCR的基本原理 |
| 1.4.4 多重PCR在病原学检测中的应用 |
| 1.5 病毒的实验室诊断方法 |
| 1.5.1 血凝及血凝抑制试验 |
| 1.5.2 琼脂凝胶扩散试验 |
| 1.5.3 免疫荧光技术 |
| 1.5.4 酶联免疫试验 |
| 1.5.5 抗碱性磷酸酶桥联酶标法 |
| 1.5.6 免疫组化技术 |
| 1.5.7 核酸探针技术 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 TMU、IB和 ND病毒的单一PCR检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验毒株 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 试剂配置 |
| 2.1.4 载体和菌株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒增殖 |
| 2.2.3 单一PCR体系的建立和优化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RT-PCR的优化 |
| 2.3.2 PCR产物序列的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 TMU、IB和 ND病毒的多重PCR检测方法的建立及应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验毒株与试剂配制 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 试剂配置 |
| 3.1.4 载体和菌株 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 多重PCR体系的建立和条件优化 |
| 3.2.2 特异性试验 |
| 3.2.3 敏感性试验 |
| 3.2.4 多重PCR方法的应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 多重PCR反应条件的优化 |
| 3.3.2 特异性试验 |
| 3.3.3 敏感性实验 |
| 3.3.4 多重PCR方法的应用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（10）IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 鸡传染性支气管炎的研究进展 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒的研究进展 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎流行病学 |
| 1.3 鸡传染性支气管炎的临床症状与病理变化 |
| 1.4 鸡传染性支气管炎的诊断 |
| 1.5 鸡传染性支气管炎的防制 |
| 1.6 鸡传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 2 鸡毒支原体的研究进展 |
| 2.1 鸡毒支原体的研究进展 |
| 2.2 鸡毒支原体感染的流行病学 |
| 2.3 鸡毒支原体感染的临床症状与病理变化 |
| 2.4 鸡毒支原体感染的诊断 |
| 2.5 鸡毒支原体感染的防治 |
| 2.6 鸡毒支原体疫苗的研究进展 |
| 3 腺病毒载体的研究进展 |
| 3.1 腺病毒载体的优点 |
| 3.2 重组腺病毒载体构建方法的研究进展 |
| 3.3 腺病毒载体在动物疫苗研究中的应用 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 S1 基因与TM-1 基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 S1 基因的RT-PCR扩增及PMD-S1 质粒的PCR扩增结果 |
| 2.2 TM-1 基因的PCR扩增及质粒PMD-TM-1 的PCR扩增结果 |
| 2.3 pMD-S1与pMD-TM-1 质粒双酶切鉴定结果 |
| 2.4 扩增的S1 基因与TM-1 基因测序结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 目的基因的选取 |
| 3.2 引物设计 |
| 3.3 同源性分析 |
| 4 小结 |
| 第三章 S1 基因与TM-1 基因重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 腺病毒重组穿梭质粒pDC315-S1-EGFP和pDC315-TM-1-EGFP双酶切结果 |
| 2.2 腺病毒重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP双酶切结果 |
| 2.3 扩增的 S1 基因与 TM-1 基因测序结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 重组腺病毒的构建、包装与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 腺病毒骨架和穿梭质粒共转染HEK293 细胞结果 |
| 2.2 包装完成的重组腺病毒感染HEK293 细胞结果 |
| 2.3 Western blot检测S1 蛋白和TM-1 蛋白表达的结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 腺病毒AdMax包装系统分析 |
| 3.2 Western blot分析 |
| 4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒滴度的测定及其相关特性的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组病毒的滴度测定结果 |
| 2.2 重组病毒的一步生长曲线 |
| 2.3 重组病毒的遗传稳定性 |
| 3.讨论 |
| 3.1 重组病毒滴度测定结果分析 |
| 3.2 重组腺病毒的生长曲线分析 |
| 3.3 重组腺病毒的遗传稳定分析 |
| 4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及着作 |
四、鸡传染性支气管炎病毒N基因片段的RT-PCR扩增及序列分析（论文参考文献）
- [1]河北部分地区IBV分离株的基因序列分析及其间接ELISA方法的初步建立[D]. 周琦. 河北科技师范学院, 2020(12)
- [2]传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选[D]. 李佳楠. 郑州大学, 2020(02)
- [3]2018-2019年广西IBV分离株S1基因序列分析及4株代表性IBV变异株的免疫原性研究[D]. 王露. 广西大学, 2020
- [4]aMPV、IBV、NDV三重RT-PCR以及aMPV N蛋白的表达和间接ELISA方法的建立与应用[D]. 陈基明. 广西大学, 2020(02)
- [5]四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究[D]. 董志华. 广西大学, 2019(01)
- [6]传染性支气管炎弱毒活疫苗的初步培育与筛选[D]. 洪艳芬. 华南农业大学, 2018(08)
- [7]鸡传染性支气管炎强毒与新城疫强毒在新城疫免疫鸡群中的协同致病作用[D]. 李智超. 新疆农业大学, 2018(06)
- [8]2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究[D]. 周海生. 扬州大学, 2017(05)
- [9]检测TMU、IB和ND病毒多重PCR方法的建立及应用[D]. 马犇. 上海交通大学, 2016(01)
- [10]IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建与鉴定[D]. 张东超. 天津农学院, 2016(08)
标签：鸡传染性支气管炎论文; 基因合成论文; 重组蛋白论文; 基因变异论文; 疫苗事件论文;