肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究

肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究

一、肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究(论文文献综述)

张竞辉[1](2021)在《MarR型转录调控因子FabT对肺炎链球菌菌落相变调控的研究》文中研究说明目的肺炎链球菌是一种重要的人类条件致病菌,可以导致多种侵袭性疾病。肺炎链球菌在生长过程中会经历一种自发、可逆的表型改变过程,该过程被成为相变。菌落透明度表型改变是相变最典型的性状之一,不同透明型的细菌拥有不同的代谢以及多种特征表型的改变,最终表现为细菌毒力的差异。影响相变发生的因素目前尚未完全明确。有研究认为,肺炎链球菌中,I型限制性甲基化系统SpnD39Ⅲ中编码序列识别亚基的三个hsdS同源基因的重组会导致识别的甲基化位点发生可逆性改变,进而引起细菌全基因组水平的差异甲基化导致相变的发生。SpnD39Ⅲ基因座中的重组酶PsrA被认为介导了hsdS同源基因的位点特异性重组。除此之外,可能还存在其他未知的重组系统参与该基因座的重组。本课题组前期发现了一个Mar R家族转录调控蛋白FabT(SPD_0379),其表达缺陷后会引起显着的生长表型改变。进一步研究显示其可能与细菌透明相的改变有关。本研究旨在探究转录调控因子FabT对已知的相变调控因素的调控作用以及可能涉及的未知因素的影响,为揭示肺炎链球菌相变的机制提供新的证据。方法分别使用Janus cassette,frameshift mutant,质粒双交换等方法构建了研究相关菌株。使用透明平板对各研究相关菌株进行了相变观察,评估菌落透明表型的改变。通过FITC-葡聚糖负染法、免疫荧光法、透射电镜、糖醛酸检测等方法对肺炎链球菌的荚膜表达水平进行了评估。利用qRT-PCR排除了lyt A或cps2A对相变的影响。分别通过体内与体外实验,探究FabT缺陷引起的相变对细菌粘附侵袭能力以及对系统性毒力的影响。利用转录组测序分析鉴定了可能受FabT调控并可能与相变相关的因子,筛选出了一个受FabT负调控的重组酶PsrA,其介导I型RM系统SpnD39Ⅲ的位点特异性重组。采用移码突变的方法构建PsrA缺陷菌株,比较FabT和PsrA发生缺陷或回复时的SpnD39III的重组改变,推测FabT和PsrA在介导相变过程中发挥作用的可能机制。结果在链霉素耐药的肺炎链球菌背景下,我们使用无标记的方法构建了fabT与cps突变株。缺陷fabT保留了下游54bp碱基,缺陷cps通过敲除dex B-cps2A基因间区域(cps启动子),该方法不在基因组上插入额外标记,避免产生极化效应。有荚膜型fabT突变株,在液体培养基中生长显示显着的生长缺陷,有提前死亡的出现。在血平板上显示出更小且粗糙凹陷的菌落。通过透明TSA平板(添加过氧化氢酶)培养,侧向打光显微观察,我们在fabT突变株中观察到透明型菌落比例的显着增加。我们在无荚膜的fabT突变株中观察到了一致的菌落透明型改变。我们通过FITC-葡聚糖负染法、免疫荧光法、透射电镜、糖醛酸检测等方法鉴定了肺炎链球菌荚膜含量的显着减少,无论是表面还是全菌水平。我们推测表面荚膜减少是由于FabT影响膜脂肪酸构成比例影响了荚膜前体在膜上的聚合与成熟,全菌水平的荚膜水平降低可能由于FabT通过未知通路调控了荚膜多糖合成。毒力实验证明,FabT引起的相变显着的降低了肺炎链球菌的系统性毒力水平。体内实验中,fabT突变株在小鼠鼻腔定植能力显着降低,在败血症模型中表现出生存率的增高。细胞黏附实验显示,fabT突变能减少肺炎链球菌对肺细胞上皮A549的黏附与侵袭作用。使用小鼠原代巨噬细胞进行抗吞噬实验显示抗吞噬能力增高,可能是由于其在细胞表面黏附能力降低导致的。提示fabT突变引起的透明型表型改变不仅与荚膜多糖改变相关,也影响了其他细胞表面黏附因子表达。转录组测序对fabT突变株中表达差异的基因进行鉴定,筛选出了67个上调基因,66个下调基因。其中一个I型限制性修饰系统SpnD39Ⅲ的序列识别亚基hsdS的基因转录水平发生显着改变,并伴有其中一个位点特异性重组酶PsrA的转录水平增加。我们通过荧光定量PCR验证了该重组酶的表达增高。重组酶PsrA通常会引起一对或数对反向重复序列IRs的倒位,催化的SpnD39Ⅲ基因座发生位点特异性重组,被认为与相变的发生相关。通过移码突变重组酶PsrA后,fabT缺陷引起的透明型菌落增加表型被完全逆转,提示PsrA的失活可直接引起不透明相的发生。为探究PsrA突变引起的SpnD39Ⅲ重组水平改变,我们使用荧光定量PCR对DNA倒位IRs的影响以及参与位点特异性重组的hsdS亚基进行了重组类型的检测。结果显示,PsrA失活后细菌完全丧失了IR1和IR3介导的倒位,提示PsrA完全催化这两组IRs介导的位点特异性重组过程。fabT突变升高的psrA表达引起了IR3的倒位水平改变。并且在fabT与psrA双突变的情况下,导致了基因组上IR2片段的丢失,提示除了PsrA介导的特异性重组之外,还有其他重组酶介导hsdS基因的切除与重组。hsdS等位基因检测结果显示,在psrA突变情况下,三对IRs介导的六种重组基因型在不同的菌中均被锁定存在,但由于他们在相变观察中均显示一致的不透明型,因此我们推测相变的发生仅与PsrA的活性相关,不与特定的等位基因型相关。此外,FabT与PsrA双突变菌株没有回复荚膜多糖的表达水平,表明FabT调控的荚膜多糖的表达并不是导致透明相变发生的原因。结论转录调控蛋白FabT影响肺炎链球菌生长稳定性,改变细菌菌落相变表型。FabT缺陷可引起细菌荚膜合成减少,并造成细菌系统性毒力的减弱。转录组测序显示FabT突变引起了上百个基因的转录水平改变,提示其在细菌中发挥一个全局性转录调控效应。催化I型RM系统SpnD39Ⅲ发生位点特异性重组的酪氨酸重组酶PsrA在fabT缺陷菌株中表达显着增加,FabT可通过PsrA依赖的方式调控SpnD39Ⅲ基因座的重组,同时引起细菌的相变表型改变。更为重要的是,FabT还存在一种PsrA非依赖的方式调控细菌的相变表型改变。

肖胜楠[2](2021)在《全局性转录调控因子Mga-like对肺炎链球菌荚膜和磷壁酸生物合成的调控研究》文中研究指明目的:全局性转录调控因子(Global transcriptional regulators)广泛存在于革兰阳性病原菌中。SPD_1587所编码的蛋白Mga-like就属于Mga/AtxA全局性转录调控因子家族的成员。该家族成员通过感应外周环境信号,直接或者间接与靶基因的调控区域结合从而调控靶基因的表达。荚膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和磷壁酸(teichoic acids,TAs)都是位于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)细胞表面的重要毒力因子。荚膜参与肺炎链球菌的调理吞噬作用,协助细菌逃避宿主免疫系统的清除。磷壁酸在肺炎链球菌粘附于宿主上呼吸道,内化进入非免疫细胞中发挥重要作用。前期实验中,我们筛选出Mga-like可能为cps的转录调控因子,并发现它还与磷壁酸合成相关基因lic1存在特异性结合。故本文旨在阐明mga-like对肺炎链球菌荚膜及磷壁酸的调控机制,并为理解肺炎链球菌从定植到侵袭性致病的发生机制提供了新思路。方法:我们首先利用红霉素抗性基因替代mga-like基因构建mga-like缺陷菌株(JH1101),和异位质粒整合构建mga-like回补菌株(JH1104)并绘制生长曲线,观测比较12h内各菌株的生长情况。之后于血平板上观察细菌的菌落形态、大小并且通过革兰染色镜下观察比较菌株的形态及链长。通过葡聚糖排阻实验及透射电镜观察表面荚膜厚度,通过Western blot进行荚膜条带模式的分析,并用流式细胞术及Western blot分别检测细菌表面和全菌裂解液中磷壁酸及磷酸胆碱的含量。EMSA及DNase I足迹实验探索Mga-like与cps启动子及lic1启动子的结合位点,并通过荧光定量PCR分析cps启动子及lic1启动子下游基因转录情况。通过体外毒力实验,检测JH1101抗吞噬及粘附能力的改变,通过体内毒力实验,检测JH1101在鼻咽部定植及引起系统性感染的能力。结果:我们成功构建出JH1101和JH1104菌株。通过所绘制的生长曲线得出mga-like的缺失并不影响肺炎链球菌的生长;通过观察血平板上菌落形态和革兰染色镜下形态得出,野生菌株JH1900,JH1101和JH1104的菌落形态,菌体大小,分裂情况及自溶时间均没有明显差异。透射电镜及FITC-葡聚糖排阻实验显示,JH1101的表面荚膜厚度与JH1900相比无显着性增加,但是免疫印迹法分析发现JH1101的小分子荚膜比JH1900增多,其条带模式发生显着变化。流式细胞术和免疫印迹实验显示,JH1101的磷壁酸和及其修饰于磷壁酸上的磷酸胆碱(phosphorylcholine,P-choline)含量显着增加。EMSA及DNase I足迹实验证明Mga-like与cps和lic1启动子存在特异性结合,且荧光定量PCR结果显示JH1101的cps和lic1启动子下游基因表达均显着增加。抗吞噬实验显示,JH1101并没有表现出明显优势,JH1900,JH1101和JH1104抵抗巨噬细胞的吞噬能力是一致的;粘附侵袭实验显示,JH1101与JH1900和JH1104相比较,表现出更强的侵袭能力;小鼠肺炎模型显示,JH1101鼻腔定植能力最强,并且更能通过血液侵袭进入脾脏,引起全身感染。结论:全局性转录调控因子Mga-like通过与cps和lic1启动子结合转录抑制荚膜和磷壁酸的合成,并造成荚膜小分子条带增多和全菌裂解液中总磷壁酸含量的增加。Mga-like介导的CPS和磷酸胆碱的转录调控增加了细菌的粘附和定植以及侵袭能力,在细菌侵袭性感染中具有重要作用。

赵尊全[3](2020)在《腺苷合成酶在致脑膜炎病原菌穿过血脑屏障中的作用及机制研究》文中研究指明尽管近代医学在抗生素使用和疫苗接种方面有着长足进步,脑膜炎的全球疾病负担在当前仍然很重,脑膜炎防治进展也远远落后于其他疫苗可预防的疾病。据报道在2016年全球脑膜炎发病近三百万例,造成数十万病患死亡。细菌性脑膜炎被认为是该疾病的最严重形式,其发病急,起病重,可导致患者出现死亡或严重后遗症。细菌性脑膜炎多由细胞外病原菌引起,且大多数病例都并发有菌血症。本研究关注于血源性细菌性脑膜炎发病的一个关键环节,即细菌如何突破血液与中枢神经系统之间的屏障而进入脑部。细菌穿过血液与中枢神经系统之间屏障的经典途径有三种:跨细胞模式、细胞旁模式和“特洛伊木马”模式。这些途径并非相互排斥,研究显示脑膜炎奈瑟球菌等致病菌可能通过多种途径从血液循环系统中侵入中枢神经系统。作为血液与中枢神经系统之间的重要天然屏障,血脑屏障不仅会阻隔病原体的入侵,也会阻碍治疗性药物的入脑。其中,一些研究显示,细胞外腺苷可以通过激活存在于脑微血管内皮细胞表面上的A1和A2A腺苷受体而改变血脑屏障通透性,该机制可应用于跨血脑屏障药物递送。另一方面,我们实验室前期工作从猪链球菌血清2型的胞壁蛋白中鉴定了一种5′-核苷酸酶(Ssads),该酶能够水解AMP、ADP、ATP水解而产生腺苷。猪链球菌血清2型在感染人类后可引发脑膜炎和链球菌中毒休克血症,并且是亚洲部分地区脑膜炎的主要致病菌。尽管存在着这些线索,目前尚未有病原菌腺苷合成酶促进菌体穿过血脑屏障的机制研究报道。在本研究第一部分中,我们旨在探讨腺苷合成酶Ssads在猪链球菌穿过血脑屏障过程中发挥的功能以及具体细胞分子机制。利用实验室近期优化的猪链球菌脑膜炎小鼠动物模型,研究发现感染腺苷合成酶基因缺陷猪链球菌(S.suisΔssads)的小鼠在感染后72h时脑中细菌载量明显低于野生型猪链球菌(S.suisWT)感染的小鼠,而它们在感染后5h和72h时血液中的细菌载量未见明显区别。对小鼠脑组织切片进行病理学分析发现,ssads基因缺陷使猪链球菌引发小鼠脑组织中脑膜增厚、出血和炎性细胞浸润的能力减弱。在以人脑微血管内皮细胞HCMEC/D3细胞系构建的体外血脑屏障模型上,我们发现腺苷合成酶介导的腺苷生成能够促进猪链球菌穿过HCMEC/D3细胞单层,但不会显着影响猪链球菌对HCMEC/D3细胞的黏附侵袭率。我们使用A1、A2A、A2B腺苷受体拮抗剂进行筛选实验,发现A1、A2A受体信号在猪链球菌穿透体外人血脑屏障过程中发挥重要作用。接下来细胞内cAMP测定实验以及A1腺苷受体激动剂、竞争性cAMP拮抗剂实验的结果均支持,A1腺苷受体级联信号的激活促进了猪链球菌穿过体外血脑屏障。我们使用由CRISPR技术编辑的HCMEC/D3细胞,A1腺苷受体激动剂/拮抗剂给药的小鼠以及CRISPR-CAS9技术构建的基因敲除小鼠进行实验,验证了Ssads的酶活性和A1腺苷受体信号传导对猪链球菌穿过血脑屏障的促进作用。此外,利用从小鼠脑组织分离的原代脑微血管内皮细胞进行荧光共聚焦实验及初步蛋白免疫印迹实验,我们发现腺苷合成酶介导腺苷生成或者A1腺苷受体信号可能促进了猪链球菌感染引起脑微血管内皮细胞的细胞骨架重排以及连接蛋白变化,并可能与MAPK途径信号分子中的ERK1/2蛋白及p38蛋白磷酸化相关。这部分的研究数据说明猪链球菌能够利用腺苷合成酶催化产生细胞外腺苷来促进其穿过血脑屏障。在本研究的第二部分中,我们探讨其他具有腺苷合成酶活性的病原菌是否也能利用催化产生细胞外腺苷来辅助脑膜炎疾病发生。我们通过序列比对及文献检索收集了具有腺苷合成酶基因的革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌信息,并借助MEGA软件(7.0)以最大似然法在“WAG+G+I+F”模型下对22个已识别或预测5′-核苷酸酶蛋白序列进行了系统进化学分析。利用磷酸根检测试剂盒,我们验证了多种致脑膜炎病原菌(包括B族链球菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)具有菌体暴露的腺苷合成酶活性,而肺炎链球菌不具备这种暴露的酶活性。接下来,我们评价5′-核苷酸酶抑制剂APCP对B族链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌穿过HCMEC/D3单层能力的影响,发现这三种细菌都可以穿过单层细胞屏障,而添加APCP会显着降低这些细菌穿过血脑屏障的能力。此外,我们实验室分离鉴定一株荚膜血清3型、MLST分型17型的B族链球菌,我们进一步探索了腺苷合成在B族链球菌进入小鼠脑部过程中的作用。借助定义明确且应用广泛的血源性B族链球菌脑膜炎小鼠模型,我们发现抑制5′-核苷酸酶活性可以抑制腺苷合成而显着降低感染后72h时小鼠脑中细菌载量。综合这部分研究数据显示,其他类似的致脑膜炎病原菌也可能通过合成细胞外腺苷来改变血脑屏障通透性从而促进细菌入侵中枢神经系统。

肖云菊[4](2020)在《细菌双组分系统YycF/YycG对肺炎链球菌荚膜多糖和磷壁酸多糖生物合成的调控研究》文中研究指明目的:细菌双组份系统(two-component system TCS)是广泛存在于微生物中的信号转导系统,可以使细菌在复杂多变的环境中感知并传导信号以维持自身生存。YycF/YycG双组份系统广泛存在于金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)等低G+C含量的革兰氏阳性菌中,参与细胞壁代谢、生物膜形成、细胞分裂等多种生理调节。在S.pn中,YycF/YycG参与细胞壁代谢,脂肪酸合成和毒力调控,其编码反应调节子YycF蛋白的基因是细菌生长的必需基因。荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)是S.pn重要的毒力因子,英国生物学家Griffith在上世纪初就发现S.pn的CPS受环境信号的调控,但具体调控机制至今尚不明确。磷壁酸(Teichoic acids,TAs)是S.pn细胞壁主要组成成分,参与细菌的分裂、粘附侵袭等多种生物活动,也是S.pn重要的毒力因子。在枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等研究中显示,YycF/YycG双组份系统在细胞壁的新陈代谢、多糖合成、细菌分裂等方面扮演了重要角色。本研究旨在探究YycF/YycG双组份系统是否参与肺炎链球菌CPS和TAs的合成调控,并确定其对S.pn致病能力的影响。方法:通过JC(Janus cassette)反选的方法构建pcsB组成型表达菌株JH1002(Pc-PcsB+)。采用长臂同源多聚酶链式反应(long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)技术用红霉素(erm)替代yycF基因构建yycF缺陷菌株JH1003;以D39链霉素抗性菌株(D39rpsl41)为背景菌株,采用JC(Janus cassette)反选的方法构建无插入基因的△yycG突变菌株JH1005。体外培养D39rpsl41、JH1002、JH1003、JH1005菌株,通过连续观测细菌的吸光度值(OD600)绘制生长曲线;光学显微镜下观察JH1003、JH1005菌株形态改变;Western blot,ELISA分析yycF和yycG突变菌株CPS和TAs含量变化;体外实验检测突变菌株抗巨噬细胞吞噬能力和细菌粘附侵袭能力改变;通过鼻腔滴入构建肺炎模型,观察小鼠生存率和细菌定植能力差异。结果:成功构建yycF突变菌株JH1003和yycG突变菌株JH1005;生长曲线结果显示,与JH1002(Pc-PcsB+)背景菌株相比,yycF缺陷菌株生长缓慢,且平台期缩短;yycG突变菌株生长较野生菌缓慢。镜下发现yycF和yycG缺陷后细菌分裂异常;Western blot实验结果显示,全菌裂解液中yycF,yycG缺陷后小分子CPS和TAs含量增多。EMSA结果显示,YycF蛋白与lic1启动子序列有特异性结合,但并未发现YycF蛋白与cps基因簇启动子有特异性结合;荧光定量PCR结果显示,yycF缺陷后,lic1启动子下游tarI基因的转录水平显着增高。粘附侵袭实验结果显示,yycF缺陷菌粘附能力减弱(P=0.006),侵袭能力无显着差异,yycG缺陷菌粘附(P=0.002)和侵袭能力(P=0.005)较D39rpsl41菌株均减弱。抗吞噬实验显示yycF缺陷后细菌抗吞噬能力较亲本菌株没有显着差异,yycG缺陷后细菌抗吞噬能力增强(P=0.013)。体内毒力实验显示,感染野生菌的小鼠全部死亡,感染JH1002,JH1003菌株死亡率分别为91.7%、75%,虽然二者没有统计学差异(P=0.183),但JH1003菌株感染组有降低趋势。JH1005菌株感染组死亡率比野生菌感染组显着降低(P=0.0005);定植结果显示,yycF缺陷菌株感染组的肺匀浆菌载量显着低于对照组(P=0.033),yycG缺陷菌株感染组的肺匀浆菌载量也显着低于野生菌感染组(P=0.006)。结论:肺炎链球菌YycF作为转录调节因子,可通过与TAs合成相关基因的启动子区域结合从而负调控细菌TAs的前体合成,同时负调控CPS的前体合成。yycF和yycG缺陷后细菌的致病能力减弱。

周梦兰[5](2020)在《中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌流行病学、药物敏感性及毒力差异研究》文中指出目的:从基因水平、蛋白水平及细胞壁多糖水平对肺炎链球菌(SP)准确鉴定方法学进行探究;分析我国多中心侵袭性SP的血清学分型和分子流行病学分型;对我国侵袭性SP药物敏感性及青霉素结合蛋白(PBP)进行突变分析;研究我国侵袭性SP主要流行血清型毒力差异。方法:本研究纳入北京协和医院181株草绿色链球菌(VGS)及2010-2015年全国27家中心分离的300株侵袭性SP。以16S rRNA和gyrB基因测序为金标准,比较两台质谱仪对181株VGS的鉴定性能。通过流式细胞仪和高分辨率荧光显微镜分析双花扁豆凝集素(Dolichos biflorus agglutinin,DBA)和蜗牛凝集素(Helix pomatia agglutinin,HPA)与不同血清型SP细胞壁的结合情况,通过Janus Cassette和pPEP1表达质粒构建基因敲除及回补株,探究磷酰胆碱酯酶(Pce)对结合的影响。通过荚膜肿胀试验和多位点序列分型(MLST)对300株侵袭性SP进行血清型分型和分子分型,比较多重PCR和cpsB基因测序的方法进行血清分型的准确性。以标准微量肉汤稀释法检测20种抗菌药物的体外敏感性;对pbpla、pbp2b和pbp2x进行扩增测序并分析其位点突变情况,研究青霉素耐药表型与基因型的关系。通过小鼠腹腔感染菌血症模型对我国主要流行血清型进行毒力差异研究,通过荧光定量PCR的方法比较血清群6内不同菌株非荚膜相关毒力基因ply、lytA、nanA、psaA、pspA及HylA的mRNA表达水平。结果:布鲁克质谱对VGS缓症群区分度较差,易将缓症链球菌、口腔链球菌及假肺炎链球菌鉴定为SP。梅里埃质谱IVD系统对SP的鉴定敏感性和特异性高,但由于菌种库限制,缓症链球菌/口腔链球菌以复合体结果展示。基于此结果建立了质谱联合16S rRNA和gyrB基因测序的实验室VGS鉴定流程。DBA/HPA与SP细胞壁磷壁酸结合,依赖于菌株体内Pce活性,首次发现pce allele B,仅见于血清型11A和11E的菌株。我国SP引起的IPD患者中,以儿童居多,尤以5岁以下儿童居多,约占所有侵袭性感染SP疾病的50%,以血流感染为主。共检测出40种血清型,1株不可分型(NT)株,常见血清型依次为23F、19A、19F、3、14、6A 和 6B,PCV7、PCV10、PCV13 及 PPV23 的覆盖率分别为 42.3%、45.3%、73.3%和79.3%。从检测准确性及操作简便性考虑,cpsB基因测序分型优于多重PCR血清分型方法,适合大多数实验室采用。MLST共检测出123种序列型(ST),其中33个为首次发现,以ST320、ST81、ST271、ST876最为常见,几个主要的克隆复合群与血清型具有明显的对应关系,CC320→19A、CC271→19F、CC81/CC880→23F、CC876→14、CC3173→6A、CC505→3。我国分离的侵袭性SP对厄他培南、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺及万古霉素全部敏感,而对阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、克林霉素、氯霉素和四环素耐药率均超过90%。除亚胺培南外,侵袭性SP对其他抗菌药物2010年至2015年耐药率均有所下降。血清型23F、19A和19F是主要的耐药血清型,血清型3敏感性较高;ST271、ST320及ST81是主要的耐药序列型,ST180和ST505对大部分抗菌药物的敏感性较高。疫苗覆盖血清型菌株对大部分抗菌药物耐药率均高于非疫苗覆盖血清型菌株。2010-2015年间疫苗非覆盖血清型菌株对部分抗菌药物年度耐药率呈上升趋势。脑脊液分离的侵袭性SP对青霉素耐药率较高,而非脑脊液(主要为血液来源)分离的侵袭性SP无耐药株。菌株PBP蛋白突变呈高度多样化,主要与青霉素MIC有关,与样本来源、判定折点无关。青霉素MIC值≤0.25μg/ml的菌株均无PBP活性位点突变,1株血清型6A(MIC=0.25 μg/ml)除外(PBP2b活性中心发生T451A突变)。青霉素MIC值≥0.5 μg/ml的菌株均存在不同程度的PBP活性位点突变。青霉素高MIC水平(MIC≥1 μg/ml)的菌株均存在PBP1a活性位点突变,并同时伴有PBP2b和PBP2x突变。非脑脊液来源的侵袭性SP即使表型判定为敏感,仍存在不同PBP活性位点的突变,临床使用需注意。PBP1a分析序列中共检测出105个不同的点突变,PBP2b分析序列中共检测出111个不同的点突变及2个插入突变,2个插入突变YIW和YTW分别位于2株血液来源PSSP中,均为国际首次报道。PBP2x分析序列中共检测出98个不同的点突变。小鼠体内试验显示,血清型3为强毒力血清型,血清型23F、19A、19F和14表现为无毒力,血清群6内不同血清型、不同菌株间毒力水平有所差异。血清群6内菌株各毒力因子的表达水平与动物实验毒力水平间无明显对应关系。结论:梅里埃质谱IVD系统对SP的鉴定性能优于布鲁克质谱,可用于SP的准确鉴定。DBA/HPA可以与不同血清型肺炎链球菌结合,磷酰胆碱酯酶基因pce是DBA/HPA与SP结合的决定性因素,pce allele B仅在血清型11A和11E菌株中发现,或可用于血清型预测。我国侵袭性SP以血清型23F、19A、19F、3、14、6A和6B为主,以ST320、ST81、ST271、ST876最为常见。尽管我国疫苗接种率较低,非疫苗覆盖血清型分离率呈上升趋势,出现血清型转换,可能为抗菌药物选择性压力结果。PBP1a活性位点突变是引起菌株青霉素高MIC水平(MIC≥1μg/ml)的必要条件,但需同时伴有PBP2b和/或PBP2x突变。我国流行血清型3菌株呈高毒力、低耐药特点。血清型23F、19A、19F、14呈低毒力、高耐药特点,而血清型6A、6B及6C的菌株间毒力水平不一。本研究为提高常规实验室SP准确鉴定能力、了解我国侵袭性感染SP血清学、分子型别、耐药性及主要流行血清型毒力情况提供了重要的参考依据,也为我国疫苗的使用或研发提供流行病学基础。

王玲[6](2020)在《肺炎链球菌PepN对细菌毒力的影响及其致病机制研究》文中研究表明目的:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)是一种革兰氏阳性病原体,在全球具有很高的发病率和死亡率,尤其危及儿童和老年人。当前,肺炎链球菌的耐药率不断升高,而且在市面上使用的疫苗保护效果也不令人满意。因此,努力寻找和开发新型肺炎链球菌毒力蛋白并研究其对肺炎链球菌的致病机理,有助于为预防和治疗肺炎链球菌感染提供新思路。之前的研究表明,肺炎链球菌氨肽酶N(aminopeptidase N,PepN)不仅可与肺炎链球菌毒力蛋白热休克蛋白ClpE相互作用,而且能抑制细胞毒性T淋巴细胞的效应功能,表明PepN极有可能是肺炎链球菌的毒力因子。然而,PepN在肺炎链球菌毒力中的作用及其致病机制仍有待探究证实。本研究的目的是探讨PepN对肺炎链球菌毒力的影响及其致病机制进行研究。方法:利用原核表达系统制备重组PepN(rPepN)蛋白。通过Western blot检测PepN在肺炎链球菌中的表达。采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)技术将pepN基因替换为红霉素耐药基因(erm)后同源重组于肺炎链球菌TIGR4,在含红霉素的哥伦比亚血平板上筛选并鉴定pepN缺陷菌株。模拟肺炎链球菌自然感染途径将野生菌TIGR4与缺陷菌TIGR4△pepN经鼻腔粘膜感染小鼠,探究该基因的缺失对肺炎链球菌致病能力的影响。通过体内定植实验和体外粘附侵袭实验,阐明该基因在细菌致病过程中的作用。采用荧光定量PCR方法探讨了PepN蛋白对细菌其他毒力蛋白的影响。通过ELISA,苏木精-伊红(HE)染色检测TIGR4与TIGR4△pepN感染小鼠肺部炎症情况及构建气管内滴注rPepN的小鼠模型,在体内评价PepN的促炎效应。采用小鼠腹腔分离的原代巨噬细胞在体外研究PepN对宿主固有免疫的影响以及相关的信号通路。结果:本研究的结果表明PepN蛋白在肺炎链球菌各种血清型中均有表达,且存在于细菌培养基上清、细胞壁和原生质体中。缺失pepN基因的肺炎链球菌TIGR4明显提高了小鼠的生存率,小鼠肺部及鼻腔灌洗液中的细菌载量明显减少,体外粘附侵袭宿主细胞的能力显着减弱,其他肺炎链球菌关键毒力因子的表达水平也显着减少。PepN在体内外均能诱导小鼠较强的炎症反应并通过MAPK和PI3K/AKT信号分子的磷酸化,诱导原代腹膜巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α,且通过特异性的信号通路抑制剂加以证实。结论:PepN是一种新的肺炎链球菌毒力因子,可通过MAPK和PI3K/AKT信号传导途径激活宿主天然免疫反应。

张悦[7](2020)在《肺炎链球菌PspA蛋白疫苗的联合免疫及PspA抗体的粘附抑制实验方法研究》文中认为当前市售多糖疫苗的保护作用十分有限,因此非常有必要开发新型的肺炎链球菌蛋白疫苗。我们最近报道了一种含有PspA家族1和2蛋白的肺炎链球菌系统疫苗和一种含有PspA2和PspA4蛋白片段的肺炎链球菌粘膜疫苗。结果发现两种疫苗都具有显着的保护潜能,但引起的保护性免疫反应各有特点。系统疫苗的皮下免疫可以诱导更明显的IgG抗体反应,粘膜疫苗的鼻内免疫可以诱导更明显的sIgA抗体反应。我们推测是否两种疫苗的联合免疫可能会引起更明显和更广泛的保护性免疫反应?因此,本研究评价了系统疫苗和粘膜疫苗进行联合免疫的有效性。结果表明,联合免疫不仅诱导产生了高水平的IgG抗体,而且诱导产生了高水平的sIgA抗体,从而有效地清除了肺部的肺炎链球菌。系统初免-粘膜加强免疫比单独的系统或粘膜免疫提供了更好的保护。此外,它比粘膜初免-系统加强免疫诱导出更强的Th1和Th17细胞介导的免疫反应。这些结果表明,系统疫苗和粘膜疫苗的联合免疫可以诱导出强大的系统和粘膜免疫反应,并且针对致命的肺炎链球菌感染可以提供最大限度的保护。调理吞噬实验是体外评价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的重要方法。但是,针对新型的肺炎链球菌蛋白疫苗,目前还没有有效的体外评价方法。在实验室的前期工作中,我们分别用被动免疫实验和补体抑制实验评价了PspA蛋白疫苗的有效性,但是并没有获得理想的结果。有研究表明,PspA在肺炎链球菌鼻咽定植中发挥了重要作用。我们认为PspA抗体可能具有抑制细菌粘附的功能。因此,本研究建立了针对PspA抗体的粘附抑制实验方法并以此方法评价了PspA蛋白疫苗的有效性。结果表明,PspA血清可以有效抑制不同PspA亚类菌株的粘附,并且对各亚类菌株的抑制率都大于50%。粘附抑制实验可以作为体外评价肺炎链球菌蛋白疫苗的一种新方法,但是,此方法的具体机制在未来需要进一步研究。

肖云菊,张竞辉,肖胜楠,尹一兵,张雪梅[8](2020)在《肺炎链球菌pcsB组成型表达的yycF缺陷菌株的构建及其致病能力》文中认为【背景】YycFG双组分系统是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S. pn)应对外界环境的重要信息传递系统,其中表达反应调节子YycF的编码基因是肺炎链球菌生长的必需基因,但其是否调控细菌毒力尚不清楚。【目的】构建肺炎链球菌pcsB组成型表达及yycF缺陷菌,分析YycF对肺炎链球菌生物学特征和毒力的影响。【方法】采用Janus cassette (JC)反选的方法构建pcsB组成型表达菌株(Pc-PcsB+),从该菌株出发用替代失活的方法构建yycF缺陷菌株(Pc-PcsB+DyycF),比较野生株D39rpsl41、pcsB组成型表达株及yycF缺陷株的生长特性、荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)含量、粘附侵袭能力和致病性的差异。【结果】成功构建pcsB组成型表达的yycF缺陷菌株(Pc-PcsB+DyycF);yycF缺陷导致细菌生长缓慢、分裂异常、胞内荚膜多糖和小分子荚膜多糖增多;体外实验结果显示,yycF缺陷菌株粘附能力较Pc-PcsB+菌株减弱(P=0.006)。体内毒力实验显示,感染野生菌的小鼠全部死亡,感染Pc-PcsB+和Pc-PcsB+DyycF菌株的小鼠死亡率分别为91.7%、75%,二者没有统计学差异(P=0.183),但Pc-PcsB+DyycF菌株感染组有降低趋势;定殖结果显示,yycF缺陷菌株感染组的肺匀浆菌载量显着低于对照组(P=0.033)。【结论】成功构建yycF缺陷菌株,并初步证明yycF基因会影响肺炎链球菌的生物性状和致病能力,为后续探讨YycFG双组分系统对肺炎链球菌致病能力调控机制的研究奠定了基础。

朱寅初[9](2019)在《ComRS系统介导的猪链球菌基因改造方法构建及生物功能分析》文中研究表明猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是重要的人畜共患病原,可引起细菌性脑膜炎、关节炎、败血症和急性休克致死;流行性广,在全球范围内均有发病报道。该菌血清型多样并在持续变异,已超56种;基因组更是繁杂,核酸交流传递频繁。自然转化指部分细菌在生长初期自然进入感受态模式,主动摄入周围环境中的外源核酸物质,通过同源重组整合至自身染色体,丰富基因多样性的过程。作为链球菌核酸水平转移的重要方式,自然转化对促进细菌进化变异以适应环境,感染宿主有特殊意义。目前猪链球菌自然转化相关的功能研究较少,具体功能蛋白并不清楚。本研究利用SS自然转化能力开发出可快速进行基因改造的方法,为分子研究提供便利,并对ComRS系统的多样性及转化的贡献尝试分析;同时深入挖掘核心功能元件ComRS系统及其间接调控的CrfP胞壁水解酶在感受态进程和细菌毒力上的作用。随后通过进化分析阐明SS2弱毒菌株和SS3、SS7起源相近;并且SS2、SS3和SS7荚膜基因簇重组演化可造成SS2菌株内毒力分群、分子防御系统及ComRS系统多样性现象。为进一步研究SS自然转化机制及荚膜基因簇易变性对细菌生物学的影响提供新的认识和理论基础。1基于ComRS系统的猪链球菌快速缺失方法构建猪链球菌基因组差异大,致病机制复杂,不能一概而论。其中对于基因的分析更是探索明确其致病机制的的重要方式,但依靠传统电转穿梭质粒进行缺失或改造目的基因的方法在部分临床菌株中并不适用,典型的如SS Chz菌株。已知猪链球菌中ComRS系统通过ComR识别信号多肽,激活并调控自然转化功能基因,负责转化完成。根据氨基酸序列进化分析,可鉴定出SS菌株中存在三类ComRS系统。经试验测定目前发现的所有ComRS系统均可实现自然转化,但不同菌株间转化效率存在明显差异,且与ComRS类型及致病能力无关。基于菌株的转化特性,尝试直接使用PCR产物作为模板建立快捷的无痕缺失方法应用于猪链球菌。构建新的缺失策略首先需要融合PCR组成sacB-spc筛选基因盒,并以目的基因两侧同源臂为媒介,再使用两步法转化完成;第一步以壮观霉素耐受为正向筛选,第二步以蔗糖敏感作为反向筛选,经染色体基因组自身同源重组完成无痕替换。PCR模板中同源臂长度及浓度直接影响转化阳性效率。此方法相较以往具有明显速度快捷和操作便利等优势,且可在不同血清型猪链球菌中广泛使用,具有普适性。2 ComR调控因子对猪链球菌2型毒力的影响ComR作为典型的Rgg样家族成员,由N端的DNA结合域和C端的多肽接受域组成,是负责猪链球菌感受态机制的必须调控因子。通过NCBI 比对及实验室菌种库PCR检测,注意到SS2强毒株均存在A型ComR,有别于弱毒株(B型ComR),可能是潜在的毒力因子。以ZY05719为模型,比较体内外转录差异发现comR在宿主血液中转录增强,提示ComR可能对SS2菌株的致病能力有促进作用。缺失comR基因,比较野生株与缺失株可知ComR可增强SS2对HEp-2和HBMEC细胞的黏附能力;经体外的猪全血杀伤,△comR的存活能力较野生株减弱。BALB/c小鼠模型的感染试验又表明,敲除comR导致SS2对小鼠的致死率和组织脏器载菌量都明显下降。炎性因子的转录检测显示,△comR感染小鼠后IL-6、TNF-α等转录高于野生株,更有助于机体清除细菌。上述结果证实ComR是毒力相关因子,在SS2感染过程中参与黏附、抵抗宿主杀伤。3猪链球菌胞壁水解酶CrfP对自然转化和毒力的功能研究近年来,猪链球菌的自然转化能力已经得到证实,但作为重要的核酸水平转移机制,围绕它的研究依然存在诸多不明。当链球菌进入感受态模式时,会激发转化相关基因表达,开启外源DNA的捕捉,摄入,转运及整合重组。除转化必须结构基因外,部分辅助性元件也在转化进程中发挥着重要作用如胞壁水解酶或细菌素多肽,可裂解非感受态自身细胞及亲缘相近种属链球菌,以掠夺核酸用于自身同源重组促使进化。本文通过氨基酸同源比对和qRT-PCR鉴定发现所有SS菌株中均存在与转化相关的特异性胞壁水解酶;启动子区域存在CIN-boxmotif,经qRT-PCR确认受感受态调控。生物信息学分析可知CrfP由CHAP和SH3b结构域共同组成,CHAP功能域发挥裂解活性,SH3b则识别结合底物,缺少SH3b结合目标底物将导致裂解功能丧失。试验证实CrfP可分泌至细胞外发挥作用,蛋白与细菌体外互作试验更表明CrfP能裂解不同血清型SS,但不能作用于其他种属菌株,提示其具有明显的宿主特异性。缺失crfP基因后直接导致菌株自然转化效率骤降,严重阻碍转化发生。比较野生株和缺失株生物学特性可知两者无差异,CrfP并不影响细菌生长及生物被膜形成。利用HEp-2和HBMEC上皮细胞黏附试验评估细菌致病作用,结果显示CrfP参与细菌对宿主的黏附过程;模式动物感染实验结果也显示失活CrfP直接导致SS2致病力的下降。综上,本研究为猪链球菌自然转化过程的发生及致病机制的研究提供更深入的认知。4猪链球菌2型和3型荚膜基因簇的演化分析猪链球菌荚膜基因簇的变异可决定其血清型的繁杂。不同地区血清型流行性和致病力存在差异,但是前期研究发现SS2内不同菌株毒力水平差异较大,同时关注到SS2弱毒株与SS3、SS7拥有相同ComRS系统。为阐明该现象分子原因,首先对实验室所有SS2、SS3、SS7进行毒力基因分型与MLST分型,进一步发现SS2弱毒菌株与SS3、SS7菌株核酸背景更为相近;相同ST型意味着可追溯到共同起源。鉴于荚膜基因簇的交换与重组在链球菌中的频发,推测上述3个血清型间可能存在荚膜基因簇重组。25株不同血清型SS的全基因组进化树表明SS2强毒亚群和SS2弱毒亚群、SS3、SS7分属两个分支,指明进化方向差异巨大;后面三者起源于相同祖先,SS2弱毒亚群与SS3、SS7的基因组共线性程度及平均核酸同源性(ANI)也更高。不仅如此在保守的核酸防御系统与感受态调控机制上,三者也高度一致,有别于SS2强毒亚群。为阐述造成其血清型差异原因,直接对荚膜基因簇分析显示不同SS cps基因簇两侧都存在高度保守的同源序列,可作为同源重组的基础;而SS2弱毒菌株荚膜基因簇中虽以cps2为主体,但是末端出现与cps3高度同源的基因,基于荚膜基因簇本身的易变性,综合前述序列分析推测SS3和SS2荚膜基因簇可能经由此位置的同源核酸发生重组后置换,进而造就与SS3菌株基因组高度相似,血清型不同的2型弱毒菌株。尽管尚不清楚荚膜基因簇交换的驱使压力及生理变化意义,但本次研究首次揭示SS中潜在的荚膜交换现象,追溯SS2弱毒菌株的起源,也为流行病学的调查及致病机制的研究提供新的认识。

陈晓瑞[10](2019)在《肺炎链球菌PspAs蛋白疫苗佐剂筛选和体外评价方法研究》文中研究说明肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原体,主要定植于鼻咽处的呼吸道粘膜中。据统计,每年有几百万人死于肺炎链球菌感染,婴幼儿和老年人所占比例较高。虽然荚膜多糖疫苗和荚膜多糖蛋白结合疫苗已经进入市场,但因血清型限制,导致其保护性有限且容易引起血清型替代现象。肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)是一种存在于所有肺炎链球菌中的具有高免疫原性的表面蛋白,分为3个家族和6个亚类,可诱导机体产生较高的免疫反应。在本实验室的前期实验结果中,我们构建了一种PspA蛋白联合疫苗PspAs,它包括PsaA-PspA23蛋白和PspA4蛋白,相比于Ppv23疫苗,其产生了较好的免疫原性及免疫保护性。然而,PspAs疫苗对一些菌株没有很好的保护能力。本研究的目的是通过筛选并加入有效的佐剂以提高PspAs疫苗的有效性。我们选择四种佐剂(氢氧化铝、MF59、AS03、AS02)与PspAs蛋白进行联合免疫,并进行佐剂剂量优化和免疫评价,测定了小鼠抗体效价、抗体IgG分型、血肺菌载量、存活率和细胞因子水平。结果表明,所有疫苗在抗原特异性免疫球蛋白G(IgG)效价方面均显示出佐剂剂量依赖性的改善,同时,用PspAs蛋白与各种佐剂联合免疫的小鼠菌肺及菌血载量明显减少。而在这些联合免疫疫苗中,AS02佐剂PspAs疫苗诱导的IgG效价高于其他佐剂,且对不同家族、不同亚类的病原菌具有较好的保护作用。此外,只有AS02组显示了高水平的细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4。这些结果表明,AS02与PspAs蛋白联合应用有望成为下一代肺炎疫苗。调理吞噬实验能够有效的评价荚膜多糖疫苗的有效性。但肺炎蛋白疫苗却缺少有效的体外评价方法。本论文评价了被动免疫实验、调理吞噬实验和补体抑制实验三种体外方法。在被动免疫实验中,首先确定了实验流程,即采用兔血清腹腔注射小鼠,注射6小时后,进行攻毒实验。然后,利用被动免疫实验方法评价了两株不同的肺炎链球菌的攻毒保护能力。结果显示随着血清稀释倍数的增大,小鼠的存活率逐渐下降。在调理吞噬和补体抑制实验中,评价了4株不同的肺炎链球菌。根据实验结果,调理吞噬实验不能准确的评价PspAs疫苗的有效性,与之相比,补体抑制实验更适合。但是补体为什么能够在PspAs抗体存在时对肺炎链球菌产生抑制作用的机制还不清楚。为了进一步探究PspA蛋白对补体抑制效果的影响,我们构建了PspA蛋白缺陷的肺炎链球菌并进行了补体抑制实验。结果显示,PspA蛋白缺陷的菌株与野生型菌株相比,荚膜多糖疫苗的免疫血清组的抑制效果有了明显的提升,这表明PspA具有阻碍补体介导的菌体生长抑制的作用,这一发现为肺炎链球菌PspA蛋白疫苗体外评价方法的建立提供了新的思路。

二、肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究(论文开题报告)

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究(论文提纲范文)

(1)MarR型转录调控因子FabT对肺炎链球菌菌落相变调控的研究(论文提纲范文)

符号说明
中文摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 肺炎链球菌转录调控因子FabT对细菌菌落表型的影响
    1.实验材料
        1.1 菌株和质粒
        1.2 实验试剂和仪器
        1.3 生长条件
    2.实验方法
        2.1 研究相关菌株的构建
        2.2 实施荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因转录水平与特异性片段拷贝数
        2.3 Western blot检测flag-tag和 GAPDH的表达水平
        2.4 生长曲线测定
        2.5 相变观察
        2.6 葡聚糖排阻实验检测CPS
        2.7 免疫荧光法检测CPS
        2.8 透射电镜检测
        2.9 糖醛酸法检测荚膜含量
        2.10 细菌毒力实验
        2.11 统计学分析
    3.实验结果
        3.1 构建研究所需菌株
        3.2 fabT缺陷引起细菌生长表型改变
        3.3 fabT缺陷引起肺炎链球菌荚膜减少
        3.4 fabT缺陷导致肺炎链球菌毒力受损
    4.讨论
第二部分 转录调控因子FabT影响肺炎链球菌相改变的分子机制
    1.实验材料
        1.1 菌株与质粒
        1.2 实验试剂和仪器
    2.实验方法
        2.1 转录组测序
        2.2 psrA移码突变菌株构建
        2.3 荧光定量PCR检测Spn D39Ⅲ等位基因型基因型与表型改变
    3.实验结果
        3.1 转录组测序探索FabT调控蛋白
        3.2 肺炎链球菌psrA突变菌株的细菌表型改变
        3.3 重组酶PsrA介导hsdS等位基因的重组
        3.4 FabT对 hsdS等位基因重组调控的机制探索
        3.5 回补菌验证fabT缺陷引起SpnD39Ⅲ等位基因重组改变的机制
    4.讨论
全文总结
附表
参考文献
文献综述 表型异质性的分子机制——菌群内DNA倒位引起的位点特异性重组
    参考文献
致谢
博士期间的论文发表情况

(2)全局性转录调控因子Mga-like对肺炎链球菌荚膜和磷壁酸生物合成的调控研究(论文提纲范文)

符号说明
摘要
ABSTRACT
前言
1.实验材料
    1.1 菌株与质粒
    1.2 实验试剂
    1.3 引物
    1.4 实验动物
2.实验方法
    2.1 构建缺陷菌株
    2.2 构建Ppepz-Mga-like重组质粒
    2.3 构建mga-like缺陷异位回补菌株
    2.4 mga-like缺陷对细菌生长影响观察
    2.5 Western blot
    2.6 ELISA
    2.7 流式细胞术检测磷壁酸和磷酸胆碱
    2.8 EMSA
    2.9 DNase I footprinting assay分析转录结合位点
    2.10 细菌总RNA的提取
    2.11 抗吞噬和粘附实验
    2.12 动物实验
3.实验结果
    3.1 构建并鉴定mga-like敲除菌株及mga-like回补菌株
    3.2 表型观察
    3.3 荚膜检测
    3.4 磷壁酸的检测
    3.5 表达蛋白
    3.6 Mga-like与cps的转录调控位点确认
    3.7 Mga-like与lic1的转录调控位点确认
    3.8 Mga-like对cps和lic1启动子基因下游的转录调控
    3.9 毒力实验
4.讨论
全文总结
参考文献
文献综述 Mga/AtxA全局性转录调控家族的转录调控因子研究现状
    参考文献
致谢
攻读硕士期间发表的学术论文题目

(3)腺苷合成酶在致脑膜炎病原菌穿过血脑屏障中的作用及机制研究(论文提纲范文)

缩略语表
摘要
Abstract
前言
第一章 猪链球菌利用腺苷合成酶来促进其穿过血脑屏障
    1 腺苷合成酶基因缺陷减弱了猪链球菌引发小鼠脑膜炎的能力
        1.1 引言
        1.2 材料与方法
        1.3 实验结果
        1.4 讨论
    2 猪链球菌通过Ssads介导的腺苷合成来穿过体外血脑屏障
        2.1 引言
        2.2 材料与方法
        2.3 实验结果
        2.4 讨论
    3 脑微血管内皮细胞被猪链球菌感染时的腺苷受体信号
        3.1 引言
        3.2 材料与方法
        3.3 结果
        3.4 讨论
    4 A1腺苷受体信号在猪链球菌脑膜炎的小鼠动物模型中的功能
        4.1 引言
        4.2 材料与方法
        4.3 结果
        4.4 讨论
    5 腺苷合成酶Ssads对脑微血管内皮细胞细胞骨架重排的影响
        5.1 引言
        5.2 材料与方法
        5.3 结果
        5.4 讨论
第二章 腺苷合成促进致脑膜炎病原菌入侵中枢神经系统
    6 其他细菌中的腺苷合成酶基因及腺苷合成酶活性
        6.1 引言
        6.2 材料与方法
        6.3 结果
        6.4 讨论
    7 腺苷合成酶活性对B族链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌穿过体外血脑屏障模型能力的影响
        7.1 引言
        7.2 材料与方法
        7.3 结果
        7.4 讨论
    8 腺苷合成酶活性对B族链球菌引发小鼠脑膜炎的影响
        8.1 引言
        8.2 材料与方法
        8.3 结果
        8.4 讨论
第三章 结论与展望
参考文献
作者在学期间取得的学术成果
主要简历
致谢

(4)细菌双组分系统YycF/YycG对肺炎链球菌荚膜多糖和磷壁酸多糖生物合成的调控研究(论文提纲范文)

英汉缩略语名词对照
中文摘要
英文摘要
前言
1 实验材料
    1.1 菌株与质粒
    1.2 引物
    1.3 实验试剂和仪器
    1.4 实验动物
2 实验方法
    2.1 yycF基因缺陷菌的构建及鉴定
        2.1.1 Pc-PcsB~+菌株的构建和鉴定
        2.1.2 Pc-PcsB+△yycF的构建与鉴定
        2.1.3 yycG基因缺陷菌株的构建与鉴定
    2.2 肺炎链球菌的实验室转化
    2.3 YycF蛋白的体外重组表达
    2.4 生长曲线
    2.5 细菌形态学观察
    2.6 全菌裂解液的制备
    2.7 Western blotting
    2.8 ELISA检测S.pn荚膜多糖和磷壁酸的含量变化
    2.9 FITC-葡聚糖法检测荚膜多糖含量
    2.10 EMSA验证YycF蛋白与CPS和TAs合成相关启动子的结合
        2.10.1 合成CPS与TAs相关启动子探针序列
        2.10.2 EMSA验证YycF蛋白与TAs合成相关启动子的特异性结合
    2.11 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)
    2.12 粘附侵袭实验
    2.13 S.pn抗巨噬细胞吞噬实验
    2.14 细菌毒力实验
        2.14.1 小鼠的生存率观察
        2.14.2 小鼠的细菌载量
    2.15 统计学分析
3 实验结果
    3.1 构建并验证JH1002(Pc-PcsB~+)菌株
    3.2 构建并验证JH1003(Pc-PcsB~+△yycF)菌株
    3.3 构建并验证JH1005(△yycG)菌株
    3.4 定量PCR验证yycF,yycG缺陷菌
    3.5 YycF重组蛋白的诱导表达及纯化
    3.6 细菌生长情况
        3.6.1 生长曲线
        3.6.2 形态学分析
    3.7 全菌CPS和TAs含量改变
    3.8 EMSA验证YycF蛋白(非磷酸化)与CPS和TAs合成相关基因启动子的结合
    3.9 YycF负性调控TAs合成相关基因的表达
    3.10 yycFG基因的缺失引起细菌毒力减弱
        3.10.1 yycFG缺陷菌株体外粘附能力减弱
        3.10.2 yycFG缺陷菌株抗巨噬细胞吞噬能力的变化
        3.10.3 yycFG缺陷菌株致病能力减弱
4 讨论
全文总结
参考文献
文献综述 细菌YycF/YycG双组份系统的研究现状
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文题录

(5)中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌流行病学、药物敏感性及毒力差异研究(论文提纲范文)

摘要
Abstract
引言
第一部分 肺炎链球菌准确鉴定方法学研究
    材料与方法
        一、主要仪器设备及试剂材料
        二、实验方法
        1.实验室鉴定方法评价
        2. DBA与HPA作为肺炎链球菌细胞壁表面标记物探究
    结果
        1. 草绿色链球菌实验室鉴定方法学结果评价
        2. DBA及HPA与肺炎链球菌细胞壁作用研究
    讨论
    小结
第二部分 中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌流行病学研究
    材料与方法
        一、主要仪器设备及试剂材料
        二、实验方法
        1. 荚膜肿胀试验分型
        2. 多重PCR分型(mPCR)
        3. CpsB基因测序分型
        4. 多位点序列分型(MLST)
    结果
        1. 中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌流行病学分布
        2. 血清型分布
        3. 肺炎链球菌血清型检测方法学比较
        4. 中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌分子流行病学特征
    讨论
    小结
第三部分 中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌药物敏感性及青霉素结合蛋白(PBP)突变分析
    材料与方法
        一、实验材料
        二、实验方法
        1. 体外抗菌药物敏感性试验
        2. PBP基因扩增测序
    结果
        1. 中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌体外抗菌药物敏感性分析
        2. 中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌PBP突变分析
    讨论
    小结
第四部分 侵袭性肺炎链球菌主要流行血清型毒力差异研究
    材料与方法
        一、主要仪器设备及试剂材料
        二、 实验方法
        1. 伦理申明
        2. 试验菌株选取
        3. 动物实验准备
        4. 小鼠菌血症模型建立
        5. 不同血清型毒力比较
        6. 非荚膜相关毒力基因表达量分析
    结果
        1. 小鼠腹腔感染菌血症模型建立
        2. 不同血清型感染小鼠血液肺炎链球菌载量及存活率
        3. 血清型6ABC菌株毒力基因表达比较
    讨论
    小结
全文结论
参考文献
论文综述 肺炎链球菌鼻咽部定植及胞内感染的致病机制研究进展
    参考文献
附录
致谢

(6)肺炎链球菌PepN对细菌毒力的影响及其致病机制研究(论文提纲范文)

英汉缩略语名词对照
中文摘要
英文摘要
前言
1 实验材料
2 实验方法
3 实验结果
4 讨论
参考文献
全文总结
文献综述
    参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文

(7)肺炎链球菌PspA蛋白疫苗的联合免疫及PspA抗体的粘附抑制实验方法研究(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
缩略词表
第1章 前言
    1.1 肺炎链球菌疫苗
        1.1.1 肺炎链球菌简介
        1.1.2 肺炎链球菌疫苗研究现状
    1.2 PspA蛋白疫苗
        1.2.1 PspA蛋白
        1.2.2 PspA疫苗研究现状
    1.3 BLP粘膜疫苗
    1.4 论文设计
        1.4.1 论文目的
        1.4.2 论文实验设计
第2章 肺炎链球菌PspA蛋白疫苗的联合免疫
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 实验动物,菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 系统疫苗免疫原制备
        2.2.2 粘膜疫苗免疫原制备
        2.2.3 SDS-PAGE及 Western-Blot
        2.2.4 疫苗免疫
        2.2.5 Elisa检测抗体效价
        2.2.6 菌肺清除实验
        2.2.7 攻毒保护实验
        2.2.8 细胞因子检测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 免疫原的制备与鉴定
        2.3.2 联合免疫程序的确定
        2.3.3 系统IgG抗体反应的测定
        2.3.4 粘膜s IgA抗体反应的测定
        2.3.5 联合免疫肺炎链球菌清除能力的评价
        2.3.6 联合免疫的保护性评价
        2.3.7 细胞因子的分泌
    2.4 讨论和本章小结
第3章 PspA抗体的粘附抑制实验方法的建立
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 样品,细胞,菌株
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 培养基配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 A549 细胞的复苏和传代
        3.2.2 肺炎链球菌的培养
        3.2.3 粘附抑制实验
        3.2.4 细菌粘附的免疫荧光检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 粘附抑制实验方法的建立
        3.3.2 粘附抑制实验方法的评价
    3.4 讨论和本章小结
本文总结及结论
参考文献
作者简介及在学期间所获得的科研成果
致谢

(8)肺炎链球菌pcsB组成型表达的yycF缺陷菌株的构建及其致病能力(论文提纲范文)

1 材料与方法
    1.1 实验动物
    1.2 菌株、培养基、主要试剂和仪器
    1.3 插入片段的制备
    1.4 肺炎链球菌的实验室转化与鉴定
    1.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
    1.6 绘制生长曲线
    1.7 ELISA检测细菌表面荚膜多糖含量
    1.8 FITC-葡聚糖法检测荚膜多糖含量
    1.9 Western blot分析荚膜多糖条带模式
    1.1 0 体外细菌粘附侵袭与抗吞噬实验
    1.1 1 体内生存率和定殖实验
    1.1 2 统计学分析
2 结果与分析
    2.1 S.pn Pc-PcsB+菌株的构建及鉴定
    2.2 S.pn Pc-PcsB+(35)yycF菌株的构建及鉴定
    2.3 细菌体外生长情况
    2.4 D39rpsl41、Pc-Pcs B+、Pc-Pcs B+(35)yyc F菌株中pcs B基因的转录水平和yycF上下游基因的转录水平
    2.5 yyc F缺陷后菌株中胞内荚膜多糖和小分子荚膜多糖增多
    2.6 yyc F缺陷菌株体外粘附能力减弱
    2.7 yyc F缺陷菌株粘附巨噬细胞的能力减弱
    2.8 yyc F缺陷后菌株在小鼠体内肺部定殖能力减弱
3 讨论与结论

(9)ComRS系统介导的猪链球菌基因改造方法构建及生物功能分析(论文提纲范文)

摘要
ABSTRACT
第一篇 文献综述
    第一章 猪链球菌的概述
        1 猪链球菌流行病学特点
        2 猪链球菌转录调控因子研究进展
        2.1 CcpA
        2.2 LuxS
        2.3 Rgg
        2.4 TstS
        2.5 NrtR
        2.6 二元调控系统
        3 猪链球菌分子分型及基因组分析
        3.1 多重PCR定型
        3.2 MLST
        3.3 毒力因子分型
        3.4 全基因组分析
        参考文献
    第二章 细菌自然转化的概述
        1 细菌自然转化的调控机制
        1.1 肺炎链球菌感受态调控机制ComDE-ComX
        1.2 枯草芽孢杆菌感受态调控机制ComAP-ComK
        1.3 猪链球菌自然转化调控机制ComRS-ComX
        2 细菌自然转化的发生机制
        3 自然转化的终止机制
        4 感受态细胞自相残杀
        5 自然转化的生物学意义
        参考文献
第二篇 试验研究
    第三章 基于ComRS系统的猪链球菌快速缺失方法构建
        1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒和培养条件
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 猪链球菌质粒电转试验
        1.4 ComRS进化分析及序列比较
        1.5 血清型及MLST分型
        1.6 自然转化方法
        1.7 猪链球菌转化效率测试
        1.8 比较不同XIP交叉诱导转化能力
        1.9 小鼠感染试验
        1.10 构建sacB-spc筛选基因盒
        1.11 构建猪链球菌缺失株及表型观察
        1.12 统计分析
        2 结果
        2.1 不同SS电转效率存在差异
        2.2 猪链球菌ComRS系统多样性分析
        2.3 ComS体外诱导活性区域鉴定
        2.4 不同XIP激活转化发生具有识别特异性
        2.5 SS菌株转化效率多样性与ComRS系统类型无关
        2.6 SS菌株转化能力强弱与致病力高低无关
        2.7 ComRS系统为核心的SS无痕基因编辑策略构建
        2.8 透射电镜观察表型鉴定基因改造有效性
        3 讨论
        参考文献
    第四章 ComR调控因子对猪链球菌2型毒力的影响
        1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒和培养条件
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 SS2菌株comR基因检测及毒力测试
        1.4 comR基因体内外转录测定
        1.5 ΔcomR缺失株及互补株的构建
        1.6 细菌形态观察
        1.7 细菌生长曲线测定
        1.8 生物被膜试验
        1.9 自然转化能力测试
        1.10 SS2对H2O2和酸性环境的耐受能力测定
        1.11 细胞黏附试验
        1.12 猪全血存活及血清生长试验
        1.13 BALB/c小鼠体内感染实验
        1.14 脑组织炎性因子转录检测
        1.15 统计分析
        2 结果
        2.1 转化能力检测
        2.2 不同comR基因的SS2存在毒力差异
        2.3 comR基因在宿主体内转录升高
        2.4 菌株基因改造及生物学性状分析
        2.5 生物被膜试验
        2.6 ComR不影响SS2耐受环境理化压力
        2.7 ComR有助于SS2黏附宿主细胞
        2.8 ComR利于SS在猪全血中存活
        2.9 ComR影响SS2毒力
        2.10 ComR抑制小鼠炎症因子转录
        3 讨论
        参考文献
    第五章 猪链球菌胞壁水解酶CrfP对自然转化和毒力的功能研究
        1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒和培养条件
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 荧光定量PCR检测chap相关基因
        1.4 生物信息学分析
        1.5 CrfP相关蛋白克隆、表达及纯化
        1.5.1 表达载体构建
        1.5.2 蛋白表达和纯化
        1.5.3 Western-blot检测
        1.6 CrfP体外杀菌试验
        1.6.1 最适蛋白浓度的筛选
        1.6.2 蛋白裂解SS的显微镜观察
        1.6.3 蛋白体外杀菌谱的筛选
        1.7 蛋白定位分析
        1.7.1 Flag标签载体构建
        1.7.2 蛋白互作试验
        1.7.3 分泌蛋白的提取与检测
        1.7.4 间接免疫荧光试验
        1.8 构建△crfP缺失株
        1.9 生物学性状比较
        1.10 细胞黏附试验
        1.11 动物实验
        1.11.1 BALB/c小鼠感染实验
        1.11.2 斑马鱼感染实验
        1.12 统计分析
        2 结果
        2.1 感受态模式下CHAP结构基因转录变化
        2.2 生物信息学分析结果
        2.3 CrfP蛋白表达检测
        2.4 CrfP具有体外杀菌活性
        2.4.1 活性蛋白效价测试
        2.4.2 荧光显微镜观察CrfP作用后SS形态变化
        2.4.3 透射电镜观察SS与CrfP孵育后菌体变化
        2.4.4 CrfP的杀菌谱
        2.5 CrfP分泌及菌体表面定位特性鉴定
        2.6 ΔcrfP生物学特征无差异
        2.7 CfrP对自然转化能力的影响
        2.8 CrfP对黏附的影响
        2.9 CrfP对毒力的影响
        3 讨论
        参考文献
    第六章 猪链球菌2型和3型荚膜基因簇的演化分析
        1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒和培养条件
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 PCR试验及毒力基因聚类分析
        1.4 MLST分析
        1.5 SS比较基因组学分析
        1.6 SS基因组防御系统功能元件的比较
        1.7 不同自然转化系统类型比较
        1.8 SS2和SS3荚膜基因簇分析
        2 结果
        2.1 毒力基因分群揭示SS2弱毒亚群与SS3、SS7菌株存在相关性
        2.2 MLST分析菌株起源
        2.3 不同血清型SS进化树分析
        2.4 CladeⅡ菌株序列共线性程度较高
        2.5 CladeⅠ和Ⅱ菌株ANI相似性比较
        2.6 CladeⅠ和Ⅱ菌株防御系统差异分析
        2.7 CladeⅡ菌株感受态系统相同
        2.8 SS3与SS2菌株间的荚膜基因簇差异比较
        3 讨论
        参考文献
全文总结
攻读博士期间发表论文
致谢

(10)肺炎链球菌PspAs蛋白疫苗佐剂筛选和体外评价方法研究(论文提纲范文)

中文摘要
abstract
缩略词表
第1章 前言
    1.1 肺炎链球菌疫苗
        1.1.1 肺炎链球菌简介
        1.1.2 肺炎链球菌疫苗研究现状
        1.1.3 PspA蛋白和PsaA蛋白介绍
    1.2 佐剂
    1.3 被动免疫实验
    1.4 调理吞噬实验和补体抑制方法
        1.4.1 调理吞噬实验
        1.4.2 补体抑制实验
    1.5 论文设计
        1.5.1 论文目的
        1.5.2 论文实验设计
第2章 PspAs肺炎蛋白疫苗的佐剂筛选
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 菌株,实验动物
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 试剂
        2.1.4 主要溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 PspAs蛋白纯化和与氢氧化铝佐剂的吸附率测定
        2.2.2 PspAs蛋白与氢氧化铝佐剂解吸附方法
        2.2.3 PspAs蛋白疫苗肌肉免疫
        2.2.4 SDS-PAGE
        2.2.5 ELISA法测定血清中抗体效价
        2.2.6 PspAs疫苗攻毒保护实验
        2.2.7 菌血菌肺清除实验
        2.2.8 细胞因子检测
    2.3 实验结果与讨论
        2.3.1 免疫原制备
        2.3.2 PspAs蛋白与氢氧化铝佐剂的吸附率测定
        2.3.3 特异性抗体IgG效价检测和比较
        2.3.4 清除肺炎链球菌的能力比较
        2.3.5 攻毒保护能力的比较
        2.3.6 特异性抗体IgG分型测定
        2.3.7 不同佐剂组的细胞因子分泌水平比较
    2.4 本章小结和讨论
第3章 PspAs肺炎蛋白疫苗体外评价方法研究
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 菌株与样品
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 主要质粒、酶和细胞
        3.1.4 主要试剂
        3.1.5 主要试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 免疫
        3.2.2 菌体Western blot
        3.2.3 ELISA法检测血清中的特异性抗体效价
        3.2.4 PspA蛋白缺陷菌同源重组质粒的构建
        3.2.5 肺炎链球菌转化方法
        3.2.6 PspA蛋白缺陷菌株鉴定
        3.2.7 被动免疫
        3.2.8 HL60 细胞培养和分化
        3.2.9 调理吞噬
        3.2.10 补体抑制
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 被动免疫实验方法的建立
        3.3.2 PspAs肺炎蛋白疫苗被动免疫实验评价结果
        3.3.3 肺炎链球菌补体抑制实验和调理吞噬实验评价
        3.3.4 PspA蛋白缺陷肺炎链球菌菌株构建及鉴定
        3.3.5 PspA蛋白缺陷菌株补体抑制实验评价和机理研究
    3.4 本章小结及讨论
本文总结及结论
参考文献
作者简介及在学期间所获得的科研成果
致谢

四、肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究(论文参考文献)

  • [1]MarR型转录调控因子FabT对肺炎链球菌菌落相变调控的研究[D]. 张竞辉. 重庆医科大学, 2021
  • [2]全局性转录调控因子Mga-like对肺炎链球菌荚膜和磷壁酸生物合成的调控研究[D]. 肖胜楠. 重庆医科大学, 2021
  • [3]腺苷合成酶在致脑膜炎病原菌穿过血脑屏障中的作用及机制研究[D]. 赵尊全. 军事科学院, 2020(02)
  • [4]细菌双组分系统YycF/YycG对肺炎链球菌荚膜多糖和磷壁酸多糖生物合成的调控研究[D]. 肖云菊. 重庆医科大学, 2020(01)
  • [5]中国多中心侵袭性感染肺炎链球菌流行病学、药物敏感性及毒力差异研究[D]. 周梦兰. 北京协和医学院, 2020(05)
  • [6]肺炎链球菌PepN对细菌毒力的影响及其致病机制研究[D]. 王玲. 重庆医科大学, 2020(12)
  • [7]肺炎链球菌PspA蛋白疫苗的联合免疫及PspA抗体的粘附抑制实验方法研究[D]. 张悦. 吉林大学, 2020(08)
  • [8]肺炎链球菌pcsB组成型表达的yycF缺陷菌株的构建及其致病能力[J]. 肖云菊,张竞辉,肖胜楠,尹一兵,张雪梅. 微生物学通报, 2020(05)
  • [9]ComRS系统介导的猪链球菌基因改造方法构建及生物功能分析[D]. 朱寅初. 南京农业大学, 2019(08)
  • [10]肺炎链球菌PspAs蛋白疫苗佐剂筛选和体外评价方法研究[D]. 陈晓瑞. 吉林大学, 2019(12)

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肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究
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